Síntesis y aplicación de materiales nanoestructurados para el estudio de muestras biológicas por métodos espectroscópicos

[Ide@s CONCYTEG 7 (87), Septiembre, 2012] ISSN: 2007-2716

Como citar: Martínez-Espinosa J.C., Amtanus-Chequer N., Funes-Oliva L., González-Solís J.L. , Palomares Anda P. (2012), “Síntesis y aplicación de materiales nanoestructurados para el estudio de muestras biológicas por métodos espectroscópicos”, Ide@s CONCYTEG, 7 (87), 1113 – 1126 pp.

Síntesis y aplicación de materiales nanoestructurados para el estudio de muestras biológicas por métodos espectroscópicos Juan Carlos Martínez-Espinosa1, Nayem Amtanus-Chequer2, Luis FunesOliva3, José Luis González-Solís4 , Pascual Palomares Anda5

Resumen El uso de materiales nanoestructurados como la plata (Ag) y el oro (Au) ha tomado fuerza en los últimos años en el área biomédica, aplicaciones recientes tales como la detección de componentes en células vivas, específicamente para estudiar la interacción de diversos fármacos antitumorales, la detección de genes que tienen relación estrecha con el algún tipo de cáncer, así como la detección de biomarcadores proteínicos para el cáncer se han estado estudiando en diferentes laboratorios de investigación a nivel Mundial. En este trabajo de investigación con resultados preliminares se aplicaron nanopartículas de plata de 80 nm para amplificar la señal Raman de una muestra de plasma sanguínea de un paciente con leucemia linfocítica aguda (LLA), se observaron intensidades amplificadas con respecto a una muestra sin nanopartículas. Se utilizó un equipo de espectroscopia Raman Horiba Jovin Ivon HR800 con una resolución de 0.6 cm-1 para la toma de espectros del plasma sanguíneo con y sin nanopartículas de Ag. Así también nanopartículas de Au fueron funcionalizadas con albúmina de suero bovino (BSA), observando incremento en la absorbancia en el intervalo de 525 a 565 nm, los cuales se atribuyen a las concentraciones con BSA.

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Ide@s CONCYTEG 7 (87), Septiembre, 2012 ISSN: 2007-2716

Para la obtención de espectros de nanopartículas con BSA fue utilizado un espectrómetro UV-VIS Jenway modelo 6715 con una resolución de 0.1 nm.

Palabras clave: Espectroscopia Raman de superficie amplificada (SERS), nanopartículas metálicas, proteínas, plasma sanguíneo.

Summary The use of nanostructured materials such as silver (Ag) and gold (Au) has gained strength in recent years in the biomedical area, recent applications such as detection of components in living cells, specifically to study the interaction of various antitumor drugs, detection of genes that have close relationship with certain cancers, and detection of protein biomarkers for cancer are being studied in several research laboratories around the world. In this research work with preliminary results were applied silver nanoparticles of 80 nm to enhancement the Raman signal of a blood plasma sample from a patient with acute lymphocytic leukemia (ALL), surface enhancement of Raman intensities were observed with respect to a sample without Ag nanoparticles. We used Horiba Raman spectroscopy equipment Jovin Ivon HR800 with a 0.6 cm-1 of resolution for taking blood plasma spectra with and without Ag nanoparticles. Au nanoparticles were also functionalized with bovine serum albumin (BSA), observing an increase in absorbance in the range from 525 to 565 nm, which are attributed to the BSA concentrations. To obtain the nanoparticles spectra with BSA was used Jenway UV-VIS spectrometer model 6715 with a resolution of 0.1 nm. Keywords: Amplified surface Raman Spectroscopy (SERS), metallic nanoparticles, proteins, blood plasma.

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[Ide@s CONCYTEG 7 (87), Septiembre, 2012] ISSN: 2007-2716

Como citar: Martínez-Espinosa J.C., Amtanus-Chequer N., Funes-Oliva L., González-Solís J.L. , Palomares Anda P. (2012), “Síntesis y aplicación de materiales nanoestructurados para el estudio de muestras biológicas por métodos espectroscópicos”, Ide@s CONCYTEG, 7 (87), 1113 – 1126 pp.

