EFECTO DE LA FRACCIÓN SOLUBLE DE ROFA EN EL LAVADO BRONCOALVEOLAR DE RATAS ADULTAS Y JOVENES: BALANCE ANTIOXIDANTE-OXIDANTE Y APOPTOSIS. Ostachuk A.1, Polo J.2, Evelson P.2 y Tasat D. R.1,3. 1
Depto de Biología- ECyT-UNSAM, 2Catedra de Qca. General e Inorgánica -FFyB -UBA y 3Depto de Radiobiología-CNEA, Buenos Aires, Argentina.
[email protected]
La existencia de altos niveles de materia particulada (MP) aérea en centros urbanos ha sido relacionada con diversas enfermedades pulmonares y con aumentos en las tasas de mortalidad y morbilidad (Ostro B, 1989; Dockery DW, 1993). La incidencia de diversas enfermedades pulmonares sobre la población depende entre otros factores de la susceptibilidad de los distintos grupos etarios, siendo las subpoblaciones más vulnerables las de los recién nacidos y los mayores de 65 años (Saldiva PHN et al., 1995; Spengler JD et al., 1996). Es conocido que las vías aéreas respiratorias sufren durante el proceso de envejecimiento cambios estructurales que podrían modificar el patrón de clearance de la MP mediado principalmente por los macrófagos alveolares (MA), células clave del sistema fagocítico mononuclear. Si bien esta células juegan un papel muy importante en la protección del huésped, pueden también producir efectos sistémicos adversos en el mismo. La MP, al interactuar directa o indirectamente con la membrana celular, induce la activación de los MA con la subsecuente modulación de los distintas vías de transducción de señales, activación de transcripción genética y generación de mediadores pro-inflamatorios (Dorger M et al., 2000). La respuesta biológica de los MA provoca la liberación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y del nitrógeno (RNS), citoquinas, factores mitogénicos y sustancias quimiotácticas. De ellos, las ROS y RNS han sido descriptos como intermediarios claves en la patogénesis de las enfermedades pulmonares mediadas por MP aérea (Becker et al., 1996). La producción de ROS está estrictamente regulada por la presencia de sistemas de defensa antioxidante. Sin embargo, existen situaciones fisiológicas en las que un aumento en la generación de oxidantes o una disminución en los niveles de antioxidantes mediante la peroxidación lipídica, la inactivación de enzimas especificas o la oxidación del ADN provocan daño tisular y muerte celular (Sies H 1997). En este contexto, resulta relevante el estudio comparativo del metabolismo oxidativo y la presencia de apoptosis en los fagocitos provenientes de individuos de diferentes grupos etarios expuestos a contaminantes ambientales particulados. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la fracción soluble del ROFA (cenizas volátiles residuales del petróleo) sobre el metabolismo oxidativo y la apoptosis en células provenientes del lavado bronqueoalveolar de animales jóvenes y adultos. Materiales y Métodos Animales: Se utilizaron ratas Wistar jóvenes (1-2 meses de edad) y adultas (9-12 meses de edad), procedentes del bioterio de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA). Los animales se mantuvieron bajo condiciones de agua y comida ad libitum. Fluido bronqueoalveolar: El fluido bronqueolalveolar (FBAL) se obtuvo mediante lavado pulmonar utilizando una solución reguladora de fosfato fría (pH: 7.2-7.4) suplementada con 0.04 % EDTA según Brain JD et al. (1977) modificada por Tasat et al. (1987). Modelo experimental: Las células de los FBAL fueron expuestas a concentraciones crecientes de la fracción soluble del ROFA (0-200 µg/ mL). Viabilidad celular: El porcentaje de células viables y no viables se determinó utilizando el colorante vital Azul de Tripán. Determinación del anión superóxido: La generación de anión superóxido (O2.-) intracelular se estudió mediante el test del Nitro Blue Tetrazolium (NBT) según Segal et al (1974). Este compuesto soluble en presencia del O 2.