Valoración del estado de la membrana basal como factor pronóstico en el carcinoma renal

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ORIGINAL

ACTAS UROLÓGICAS ESPAÑOLAS MARZO 2002

VALORACIÓN DEL ESTADO DE LA MEMBRANA BASAL COMO FACTOR PRONÓSTICO EN EL CARCINOMA RENAL J. RUBIO BRIONES, L. MORELL QUADRENY*, J.A. LÓPEZ GUERRERO*, J. CASANOVA RAMÓN-BORJA, C. MEJÍA VÁZQUEZ*, I. IBORRA JUAN, A. PELLÍN PÉREZ*, E. SOLSONA NARBÓN, A. LLOMBART BOSCH* Servicio de Urología. Instituto Valenciano de Oncología. Valencia. *Departamento de Anatomía Patológica. Facultad de Medicina. Universidad de Valencia. Valencia. PALABRAS CLAVE: Carcinoma renal. Laminina. Colágeno IV. Inmunohistoquímica. KEY WORDS: Renal carcinoma. Laminin. Collagen IV. Immunohistochemistry. Actas Urol Esp. 26 (3): 190-195, 2002

RESUMEN FUNDAMENTOS: Conocer el estado de la membrana basal (MB) en el carcinoma renal (CR) y su importancia como factor pronóstico. MATERIAL Y MÉTODOS: Se seleccionaron 73 pacientes con CR. Se realizó inmunohistoquímica con anticuerpos monoclonales contra las proteínas basales laminina y colágeno IV. La valoración de los resultados consideró la integridad de la MB dentro del tumor tomando como punto de corte un 75 % de basales fragmentadas en el tumor. RESULTADOS: El seguimiento fue de 6,3 ± 4,3 años, durante el cual hubo progresión de la enfermedad en 27 pacientes. La correlación en la expresión de ambas moléculas fue significativa (p=0,000). La fragmentación de la MB en más del 75% del tumor expresada con laminina se relacionó con una presencia de clínica por el tumor (p=0,019), con un peor grado de diferenciación celular (p=0,004) y con más del 10% de necrosis (p=0,001). Una fragmentación mayor del 75% expresada con colágeno IV se asoció a tumores mayores de 7 cm (p=0,014). Se observó una peor supervivencia en aquellos pacientes con tumores con más del 75% de fragmentación de la MB medida con colágeno IV (p=0,042), mientras que con la laminina se apreció una tendencia similar que no alcanzó la significación estadística (p=0,119). En el análisis univariado resultaron factores pronósticos el grado III-IV, la presencia de más de un 10% de necrosis en el tumor, la presentación clínica del tumor y con una fragmentación de la MB mayor del 75% analizada con colágeno IV, persistiendo los dos primeros en el análisis multivariado. CONCLUSIONES: Colágeno IV y laminina representan correctamente y de forma paralela el grado de fragmentación de la MB en el CR. Dentro de una batería de factores inmunohistoquímicos en CR se debería incluir al menos una de ellas por su implicación pronóstica.

ABSTRACT OBJETIVES: To know the basal membrane (BM) integrity in renal cell carcinoma (RC) and its importance as prognostic factor. MATERIAL AND METHODS: 73 patients with RC were selected. Immunohistochemistry with monoclonal antibodies against basal proteins laminin and collagen IV was performed. Percentage for BM fragmentation in the whole tumour was considered taking 75% as cut off. RESULTS: Follow-up was 6.3 ± 4.3 years and 27 patients progressed. Correlation between laminin and collagen IV was significative (p=0.000). A BM fragmentation expressed with laminin bigger than 75% was related to tumoural symphtoms (p=0.019), worse grade (p=0.004) and necrosis in more than 10% of the tumour (p=0.000). Fragmentation observed with collagen IV was associated to tumours greater than 7 cm (p=0.014). Those patients whose tumours displayed more than 75% of BM fragmentation, measured with collagen IV, presented worse survival (p=0.042). A similar trend was observed in the case of laminin, but it did not reach statistic significance (p=0.119). In the univariated analysis grade III-IV, more than 10% of necrosis within the tumour, tumoural symphtoms and BM fragmentation bigger than 75% measured with collagen IV were prognostic, while only grade and necrosis did so in the multivariate analysis. CONCLUSIONS: Collagen IV and laminin represent nicely, with a similar expression pattern, the BM fragmentation in RC. Within a battery of immunohistochemical markers to study RC at least one of them should be included because their prognostic implication.

