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Reumatol Clin. 2010;6(3):173–177
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Formacio´n me´dica continuada
Te´cnicas inmunolo´gicas que apoyan el diagno´stico de las enfermedades autoinmunes$ Diego F. Herna´ndez Ramı´rez y Javier Cabiedes ´n, Me ´n Salvador Zubira ´xico D.F, Me´xico Laboratorio de Inmunologı´a, Departamento de Inmunologı´a y Reumatologı´a, Instituto Nacional de Ciencias Me´dicas y Nutricio
´ N D E L A R T ´I C U L O INFORMACIO
R E S U M E N
Historia del artı´culo: Recibido el 17 de septiembre de 2009 Aceptado el 6 de octubre de 2009 On-line el 6 de enero de 2010
˜ os el avance tecnolo´gico ha permitido desarrollar te´cnicas que ayudan al diagno´stico Durante los u´ltimos an de mu´ltiples enfermedades. En el caso de las enfermedades autoinmunes, las te´cnicas inmunolo´gicas son de gran ayuda ya que permiten la deteccio´n de varios autoanticuerpos simulta´neamente a partir de ˜ os. Aunado al desarrollo de las nuevas te´cnicas, la sensibilidad y volu´menes de muestra pequen especificidad en la deteccio´n de las especificidades de los anticuerpos tambie´n han ido en aumento, de tal manera que el clı´nico puede contar con pruebas que le permiten hacer los diagno´sticos tempranos con mayor certeza y hacer tambie´n el seguimiento del curso de la enfermedad en funcio´n de la variacio´n de los anticuerpos presentes en las muestras de los pacientes. Cabe destacar que las nuevas te´cnicas de laboratorio que se utilizan para el apoyo en el diagno´stico de las enfermedades autoinmunes ya no son exclusivas de laboratorios de investigacio´n, sino que por su control de calidad, facilidad de estandarizacio´n ˜ os. En el presente trabajo se y reproducibilidad pueden usarse en laboratorios clı´nicos medianos y pequen describen las te´cnicas de mayor aplicacio´n en el laboratorio clı´nico para enfermedades autoinmunes. ˜ a, S.L.. Todos los derechos reservados. & 2009 Elsevier Espan
Palabras clave: Ensayos inmunoenzima´ticos Laboratorio de autoinmunidad Enfermedades autoinmunes
Immunological Techniques that Support the Diagnosis of the Autoimmune Diseases A B S T R A C T
Keywords: Immunoenzimatic assays Autoimmunity laboratory Autoimmune disease
During the past few years technological advance have been allowed the developing of techniques that help to the diagnosis of multiple diseases. In the case of the autoimmune diseases, immunological techniques are helpful since they allow the detection of multiple autoantibodies at the same time with small volumes of sample. Together with the development of the new techniques, sensitivity and specificity in the detection of the antibodies specificities’ also have been increased, in such a way that the clinicians can count with tests that allow them to make early diagnoses with greater certainty and also to follow the course of the disease based on the variation of the antibodies presents in the patient’s samples. It is important to emphasize that the new techniques of laboratory that are used for the support of the diagnosis of autoimmune diseases, no longer are exclusive for research laboratories but by their facility of standardization, quality control and reproducibility they can be used in clinical laboratory of medium and small sizes. In the present paper we describe those techniques with greater application in the clinical laboratory of autoimmune diseases. ˜ a, S.L.. All rights reserved. & 2009 Elsevier Espan
Introduccio´n Desde la descripcio´n de Hargraves del feno´meno de las ce´lulas LE y su asociacio´n con el lupus eritematoso generalizado (LEG), el estudio de los anticuerpos asociados a las enfermedades autoinmunes cobro´ gran importancia. Actualmente, el apoyo por el laboratorio para el diagno´stico de las enfermedades autoinmunes
$ Nota: Seccio´n acreditada por el SEAFORMEC con 1,7 cre´ditos. Consultar preguntas de cada artı´culo en: URL: http://reumatologı´aclı´nica.org. Autor para correspondencia. ´nico:
[email protected] (J. Cabiedes). Correo electro
consiste en un gran nu´mero de te´cnicas que permiten tanto identificar como confirmar el o los antı´geno(s) especı´ficos reconocidos. Adema´s, este tipo de te´cnicas han evolucionado de manera importante en las u´ltimas de´cadas, ya que se han desarrollado pruebas con mayor especificidad y sensibilidad. Entre las te´cnicas ma´s utilizadas se encuentran: la inmunofluorescencia indirecta (IFI), el ensayo inmunoenzima´tico (ELISA), el ensayo mu´ltiple y la electroinmunotransferencia (EIT). Cada una de ellas presenta diferencias pero conservan el fundamento general que es el reconocimiento de la unio´n antı´geno-anticuerpo, por lo que presentamos las caracterı´sticas ma´s importantes de dichas pruebas.
