Utilización de la técnica RAPD para estudios poblacionales en la raza bovina Blanca Cacereña

POSTER

UTILIZACIÓN DE LA TÉCNICA RAPD PARA ESTUDIOS POBLACIONALES EN LA RAZA BOVINA BLANCA CACEREÑA THE USE OF RAPD TECHNIQUE IN POPULATION STUDIES OF BLANCA CACEREÑA BOVINE BREED Parejo, J.C., M.E. Sansinforiano, A. Rabasco, M. Martínez-Trancón, J.L. Fernández-García y J.A. Padilla Genética y Mejora Animal. Facultad de Veterinaria. Departamento de Zootecnia. Universidad de Extremadura. Avda. Universidad, s.n. Cáceres. España.

PALABRAS CLAVE ADICIONALES

ADDITIONAL KEYWORDS

Polimorfismos RAPD. Vacuno. Relaciones genéticas.

RAPD. Polymorphisms. Cattle. Genetic relationships.

RESUMEN La progresiva desaparición de especies supone una grave pérdida para la reserva genética mundial, siendo su principal causa las actuaciones y las modificaciones introducidas por el hombre en el medio ambiente durante las últimas décadas. La raza bovina Blanca Cacereña se encuentra actualmente en peligro de extinción, debido al escaso número de individuos existentes, al presumible alto grado de endogamia intrarraza debido a haberse explotado de forma cerrada en las últimas décadas y al posible cruzamiento con razas recientemente introducidas. La aplicación de una estrategia eficiente de recuperación y conservación es fundamental si se pretende mantener una representación adecuada de la raza. Mediante la utilización de la técnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) se pretende identificar marcadores raciales y determinar la variabilidad genética existente en los efectivos vivos representantes de la Blanca Cacereña. Esta información podría ser de gran utilidad a la

hora de diseñar un plan de recuperacion y conservacion para la raza. En este trabajo se estiman las relaciones genéticas entre las razas bovinas Avileña, Blanca Cacereña, Charolesa y Retinta, obtenidas a partir de análisis RAPD. Además, se presentan resultados preliminares del análisis poblacional de la raza Blanca Cacereña, referentes a las relaciones genéticas encontradas en machos de esta raza y su comparación con machos de la raza Charolesa.

SUMMARY The bovine Blanca Cacereña breed is one of the more endangered breed in Spain, due to the decreasing number of pure breed animals, the expected increasing of inbreeding coeficient by closed-crossing and the possible crossbreeding with another introduced breeds. An effective strategy of recovery and conservation is essential for support a suitable

Arch. Zootec. 47: 279-286. 1998.

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por la creación de la asociación de criadores y por la concesión de ayudas encaminadas a consolidarla. En este sentido, el diseño y ejecución de un plan de Conservación y Recuperación, es esencial para mantener una representación adecuada de la misma que constituya una reserva de genes que puedan ser utilizados en el momento que se considere oportuno. Entre las acciones previas al diseño de este Plan, es necesaria la caracterización genética de la raza, mediante la detección de marcadores genéticos que identifiquen a los individuos pertenecientes a la misma y determinen su variabilidad. La técnica RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA; Williams et al., 1990; Welsh y McClelland, 1990) ha sido aplicada con éxito en estudios genéticos de muchas especies de animales y plantas, entre los que se incluyen los relativos a la caracterización de poblaciones bovinas (Bardin et al., 1992; Kemp y Teale, 1992). Su aplicación a mezclas de ADN representativas de poblaciones o razas diferentes, aumenta la rapidez de detección de marcadores poblacionales (Kemp y Teale, 1994). En este trabajo hemos utilizado la técnica RAPD para el análisis de mezclas de ADN de la raza Blanca Cacere-

representation of the breed. By RAPD technique we claim to identify racial markers and to determine the genetic variability in Blanca Cacereña breed. This information will be useful in a future conservation plan of the breed. The genetic relationship among the Avileña, Blanca Cacereña, Charolesa and Retinta breeds were obtained from RAPD analyses. We have estimated the genetic relationships between Blanca Cacereña and Charolesa males.

INTRODUCCIÓN

La sustitución y cruzamiento de la raza vacuna Blanca Cacereña en las últimas décadas ha provocado una importante regresión del número de efectivos vivos de esta raza. Desde 1979 se encuentra declarada como raza de protección especial por el Ministerio de Agricultura (Orden del 30 de Junio de 1979), y más recientemente, ha sido clasificada por la Unión Europea como raza en peligro de extinción. Este hecho, unido a que los animales vivos provienen de un número muy reducido de ancestros, sugiere la existencia en esta raza de una escasa variabilidad genética y elevada consanguinidad. Existe un interés creciente por parte de criadores y entidades públicas en la conservación y fomento de esta raza, interés que se ha visto materializado

Tabla I. Relación de marcadores RAPD raciales. (Relation of breed RAPD markers).

