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ARTICLE IN PRESS
Med Clin (Barc). 2009;133(17):649–656
www.elsevier.es/medicinaclinica
Original
Sı´ndrome de Prader Willi: estudio de 77 pacientes David Poyatos a,, Cristina Camprubı´ a, Elisabeth Gabau b, Ramo´n Nosas b, Sergi Villatoro b, Marı´a Dolores Coll a y Miriam Guitart b a b
`noma de Barcelona, Barcelona, Espan ˜a Unitat de Biologia Cellular, Facultat de Biocie`ncies, Universitat Auto `ria Parc Taulı´, Institut Universitari Parc Taulı´-UAB, Sabadell, Espan `tica (UDIAT), Centre Diagno `stic i Servei de Pediatria, Hospital de Sabadell, Corporacio ´ Sanita ˜a Laboratori Gene
´ N D E L A R T ´I C U L O INFORMACIO
R E S U M E N
Historia del artı´culo: Recibido el 31 de octubre de 2008 Aceptado el 1 de abril de 2009 On-line el 13 de septiembre de 2009
´n: El Sı´ndrome de Prader-Willi (SPW) es una enfermedad gene´tica que se caracteriza por Introduccio hipotonı´a neonatal, hipogonadismo, hiperfagia que conduce a obesidad, estatura baja, retraso en el desarrollo, retraso mental moderado, alteracio´n del comportamiento y apariencia facial caracterı´stica. Se origina por la pe´rdida o inactivacio´n de genes de expresio´n paterna incluidos en la regio´n 15q11-13 regulada por impronta geno´mica. Existen diferentes causas gene´ticas: delecio´n de la regio´n 15q11-q13 de origen paterno en el 70% de los pacientes, disomı´a uniparental materna en el 20-25% y menos de un 5% presenta defecto de impronta. Se presentan los resultados obtenidos en el estudio transversal clı´nicogene´tico de 77 pacientes SPW. Pacientes y me´todos: Se ha realizado el estudio de 374 pacientes con sospecha de SPW. Se emplean te´cnicas citogene´ticas de cariotipo con bandas G e hibridacio´n in situ fluorescente (FISH) y te´cnicas moleculares de microsate´lites, Southern blot, MS-PCR y secuenciacio´n. Se emplean los criterios de Holm para la correlacio´n fenotipo-genotipo en 48 pacientes. Resultados: Se confirma el diagno´stico de SPW en 77 pacientes, 46 con delecio´n, 16 con disomı´a uniparental, 2 con defecto de impronta y 13 con solo un patro´n de metilacio´n SPW. No se observan diferencias significativas en la correlacio´n fenotipo –genotipo. Conclusiones: Las frecuencias de las alteraciones moleculares, 71,87% delecio´n, 25% DUPmat y 3,12% DI, son similares a las descritas en la literatura. Se presenta el algoritmo de diagno´stico utilizado con la MS-PCR como te´cnica ra´pida para confirmar el diagno´stico de SPW. ˜ a, S.L. Todos los derechos reservados. & 2008 Elsevier Espan
Palabras clave: Sı´ndrome de Prader-Willi Enfermedad gene´tica Disonomı´a unipaental
Prader Willi syndrome patients: Study of 77 patients A B S T R A C T
Keywords: Prader-Willi syndrome Genetic disease Uniparental disomy
Background: The Prader-Willi syndrome (PWS) is a disease of genetic origin. It is characterized by neonatal hypotonia, hypogonadism, hiperfagia leading to obesity, low stature, developmental delay, moderate mental retardation, abnormal behavior and characteristic facial appearance. It is caused by the loss or the inactivation of paternal genes of the imprinted region 15q11-13. There are different genetic causes: paternal 15q11-q13 deletion in 70% of patients, maternal uniparental disomy in the 20-25% and less than 5% have an imprinting defect. We present the results obtained in the transverse clinical - genetic study of 77 PWS patients. Patients and methods: There has been realized the study of 374 suspected PWS patients. Cytogenetics studies of bands G and hybridization in situ fluorescent (FISH) and molecular genetics analysis of microsatellites, Southern blot, MS-PCR and sequenciation were carried out. Holm’s criteria use for the correlation phenotype - genotype in 48 patients. Results: PWS was confirmed in 77 patients, 46 deletion, 16 uniparental disomy, two imprinting defect and 13 only PWS methylation pattern. Significant differences do not observe in the correlation phenotype genotype. Conclusions: The frequencies of the molecular alterations, 71.87 % deletion, 25 % UPD and 3.12 % DI, they are similar to described in the literature. It presents the algorithm of diagnosis used with the MS-PCR as rapid technology to confirm PWS. ˜ a, S.L. All rights reserved. & 2008 Elsevier Espan
Ve´ase contenido relacionado en DOI: 10.1016/j.medcli.2009.06.014
Autor para correspondencia.