˜ a, S.L.. Todos los derechos reservados. 1699-258X/$ - see front matter & 2009 Elsevier Espan doi:10.1016/j.reuma.2009.10.003
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Inmunofluorescencia indirecta La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una de las te´cnicas ma´s utilizadas en los estudios de autoinmunidad debido a su fa´cil manejo y estandarizacio´n. Sin embargo, la lectura e interpretacio´n requieren de amplia experiencia. La te´cnica se basa en el reconocimiento de los anticuerpos que reconocen estructuras antige´nicas celulares nativas. La interaccio´n se evidencia por medio de un anticuerpo antiinmunoglobulina humana, producido en conejo, cabra o cobayo, dirigido contra las fracciones constantes (Fc) de las inmunoglobulinas IgG, IgA y/o IgM. Este anticuerpo antiinmunoglobulina humano esta´ conjugado o acoplado a un fluoro´foro (generalmente isotiocianato de fluoresceı´na [FITC]). Los resultados del reconocimiento de los antı´genos por los autoanticuerpos presentes en el suero, plasma o cualquier otro lı´quido, se evalu´an en un microscopio de epifluorescencia. Actualmente, la IFI se utiliza en los estudios de autoinmunidad para la deteccio´n de anticuerpos anti-DNA de doble cadena (DNAcd) o DNA nativo (DNAn) utilizando como sustrato Crithidia luciliae. Para la deteccio´n de anticuerpos que reconocen antı´genos nucleares se utilizan como sustratos lı´neas celulares epiteliales humanas como las ce´lulas HEp-2 o las ce´lulas HeLa. En el caso de los anticuerpos contra componentes de los gra´nulos primarios y especı´ficos de los polimorfonucleares o anticuerpos anticitoplasma de neutro´filos (ANCA), se utilizan neutro´filos fijados con etanol y formalina; y para los anticuerpos que reconocen antı´genos o´rgano-especı´ficos, se utilizan como sustratos cortes de tejidos especı´ficos (v. g. tiroides, eso´fago, esto´mago, gla´ndulas suprarrenales, gla´ndulas salivales, etc.).
Tabla 1 Antı´genos reconocidos por los autoanticuerpos que dan los patrones de tincio´n de los ANA Patro´n
Antı´geno
Nuclear
Homoge´neo Moteado grueso Perinuclear Nucleolar Citopla´smico Mitocondrial
Ciclo celular Citopla´smico
Filamentos intermedios
DNAcd, histonas, Ku RNP, Sm, Scl-70, SSB, RNA DNAcd, DNAcs RNA, RNP SSA, Clatrina Mitocondriales, fosfolı´pidos de la mitocondria Vimentina, actina, desmina, etc.
DNAcd: DNA de cadena doble; DNAcs: DNA de cadena sencilla; RNP: ribonucleoproteı´nas.
Deteccio´n de anticuerpos antiI-DNAn con Crithidia luciliae como sustrato El ensayo se fundamenta en el reconocimiento de los anticuerpos que reaccionan contra el DNAn de la mitocondria gigante (cinetoplasto) del para´sito Crithidia luciliae1. La prueba solo se ˜ e el cinetoplasto independienteconsidera positiva cuando se tin mente de la tincio´n en el nu´cleo, debido a que en el nu´cleo puede existir reactividad contra otros componentes, lo que da resultados falsos positivos. La te´cnica es altamente especı´fica, pero poco sensible, por lo que es conveniente en ciertos casos confirmar los resultados con otras pruebas ma´s sensibles como el ELISA.
