Agronomía Costarricense Universidad de Costa Rica
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ISSN (Versión impresa): 0377-9424 COSTA RICA
2000 Jorge A. Sánchez / Ramón Orta / Eric Calvo / Bárbara Muñoz / José Fresneda UTILIZACION DEL METODO DE HIDROLISIS DE LOS AMILOSTATOLITOS PARA EL DIAGNOSTICO DE RESISTENCIA AL CALOR, LA SEQUIA Y LA SALINIDAD EN EL TOMATE Agronomía Costarricense, julio-diciembre, año/vol. 24, número 002 Universidad de Costa Rica San José, Costa Rica pp. 49-55
Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal Universidad Autónoma del Estado de México http://redalyc.uaemex.mx
Agronomfa Costarricense 24(2): 49-55, 2000
UTILIZACION DEL METODO DE HIDROLISIS DE LOS AMILOSTATOLITOS PARA EL DIAGNOSTICO DE RESISTENCIA AL CALOR, LA SEQUIA Y LA SALINIDAD EN EL TOMATEI Jorge A. SancheZ2/*, Ramon Orta*, Eric Calvo*, Barbara Muiioz*, Jose Fresneda** Palabras clave: Lycoper.l'icone.l'cu[entum, tomate,diagn6sticoprecoz,segura,salinidad,calor.
RESUMEN
ABSTRACT
Se adapt6 la tecnica de hidr61isisde los amilostatolitos y se comprob6 su efectividad para el diagn6stico precoz de grados de resistencia al calor, la sequfa y la salinidad en variedades de tomate. EI fundamento te6rico de esta tecnica es la correlaci6n inversa entre el d d .t . d d d h.d ' I ' . .1 I' . d
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Use of the amilostatolith hydrolysis method for diagnosis of resistance to heat, drought and salinity in tomato.The techniqueof amilo.statolithhydrol.ysis was a~apte~ and. its effectIveness assessed In theprecocIous dIagnosIs of degreesof ~si~tanceto heat,dro.ughtand.salinityi? tomato
OCl-
d
aplce
e
falces b~J~condIcIonesamblentalesextre.mas. La efechvldad fue comproba~aen 13 Va~le?ades de tomate de comportamlento agronomlCO bien conocido en Cuba. EI metodo se puede usaf en investigacionessobre el mejoramiento genetico de este cultivo, con ahorro de recursos materiales para la introducci6n de nuevas variedades de comportamiento agron6mico desconocido.
vanetles.
The
theoretIcal
'" technique
baSIS
of
thIS
. IS
the
Inverse
correlatIon
between
degree
f . 0 reslstance 0f the p1ants and the speed 0f amilostatolithhydrolysis(starchgrain hydrolysisin root apices) under extreme environmental conditions.The effectiveness was shown with 13 tomato varietiesof very well-known agronomic behaviorin Cuba. The method can be used in investigations aboutthegeneticimprovement of this crop,as a way of savingmaterialresources during the introduction of new varieties of unknown agronomicbehavior.
1/
Recibidoparapublicaci6nel 6 de abril del 2000.
2/ *
Autor paracorrespondencia. Institutode Ecologfay Sistematica, MinisteriodeCien-
**
InstitutodeInvestigaciones Fundamentales enAgricu~IuraTropical,"Alejandrode Humboldt".Ministeriode la Agricultura(MINAGRI), Calle 2 esq. a.1 Santiago'
cia Tecnologfay MedioAmbiente,(CITMA). Carretera de VaronaKm 31/2Capdevila,BoyerosApartado postal8029,C6digopostal10800,Habana,Cuba.
de las Vegas,Habana8, Cuba.