- se reduce y precipita como sales insolubles de formazana en forma de cristales azules. Las células se incubaron bajo agitación constante con 0.1% NBT durante 10 min. a 37 °C y se estimularon con tetradecanoilforbol acetato (TPA) (100 µg/ mL) durante 45 min. La reacción se detuvo fijando la suspensión celular con paraformaldehido 4%. La cuantificación de las células reactivas y no reactivas se realizó sobre extendidos celulares bajo microscopía óptica (Molinari et al., 2000). Determinación de la capacidad antioxidante total (TRAP): La capacidad antioxidante total se determinó mediante quimioluminiscencia. El medio de reacción consistió en 2,2- azobis 2- amidinopropano (ABAP) 20 mM y luminol 40 µM en buffer fosfatos 100 mM. El ABAP es una fuente de radicales libres que reacciona con el luminol generando quimioluminiscencia. Al agregar una muestra que contiene antioxidantes, la emisión de luz disminuye hasta niveles basales. El tiempo que tarda en retornar a la emisión original (tiempo de inducción, τi) es directamente proporcional a la cantidad de antioxidantes presentes en la muestra. Se midió la emisión y se determinó el tiempo de inducción, τi para cada muestra. La curva de calibración se realizó con Trolox 150 mM (análogo hidrosoluble de la vitamina E). Los resultados se expresaron en µM de unidades Trolox. (Lissi y col., 1992). Apoptosis: 1) Morfología nuclear: Las células se fijaron en una mezcla fría de acetico-metanol (1:3) durante 15 min. y se colorearon con 5µg/ mL de Hoescht 33258 (1 mg/ mL) durante 10 min. El porcentaje de células con picnosis y fragmentación nuclear, fue cuantificado bajo microscopía de fluorescencia a 460 nm. 2) Análisis de la fragmentación del ADN: Las células fueron resuspendidas en PBS y el ADN fue extraído utilizando el kit GenElute mammalian genomic DNA (Sigma Aldrich Co). Los fragmentos de ADN fueron separados mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% y fueron visualizdos por tinción con bromuro de etidio (Jones y col.,1998).
100
100
80
80
Células Reactivas (%)
Células Reactivas (%)
Figura 1
60 40 20 0 0
10
50
100
200
60 40 20 0 0
10
ROFA (µ g/mL) Joven ROFA
50
100
ROFA (µ g/mL)
Joven ROFA+TPA
Adulto ROFA
Adulto ROFA + TPA
Figura 2
Figura 3 100
Apoptosis (%)
80
60
40
20
0
Jovenes Control
Adultos 200ug/ml
Tabla 1
Control ROFA 10 ROFA 200
Capacidad Antioxidante (µM /106 células) Jóvenes Adultos 6,28 ± 0,10 3,18 ± 0,31 6,59 ± 0,15 3,16 ± 0,40 5,10 ± 0,27 3,59 ± 0,60
200
Resultados y Discusión Metabolismo oxidativo: Generación del anión superóxido (O2.- ) y Capacidad antioxidante total (TRAP) La fracción soluble de ROFA (10-200µg/mL) estimuló la generación del O2.- en el FBAL proveniente de animales jóvenes y adultos hasta alcanzar niveles similares a los inducidos por el TPA (Fig. 1A y 1B). Como muestra la Tabla 1, la capacidad antioxidante de los homogeneizados de células pertenecientes al grupo de animales jóvenes es mayor tanto en los controles como en los tratados con ROFA, en comparación con los valores obtenidos para los homogeneizados de células del grupo de animales adultos. Además, mientras que la dosis máxima de ROFA (200 µg/mL) empleada provocó una disminución de hasta un 20 % en el FBAL proveniente de animales jóvenes, no se encontraron variaciones significativas para ninguna de las dosis de ROFA ensayadas en el FBAL proveniente de animales adultos. Apoptosis: La figura 2 muestra macrófagos alveolares procedentes del FBAL de animales adultos controles y expuestos a 200 µg/mL ROFA. Estos últimos presentaron cambios morfológicos que recuerdan claramente figuras características del proceso de apoptosis. Como se observa en la figura 3, la fracción soluble de ROFA fue capaz de inducir un incremento en el porcentaje de células apoptóticas en ambas poblaciones celulares. Cabe destacar que aún en el FBAL de animales adultos donde los niveles basales son elevados se observó un aumento en el número de células apoptóticas. Por otra parte, la fragmentación del DNA evaluada mediante electroforesis en geles de agarosa mostró, sólo para la población de células provenientes de animales adultos, el patrón de migración conocido como laddering indicando fragmentación internucleosomal del DNA (dato no mostrado). El incremento en la generación de radicales libres y la disminución en la capacidad antioxidante podrían provocar estrés oxidativo con el consiguiente daño tisular asociado. Este claro desbalance en el metabolismo oxidativo sería el factor desencadenante del aumento de la muerte celular programada principalmente en la población celular proveniente de animales adultos. Por lo tanto, concluimos que el efecto de la fracción soluble de ROFA sobre el metabolismo oxidativo es dependiente de la edad del individuo.
