Revista Colombiana de Biotecnología Universidad Nacional de Colombia
[email protected]
ISSN (Versión impresa): 0123-3475 ISSN (Versión en línea): 1909-8758 COLOMBIA
2003 Nubia Amparo Ruiz Suárez / Henry Godoy Silva / Alejandro Giraldo / Fabio A. Aristizabal TAMIZAJE CITOGENÉTICO Y MOLECULAR DE LA FAMILIA DEL GEN DAZ EN UNA POBLACIÓN DE HOMBRES INFÉRTILES Revista Colombiana de Biotecnología, julio, año/vol. V, número 001 Universidad Nacional de Colombia Bogotá, Colombia pp. 96-100
Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal Universidad Autónoma del Estado de México http://redalyc.uaemex.mx
Tamizaje citogenético y molecular de la familia del gen DAZ en una población de hombres infértiles Cytogenetic and molecular screening of the DAZ gene family in a population of infertile males Nubia Amparo Ruiz Suárez Alejandro
*,
Henry Godoy Silva *,
Giraldo**, Fabio A. Aristizabal
***.
RESUMEN El propósito de este estudio fue evaluar la frecuencia de alteraciones genéticas cromosómicas numéricas y estructurales, junto con las microdeleciones del gen DAZ en el cromosoma Y de una población de pacientes infértiles; hasta ahora se ha establecido la presencia de anormalidades genéticas en el 24% de los hombres que presentan alteraciones espermáticas severas (Dohle etal. 2002),la deleción de la familia de genes DAZ (Deletec in Azoospermia) es la causa más común; se ha encontrado en el 6% de las oligozoospermias y el 12% de las azoospermias (Van Landuyt et al. 2000).Se estudió una población de 20 pacientes azoospérmicos y 10 oligozoospérmicos empleando como controles 5 hombres con semen normal, a cada muestra se le efectuó análisis cromosómico por banda QFQ y molecular por amplificación de sY254, sY255 y sY257. Al realizar el estudio genético se encontró alteraciones en el 16.6% de los casos, un 6.6% a nivel cromosómico y un 10% a nivel molecular. No se observó ninguna alteración cromosómica ni molecular en las muestras control. Las frecuencias encontradas conducen a una ampliación de la población en estudio y a ratificar la necesidad de realizar un prediagnóstico y asesoría genética a las parejas infértiles con el fin de evitar la propagación de los defectos y brindar un mejor pronóstico de los procedimientos de reproducción asistida. Palabras clave: azoospermia,
oligozoospermia,
microdeleciones,
ICSI
ABSTRACT The purpose of this study was to evaluate the frequency of Y chromosome structural, numerical, chromosomal and genetic abnormalities, as well as DAZ gene microdeletions in the Y chromosome in a population of infertile males. Genetic abnormalities have been established to date in up to 24% of males having severe abnormalities in their sperm (Dohle et al. 2002); deletion of the DAZ gene family (deleted in azoospermia) is the most common cause. It has been found in 6% of the oligozoospermias and in 12% of the azoospermias (VanLanduyt et al. 2000).A population of 20 azoospermic and 10 oligozoospermic males was studied. Five males having normal sperm parameters were used as controls. Each sample was karyotyped (QFQ banding) and underwent sY254, sY255 and sY257 molecular amplification. Genetic study revealed alterations in 16.6% of the cases: 6.6% at chromosome level and 10% at molecule level. No chromosomal or molecular gene alterations were detected in control males. The frequencies found lead to a broader population-based study being recommended. They confirmed the need for performing judicious genetic counselling in infertile couples with male factor infertility to avoid or minimise the risks of transmitting these abnormalities to offspring and provide better prognosis for assisted reproductive techniques in such patients. Key words: azoospermia,
oligozoospermia,
microdeletions,
ICSI
Estudiante posgrado genética humana, Instituto de Genética, Facultad de Medicina Posgrado genética humana, Instituto de Genética, Facultad de Medicina. e-mail:
[email protected] Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Instituto de Biotecnología Universidad Nacional de Colombia. Carrera 30-Calle 45, A.A. 14490, Bogotá D.C. e-mail:
[email protected]
Recibido:
96
julio 26 de 2002. Aceptado: mayo 16 de 2003.
TAMIZAJE CITOGENÉTICO
y MOLECULAR DE LA FAMILIA DEL GEN DAZ EN UNA POBLACIÓN DE HOMBRES INFÉRTILES
INTRODUCCiÓN
MATERIALES
Se define la infertilidad como la incapacidad de lograr una gestación durante un periodo de dos años de relaciones sexuales sin el empleo de ninguna medida anticonceptiva. Los problemas de infertilidad afectan a113% de las parejas en edad fértil (Van Landuyt et al. 2000) y en el 60% de los casos se involucra el factor masculino. El 20% de los casos en los que participa el factor masculino son los que presentan oligozoospermia (disminución del recuento espermático) o azoospermia (ausencia de espermatozoides en el eyaculado) (Diemer, Desjardins 1999).