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bles. Para el estudio inmunohistoquímico se utilizaron las secciones más representativas de cada tumor aplicando la técnica ABC previa digestión enzimática con pepsina (Pepsina 0,4% en ClH 0.01M) durante 2 horas, con la intención de realzar los radicales antigénicos enmascarados por la fijación y procesado del material. Los anticuerpos monoclonales primarios de la laminina y del colágeno IV (Sanbyo) se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente a una dilución 1/400. En todos los casos se asociaron preparaciones de riñón normal como control (Fig. 1). La valoración de los resultados consideró íntegra la membrana basal cuando la inmunotinción fue continua y ausente cuando no fue posible su identificación. Entre dichos extremos, se valoró el

D

urante las 2 últimas décadas se han analizado diferentes factores clínicos, patológicos e inmuhohistoquímicos con el fin de adecuar el manejo clínico del carcinoma renal (CR) 1,2 . Cuestiones como el valor de la inmunoterapia adyuvante para los tumores de mal pronóstico o la indicación de actitud expectante en casos seleccionados necesitan estudios prospectivos y randomizados basados en factores independientes del grado y del estadio tumoral, que pese a ser buenos factores pronósticos no están contrastados por todas las series y por lo tanto son insuficientes para el manejo de este tumor. Toda la superficie externa de las distintas partes de la nefrona esta recubierta por membrana basal (MB). Sus principales componentes son la laminina y el colágeno IV, además de proteoglicanos y entactina/nidógeno. La MB está implicada en procesos de adhesión celular, migración, diferenciación y filtración3; alteraciones por tanto de sus componentes y su funcionalismo se implican en la patogénesis de distintas nefropatías como la diabética, los síndromes de Alport y de Goodpasture, la nefropatía membranosa y otras muchas4. Es también bien conocido el fenómeno de fragmentación y disrupción de la MB durante la progresión de distintos tumores sólidos. El objetivo de este trabajo es valorar la importancia del estado de la MB en el CR como factor pronóstico, analizando la expresión de sus dos principales componentes, la laminina y el colágeno IV.

FIGURA 1. Preparación correspondiente a un riñón normal, en donde se puede observar mediante una inmunotinción con laminina la integridad de las membranas basales alrededor de todos los túbulos seccionados.

MATERIAL Y MÉTODOS Se seleccionaron 73 pacientes, 20 mujeres y 53 hombres, operados en el Instituto Valenciano de Oncología por CR entre los años 1985 y 1998 de los que se disponía suficiente material incluido en parafina en buen estado de conservación para su estudio histológico e inmunohistoquímico (IHQ). La edad media fue de 59,4 ±12,3 años. Diecinueve tumores (26%) fueron detectados de forma incidental, mientras 54 presentaron clínica. Para el estadiaje se siguió el TNM de 19925, para la tipificación histológica la clasificación de Heidelberg6 y para la determinación del grado de diferenciación celular la clasificación de Furhman7. Se valoró también el porcentaje de necrosis tumoral en el tumor basado en el estudio de los cortes disponi-

FIGURA 2. Preparación correspondiente a un carcinoma renal, en el que se puede observar la pérdida de membranas basales alrededor de las células tumorales mediante una inmunotinción con colágeno IV.