´nico:
[email protected] (D. Poyatos). Correo electro ˜ a, S.L. Todos los derechos reservados. 0025-7753/$ - see front matter & 2008 Elsevier Espan doi:10.1016/j.medcli.2009.04.051
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Introduccio´n El sı´ndrome de Prader Willi (SPW) es una enfermedad de origen gene´tico que ocurre de forma espora´dica en uno de cada 20.000 recie´n nacidos1. Se considera la causa ma´s comu´n de obesidad de origen gene´tico. Su expresio´n clı´nica es heteroge´nea, afecta a mu´ltiples sistemas y la mayorı´a de las manifestaciones esta´n relacionadas con una disfuncio´n hipotala´mica. Se caracteriza por hipotonı´a neonatal, apariencia facial caracterı´stica, hipogonadismo, hiperfagia, estatura baja, retraso en el desarrollo, retraso mental moderado y un fenotipo conductual propio del sı´ndrome. No obstante, muchos de sus rasgos son poco especı´ficos ˜ os2. y otros cambian con la edad, sobre todo a partir de los 3 an Esta variabilidad, o incluso ausencia de algunas caracterı´sticas en los pacientes, puede a veces dificultar su diagno´stico, sobre todo a edades tempranas. Por otra parte, adolescentes o adultos que presentan retraso mental y obesidad pueden diagnosticarse erro´neamente de SPW. En 1993 se describieron los criterios consensuados de diagno´stico clı´nico del sı´ndrome en 2 protocolos, ˜ os y otro para uno para pacientes con edades inferiores a 3 an ˜ os3. Los umbrales adecuados para considerar el mayores de 3 an diagno´stico clı´nico del SPW serı´an una puntuacio´n superior a 6 ˜ os y superior a 8 para mayores de 3 an ˜ os. No para menores de 3 an obstante, a pesar de la utilidad de estos protocolos, trabajos posteriores plantean algunas limitaciones. El 3 al 4% de los ˜ os con una puntuacio´n superior a 8 no pacientes mayores de 3 an presenta anomalı´as moleculares4,5, mientras que en un 30% de los pacientes con una puntuacio´n inferior a 6 se confirma el sı´ndrome
BP1
HERC2 GPC5
Deleción tipo I
CYF1P1 NIPA2 NIPA1
BP2
Deleción tipo II
MKRN3 MAGEL2 NDN C150RF12
IC
SA-SRO PW-SRO SNURF-SNRPN HBII-436 HBII-13/PAR-SN/PAR-5 HBII-437 HBII-438A HBII-85/PWCR1/PAR-7
ARNsno IPV HBII-52/PAR-4 HBII-438B
UBE3A
mediante estudios moleculares6. Estos datos indican la necesidad del diagno´stico molecular. En el 2001 se propone un nuevo marcador clı´nico ma´s resumido, con criterios que difieren para distintas edades y justifican la pra´ctica de test gene´ticos para el diagno´stico definitivo del SPW7. El SPW esta´ asociado a anomalı´as en la regio´n q11-q13 del cromosoma 15 paterno (fig. 1) que originan la pe´rdida o la inactivacio´n de los genes de expresio´n paterna. Tres son los mecanismos moleculares que lo causan. El ma´s frecuente es la delecio´n en la regio´n 15q11-q13 de origen paterno (70%) debido a la presencia de secuencias cortas repetidas8 que generan inestabilidad. La delecio´n puede ser de 2 clases segu´n do´nde este´n localizados los BP (breakpoint ‘puntos de rotura’), la de tipo I ocurre entre el BP1 y el BP3 y la de tipo II entre el BP2 y el BP38–11, que se presenta con una frecuencia del 40 y del 60%, respectivamente10. La disomı´a uniparental materna (DUPmat) (20–25%) se produce generalmente por la correccio´n de una trisomı´a 15 con la pe´rdida del cromosoma 15 paterno12, los 2 cromosomas 15 que se heredan son de origen materno. El defecto de impronta (DI)13 es la causa menos frecuente (5%) y consiste en la presencia de impronta materna en el cromosoma 15 paterno debido a 2 posibles mecanismos: por microdelecio´n en la secuencia del SPW-SRO del centro regulador de la impronta, que en la mayorı´a de los casos se hereda (15–20%), o por defectos epigene´ticos de novo14 que no presentan anomalı´as en la secuencia del SPW-SRO (80%). El ana´lisis del patro´n de metilacio´n es la te´cnica que permite confirmar el diagno´stico del SPW, ya que puede detectar pacientes con delecio´n, DUPmat o DI, pero no diferencia