metálicos que se emplean con fines de

Introducción

investigación (Mandal et al., 2006). Entre las

L

a nanotecnología es un área que ha crecido exponencialmente en los últimos años y ha atraído la

atención

de

investigadores

de

herramienta de suma importancia para el desarrollo de este campo son la síntesis, y

funcionalización

de

nanopartículas (NPs), que son materiales que miden menos de 100 nm de diámetro (Maynard y Kuempel, 2005). Entre algunas de las propiedades más interesantes que presentan

las

NPs

son

las

ópticas,

electrónicas, magnéticas y catalíticas, mismas que dependen directamente de la forma, tamaño y vía de síntesis (Won-Mi et al., 2003; Zhou et al., 2009).

limitan la aplicación de nanopartículas a experimentos, por ejemplo el alto costo que presentan en el mercado. Debido a esta situación se han optado por probar diversos mecanismos de síntesis, entre los más los

químicos,

titanio, gadolinio y plata.

Biocompatibilidad y funcionalización Si bien las nanopartículas metálicas son utilizadas con fines de marcaje, diagnóstico y tratamiento de enfermedades como el cáncer (Asharani et al., 2010a), nos falta realizar más investigaciones sobre el campo de la nanotoxicología que involucre aspectos de citotoxicidad e impacto ambiental. En años recientes se han logrado algunos avances en este campo, Asharani et al., 2010b realizaron estudios

sobre

la

biocompatibilidad

de

nanopartículas de oro, plata y platino

Sin embargo existen cuestiones que

comunes

biomédicas se encuentran el oro, platino,

diversos

campos (López-Lorente et al., 2011). Una

purificación

nanopartículas más utilizadas en las ramas

físicos

y

recientemente los biológicos.

aplicadas a eritrocitos humanos. En estos trabajos concluyen que los materiales que presentan una mayor biocompatibilidad son las nanopartículas de oro, mientras que las más citotóxicas fueron las nanopartículas de plata, causando lisis, hemaglutinación, daño de la membrana celular, distorsión del citoesqueleto y por ende afectación de la forma. Aunado a lo anterior plantean una

La biosíntesis de nanomateriales es una vía que se ha explorado en la actualidad, pues existen

algunos

microorganismos

como

relación directa entre la concentración de nanopartículas de plata (100 µg/mL) y los efectos que se generan.

bacterias y hongos que producen materiales 1115

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En efecto las nanopartículas de oro son las más utilizadas en el área biomédica, estos

enfriamiento a temperatura ambiente (Kimling et al., 2006).

nanomateriales pueden recubrirse de un sinfín de moléculas y son una herramienta muy útil en la investigación de enfermedades muy específicas.

Entre

las

moléculas

más

utilizadas como recubrimiento se encuentran: fármacos, ADN, anticuerpos, proteínas, entre

El método por etanol - ácido linoleico, consiste la reducción de un coloide del metal requerido, agregando etanol y ácido linoleico, seguido de una agitación y calentamiento a temperaturas de entre 80

muchas otras.

y 100°C durante un periodo de 6 h. El etanol presente en la mezcla realiza la

Síntesis de nanomateriales

función de reducir los iones del metal a Los métodos químicos se basan en la

nanopartículas, después del proceso de

reducción química de sales metálicas, dentro

reducción el ácido linoleico se adsorbe en

de

de

la superficie de las nanopartículas con las

reducción por citrato de sodio (figura 1),

cadenas presentes de alquilo, una vez

etanol-ácido linoleico, entre otros agentes

terminado el proceso las nanopartículas

reductores.

son recuperadas en el fondo del recipiente

estos

métodos

encontramos

al

que contiene la mezcla una vez que se El método de reducción por citrato de

llegó a la temperatura ambiente y se

sodio, consta en hacer reducir la sal del

resuspenden en cloroformo, la aparición

metal requerido solubilizada en agua

de un color rojizo indica el término de la

desionizada, seguido de calentamiento

reducción del metal a nanopartículas (Das

hasta punto de ebullición, posteriormente

et al., 2009).

se agrega la solución del agente reductor (citrato de sodio al 5%) y se continua calentando hasta que la mezcla presente un cambio de tonalidad a un color purpura, lo que indica el término de la reacción, y se retira el calentamiento, seguido de una agitación vigorosa y

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“Síntesis y aplicación de materiales nanoestructurados para el estudio de muestras biológicas por métodos espectroscópicos” Martínez-Espinosa J.C., Amtanus-Chequer N., Funes-Oliva L., González-Solís J.L. , Palomares Anda P.

pueden producir extra o intracelularmente, además

de

emplear

bacterias,

también

podemos emplear células humanas para la producción de nanopartículas, así los hongos son potenciales microorganismos para la producción de nanopartículas, siendo que las mayoría de estos las producen de forma extracelular, dentro de estos encontramos a Colletotrichum o Aspergillus fumigatus, los cuales producen nanopartículas de plata, otro microorganismo empelado para la producción de nanopartículas de plata es el hongo Penicillium (Sadowski et al., 2008). Figura 1. Formación de nanoestructuras metálicas por método de reducción de sal (Bönnemann y Richards, 2001).