Nº Fragmentos totales en cada raza Fragmentos presentes únicos en cada raza Fragmentos ausentes en cada raza Total de posibles fragmentos marcadores

Avileña

Blanca Cacereña

Charolesa

Retinta

1538 28 40 68

1551 15 19 34

1590 48 20 68

1536 13 29 42

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ña y de otras tres razas bovinas presentes en la región (Avileña, Charolesa y Retinta), con objeto de identificar marcadores raciales y estimar las distancias genéticas entre las razas citadas. Así mismo hemos iniciado estudios poblacionales con machos de la raza Blanca Cacereña.

Cada reacción se realizó por duplicado y los productos obtenidos se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa (2 p.100), utilizando

MATERIAL Y MÉTODOS

Se realizó la extracción del ADN a partir de 10 ml de sangre completa de los 59 animales objeto de estudio (10 pertenecientes a la raza Avileña, 26 a la raza Blanca Cacereña, 13 a la raza Charolesa y 10 a la raza Retinta), según el método de Sambrook et al. (1989). Los ADN pool raciales se obtuvieron mezclando iguales cantidades de ADN de 10 individuos (7 hembras y 3 machos) de cada raza. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador UNO-Thermoblok (Biometra) en reacciones de 50 ml, utilizando tampón de reacción y ADNPolimerasa (Primezyme. Biometra), desoxirribonucleótidos trifosfato (Pharmacia) y una solución 10 mM de MgCl2. En el análisis de los pools de ADN, se han empleado un total de 130 oligonucleótidos cebadores de cadena corta (8-20 bases) y secuencia aleatoria, con una composición en G+C comprendida entre el 45 y el 90 p.100. Para el análisis de las muestras individuales se han empleado 18 cebadores. La composición de la reacción y los parámetros de amplificación han sido previamente optimizados para el tipo de muestras y cebadores utilizados (Parejo et al., 1997).

Figura 1. Patrones de amplificación obtenidos con el cebador OPA 044 en las razas Avileña (AV), Blanca Cacereña (BC), Charolesa (CH) y Retinta (RE). La flecha indica un fragmento específico de la raza Avileña. MXIV: Marcador de pesos moleculares. (RAPD patterns obtained with the primer OPA 044 in the Avileña (AV), Blanca Cacereña (BC), Charolesa (CH) y Retinta (RE) breeds. The arrow marks a specific band of Avileña breed. MXIV: Molecular Welgth Marker).

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como marcador de peso molecular un ladder de 100 pdb (DNA Molecular Weight Marker XIV, Boehringer Manheim). Los geles se tiñeron por inmersión en una solución de bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz ultravioleta a 312 nm. Los fragmentos considerados informativos fueron tabulados en matrices de presencia/ausencia, que sirvieron de base para estimar las relaciones genéticas. Se ha utilizado el paquete estadístico NTSYS vers. 1.50 (Applied Biostatistic Inc, 1989) para estimar dichas relaciones según el coeficiente de distancia genética de Nei (1978). Los dendrogramas se construyeron utilizando el método UPGMA (Sneath y Sokal, 1973). RESULTADOS

Figura 2. Patrones de amplificación obtenidos con el cebador OPA 095 en las razas Avileña (AV), Blanca Cacereña (BC), Charolesa (CH) y Retinta (RE). La flecha indica un fragmento específico de la raza Blanca Cacereña. El asterisco muestra un fragmento polimórfico. MXIV: Marcador de pesos moleculares. (RAPD patterns obtained with the primer OPA 095 in the Avileña (AV), Blanca Cacereña (BC), Charolesa (CH) y Retinta (RE) breeds. The arrow marks a specific band of Blanca Cacereña breed. The asterisc show a polimorphic fragment. MXIV: Molecular Weigth Marker).

De los 130 oligonucleótidos cebadores probados, 113 (86,92 p.100) produjeron patrones válidos de amplificación, y 79 de ellos (69,91 p.100) produjeron fragmentos de ADN polimórficos. Se han amplificado un total de 1701 fragmentos de los cuales 301 resultaron polimorficos (17,7 p.100). La media de fragmentos amplificados por cebador fue de 13,75 (327), y el tamaño de tales fragmentos estuvo comprendido entre 200 y 1700 pdb. En la tabla I se presenta el número total de posibles fragmentos marcadores detectados en las razas en estudio. Estos fragmentos se han contabilizado tanto por presencia como por ausencia (figuras 1 a 4). En la figura 5 se representan gráficamente las distancias genéticas rela-

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Figura 3. Patrones de amplificación obtenidos con el cebador OPA 104 en las razas Avileña (AV), Blanca Cacereña (BC), Charolesa (CH) y Retinta (RE). La flecha indica un fragmento específico de la raza Charolesa. MXIV: Marcador de pesos moleculares. (RAPD patterns obtained with the primer OPA 104 in the Avileña (AV), Blanca Cacereña (BC), Charolesa (CH) y Retinta (RE) breeds. The arrow marks a specific band of Charolesa breed. MXIV: Molecular Weigth Marker).