cua´l de los 3 mecanismos ha tenido lugar. Para determinar la causa y ofrecer asesoramiento gene´tico a las familias, adema´s de realizar el ana´lisis de mutilacio´n, se debe proseguir el estudio gene´tico con otras te´cnicas de metilacio´n, como la FISH (fluorescent in situ hybridation ‘hibridacio´n in situ fluorescente’), que permite identificar la delecio´n, o el estudio familiar de microsate´lites, que da informacio´n sobre el origen parental de los alelos y detecta si los 2 alelos proceden de un solo progenitor. Los casos con DI presentara´n un patro´n de metilacio´n caracterı´stico del sı´ndrome, ausencia de delecio´n mediante la FISH y ausencia de la DUPmat mediante el estudio de microsate´lites. Disponer de un diagno´stico gene´tico completo permite orientar al especialista sobre el prono´stico, ya que se describen diferencias clı´nicas segu´n la causa gene´tica y segu´n la edad14. En este estudio se presenta la serie ma´s larga estudiada en ˜ a15,16, donde se recoge la experiencia de los autores de este Espan estudio en el diagno´stico molecular de 77 pacientes con SPW ˜ os, se valoran las te´cnicas empleadas y se indican las durante 12 an estrategias que deben seguirse para un diagno´stico correcto. Conocida la alteracio´n molecular, se han revisado las historias clı´nicas, recogidas en el protocolo de Holm, para comparar la clı´nica de los pacientes y establecer si hay diferencias fenotı´picas o rasgos peculiares segu´n cua´l sea la alteracio´n molecular.
Pacientes y me´todo
ATP10C GABRB3 GABRA5 GABRG3 P (OCA2)
BP3
HERC2
Figura 1. Regio´n 15q11q13. Verde: expresio´n paterna. Rojo: expresio´n materna. Azul: expresio´n biparental (adaptado de Bittel DC, Bulter MG. Expert Rev Mol Med. 2005;7:1–20).
Se ha realizado un estudio transversal clı´nico y gene´tico a un total de 374 pacientes con sospecha clı´nica de SPW, enviados al laboratorio de Gene´tica de la UDIAT, centro diagno´stico de la Corporacio´n Sanitaria Parc Taulı´ procedentes del territorio ˜ ol, durante el perı´odo comprendido entre 1994 y 2006. En espan 10 familias con el antecedente de un hijo afectado de SPW causado por delecio´n se llevo´ a cabo un diagno´stico prenatal. Los pediatras especialistas en Neurologı´a, Neonatologı´a y Endocrinologı´a de cada uno de los centros registraron las caracterı´sticas clı´nicas de los pacientes mediante el empleo de
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los protocolos de clasificacio´n de Holm3. En el estudio se incluyeron casos con puntuacio´n inferior a la requerida para considerar un SPW, pero que indicarı´an su sospecha. Se recogieron 3 a 5 ml de sangre perife´rica con heparina de los pacientes para el establecimiento del cultivo celular y para la realizacio´n del cariotipo, y se recogieron 9 a 12 ml de sangre perife´rica con a´cido etilendiaminotetraace´tico sal tripota´sica anticoagulante (EDTA-K3) para la extraccio´n de a´cido desoxirribonucleico (ADN) de los pacientes y de los padres, siempre que fue posible. Se realizo´ el cariotipo con bandas G para detectar posibles alteraciones cromoso´micas. La te´cnica de FISH se utilizo´ para resolver microdeleciones menores de 4 Mb que esta´n por debajo del lı´mite de resolucio´n del microscopio o´ptico. Se emplearon las sondas SNRPN y D15S10 (Vysis) para valorar la delecio´n en la regio´n 15q11-q13, mediante el ana´lisis de 50 metafases. El ana´lisis de los microsate´lites D15S11, D15S128, D15S210, D15S122, D15S113, GABRB3 y D15S97 se implanto´ en 1995 para determinar el origen parental de los alelos e identificar las DUPmat. En esta e´poca se describe que algunos casos con herencia biparental presentan anomalı´as de la impronta. Por esto, se llevo´ a cabo la determinacio´n del patro´n de metilacio´n mediante la te´cnica Southern blot con deteccio´n quimioluminiscente17. El ADN geno´mico se digirio´ con las enzimas de restriccio´n Hind III+Hpa II o Bgl II+Cfo I y se hibrido´ con la sonda PW71B para analizar el estado de metilacio´n del locus D15S63 (PW71)18,19 y las enzimas de restriccio´n Xba I+Not I con la sonda KB17 para el exo´n 1 del gen SNRPN20. Posteriormente21, se adapto´ la te´cnica MS (methylation specific ‘especı´fica de metilacio´n’)-PCR (polymerase chain reaction ‘reaccio´n en cadena de la polimerasa’), que consiste en la amplificacio´n del ADN previamente tratado con bisulfito so´dico, el que convierte la citosina en uracilo, excepto cuando la citosina esta´ metilada. Esta metodologı´a permite diferenciar el alelo materno metilado del alelo paterno no metilado en el centro regulador de la impronta22. Para identificar microdeleciones en la regio´n del SPW-SRO del centro regulador de la impronta en los pacientes con DI se realizo´ un ana´lisis de Southern blot cuantitativo de ADN geno´mico digerido con la enzima de restriccio´n Bgl II e hibridacio´n con la sonda Kb17 marcada con a-[32P]dCTP23. En los casos positivos se determino´ el origen del cromosoma portador de la microdelecio´n mediante un estudio combinado de RFLP (restriction fragment length polymorphisms ‘polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccio´n) y metilacio´n del polimorfismo Hpa II y Msp I en el intro´n 1 del gen SNURF-SNRPN. Los casos en los que no se observa microdelecio´n del centro regulador de la impronta se continu´a con la secuenciacio´n para revelar la existencia de alguna variacio´n en la secuencia o reordenacio´n estructural que sea la causante del DI; si el resultado es negativo se indica la existencia de una epimutacio´n.
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Resultados ´lisis molecular Ana El estudio molecular ha confirmado el diagno´stico del SPW en 77 casos (20,59%) de los 374 casos enviados con sospecha clı´nica de SPW (tabla 1). La causa gene´tica asociada al sı´ndrome se ha determinado en 64 de 77 casos, en los 13 casos restantes con patro´n de metilacio´n caracterı´stico de SPW no se ha determinado la causa gene´tica por no disponer de material biolo´gico para proseguir el estudio. De los 77 pacientes con SPW, se observo´ la presencia de delecio´n en 46 casos (tabla 1), 15 casos detectados so´lo con la te´cnica de FISH, 5 casos con la te´cnica de FISH y ana´lisis de microsate´lites, 19 casos con la te´cnica de FISH y ana´lisis de metilacio´n, un caso con ana´lisis de microsate´lites y metilacio´n y 6 casos con las 3 te´cnicas. Uno de los pacientes presento´ adema´s un cariotipo 47XXY24, en 13 pacientes el cariotipo con bandas G fue normal y en el resto no se realizo´. La frecuencia de delecio´n fue del 71,87% (46 de 64) (tabla 2). Se confirmo´ la DUPmat en 16 casos (tabla 1), 6 casos detectados con la te´cnica de FISH y ana´lisis de microsate´lites, 2 casos con ana´lisis de microsate´lites y metilacio´n y 8 casos con las 3 te´cnicas. La frecuencia observada de las DUPmat fue del 25% (16 de 64) (tabla 2). En 2 pacientes se diagno´stico un DI, ya que presentaron un patro´n de metilacio´n caracterı´stico del SPW, la te´cnica de FISH fue normal y habı´a herencia biparental en el ana´lisis de microsate´lites (tabla 1). Para estudiar si hay una microdelecio´n en el centro regulador de la impronta se realizo´ el estudio mediante Southern blot cuantitativo. En uno de los pacientes se confirmo´ la presencia de microdelecio´n, que resulto´ ser de novo al realizar el ana´lisis del locus SNURF-SNRPN mediante RFLP con metilacio´n23. En el otro paciente no se observo´ la microdelecio´n que, junto a la ausencia de anomalı´as en el centro regulador de la impronta, indica que la causa del DI es una anomalı´a epigene´tica de novo. La frecuencia del DI fue del 3,12% (2 de 64) (tabla 2).
Tabla 2 Frecuencia de las alteraciones moleculares en el sı´ndrome de Prader Willi Alteracio´n
Pacientes
%
Delecio´n paterna DUPmat DI Total
46 16 2 64
71,87 25,0 3,12
DI: defecto de impronta; DUPmat: disomı´a uniparental materna.