Por otro lado para la producción de nanopartículas de oro se emplea el hongo Cylindrocladium floridanum donde el hongo

Sin

embargo

no

solo

los

métodos

químicos son utilizados para la producción de nanopartículas

metálicas,

también

encontramos los métodos biológicos, los cuales utilizan, organismos como bacterias, hongos y plantas, para la producción. Se han registrado una gran cantidad de cepas productoras de nanomateriales, en el caso de las bacterias encontramos a Pseudomonas strutzeri la cual produce nanopartículas de plata a partir de la reducción de iones de plata, obteniendo un tamaño de partícula en un rango de 16 a 40 nm. Algunas otras bacterias además de reducir plata, reducen magnetita, también para la producción de nanopartículas, la principal característica de

es crecido en medio de cultivo MGYP, bajo las condiciones de 30 °C de temperatura, 180 rpm de agitación, durante un periodo de 72 h, una vez que el periodo se cumple, se separa la biomasa del medio de cultivo, empleado centrifugación a 5000 rpm, por 5 min. Una vez que se tiene la biomasa se resuspenden en la sal del metal a reducir en este caso ácido tetracloroaurico y se incuba a 30 °C durante 7

días,

así

como

las

nanopartículas

sintetizadas por métodos químicos necesitan ser caracterizadas, también las sintetizadas por vía biológica requiere la caracterización de las misma empleando las mismas técnicas antes mencionadas (Narayanan y Sakthivel, 2011).

utilizar bacterias es que las nanopartículas se 1117

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Así

mismo

la

planta

Pelargonium

graveolens tiene la capacidad de reducir el

estado intermedio entre un simple átomo y un material compacto (Sanchez, 2004).

cloruro de oro a nanopartículas de oro, se utilizan las hojas finamente cortadas y

La plata y el oro son de los metales en

lavadas, se mezclan las hojas con 100 mL de

escalas nanométricas que actualmente se

agua destilada agitando por 1 min. Una vez

aplican en áreas de la biomedicina. La

finalizado la mezcla se decanta y se filtra, a

propiedad antimicrobiana

una parte del filtrado se le agrega 100 mL del

relacionada con la concentración de plata, así

ácido tetracloroaurico. Cierta ventaja que

como la razón de plata liberada. La plata en

posee esta planta es que presenta el

su estado metálico es inerte pero reacciona en

crecimiento del hongo Colletotrichum sp.,

la piel debido a su humedad. Por otra parte el

que como ya se mencionó anteriormente

fluido de una herida causa ionización del

también es utilizado para la producción de

metal. La plata ionizada es altamente

nanopartículas (Shankar et al., 2003).

reactiva, ya que se une a las proteínas del

de

plata

está

tejido y trae cambios estructurales en la pared celular bacteriana y la membrana nuclear que

Estudio de muestras biológicas mediante nanomateriales y espectroscopia Raman

lleva a la distorsión y la muerte celular. La plata también se une al ADN y ARN bacteriano mediante la desnaturalización e inhibe la replicación bacteriana (Landsdown,

Los sistemas coloides poseen propiedades ópticas derivadas del tamaño de las partículas en suspensión, como es la propiedad de dispersar la luz incidente por sucesivas reflexiones y refracciones, tal efecto se conoce como efecto Tyndall. Los coloides metálicos

particularmente

propiedades

ópticas

presentan

específicas

de

su

naturaleza metálica. Sin embargo, en algunos aspectos, pueden diferir respecto a las de los metales,

entendidos

como

materiales

compactos. En realidad, las nanopartículas

2002; Castellano et al., 2007). Por su parte los materiales nanoestructurados de oro coloidal han sido ampliamente utilizados como

sustratos

para

detección

de

componentes en células vivas, especialmente para estudiar la interacción de diversos fármacos antitumorales (Nabiev et al., 1991). Otros estudios incluyen la detección de genes relacionados con el algún tipo de cáncer y la detección de biomarcadores proteínicos para el cáncer (Vo-Dinh et al., 2002; Ansari et al., 2005).

metálicas pueden ser consideradas como un

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“Síntesis y aplicación de materiales nanoestructurados para el estudio de muestras biológicas por métodos espectroscópicos” Martínez-Espinosa J.C., Amtanus-Chequer N., Funes-Oliva L., González-Solís J.L. , Palomares Anda P.