Figura 4. Patrones de amplificación obtenidos con el cebador OPA 090 en las razas Avileña (AV), Blanca Cacereña (BC), Charolesa (CH) y Retinta (RE). La flecha indica un fragmento específico de la raza Retinta. MXIV: Marcador de pesos moleculares. (RAPD patterns obtained with the primer OPA 090 in the Avileña (AV), Blanca Cacereña (BC), Charolesa (CH) y Retinta (RE) breeds. The arrow marks a specific band of Retinta breed. MXIV: Molecular Weigth Marker).

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Cacereña y 0,123 en la Charolesa. A partir de la estimación de las distancias genéticas (Nei, 1978) entre machos se ha construido el dendrograma (figura 6) en el que se puede

Figura 5. Dendrograma de las cuatro razas basado en la distancia genética de Nei (1978) calculada a partir de la frecuencia de los marcadores. (UPGMA Dendrogram for the four bovine breeds based on Nei’s (1978) genetic distance computed from RAPD markers frequencies).

tivas entre las cuatro razas analizadas. Hemos iniciado el estudio poblacional de la raza Blanca Cacereña en 20 machos. Se utilizaron 5 machos de la raza Charolesa para su comparación. De los 18 cebadores utilizados, 17 produjeron fragmentos de ADN polimórficos. Se amplificaron un total de 285 bandas, (263 en la raza Blanca Cacereña y 267 en la Charolesa), de las cuales 94 (35,74 p.100) fueron polimórficas en la raza Blanca Cacereña y 91 (34,1 p.100) en la Charolesa. La heterocigosis media estimada ha sido de 0,117 en Blanca

Figura 6. Dendrograma de los machos de las razas Blanca Cacereña y Charolesa basado en la distancia genética de Nei (1978) calculada a partir de la frecuencia de los marcadores RAPD y utilizando el método UPGMA.. (UPGMA Dendrogram for the males of bovine breeds Blanca Cacereña y Charolesa based on Nei’s (1978) genetic distance computed from RAPD markers frequencies).

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observar una separación clara en dos grupos entre ambas razas. DISCUSIÓN

Debido a las restricciones en la capacidad de proceso del paquete estadístico utilizado, las relaciones genéticas entre las cuatro razas se han estimado únicamente con los fragmentos polimórficos. Este hecho ha llevado a una sobreestimación de la distancia genética real, y por tanto los valores encontrados deberán entenderse como una valoración relativa de las relaciones genéticas entre las razas comparadas. Sin embargo, la utilización del RAPD con pools de ADN de cada raza ha permitido obtener, en un tiempo relativamente corto, un número considerable de fragmentos marcadores para cada raza. Cada posible marcador RAPD deberá ser validado mediante un muestreo de individuos pertenecientes a esta y otras razas. La detección de un grupo de marcadores RAPD en Blanca Cacerena permitirá identificar a los individuos pertenecientes a la misma. Los resultados del análisis de los

machos, muestran una muy baja heterocigosis estimada. Este dato parece ratificar la existencia de una escasa variabilidad genética en la raza, contemplada en nuestra hipótesis de partida. La distancia genética estimada entre la raza Blanca Cacereña y la Charolesa, en función de los análisis individualizados de los machos, fue de aproximadamente 0,15 (Nei, 1978). Esta distancia es de similar magnitud a la obtenida del análisis de 10 sistemas genéticos sanguíneos entre esta raza y un grupo de razas bovinas autóctonas españolas (Vallejo et al., 1990). Sin embargo, nuestros resultados no permiten corroborar las conclusiones obtenidas por estos autores que diferenciaban la raza Blanca Cacereña a nivel de subespecie, debido a que aquellos se han obtenido a partir de una muestra no representativa de toda la población. No obstante, los resultados obtenidos en este trabajo ponen de manifiesto la validez de la técnica RAPD para la caracterización genética de los individuos pertenecientes a la raza Blanca Cacereña, cuya información podrá ser decisiva a la hora de diseñar su Plan de Recuperación y Conservación.

BIBLIOGRAFÍA Bardin M.G., C. Bandi, S. Comincini, G. Damiani and G. Tognoni. 1922. Use of RAPDs markers to estimate genetic variation in bovine populations. Anim. Genet., 23 (Suppl. 1): 57. Kemp, S.J. and A.J. Teale. 1992. Random amplified DNA polymorphisms (RADPS) and pooled DNA in bovine genetic studies. Proc. 23rd Conf. Inter. Soc. Anim. Genet. Interlaken,

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