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J. RUBIO BRIONES, L. MORELL QUADRENY, J.A. LÓPEZ GUERRERO, Y COLS.

porcentaje de basales fragmentadas dentro de la totalidad del tumor, estableciendo un punto de corte en 75%. En la valoración clínica se consideró a un paciente en progresión cuando el CR se reprodujo localmente o a distancia. La recaída local, en el riñón contralateral o como metástasis única fue tratada mediante cirugía e inmunoterapia basada en interleukina-2 subcutánea. La progresión metastásica múltiple fue tratada con inmunoterapia. El seguimiento medio de la serie fue de 6,3±4,3 años, con un rango entre 1 y 15 años. En el momento del estudio 38 pacientes (52,1%) estaban libres de enfermedad y 5 vivos con enfermedad. Treinta pacientes fallecieron, 19 por progresión tumoral (26%) y 11 por diversas causas intercurrentes. Un total de 27 pacientes (37%) presentaron progresión de la enfermedad tras la nefrectomía; de ellos sólo 3 están libres de enfermedad en la actualidad tras cirugía ± inmunoterapia. Los datos se han analizado utilizando el paquete informático SPSS versión 10.0. El análisis de las características cualitativas de los pacientes y de sus tumores en los diferentes subgrupos se ha realizado utilizando tablas de contingencia y empleando el test Chi-cuadrado de Pearson, así como el test de Correlación de Spearman para las asociaciones lineales. Para el estudio de la supervivencia de la serie en función de la expresión de laminina y colágeno IV, se ha realizado el análisis actuarial de Kaplan-Meier empleando el contraste estadístico log rank. En todos los tests se han tomado como límites de significación p75% ≤75%

40%

29 29

20% 0%

10 10

≤ 75%

> 75%

Laminina

FIGURA 3. Correlación entre las inmunotinciones de laminina y colágeno IV. Los números que figuran en el interior de las barras corresponden al número de casos.

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VALORACIÓN DEL ESTADO DE LA MEMBRANA BASAL COMO FACTOR PRONÓSTICO EN EL CARCINOMA RENAL

TABLA I RELACIONES DE LAS INMUNOTINCIONES CON LAMININA Y COLÁGENO CON EL RESTO DE FACTORES CLÍNICO-PATOLÓGICOS Laminina (75%)

Colágeno IV (75%)

X2

p

X2

p

Sí / No

5,481

0,019

1,723

0,189

PT

T1-2 / T3-4

0,344

0,557

0,839

0,360

Grado

I-II / III-IV

13,596

0,004

7,319

0,062

Necrosis

10%

10,340

0,001

2,043

0,153

Tamaño

7 cm/ =7 cm

1,165

0,280

6,011

0,014

Progresión

Sí / No

1,157

0,282

0,126

0,722

Factor

Subgrupos

Clínica

inmunotinciones se relacionaron estadísticamente con el tamaño tumoral cuando los puntos de corte fueron 2,5 cm y 4 cm. Excluyendo los 11 pacientes muertos por otras causas durante el seguimiento, la supervivencia de los 62 restantes, con un seguimiento medio de 75,6 meses, se indica en relación a la expresión de laminina y colágeno IV en las Figuras 4 y 5 respectivamente; se observó una tendencia a la significación con la laminina -estadísticamente no válida- (p=0,119) y una relación estadísticamente significativa en el caso del colágeno IV (p=0,042). En la Tabla II se muestra el potencial pronóstico

1.1

Log Rank = 4,12; p=0,0425

1.0

Supervivencia acumulada

0.9 0.8 0.7

Colágeno IV ≤ 75%

0.6

≤ 75% -cens 0.5

> 75%

0.4

>/75% -cens

0.3 0

100

200

Supervivencia Global (meses)

FIGURA 5. Curva de supervivencia de Kaplan Meier que muestra el pronóstico en función de la inmunotinción con colágeno IV.

1.1

Log Rank = 2,42; p=0,1197

1.0

de los distintos factores analizados respecto a la supervivencia en este grupo de pacientes según análisis univariado. Además, en el análisis multivariado de todos ellos (Tabla III), el grado de diferenciación celular (p=0,009) y un porcentaje de necrosis mayor al 10% del tumor (p=0,007) mantienen un valor estadístico como factor pronóstico de supervivencia.

Supervivencia acumulada

0.9 0.8 0.7

Laminina ≤ 75%

0.6

≤ 75% -cens

0.5

> 75% 0.4

>/75% -cens

0.3 0

100

200

DISCUSIÓN

Supervivencia Global (meses)

La estructura de la membrana basal está formada principalmente por laminina y colágeno IV. Existen otras moléculas como la entactina/nidó-

FIGURA 4. Curva de supervivencia de Kaplan Meier que muestra el pronóstico en función de la inmunotinción con laminina.