Referencias Becker S, Soutkup JK, Gilmour MI, Devlin RB. Stimulation of human and rat alveolar macrophages by urban air particulates: effects on oxidant radical generation and cytokine production. Toxicol Appl Pharmacol 1996, 141 (2): 637-648. Brain JD.,Godleski J. and Sorokin S. Quantification, origin and fate of pulmonary macrophages. In Lung Biology in Health and Disease. ed. Brain JD, Proctor DF and Reid LM. Respiratory Defense Mechanisms (part II): 849 – 893, 1977 Dockery DW, Pope III, Xu X, Spengler JD, Ware JH, Fay ME, Ferris Jr BG, Speizer F. An association between air pollution and mortality in six US cities. N Engl J Med 1993, 329:1753-9. Dorger M, Krombach F. (2000) J. Aeros. Med. 13:369-380 Jones R., Johnson V, Buck N, Dobrota M, Hinton R, Chow S, Kass G. Fas-mediated apoptosis in mouse hepatocytes involves the processing and activation of caspases. Hepatology 1998, 27: 1632-1642. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo M. Luminol luminescence induced by 2,2’-azo-bis-amidinopropane thermolysis. Free Rad. Res. Comm. 1992, 17: 299-312. Molinari de Rey B, Tasat DR, Fernández M., Duran HA, Curiale J, Stoliar A, Cabrini RL. Automated image analisis for monitoring oxidative burst in macrophages. Anal. Quant. Cytol. Histol. 2000, 22: 423-427 Ostro B, Rtuschild S. Air pollution and acute respiratory morbidity: an observational study of multiple pollutants. Environ Res 1989, 50:238-247. Rom WN, Travis WD, Brody AR. (1991) Am. Rev. Respir. Dis 143:408-422 Saldiva PHN, Lichtenfels AJFC, Paiva PSP, Barone IA, Martins MA, Massad E, Pereira JCR, Xavier V P, Singer JM, Bohm GM. Association between air pollution and mortality due to respiratory diseases in children in São Paulo- Brazil. Environ. Res 1994, 65: 218-225. Segal AW. Nitroblue-tetrazolium tests. Lancet 1974, 2: 1248-1252 Sies H. (1997) Exp. Physiol. 82:291-295 Spengler JD, Koutrakis P, Dockery DW, Raizenne M, Speizer FE. Health effects of acid aerosols on north american children: air pollution exposures. Environ Health Perspect 1996,104:492-99. Tasat DR, de Rey BM. Cytotoxic effect of uranium dioxide on rat alveolar macrophages. Environ Res 1987, 44:71-81
Leyendas Figura 1. Efecto de la fracción soluble de ROFA sobre la generación de anión superóxido. La figura muestra el porcentaje de células reactivas presentes en el FBAL proveniente de ratas jóvenes y adultas controles y tratadas con TPA. Los valores representan la media ± SE., n = 4. Figura 2. Microfotografía óptica de macrófagos alveolares provenientes del FBAL de ratas adultas teñidos con Hoescht 33258. Los macrófagos controles (Izquierda) presentan una tinción nuclear homogénea mientras que los macrófagos expuestos a 200 µg/mL ROFA (Derecha) muestran una tinción nuclear irregular correspondiente a distintos grados de condensación de la cromatina. Aumento: 100x Figura 3. Efecto de la fracción soluble de ROFA sobre el porcentaje de células apoptóticas. Las barras muestran el porcentaje de células apoptóticas del FBAL de animales jóvenes y adultos estimulados con 200 µg/mL ROFA. Los valores representan la media ± SE., n = 4. Tabla 1. Capacidad antioxidante total (TRAP). Evaluación de la TRAP en el FBAL proveniente de animales jóvenes y adultos controles y tratados con ROFA 10 y 200 µg/ mL. Los valores representan la media ± SE., n = 3.