Anticuerpos antinucleares La identificacio´n y cuantificacio´n de los anticuerpos antinucleares (ANA) no solo incluye antı´genos que se localizan en el nu´cleo de ce´lulas HEp-2, sino tambie´n antı´genos del citoplasma. La importancia de usar ce´lulas HEp-2 como sustrato se fundamenta principalmente en que tienen un nu´cleo ma´s grande de lo normal debido a su gran cantidad de antı´genos nucleares (v. g. ma´s de 46 cromosomas, ma´s de 3 nucleolos, abundantes ribonucleoproteı´nas, etc.) y citopla´smicos (v. g. mitocondrias, lisosomas, ribosomas, etc.) lo que permite hacer una fa´cil deteccio´n e identificacio´n de los antı´genos reconocidos por los autoanticuerpos presentes en los sueros de los pacientes con enfermedades autoinmunes. Adema´s, por ser una lı´nea celular muy activa, se pueden observar todas las fases del ciclo celular en los cultivos, con lo que se facilita la identificacio´n de antı´genos presentes solo en las fases de divisio´n, como los centro´meros o aquellos conocidos como proliferating cell nuclear antigens (PCNA) La deteccio´n de ANA mediante IFI utilizando como sustrato ce´lulas HEp-2 es u´til como prueba de tamizado inicial, debido a que los patrones de tincio´n ma´s comunes se relacionan con una
Figura 1. Patro´n cANCA. Los anticuerpos que reconocen las proteı´nas de´bilmente catio´nicas proteinasa-3 (PR-3) y proteı´na catio´nica de 57 kDa (CAP-57) dan el patro´n citopla´smico en neutro´filos fijados con alcohol o acetona.
gran variedad de antı´genos (tabla 1); sin embargo, resulta necesario realizar pruebas ma´s sensibles y especı´ficas como el ELISA para identificar el antı´geno o antı´genos reconocidos por los autoanticuerpos. Tambie´n se pueden observar patrones de tincio´n especı´ficos para antı´genos, como: proteı´nas de la la´mina nuclear, centrı´olos, Jo-1 y Scl-70, en cuyos casos el patro´n observado es de gran utilidad para identificar especı´ficamente al antı´geno reconocido, el cual puede ser confirmado mediante ELISA o EIT.
Anticuerpos anticitoplasma del neutro´filo Para la deteccio´n de los ANCA, la IFI se utiliza tambie´n como prueba de tamizado inicial, debido a que en ella se observan los 3 patrones de tincio´n que se relacionan con manifestaciones clı´nicas de autoinmunidad. Los patrones son: el citopla´smico o cANCA, el perinuclear o pANCA y el atı´pico o xANCA. El patro´n cANCA se caracteriza por presentar una tincio´n citopla´smica en neutro´filos fijados con etanol o acetona. Los anticuerpos que dan el patro´n cANCA reconocen proteı´nas de´bilmente catio´nicas o neutras como la proteinasa-3 (PR-3) y la proteı´na catio´nica de 57 kDa (CAP-57), las cuales se liberan de los gra´nulos especı´ficos por el tratamiento de las ce´lulas con alcohol o acetona y se distribuyen de manera homoge´nea en el citoplasma de los neutro´filos (fig. 1). El patro´n pANCA se observa en neutro´filos fijados con etanol o acetona y es perinuclear homoge´neo. El patro´n esta´ dado por los anticuerpos que reconocen proteı´nas fuertemente catio´nicas como: mieloperoxidasa (MPO), elastasa y azurocidina, las cuales cuando son liberadas de los gra´nulos primarios y especı´ficos del
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nados o´rganos. Para caracterizar el o los antı´genos especı´ficos reconocidos por los anticuerpos, es necesario utilizar ELISA que contienen los antı´genos especı´ficos. Para la deteccio´n de anticuerpos o´rgano especı´fico, se emplean laminillas que contienen cortes de tejidos de o´rganos, en su mayorı´a de primates. Entre estos cortes se cuentan: gla´ndulas adrenales, mu´sculo cardiaco, ˜ o´n (para eso´fago (para identificar anticuerpos antiendomisio), rin identificar anticuerpos antimembrana basal glomerular) y pa´ncreas (para identificar anticuerpos antice´lulas de los islotes pancrea´ticos).
Ensayo inmunoenzima´tico
Figura 2. Patro´n pANCA. A) Los anticuerpos que reconocen las proteı´nas fuertemente catio´nicas mieloperoxidasa (MPO) elastasa y azuricidina dan el patro´n perife´rico del nu´cleo en neutro´filos fijados con alcohol o acetona. B) Estos mismos anticuerpos cuando se prueban en neutro´filos fijados con formalina dan un patro´n citopla´smico.