Los pacientes incluidos en este estudio fueron remitidos de diferentes programas de Reproducción Asistida del país. Se estudió una población de 20 pacientes con diagnóstico de azoospermia y 10 afectados por oligozoospermia, empleando como control las muestras de 5 hombres normozoospermicos y se realizó la evaluación del semen con base en los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS 1994). Los pacientes con causa conocida de su infertilidad como azoospermia obstructiva, agenesia de vasos deferentes, seminoma, parotiditis, criptorquidia, varicocele, exposición a tóxicos, radiación u otros traumas no fueron incluidos en el estudio. Todos los pacientes firmaron un consentimiento para su inclusión en el estudio después de haber conocido y entendido la finalidad la investigación.
Se ha establecido la presencia de anormalidades genéticas en el 24% de los hombres con oligozoospermia extrema y azoospermia (Dohle et al. 2002), éstas incluyen las aberraciones cromosómicas tanto numéricas como estructurales, las microdeleciones en el cromosoma Y (Diemer et al. 1999), y mutaciones en el gen CFTR de la fibrosis cística (Dohle et al. 2002). Las alteraciones cromosomicas se han encontrado con mayor frecuencia en los individuos que presentan parámetros anormales en la calidad de su semen que en la población general según algunos autores (Vegetti 2000; Colombero 1999; Chandley 1997), aunque en otros trabajos no se ha establecido esta relación (Miharu et al. 1994; Martín y Radamer, 1999). También se han encontrado anormalidades cromosómicas en células de línea germinal en personas con cariotipos de sangre periférica normales y asociadas con una tendencia incrementada a presentar no disyunción durante la espermatogénesis (Moosani et al. 1995). La deleción de la familia de genes DAZ en Yq11 es la causa molecular más frecuente de la infertilidad masculina; se ha encontrado en el 6% de las oligozoospermias y el 12% de las azoospermias (Van Landuyt et al. 2000). Para el tratamiento de la infertilidad la técnica más moderna es ellCSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides) (Palermo et al. 1992) en el cual se selecciona entre los pocos espermatozoides presentes en el eyaculado, en el tejido testicular o el epidídimo, un solo espermatozoide para ser introducido directamente en el interior del citoplasma del oocito (Steirteghem et al. 1994) evitando así su paso por las barreras de la selección natural (Danan et al. 1999); el empleo de ICSI ha permitido la transmisión de defectos genéticos de los padres a sus descendientes, sin que esas personas tuviesen conocimiento previo de dicho riesgo, condición que podría evitarse mediante el diagnostico molecular (page et al. 1999).
Y MÉTODOS
El análisis cromosómico se realizó a partir de linfocitos de sangre periférica con elaboración de bandas QFQ con quinacrina acorde con las técnicas estandarizadas en la Universidad Nacional de Colombia, observando un mínimo de 10 metafases y un máximo de 20 en cada caso. Se extrajo ADN genómico a partir de los leucocitos de sangre periférica, por el método de Salting Out estandarizado en la Fundación Arthur Stanley Gillow. Se realizó la amplificación por PCR de la región de genes DAZ con los STS: sY254, en los pacientes que se determinó la presencia de la deleción de este STS se realizó la amplificación de sY255 y sY257 como fue descrito por Reijo (1996). Los productos amplificados fueron visual izados por coloración con bromuro de etidio en gel de poliacrilamida al 12%. Se determinó la microdeleción de los segmentos cuando no hubo amplificación de los marcadores al realizar tres PCR consecutivas. Como control positivo de la amplificación se empleó ADN de hombres normozoospérmicos y como control negativo ADN de mujer.
RESULTADOS Al realizar el estudio cromosómico en 2 de los 20 pacientes azoospérmicos se diagnosticó la aberración cromosómica numérica 47,XXY compatible con el Síndrome de Klinefelter. No se observó ninguna alteración cromosómica en los pacientes con oligozoospermia ni en las muestras control (Tabla 1).
97
REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA Vol. V
N° 1 Julio 2003
DISCUSiÓN
Tabla 1. Alteraciones cromosómicas encontradas en 30 hombres infértiles.