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J. RUBIO BRIONES, L. MORELL QUADRENY, J.A. LÓPEZ GUERRERO, Y COLS.

TABLA II ESTUDIO DE SUPERVIVENCIA SEGÚN LOS ANÁLISIS UNI Y MULTIVARIADO DE LOS DISTINTOS FACTORES CLÍNICOS, PATOLÓGICOS E INMUNOHISTOQUÍMICOS ESTUDIADOS Factor

Subgrupos

Log rank

p

Clínica

Sí / No

10,97

0,041

PT

T1-2 / T3-4

3,7

0,054

Grado

I-II / III-IV

10,97

0,0009

Necrosis

10%

11,7

0,0006

Patrón

Papilar / Resto

1,68

0,1944

Tamaño

≤7 cm / >7 cm

3,28

0,0701

Laminina

75%

2,42

0,1197

Colágeno IV

75%

4,12

0,0425

importantes para la disrregulación de la familia de las lamininas en la MB. Esto último concuerda con líneas de investigación en otros tumores sólidos sobre la hipótesis que alteraciones en las cadenas de la laminina, y no sólo su disrupción, estén implicadas en la invasión de las células tumorales10 (Pyke 1995) y con la importancia de la abolición de la interacción integrinas-lamininas en el poder de progresión y diseminación del CR, demostradas in vivo e in vitro por Rahilly y cols11,12. Nuestros resultados demuestran que son útiles para conocer el grado de fragmentación de la MB mediante técnicas IHQ rutinarias tanto la laminina como el colágeno IV. El hecho de que su expresión esté estadísticamente relacionada, podría permitir realizar tan sólo una de ellas en el caso de caracterización con una batería IHQ del potencial biológico de un CR, aceptando las limitaciones de la técnica de IHQ13. Por otro lado, el estudio de la función de anclaje de las células de un CR a su MB debería también incluir la integrina α6β1, principal implicada en la unión célulaMB en el riñón, y cuya infraexpresión se ha relacionado con el grado de diferenciación celular, la polarización del epitelio tubular y la fragmentación de la MB en el CR14, proteína que no hemos tenido ocasión de estudiar. Tanto la necrosis tumoral, fenómeno habitual en los tumores sólidos malignos de gran tamaño, como la presentación clínica del tumor se han descrito como factores pronósticos en el CR 1,15 . Ambos parámetros aparecen relacionados con el estado de fragmentación de la MB en nuestra serie, lo que sugiere que, si la integridad de aquella limita el crecimiento del tumor, una vez rota el crecimiento sería más rápido, produciendo necrosis en sus zonas centrales e invasión de órganos o estructuras adyacentes, fenómeno responsable de una clínica más agresiva.

geno y los proteoglicanos que sirven de nexo entre aquellos y que han sido menos estudiadas. La laminina es una trímero compuesto por subunidades α, β y γ, de las que existen a su vez distintos subtipos. La combinación de éstos permite conocer en la actualidad hasta 12 lamininas distintas, de las que las más importantes en riñón son la 1 y la 10. También existen distintos tipos de colágeno IV en función de los tipos de cadenas α que lo integren4. Los estudios de Lohi y cols. han permitido caracterizar la expresión de las distintas subunidades de las lamininas en distintos tipos de CR8, apoyando la distinción no sólo morfológica sino molecular que justifica la clasificación de Heidelberg9. La demostración de líneas celulares derivadas de CR capaces de producir lamininas diferentes cuando son implantadas en ratones atímicos, con una expresión distinta a su producción in vitro, supone que existen factores del huésped

TABLA III ANÁLISIS MULTIVARIABLE DE REGRESIÓN DE COX. VARIABLES SOBRE EL QUE SE HA REALIZADO EL ANÁLISIS: CLÍNICA (SI/NO), pT (T1-2/T3-4), GRADO (I-II/III-IV), NECROSIS (10%), PATRÓN (PAPILAR/RESTO), TAMAÑO (=7cm />7 CM), LAMININA (75%), COLÁGENO IV (