Figura 3. Patro´n xANCA o atı´pico. Los anticuerpos que reconocen las proteı´nas catepsina G, lisozima y lactoferrina dan el patro´n xANCA o atı´pico en neutro´filos fijados con alcohol, acetona o formalina.
neutro´filo se reorganizan en la periferia del nu´cleo, el cual tiene carga negativa por el DNA (fig. 2A). El patro´n pANCA se debe confirmar en neutro´filos fijados con formalina. La formalina es un solvente orga´nico que reduce el efecto de atraccio´n de las proteı´nas catio´nicas (MPO, elastasa y azurocidina) hacia el DNA, con lo que quedan distribuidas en el citoplasma. Los anticuerpos que las reconocen dan un patro´n citopla´smico en la IFI (fig. 2B). El patro´n xANCA o atı´pico es el resultado del reconocimiento de las proteı´nas: catepsina G, lisozima y lactoferrina. Dichas proteı´nas se liberan de los gra´nulos especı´ficos de los neutro´filos y se redistribuyen en la periferia del nu´cleo cuando son tratados con etanol, acetona o formalina. Es importante enfatizar que el efecto de reacomodo perinuclear de las proteı´nas mencionadas no se ve modificado en los neutro´filos fijados con formalina (fig. 3). Por ser un patro´n perinuclear se puede confundir con el patro´n pANCA, por lo que es importante estudiar las muestras de los pacientes que presentan dicho patro´n en neutro´filos fijados con alcohol o acetona y en neutro´filos fijados con formalina.
Anticuerpos o´rgano especı´fico Mediante IFI se identifica la reactividad de los autoanticuerpos presentes en las muestras de pacientes con enfermedades autoinmunes, los cuales reconocen antı´genos especı´ficos de determi-
Como se menciono´ anteriormente, el ELISA es una de las te´cnicas ma´s utilizadas para identificar o confirmar la especificidad de los anticuerpos presentes en las muestras de los pacientes con enfermedades autoinmunes. Adema´s, por su fa´cil estandarizacio´n, manejo y variedad de antı´genos disponibles, ha desplazado notablemente a otras te´cnicas como el radioinmunoensayo para la deteccio´n de anticuerpos anti-DNAcd (conocido tambie´n como prueba de Farr), ya que no utiliza radionu´clidos, lo que hace que sea una te´cnica accesible y de bajo riesgo. Si bien existen diferentes tipos de ELISA, el ma´s utilizado en el laboratorio de diagno´stico de autoinmunidad es el ELISA indirecto, el cual se fundamenta en el reconocimiento de los anticuerpos especı´ficos presentes en las muestras de los pacientes, mediante un anticuerpo dirigido contra la regio´n Fc humana de cualquier isotipo (IgG, IgA o IgM) e inclusive de cualquier subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2). Los anticuerpos anti-Fc esta´n unidos a enzimas como la peroxidasa o la fosfatasa alcalina. Los antı´genos utilizados en las placas de ELISA pueden ser nativos, recombinantes (antı´geno completo o epı´topo especı´fico) o sinte´ticos (epı´topo especı´fico). Despue´s de permitir la interaccio´n de los anticuerpos de las muestras de los pacientes con el antı´geno pegado a la placa de ELISA, se realizan lavados para eliminar los anticuerpos inespecı´ficos y se agrega el anticuerpo antiinmunoglobulina humana unido a enzima, permitiendo la interaccio´n por un tiempo determinado. Posteriormente, se adiciona la solucio´n que contiene el sustrato-cromoge´nico especı´fico de la enzima (3, 30 , 5, 50 -Tetrametilbenzidina [TMB] para la peroxidasa o p-nitrofenilfosfato para la fosfatasa alcalina) el cual cambiara´ de color en funcio´n de la cantidad de anticuerpos conjugados con la enzima y cuya cantidad depende de los anticuerpos del paciente que reconocieron al antı´geno pegado a la placa. En otras palabras, la intensidad de coloracio´n es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo del paciente unido al antı´geno3 (fig. 4). La te´cnica puede ser cualitativa si solo se requiere conocer si existen o no anticuerpos con reactividad por determinado antı´geno o cuantitativa si se requiere conocer la cantidad de anticuerpos presentes en las muestras, para lo cual el ensayo debe incluir una curva patro´n de reactividad especifica. El ELISA tiene como ventaja que no se necesita un equipo sofisticado para su lectura.