50
AGRONOMIA COSTARRICENSE
INTRODUCCION El tomate(Lycopersiconesculentum, Mill.) y otrashortalizasde amplioconsumoen Cubason ejemplosde un fuerte trabajode mejoramientoy obtenci6nde nuevasvariedadesresistentesa las condicionesambientalesdesfavorablespara los cultivos (Munoz y Sardinas1989,Domini et at. 1993,1994,G6mezy Laterrot 1997). Sin embargo,la introducci6n de nuevas variedadesconfrontauna limitante fundamental; la imposibilidad de probarlastodas a la vez, en condicionesexperimentales,debido a liplitacionesmaterialesy humanas.Por estosmotivos, el numerode variedadesen que puededeterminarsela resistenciaa la sequiay la salinidadmediante experimentosde campo,es necesariamente limitado. Los metodosfisio16gicosy bioquimicos para el diagn6sticoprecozadquieren,por consiguiente,mayor importanciacadadia. Henckelet at. (1970)describieronuna tecnica de laboratorioparael diagn6sticoprecozde gradosde resistenciade lasplantasa la sequiay la salinidad,queconstituyeunaherramientautil para seleccionary descartarpotencialidades deresistencia de muchasvariedades ala vez,sin necesidad de su evaluaci6nen condicionesde campo.La tecnica sebasaen la correlaci6nexistenteentreel grado de resistenciaa cualquierfactor estresante del ambientey la velocidadde hidr61isisde los amilostatolitos(granosde almid6n)en el apicede las falces.Esta correlaci6nes inversaen la generalidadde las especiesy variedadescultivadas;a mayor grado de resistencia,menor velocidadde hidr61isisde amilostatolitosbajo condicionesde sequia y salinidad.ParaHenckel(1982)la resistencia a la sequiaes una caracteristicacomplejaque incluyela resistenciaal calor y ala desecaci6n. La determinaci6nde la resistenciaa la sequiay la salinidadpor el metodode Henckelet at. (1970)presentalas siguientesventajas:1) la evaluaci6n se realiza en un organismo completo (plantulas)y no con una parte de el; por tanto, puedeutilizarseen los trabajosde selecci6nde variedades;2) el metodopermitedeterminaral mismo tiemporesistenciade lasplantasal calor,la desecaci6ny la salinidad;y 3) el metodoessencillo, pococostoso,y exigepocosmaterialesy equipos.
En Cuba,los mejoresrendimientosde las variedadesde tomate,de mayorexplotaci6nen la agricultura,se obtienenen la campanaconocida como "epoca6ptima" 0 "periodo invemal", que comprendelas siembrasrealizadasdel 21 de octubre al 20 de febrero (Casanova1991).El estudio del comportamientodel tomateen diferentes condicionesambientalesdel pais (G6mezct at. 1988,Domini et at. 1993,Sim6n et at. 1994)demostr6 que existe una marcadainfluencia del ambientesobre la expresi6nde rendimiento,10 que obliga a continuarla busquedade nuevasvariedadescapacesde evitar perdidasen los rendimientoscuandocrecenen condicionesclimaticas adversas.El objetivo de estetrabajorue la adaptaci6n y aplicaci6nde la tecnicade hidr61isisde amilostatolitosen el cultivo del tomate,como un mecanismode selecci6nque facilite la introducci6n de variedadesen la practicaagricola.
MATERIALES Y METODOS Material vegetal y procesode germinacion El presentetrabajo serealiz6 con semillas frescasde 13 variedadesde tomatecultivadasen Cuba (Cuadro 1) suministradaspor el Laboratorio Central de Certificaci6n de Semillasdel Ministerio de la Agricultura y el lnstituto de lnvestigacionesFundamentalesen Agricultura Tropical"Alejandro de Humboldt". Las semillasde cadavariedada probarse colocanen placasde Petri (9 cm de diametro)sobre papelde filtro humedecidocon aguadestilada esteril para incubarlasa 25°C, bastaobtener suficientessemillasgerminadas(200 a 300) con falces 1-2 cm de longitud. Metodo de hidrolisis de los amilostatolitos Tincion. Las falces se cortan en su extremo basal y se depositanen un recipiente que contengauna soluci6n 7:4 agua:lugol (v/v) por 15-30seg.El tiempo de exposici6na la soluci6n colorantedependede la variedadensayada,debe determinarseempiricamente,y estadadopor el tiempo mfnimo indispensablepara colorear
SANCHEZ et al.: Diagn6sticode resistenciaal calor, la sequfay la salinidaden tomate.