Tabla 1 Resultado gene´tico en los pacientes segu´n las te´cnicas empleadas Te´cnica
Resultado positivo, n
Te´cnica de FISH Microsate´lites Te´cnica de FISH+microsate´lites Metilacio´n Te´cnica de FISH+metilacio´n Microsate´lites+metilacio´n Te´cnica de FISH+microsate´lites+metilacio´n Total
15 – 5 – 19 1 6 46 Delecio´n
– – 6 – – 2 8 16 DUPmat
Resultado negativo, n – – – – – – 2 2 DI
– – – 7 6a – – 13 Falta determinar alteracio´n
DI: defecto de impronta; DP: diagno´stico prenatal; DUPmat: disomı´a uniparental materna; FISH: hibridacio´n in situ fluorescente. a Pacientes con te´cnica de FISH normal, pueden ser DUPmat o DI.
19 1 – 197 26+10 (DP) 2 52 297+10 (DP)
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D. Poyatos et al / Med Clin (Barc). 2009;133(17):649–656
Tabla 3 Relacio´n de causa gene´tica, edad y puntuacio´n de los 48 pacientes con sı´ndrome de Prader Willi Edad
Delecio´n paterna DUPmat DI So´lo metilacio´n Total
˜ os o 3 an
˜ os 4 3 an
No disponible
n
Puntosa
n
Puntosa
n
Puntosa
9 2 – 2 13
4,69 4,25 – 4,38 27
19 5 2 1 8
8,26 8,17 5,5 6,5
5 1 – 2
6 6,25 – 9,88
DI: defecto de impronta; DUPmat: disomı´a uniparental materna. a Puntuacio´n media segu´n el protocolo de Holm.
Tabla 4 Frecuencia de las caracterı´sticas clı´nicas de 48 pacientes con sı´ndrome de Prader Willi Caracterı´sticas clı´nicas
˜ os, o3 an %
˜ os, 43 an %
No disponible, %
De los 13 pacientes en los que no se ha podido determinar la alteracio´n molecular y con un resultado de metilacio´n positivo (tabla 1), 6 casos con la te´cnica de FISH normal podrı´an ser una DUPmat si el resultado del ana´lisis de microsate´lites pendiente de realizar fuera herencia monoparental materna, mientras que en los 7 casos restantes la causa gene´tica podrı´a ser por cualquiera de los 3 mecanismos. De los 297 casos restantes, so´lo se pudo realizar el ana´lisis de metilacio´n en 277 casos, en los que el resultado fue normal, por lo que se descarta el diagno´stico del SPW. En los otros 20 casos no se asegura que no fueran SPW, ya que en 19 so´lo se realizo´ la te´cnica de FISH, que descarto´ la delecio´n en la regio´n 15q11-q13, y en un caso so´lo se realizo´ el ana´lisis de microsate´lites, por lo que se descarta que se trate de una DUPmat. Los 10 diagno´sticos prenatales se realizaron mediante la te´cnica de FISH y el test de metilacio´n, todos e´stos fueron normales y dieron lugar a un embarazo normal a te´rmino.
Total, %
´lisis clı´nico Ana Criterios mayores Hipotonı´a Problemas de alimentacio´n Facies caracterı´stica Obesidad Hipogonadismo Retraso mental moderado Hiperfagia Criterios menores Movimientos fetales disminuidos Fenotipo conductual ˜o Trastornos del suen Talla baja Hipopigmentacio´n ˜ os Manos y pies pequen Manos estrechas Anomalı´as oculares Saliva viscosa Defectos articulares Rascarse la piel
100 50 58,33 100 83,33 0 50
96 92 86,96 91,66 88,46 92 100
100 57,141 55,556 100 62,50 100 85,72
97,8 75 72,7 93,1 82,6 93,9 88,6
40
65
42,86
54,1
0 0 0 18,18 63,63 30 22,22 0 0 0
61,11 60 70 36,84 82,61 68,42 66,66 76,19 33,33 62,5
66,66 25 75 40 66,66 62,5 57,14 66,66 60 33,33
61,9 52,6 70,8 31,4 74,4 56,8 52,9 72 40 57,9