Herramientas

análisis

Chilkoti, 2004; Zhao et al., 2004; Orendorff

permiten la identificación y caracterización

et al., 2005; Hu et al., 2006). Recientemente

muy específica de la materia orgánica e

las nanopartículas con diferentes diámetros y

inorgánica con el mínimo esfuerzo para la

formas geométricas se han estado aplicando

preparación

y

en áreas biomédicas para la identificación de

Mayerhöfer, 2009). Una de ellas es la

biomoléculas. SERS ha sido ampliamente

espectroscopia Raman (ER), la cual es una

utilizado

técnica espectroscópica que se basa en la

transducción de señales en la detección

dispersión de luz, tal que permite la

biológica y química, como lo son: análisis de

identificación de moléculas a través de su

pesticidas,

información espectral, la cual se considera

glucosa y residuos nucleares (Bao et al.,

como una huella dactilar molecular.

2003; Grubisha et al., 2003; Shafer-Peltier et

de

modernas

una

de

muestra

(Popp

como

ántrax,

un

mecanismo

antígeno

de

prostático,

al., 2003; Yonzon et al., 2004; Zhang et al., Sin embargo, la sensibilidad de la ER es

2005; Hui et al., 2011). SERS también se ha

bastante baja, lo que significa que resulta

aplicado para la identificación de bacterias y

complicado para utilizarse en análisis de las

en el diagnóstico genético (Culha et al., 2003;

muestras con bajas concentraciones. Una

Jarvis et al., 2004). Por ejemplo trabajos

posible solución a este problema es el uso de

reportados por Christine D. Keating, en

nanoestructuras metálicas o nanopartículas

donde realizan una investigación en un nuevo

para mejorar el efecto Raman que resulta

enfoque para la detección ultrasensible de

intrínsecamente débil.

hibridación de DNA baso en nanopartículas de oro, las cuales tienen una sensibilidad de

Al aplicar nanomateriales y combinar con

103 veces más para el oligonucleótido en

ER se conoce como espectroscopia Raman de

comparación con un caso no amplificado, es

superficie

Surface

decir, sin utilizar nanopartículas de Au (He et

Enhanced Raman Spectroscopy) y la cual

al., 2000). Otro trabajo reportado como el

combina la especificidad de Raman con alta

grupo de Kneipp et al., 2002, en donde llevan

sensibilidad que permite el análisis de las

a cabo mediciones en células, las cuales les

muestras con concentraciones bajas.

fueron depositadas nanopartículas de Au de

La

nanomateriales

60 nm, los resultados demuestran una

aplicados en la biodetección se asocia

amplificación de las intensidades Raman muy

íntimamente a sus propiedades físicas y

significativas.

amplificada

sensibilidad

de

(SERS,

los

químicas, específicamente en su tamaño y forma ( Maxwell et al., 2002; Nath y 1119

Ide@s CONCYTEG 7 (87), Septiembre, 2012 ISSN: 2007-2716

Resultados

preliminares

que

hemos

obtenido al estudiar el plasma sanguíneo de pacientes

con

leucemia,

muestran

la

amplificación considerada de la señal Raman al aplicar coloides de plata

.En la figura 2, podemos observar la amplificación de las señales Raman muy intensa al utilizar nanopartículas de plata de 80 nm. La comparación es utilizando los datos

en

bruto,

además

dicha

Figura 3. Espectro Raman normalizado de una muestra de plasma sanguíneo de LLA con y sin coloides de Ag de 80 nm. Tomado con equipo Horiba Jobyn Yvon HR800.

gráfica

corresponde a la componente de plasma sanguíneo de un paciente con LLA. En donde la relación de plasma sanguíneo-coloide fue 1:1. Para verificar la amplificación de algunas intensidades se normalizaron los espectros para llevar a cabo la comparación, como la podemos observar en la figura 3, aunque es claro que algunos corrimientos se pierden ya que el efecto de las nanopartículas surtió efecto en determinadas biomoléculas.