correctamentelos amilostatolitos agrupadosen la zona del apice de la raiz inmediataa la caliptra. Las falces tefiidas deben enjuagarsecon aguaantesde observarseal microscopio. Evaluacion. Se realiz6 determinandoel contenido de amilostatolitos presenteen cada raiz. ParaHenckel.etal. (1970) la cantidadde almid6n estatolitico es una medidaindirecta de la actividad de las enzimashidroliticas cuandolas plantulas(semillas recien germinadas)se someten a condicionesambientalesextremas.En plantas susceptiblesa la sequia,el almid6n estatolitico se hidroliza con mayor rapidez. Las falcestefiidassecolocanen aguadestilada sobreportaobjetosen gruposdiscretosy se presionanligeramentecon el cubreobjetosbasta lograr la rotura de los tejidos. Debendisponerse en hilera parafacilitar la observaci6nde cadauna al microscopio.El aumento6ptimo a utilizar es 100x.La evaluaci6ndel contenidode amilostatolitos en cadaraiz se realiza asignandolevalores convencionalessegunla siguienteescala: I-Ninguno 0 muy pocos. 2-Contenidomedio. 3-Contenidomaximo. Estasevaluacionesdebenserrealizadassecuencialmentepor 2 observadoresdiferentesy promediadoslos valoresasignadosa cadaraiz como unica via para minimizar el efecto subjetivo. El metodoinicial creadopor Henckelet al. (1970) propone la valoraci6n del contenido inicial de amilostatolitosen cadaraiz utilizando una escala de 0-5. Sin embargo,la amplitud de dicha escala podriahacermassubjetivala evaluaci6n;por tanto, se proponeutilizar la escaladel 1-3. Para descartarfalsos positivos en nuestras determinaciones(contenidosamilostatoliticos elevadosen la radicula de variedadessusceptibles, provocadospor la perdida de la actividad de las enzimascorrespondientesy no por la resistenciade estasa los tratamientos)debe comprobarsela vitalidad de las celulasradicales tratadasmedianteel metodo topografico de Tetrazolio (ISTA 1985).Paraello las plantulastratadasse sumergenen soluci6n acuosade cloru-
51
ro de 2, 3, 5-trifenil tetrazolium al 0.1% durante 24 h a 30°C. La valoraci6n se realiza de la siguienteforma: 1) plantulasviables, aquellasque presentanla radicula completamentetefiida;,y 2) plantulas muertas,aquellasdondela radicula no se tifie 0 la tinci6n no es uniforme. Tamafio de muestra. El tamafio minimo estadisticamente valido para el numerode falces a observarse calculapor la siguientef6rmula: N= Up2fE2*(DE/X*100)2 ParaN, numerominimo necesariodeobservaciones;P,probabilidadde certeza;Up, raz6nde la distribuci6nnormal,U95= 1.96;E, magnitudde la exactitudrelativa;X, mediaaritmeticade todas las deterrninaciones; DE, desviaci6nestandarde las deterrninaciones. ParaP=95%y E=lO%:N=(1.96/l0)2*(DE/X*lOO)2 Tratamientos Calor. Las semillas germinadasde cada variedada probar se separanen 2 grupos.EI primerode ellos (grupo control) semantienea 25°C yalta humedaddespuesde la germinaci6n,mientras el otro es sometidoa inmersi6n en aguadurante 1 h a 36°C (grupo tratado).Ambos grupos debenpasarpor los pasosdel metodode hidr61isis de los amilostatolitos. Desecacion.Las semillas germinadasde cadavariedada probar seseparanen 2 grupos.El primero (grupo control) se mantienea 25°Cy aIta humedaddespuesde la germinaci6n,mientras el otro es sometidoa la exposici6nde un ambiente seco,logradodentrode unadesecadora con so1.uci6nde NaCl al 3.85% durante 1 h, en la oscuridad a 20:t2°C;aI retirarsela placade Petri de la desecadoradebeafiadirseleaguaparafacilitar su posteriormanipulaci6n.Ambos gruposdebenpasar por los pasosdel met?dode hidr61isisde los amilostatolitos. Salinidad. Las semillasgerrninadasde cada variedada probarse separaranen 2 grupos.El primero(grupocontrol) se mantienea 25°Cy aIta humedaddespuesde .la gerrninaci6n,mientrasel
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AGRONOMIACOSTARRICENSE
segundoes sometidoa la inmersi6nen una soluci6n de NaCI al 0.6% (p/v) duranteI h a 25°C. Ambos gruposdebenpasarpar los pasosdel metodo de hidr6lisis de los amilostatolitos.