Azoospérmicos
(20)
Alteraciones (Casos) (2)
Oligozoospérmicos
(10)
(O)
O
Total
(30)
(2)
6.6
(5)
Alteraciones (O)
Pacientes (Casos)
Clasificación
Controles Normozoospérmicos
Cromosómicas %
10
Cromosómicas O
En la evaluación molecular de los 30 pacientes incluidos se detectó la microdeleción de Yq11 en tres pacientes, 2 con diagnóstico de azoospermia (Figura 1) Y uno con oligozoospermia severa. En ninguno de los hombres control se encontró la microdeleción (Tabla 2). Tabla 2. Presencia de la deleción del gen DAZ en 30 hombres infértiles
Pacientes Clasificación Azoospérmicos
Deleciones del gen DAZ (Casos) % (2) 10 (1) 10 (3) 10
(Casos) (20)
Oligozoospérmicos
(10)
Total
(30)
Deleciones del gen DAZ
Controles Normozoospérmicos
(5)
(O)
O
El propósito de este estudio fue evaluar la frecuencia de alteraciones genéticas en una población de pacientes infértiles a nivel cromosómico, mediante la obtención y análisis de los cariotipos y a nivel molecular determinando la presencia de deleciones del gen DAZ, mediante la amplificación por PCR de los STS: sY254, sY255 y sY257. Se encontró alguna alteración genética en el 20% de los pacientes azoospérmicos y en el 10% de los pacientes oligozoospérmicos sin evidenciar alteraciones genéticas en los controles; en total se determinó una causa genética para la infertilidad en el 16.6% de los casos estudiados (Tabla 3). Tabla 3. Sumario de las alteraciones cromosomicas y deleciones de gen DAZ encontradas en 30 hombres infértiles. Pacientes (Casos) Clasificación (20) Azoospérmicos (10) Oligozoospérmicos (30) Total Controles (5) Normozoospérmicos
98
Alteraciones Cromosómicas (Casos) % (2) 10 (O) O (2) 6.6 (O)
O
96 - 100
Deleciones del gen DAZ (Casos) % (2) 10 (1) 10 (3) 10 (O)
O
I %
Total 20 10 16,6 O
Las frecuencias de las alteraciones genéticas encontradas en esta población superan las reportadas en la literatura, en el análisis cromosómico y en las deleciones del gen DAZ (Van Layout et al. 2000) lo cual puede ser inducido por el reducido tamaño de la población, por lo cual en este momento se recomienda realizar la determinación a una muestra de mayor tamaño. Otro factor que puede generar variación en los resultados es que se han modificado, para cada trabajo reportado, tanto los criterios de inclusión como los parámetros de clasificación aplicados a la muestra. También son afectados los resultados por el empleo de marcadores de diferentes posiciones en el cromosoma Y. En este estudio se utilizaron técnicas de electroforesis cotidianas que requieren de repetición de la determinación para confirmar los resultados negativos por no incluir control interno genómico. Por otro lado, si se utilizan otras técnicas se podría complementar el estudio determinando no sólo la presencia del gen asociado con la infertilidad, sino definir si la cantidad de copias presentes de la familia de genes en estos pacientes es la esperada o determinar si los diferentes fenotipos de estos pacientes se asocian con el número de genes DAZ presentes cuando se presenta una deleción parcial de algunas copias del gen (De Vries et al. 2002; Bienvenu et al. 2001). Cuando se emplea ellCSI en pacientes infértiles hay que tener en cuenta cuatro argumentos demostrados: 1. aumento de las frecuencias de alteraciones genéticas de los pacientes infértiles; 2. transmisión mediante el empleo de esta técnica de los defectos del cromosoma Y del padre a los hijos (Jeremias et al. 1996); 3. asociación establecida entre la presencia de las microdeleciones con la disminución en las tasas de fertilización y la baja cali-
TAMIZAJE CITOGENÉTICO Y MOLECULAR DE LA FAMILIA DEL GEN DAZ EN UNA POBLACIÓN DE HOMBRES INFÉRTILES
dad embrionaria del procedimiento (Scholtes et al. 1998) y 4. la reducción progresiva del número de espermatozoides demostrada en algunos individuos (Bienvenu etal., 2001). Estos argumentos muestran la necesidad de realizar un prediagnóstico y asesoría genética a las parejas infértiles para evitar la propagación de los defectos y brindar un mejor pronóstico de los resultados esperados en el procedimiento.
Dañan C, Damien S, Van Steirtegghem A, Cazenueve C, Duquesnoy, Besmond C, Goossens M, Lissens W, Amselem S. 1999. Evaluation of parental mitochondrial inheritance in neonates born after intracytoplasmatic sperm injection. Am. J. Hum. Genet. 65:463-473. De Vries JWA., Hoffer MJV., Reppings., Hoovers JMN., Leschot NJ., Van Der Ver F. 2002. Reduced copy number of DAZ genes in subfertile and infertile men. Fértil Steril. 77(1):68-75 Diemer T, Desjardins C. 1999. Developmental and genetic disorders in spermatogenesis. Hum Reprod. 5; 120-140 Dohle Gr., Halley DJJ., Van Hemel Jo.,Van Der Ouweland AMW., Pleters MHE.5 Weber RFA., Govaerts LCP. 2002. Genetic risk factors in infertile men with severe oligozoospermia and azoospermia. Hum Reprod. 17; 13-16.