Ensayo luminome´trico mu´ltiple ˜ os el ensayo luminome´trico mu´ltiple (ELM) se En los u´ltimos an ha vuelto popular, debido a que permite la deteccio´n de hasta 100 diferentes autoanticuerpos que reconocen el mismo nu´mero de ˜o antı´genos en una sola determinacio´n y con un volumen pequen de muestra (aproximadamente 50 mL). Estas son las ventajas ma´s importantes del ensayo comparado con el ELISA, ya que para realizar el mismo nu´mero de determinaciones especı´ficas por ELISA se requerirı´an 100 placas y 5 mL de muestra. La te´cnica es
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una variante del ELISA indirecto, pero la deteccio´n es distinta: en el ELISA se utiliza un compuesto cromoge´nico, en tanto que en el ELM la deteccio´n se realiza por fluorescencia, con lo que la sensibilidad del ensayo es mayor. El ELM se fundamenta en la deteccio´n de anticuerpos que reaccionan contra antı´genos especı´ficos, los cuales recubren esferas que contienen diferentes proporciones de un fluoro´foro (combinaciones de un fluoruro rojo y otro infrarrojo). La determinacio´n de la cantidad de anticuerpo unido al antı´geno se revela por la interaccio´n de un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana conjugado con biotina. Posteriormente, se adiciona un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (PE). El ensayo se lee en un lumino´metro, instrumento que tiene el mismo principio que el cito´metro de flujo. De manera breve,
Placa cubierta con el antígeno
Incubación con el suero del paciente
Incubación con el anticuerpo de detección
Adición del sustrato y detección del cambio de color Figura 4. ELISA. La placa de 96 pozos se recubre con antı´genos especı´fico, los cuales son reconocidos por los anticuerpos presentes en los sueros de los pacientes. La unio´n se revela cuando se adiciona un anticuerpo anti-Fc humana conjugado con una enzima. Al agregar el sustrato de la enzima cambia de color el medio.
cuando se hacen pasar por un detector de fluorescencia, las microesferas que contienen los complejos antı´geno-anticuerpoestreptavidina-PE, el colorante de las microesferas y la PE se excitan por haces de luz de longitudes de onda de 635 y 488 nm respectivamente. La luz del la´ser que pasa por el filtro de longitud de onda de 635 nm excita al fluoro´foro de la microesfera, lo que permite la identificacio´n de los antı´genos y el la´ser que pasa por el filtro de 488 nm excita a la PE conjugada con estreptavidina, permitiendo la deteccio´n de la cantidad de anticuerpo especı´fico presente en la muestra del paciente (fig. 5)2,4.
Electroinmunotrasferencia La EIT, junto con el ELISA y el ELM son las te´cnicas de mayor sensibilidad y especificidad para la deteccio´n de anticuerpos contra antı´genos especı´ficos; sin embargo, la EIT tiene la desventaja de ser cualitativa o semicuantitativa. Se fundamenta en el reconocimiento de anticuerpos que tienen especificidad por antı´genos que se absorben en una membrana (de nitrocelulosa o nylon). Los antı´genos adsorbidos en la membrana fueron previamente separados en geles de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) y transferidos a las membranas. La unio´n de los anticuerpos a los antı´genos especı´ficos se detecta mediante la adicio´n de un anticuerpo que reconoce la regio´n Fc de las inmunoglobulinas humanas, el cual esta´ acoplado a una enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa). La unio´n se revela con la adicio´n de un sustrato-cromoge´nico soluble (alfa-naftol/Fast red o NBT/ BCIP [cloruro de azul de tretrasodio/sal de toluidina de 5-bromo-4cloro-3-indolfosfato], para cada enzima, respectivamente) el cual se precipita en el sitio en donde se encuentra el complejo antı´genoanticuerpo por la accio´n de la enzima. La EIT es una te´cnica accesible y de fa´cil interpretacio´n ya que no requiere de ningu´n instrumento para su lectura, pues se hace de forma visual6.