significativamentediferente entre el grupo control y el grupo tratado(N.S.). 2) Medianamenteresistenteal calor,desecaci6ny/o la salinidad,cuandola diferenciaen actividad hidrolitica result6significativa(* 0 **). 3) Susceptiblesal calor, desecaci6ny/o la salinidad,cuandola diferenciaresult6 altamente significativa(***).
Analisis estadistico Si para una variedadse deseadeterminar simultaneamente su gradode resistenciaal calor, la desecaci6ny la salinidad,bastacon evaluarun valor del control para la comparaci6ncon los 3 tratamientos.La evaluaci6nestadisticaserealiz6 a partir del calculo de la media aritmeticade todaslas determinacionesdel contenidode amilostatolitos par raiz, (escala1-3)de las plantulastratadas(calor, desecaci6n0 salinidad)con relaci6n a la media aritmetica del control, aplicando la prueba"t" de Student.
RESULTADOS Y DISCUSION En el Cuadra I se apreciael alto nl:imero de observacionesque debieronrealizarseen cada variedad de tomate evaluada.Resultadossimilares se ban reportado en otros cultivos (Capate y Suarez1977,Capotey Casal 1978); esto sedebefundamentalmentea la amplia variabilidad genetica que presentael tomate, tanto a nivel intravarietal como intervarietal (Rick 1983). Este resultado podria parecerun inconveniente del metoda de diagn6stico aplicado; sin embargo, el carta tiempo empleado(un mes) en obteneTla informaci6n superaesta aparentedificultad.
Clasificacion de las variedades Las variedadesse clasificaroncomo: 1) Resistentesal calor, desecaci6ny/o salinidad, cuandola actividadhidrolitica no result6
Cuadro 1. Desviaci6nestafidar(DE), nurneromfnirno de observacionescalculado(N), y nurneroreal de observacionesrealizadas (n), para las distintasvariedadesde tornateen la determinaci6nde la resistenciaa la sequfa(calor y desecaci6n) y la salinidad. Tratamientos Variedades
HC-38-80 HC-78-80 8/6/2 8/6/M2 Carnpbell-28 INCA-15 INCA-17 L-3-16 L-IO-3 Criollo Quivic.4n INIFAT-28 Placero C-28-V
Control
Calor
Desecaci6n
Salinidad
DE
N
n
DE
N
n
DE
N
n
DE
N
n
0.67 0.65 0.49 0.71 0.68 0.41 0.68 0.56 0.67 0.64 0.67 0.62 0.71
31 30 16 48 48 20 43 27 30 36 34 41 40
45 50 29 55 55 31 50 40 51 40 40 50 50
0.71 0.61 0.48 0.51 0.58 0.69 0.60 0.64 0.68 0.65 0.69 0.66' 0.44
54 44 50 48 49 57 33 44 48 31 45 45 30
65 50 56 55 55 65 40 50 55 52 50 50 40
0.51 0.67 0.61 Q59 0.59 0.59 0.68 0.61 0.65 0.58 0.62 0.68 0.64
42 51 45 51 51 70 43 45 30 24 44 40 39
51 62 50 58 58 80 89 50 49 36 52 45 45
0.48 0.52 0.45 0.51 0.51 0.58 0.63 0.56 0.51 0.65 0.49 0.58 0.55
45 39 44 48 48 38 35 38 45 30 25 36 35
60 45 60 56 56 52 50 50 60 48 54 50 45
SANCHEZ et al.: Diagn6sticode resistenciaal calor, la sequfay la salinidaden tomate.