Figura 1. Se muestra la Amplificación del STS sY254 para algunos de los hombres azoospermicos en estudio Línea 1: Control negativo, Línea 2: Control mujer, Línea 3,4,5,7: Hombres sin la deleción, Línea 6,8: Hombres con la deleción, Línea 9: Control hombre, Línea 9: Marcador.
AGRADECIMIENTOS Fundación Arthur Stanley Gillow, Instituto de Genética Universidad Nacional de Colombia
BIBLIOGRAFÍA Bienvenu T., Patrat C., Me Elreaver Y K., Almeida M., Jouannet P. 2001. Reduction in the DAZ gene copy number in two infertile men with impaired spermatogenesis. Ann Genet 44(3):125-128 Chandley AC. 1997 The chromosomal bases of human infertility. Br Med Bul!. 35:11-6 Colombero LT, Hariprashad JJ, .Ming C. 1999. Incidence of sperm aneuploidy in relation to semen characteristics and assisted reproductivo outcome. Fértil. Steril. 72(1): 90-96.
Jeremías J, Wiitkin S. 1996. Molecular approaches to the diagnosis of male infertility. Mol. Hum. Reprod. 2; 198-202. Martin RH, Rademaker AW. 1999. Nondisjunction in human sperm: comparison of frequencies in acrocentric chromosomes Cytogenet Cell Genet. 86(1):43-55 Miharu N, Best RG, Young SR. 1994. Numerical chromosome abnormalities in spermatozoa of fertile and infertile men detected by fluorescence in situ hybridization. Hum Genet. 93(5):502-6. Moosani N, Pattinson HA, Cárter MD, COX DM, Rademaker AW, Martin RH. 1995. Chromosomal analysis of sperm from men with idiopathic infertility using sperm karyotyping and fluorescence in situ hybridization. Fértil Steril. 64(4):811-7. OMS 1994 Manual de laboratorio para el examen de semen humano y de la interacción entre el semen y el moco cervical. Panamericana. Page DC., Silber S., Brown LG. 1999. Men with infertility caused by AZFc deletion can produce sons by ICSI, but are likely to transmit the deletion and infertility. Hum. Reprod. 14( 7)17221726
99
REVISTA COLOMBIANA
DE BIOTECNOLOGÍA
Vol. V
N° 1 Julio 2003
Van Golde RJ, Wetzels AM, De Graaf R, Tuerlíngs JH, Braat DO, Kremer JA. 2001. Decreased fertilization rate and embryo quality after ICSI in oligozoospermic men with microdeletions in the azoospermia factor c regíon of the Y chromosome. Hum Reprod. 16(2):289-92.
Palermo G, Joris H, Devorey P, Van Stteirtrghrm AC. 1992 Pregnancies after intracytoplasmic injection of a single spermatozoon into an oocyte. Lancet. 340: 17-18. Reijo R, Alagappan RK, Patrizio P, page D. 1996. Severe oligospermia resulting from deletions of azoospermia factor gene on Y chromosome. Lancet. 347: 1290-1293.
Van Landuyt L, Lissens W, Stouffs K, Tournaye H, Liebaers 1, Van Steirteghem A. 2000. Validation of a simple Yq deletion screening program in an ICSI candidate population. Mol. Hum. Reprod. 6:291-297.
Scholtes MC, Behrend C, Dietzet DJ, Hoogstraten DG, Marx K, Wohlers S, Verhoevenh, Zeilmmaker GH. 1998. Chromosomal aberrations in couples undergoing intracytoplasmic sperm injection: influence on implantation and ongoing pregnancy rates. Fertil. Steril. 70(5)933937.
Vegetti W, Van Assche E, Frias A, Verheyen G, Bianchi M, Bonduelle M, Liebaers 1, Van Steirteghem A. 2000. Correlation between semen parameters and sperm aneuploidy rates investigated by fluorescence in-situ hybridizatiion in infertile men. Hum. Reprod. 15(2):351-365.
Steirteghem A, Joris H, Jiaen L, Zsolt P, Geertrui B, Vakele A, Desmet B, Van Rans H. 1994. IntraCytoplasmic Sperm Injection. Serono
LA REVISTA
96 - 100
COLOMBIANA
DE BIOTECNOLOGíA
felicita al INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA IBUN O
I
por la conmemoración
de sus 15 años de creación
1987
2002
y a la profesora María Consuelo Díaz - Baez Directora del Posgrado Interfacultades
en Microbiología UN
Por el título recibido en mayo de 2003 como:
Doctor of Applied Sciences Honoris Causa Del Royal Melbourne
Institute
of Technology
Australia
100
- RMIT University