Nanoensayo luminome´trico mu´ltiple El nanoensayo luminome´trico mu´ltiple (NALIA) es uno de los me´todos de deteccio´n mu´ltiple de reciente desarrollo. Permite
Perlas recubiertas con el antígeno
Incubación con el suero de pacientes
Láser rojo de lectura de perlas Láser verde de lectura de antígeno
Incubación con el anticuerpo de detección conjugado con biotina
Incubación con el conjugado estreptavidina-fluoroforo
Figura 5. Ensayo luminome´trico mu´ltiple. Las microesferas recubiertas con antı´genos especı´ficos son reconocidas por los anticuerpos presentes en el suero de pacientes. La interaccio´n antı´geno-anticuerpo se revela por la formacio´n de un complejo anticuerpo anti-Fc humana-estreptavidina-PE el cual al pasar por el detector del equipo de luminometrı´a es excitado por un la´ser que pasa por 2 filtros: uno de 635 nm, que permite discriminar entre perlas y otro de 488 nm, que permite cuantificar la intensidad media de fluorescencia, es decir, la unio´n de los anticuerpos del paciente al antı´geno.
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de un instrumento lector y de un programa de computadora para su interpretacio´n (fig. 6). Conclusiones
La IFI es una te´cnica de tamizado inicial que, de acuerdo a los
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1 La 2 Ro 3 PCNA 4 dsDNA 5 U1-anRNP + Blotin-HSA
6 SM 7 Jo 8 Scl70 9 CENP-B 10 Sm-RNP -Buffer
sustratos utilizados (ce´lulas HEp-2, neutro´filos o tejidos) permite identificar los posibles antı´genos reconocidos por los autoanticuerpos presentes en los sueros de los pacientes con enfermedades autoinmunes. Entre las te´cnicas inmunolo´gicas que apoyan al diagno´stico de las enfermedades autoinmunes se cuenta la IFI, el ELISA, la EIT y los ensayos mu´ltiples (ELM y NALIA). El ELISA, la EIT y los ELM son pruebas confirmatorias de la reactividad de los anticuerpos presentes en las muestras de pacientes. Su sensibilidad y especificidad son mayores comparadas con las pruebas de tamizado inicial.
Conflicto de intereses Figura 6. Imagen que muestra una placa del nanoensayo luminome´trico mu´ltiple o NALIA (parte superior). En la parte inferior de la imagen se esquematiza un pozo; como se puede ver cada pozo contiene 10 antı´genos y 2 controles por duplicado. Los antı´genos se muestran en la parte inferior derecha de la imagen. Los controles, localizados en la parte media del pozo son: amortiguador o buffer (control negativo) y albu´mina se´rica humana unida a biotina (Biotin-HSA, control positivo del sistema). McBride, 2008.
identificar la reactividad simulta´nea contra 10 autoantı´genos. Es una te´cnica que deriva de la EIT y se fundamenta en el ˜ as cantireconocimiento de autoantı´genos adsorbidos en pequen dades o puntos, en placas de 96 pozos de ELISA con fondo de membrana de nitrocelulosa. El complejo antı´geno-anticuerpos se detecta por medio de un segundo anticuerpo que reconoce la regio´n Fc de las inmunoglobulinas humanas, el cual esta conjugado con un fluoro´foro. La reactividad se mide por medio de un analizador de ima´genes5. La te´cnica es cualitativa y requiere
Los autores declaran no tener ningu´n conflicto de intereses. Bibliografı´a 1. Aarden LA, de Groot ER, Felkamp TEW. Immunology of DNA III. Crithidia luciliae a sample substrate for the detection of anti-ds DNA with immunofluorescence techniques. Ann NY Acad Sci, 1985;254:505–15. 2. Binder SR. Autoantibody detection using mu´ltiplex technologies. Lupus. 2006;15:412–21. 3. Engvall E, Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin. G Immunochem. 1971;8:871–4. 4. Fritzler MJ. Advances and applications of multiplexes diagno´stic technologies in autoinmune diseases. Lupus. 2006;15:422–7. 5. McBride JD, Guy F, Fordham J, Kolind T, Ba´rcenas-Morales G, Isenberg DA, et al. Screening Autoantibody Profiles in Systemic Rheumatic Disease with a Diagnostic Protein Microarray That Uses a Filtration-Assisted Nanodot Array Luminometric Immunoassay (NALIA). Clin Chem. 2008;54:883–90. 6. Neal W. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 1981;112:195–203.