EI mayor porcentajede hidr61isisde los amilostatolitosse produjo en las variedadessusceptiblesala sequiay la salinidadHC-38-80,HC78-80, 8/6/2 y 8/6/M2 (en general,diferenciasde
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mis del 30%respectoa suscontroles),con lasmaYaTesdiferenciasestadisticasobtenidas(Cuadro 2). En las variedadesreportadascomo resistentes ala sequiaINCA-I7, L-3-16, L-IO-3, asicomoen
Cuadro2. Contenidomedio de amilostatolitosen las celulas del apicede las rafces para las distintas variedadesde tomate. Medias aritmeticas Variedades HC-38-80
HC-78-80
Control
Tratamiento
Diferencias entre medias
2.46
1.87
0.59
1.41
1.05
1.31
1.15
1.74 1.43
0.78 0.90 1.09
2.52
1.62
% respecto al control
t
Grado de resistencia
23.9 (calor) 42.6 (sequfa) 46.7 (salinidad)
***
Baja
***
Baja
***
Baja
30.9 (calor)
***
Baja
35.7(sequfa)
***
Baja
43.2 (salinidad)
***
Baja
8/6/2
2.36
1.48 1.62 1.41
0.88 0.74 0.95
37.2 (calor) 31.3 (sequfa) 40.2 (salinidad)
*** *** ***
Baja Baja Baja
8/6 M2
2.33
1.58 1.42 1.40
0.75 0.91 0.93
32.1 (calor) 39.5 (sequfa) 39.9 (salinidad)
*** *** ***
Baja Baja Baja
Campbell-28
1.80
1.54 1.32 1.31
0.26 0.48 0.49
14.4(calor) 26.6 (sequfa) 27.2 (salinidad)
* *** ***
Media Baja Baja
INCA-15
2.22
1.89 1.45 1.46
0.33 0.77 0.76
14.8(calor) 34.6 (sequfa) 34.2 (salinidad)
* *** ***
Media Baja Baja
INCA-17
1.80
1.61 1.45 1.30
0.19 0.24 0.50
10.3(calor) 13.3(sequfa) 27.7 (salinidad)
N.S. N.S. **
Alta Alta Media
L-3-16
2.04
1.89 1.82 1.56
0.15 0.22 0.48
7.3 (calor) 10.7 (sequfa) 23.5 (salinidad)
N.S. N.S. **
Alta Alta Media
.2.13
1.98 1.87 1.85
0.15 0.25 0.28
7.4 (calor) 11.8(sequfa) 13.1(salinidad)
N.S. N.S. N.S.
Alta Alta Alta
Criollo Quivican
2.51
2.32 2.28 2.00
0.19 0.23 0.24
7.5 (calor) 9.1 (sequfa) 9.5 (salinidad)
N.S. N.S. N.S.
Alta Alta Alta
INIFAT-28
2.24
1.94 1.84 1.84
0.30 0.40 0.40
10.7(calor) 13.3(sequfa) 17.8(salinidad)
N.S. N.S. **
Alta Alta Medill
Placero
2.3
2.13 2.02 1.94
0.17 0.28 0.36
7.3 (calor) 12.1(sequfa) 15.6(salinidad)
N.S. N.S. **
Alta Alta Media
C-28-V
2.22
2.06 2.03 1.85
0.16 0.19 0.37
7.2 (calor) 8.5 (sequfa) 16.6 (salinidad)
N.S. N.S. **
Alta Alta Media
L-I0-3
N.S. * ** ***
no significativo: resistentes Significativo para P SO.05:resistenciamedia Significativo para P SO.Ol:resistenciamedia Altamente significativo para P SO.OOl:sensibles~
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AGRONOMIA COSTARRICENSE
Criollo Quivican, INIFAT-28, Placeroy C-28-V no existendiferenciasestadfsticas significativasen la cantidadde arnilostatolitospresenteen las rafcesantesy despuesdel estres;la hidrolisisrue solamentedel 7.1-13.3%.Sin embargo,la mayorfa de estasvanedadesbajo condicionesde salinidad, apenaspresentaronresistenciamedia; solamente la variedadL-I0-3 y Criollo Quivicansecomportaron como resistentes.For ultimo, las variedades Campbell-28e INCA-IS fueron sensiblestanto a la desecacioncomo a la salinidady presentaron valoresintermediosde hidrolisisy de significancia estadfsticade la diferencias,bajo condicionesde calor; por 10que, puedenconsiderase de resistencia mediaen estacondicionde estres. En la epocade temperaturas elevadaspara la siembradel tomateen Cuba(campanadeprimavera-verano,enmarcadadesdeel 21 de febrero bastael 20 de agosto)(Casanova1991)las variedadesHC-78-80,HC-38-80y