El estudio de las proteínas plasmáticas ha proporcionado información importante sobre procesos fisiológicos y de enfermedad. En la actualidad y gracias al desarrollo de potentes técnicas bioquímicas y moleculares se han encontrado más de 100 proteínas plasmáticas (tabla 1). Entre ellas la albúmina es la proteína más abundante en el plasma sanguíneo,

puesto

que

presenta

una

concentración de 40 mg/mL (Carter y Ho, 1994), aunado a ello esta proteína tiene funciones demantenimiento del pH (Figge et al., 1991) y transporte de ácidos grasos libres en el plasma.

Figura 2. Espectro Raman sin normalizar de una muestra de plasma sanguíneo de LLA con y sin coloides de Ag de 80 nm. Tomado con equipo Horiba Jobyn Yvon HR800

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“Síntesis y aplicación de materiales nanoestructurados para el estudio de muestras biológicas por métodos espectroscópicos” Martínez-Espinosa J.C., Amtanus-Chequer N., Funes-Oliva L., González-Solís J.L. , Palomares Anda P.

Tabla 1. Proteínas transportadoras importantes en el plasma. Proteína Materiales transportados Transportador primario: ácidos grasos, bilirrubina, drogas. Transportador secundario: hemo, tiroxina, Albúmina cortisol Triglicéridos, fosfolípidos, Apolipoproteínas colesterol Hemo de la hemoglobina Hemopexina plasmática Transferrina Hierro Ceruloplasmina Cobre Prealbúmina Tiroxina, vitamina A Globulina específica de grupo (G) Vitamina D Transcortina Cortisol Transcobalaminas I y II Vitamina B12

Tomado de West, 1995.

Figura 4. Espectros UV-Vis tomados en intervalos de 475-600 nm y su interacción con diferentes concentraciones BSA.

Se estudio la interacción entre la albúmina de suero bovino (BSA) y nanopartículas de oro de 60 nm, se utilizaron dos métodos uno propuesto por Chithrani et al., 2009 y otro que presenta una modificación, pues se sustituye la solución de NaCl al 10% por agua desionizada para la resuspensión del pellet de nanopartículas con BSA (figura 4). Por otra parte se encontró una relación inversa entre la concentración de BSA y la absorbancia por medio de espectrofotometría UV (figura 5), estos resultado coinciden con los publicados por Ravindran et al. 2010 para nanopartículas de plata, además reportan que

Figura 5. Espectro normalizado UV-Vis tomado en intervalos de 475-600 nm y su interacción con diferentes concentraciones BSA.

al añadir diversas concentraciones de BSA a la plata coloidal se da una aglomeración entre ambos componentes.

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Conclusiones Resultados preliminares en plasma sanguíneo

Agradecimientos

con

prometen

Agradecemos a la UPIIG-IPN, al CULagos-

resultados alentadores en un futuro cercano.

UDG y al CETS por el apoyo en este trabajo

El estudio de las proteínas plasmáticas

preliminar de investigación.

nanopartículas

mediante permitirá

de

materiales descartar

plata

nanoestructurados

o

encontrar

nuevas

metodologías para el análisis de plasma sanguíneo para aplicaciones de detección de cáncer. Un estudio en puerta consistirá en analizar las concentraciones de proteínas plasmáticas

en

muestras

de

suero

cancerígenas y muestras de sujetos sanos aplicando la técnica SERS y Western blot.

Por otra parte las propiedades espectrales por absorción de UV-Vis de nanopartículas de oro se observaron muy diferentes de las partículas recubiertas con BSA. Un notable incremento en la absorbancia se observó en el rango de 525-565 nm, los cuales pueden ser atribuidos a los cambios conformacionales del

BSA

sobre

la

interacción

con

nanopartículas de Au. Esto es que a mayores concentraciones

de

BSA,

existe

una

disminución en la intensidad de los espectros de absorción en el plasmon resonante. Finalmente

la

biofuncionalización

de

nanopartículas de Au será esencial para obtener la biocompatibilidad de aplicaciones biomédicas específicas, y en combinación con la técnica de ER para el estudio y tratamiento del cáncer. 1122

“Síntesis y aplicación de materiales nanoestructurados para el estudio de muestras biológicas por métodos espectroscópicos” Martínez-Espinosa J.C., Amtanus-Chequer N., Funes-Oliva L., González-Solís J.L. , Palomares Anda P.

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