Campbell-28reportadascomo susceptibles0 de resistenciamedia, respectivamente, en esteensayodisminuyensignificativamentesusrendimientoscuandose compacaroncon INCA-17 y L-IO-3 las cualesban sido seleccionadas por su adaptaciona condicionesde alta temperatura(Gomezet al. 1988,Dominf et al. 1994).Same Iglesias(1994)demostraron ensiembras realizadasen condicionesnormalesque las variedadesCampbell-28,HC-78-:80e INCA-17 tienenunaproduccionde frutos muy similar entre ellas,perocuandola siembraserealizoen "epoca no optima"los mejoresrendimientosseobtuvieron en la variedadINCA-17 reportadacomoresistente al calor y ala desecacionen esteexperimento. La correspondencia casi exacta entre nuestrosresultadosy la experienciaagronomica adquirida en Cuba con las mismas variedades (Gomezet al. 1988,Dominf et al. 1993,1994,Siman et al. 1994)indica que el metodode hidrolosis de los amilostatolitospuedeserefectivopara e1diagnosticoprecozdel grado de resistencia a la sequfay a la salinidaden variedadesde tomateutiles a nuestraeconomfa,maximesi setoma en consideracionsu sencillezy la no necesidad de un equipamientocomplejo.
Henckelet al. (1970)demostraron tarnbien, la efectividadde la tecnicade diagnosticoen semilla botanicade diversas variedadesde trigo (Triticumvulgare),avena(Avenasativa),mijo (Panicum milaceum),mafz(Zeamays),pepino(Cucumissativus), calabaza(Cucurbitamaxima),melon (CucumismelD),y enfrijol negro(Phaseolusvulgaris). La eficaciade la t6cnicaseprobopor primeravez en Cubaen rafcesde semillaagamica provenientes de canutosde callade azucar(Saccharumofficinarum) (Capotey Suarez1977).Posteriormente, Capote y Casal(1978)aplicaronel metodoen semillas gamicasde unagramfneade interesparala ganaderfacubana,comoesel Cenchrusciliaris. For otra parte, en el presentetrabajo se observo que el porcentajede hidrolisis de los amilostatolitos,en cualquierade las variedades evaluadas,siemprerue superioren las condiciones de desecaciony de sa1inidadque en 1asde calor. Esto podrfa debersea una menorresistencia 0 toleranciade los cultivos a estos2 tipos de estres0 a la falta de ajustedel metodoen cuanto a factorestales como concentracionde NaCI y tiempo de exposicionde las plantulas.For consiguiente,el ajustede la tecnicano solo permitirfa discriminar entre variedadesresistentesy susceptibles,sino tambienen el gradode resistencia 0 susceptibilidaddentrode cadagrupo. Finalmente,care destacarque,aunqueestos resultados corresponden conla experienciaagronomicadeterrninada conestasvariedades en Cuba,la evaluacionconclusivade la resistenciade lasplantas cultivadasa cualquierfactor estresante, segun Henckel(1982),no solo deberaincluir la deterrninaciondel gradode supervivencia de lasplantasen ambientesdesfavorables, sinotambienla productividad(rendimiento)y el crecimientovegetativode las variedadesen esascondiciones.Esto sugiere quela utilizacioneficazde dichatecnicaen el trabajo de seleccionde nuevasvariedadesevitar!i1a realizaciona priori de experimentos de campocon aquellasvariedades que se descartende acuerdoa los finesde los productores. Contribuyendo deesta maneraa la introduccionaceleradade nuevoscultivaresresistentes en la practicaagricola.
SANCHEZ et aI.: Diagn6stico de resistencia al calor, la sequfa y la salinidad en tomate.
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