En la revisio´n de las historias clı´nicas, de los 77 casos confirmados molecularmente de SPW, so´lo se dispuso del protocolo clı´nico de 48 pacientes; de e´stos 13 eran menores de ˜ os, 27 mayores de 3 an ˜ os y de 8 no se recogio´ la edad (tabla 3). 3 an ˜ os (extremos de 0,2 a 36) y la La media de edad fue de 12 an distribucio´n por sexo fue de 47 mujeres (61%) y de 30 varones (39%). En la tabla 3 se relaciona la causa gene´tica con la edad y la ˜ os puntuacio´n obtenida segu´n los criterios de Holm. En los o3 an ˜ os la media de la puntuacio´n esta´ entre 4,25 y 4,69 y en los 43 an entre 5,5 y 8,26. Las caracterı´sticas clı´nicas en los 48 pacientes se recogen en la tabla 4, aunque algunos ı´tems no se registraron en todos. Las ma´s frecuentes fueron hipotonı´a (97,8%), retraso mental moderado (93,9%), obesidad (93,1%) e hiperfagia (88,6%). En la tabla 5 se observa la correlacio´n fenotipo y genotipo, se agrupo´ a los pacientes segu´n la causa gene´tica y la edad. En los menores de 3 ˜ os con delecio´n los ma´s frecuentes fueron hipotonı´a (9 de 9), an
Tabla 5 Caracterı´sticas clı´nicas en los 48 pacientes con sı´ndrome de Prader Willi segu´n la causa gene´tica y la edad Caracterı´sticas clı´nicas
Del
DUP
So´lo metilacio´n
DI
˜ os o3 an
˜ os 43 an
˜ os o3 an
˜ os 43 an
˜ os o3 an
˜ os 43 an
˜ os o3 an
˜ os 43 an
Criterios mayores Hipotonı´a Problemas de alimentacio´n Facies caracterı´stica Obesidad Hipogonadismo Retraso mental moderado Hiperfagia
9 9 5 6 0 7 0 2
19+5 22 19 19 21 18 23 19
2 2 0 1 1 2 0 1
5+1 6 4 3 2 6 5 5
– – – – – – – –
2 1 1 1 1 1 1 1
2 2 1 0 0 2 0 1
1+2 3 3 2 2 2 2 2
Criterios menores Movimientos fetales disminuidos Fenotipo conductual ˜o Trastornos del suen Talla baja Hipopigmentacio´n ˜ os Manos y pies pequen Manos estrechas Anomalı´as oculares Saliva viscosa Defectos articulares Rascarse la piel
3 0 0 0 2 6 3 2 0 0 0
11 8 5 12 9 15 10 12 9 5 7
0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
2 2 3 3 0 5 3 2 5 1 3
– – – – – – – – – – –
2 0 0 1 0 2 2 0 1 0 0
1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
1 3 2 1 0 3 3 1 3 2 1
Del: delecio´n; DI: defecto de impronta; DUP: disomı´a uniparental. Pacientes sin registro de edad que por su clı´nica se incluyen en el grupo de edad.
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Discusio´n
˜ os (6 de 8). En los hipogonadismo (7 de 9) y manos y pies pequen ˜ os y los 5 pacientes sin registro de 19 pacientes mayores de 3 an edad con delecio´n, se manifesto´ mayoritariamente obesidad (21 de 21), retraso mental moderado (23 de 24), hipotonı´a (22 de 23) e hiperfagia (19 de 20). En los 8 pacientes con DUPmat, los 2 ˜ os manifestaron hipotonı´a e hipogonadismo, pero menores de 3 an ˜ os sin problemas de alimentacio´n. Los 5 pacientes mayores de 3 an ma´s un paciente sin registro de la edad, manifestaron hipotonı´a (6 de 6), hipogonadismo (6 de 6) e hiperfagı´a (5 de 5), fueron moderados la obesidad (2 de 4) y los rasgos faciales (3 de 4); ninguno de e´stos manifesto´ hipopigmentacio´n. Dos pacientes ˜ a de 5,4 an ˜ os y 4,5 puntos con un fenotipo presentaron DI, una nin tı´pico del SPW, pero sin presencia de hipopigmentacio´n ni ˜ os y 6,5 puntos que destaca hipogenitalismo, y una mujer de 29 an por problemas psico´ticos, retraso mental grave (coeficiente intelectual 35), limitaciones significativas en la pra´ctica de habilidades adaptativas, hipogenitalismo, ası´ como ausencia de hipopigmentacio´n y de rasgos faciales caracterı´sticos. Por u´ltimo, entre los 5 pacientes con so´lo un patro´n de metilacio´n caracterı´stico del SPW, en los que no se pudo determinar la causa gene´tica al no disponer de ma´s muestra, habı´a 2 menores de 3 ˜ os con un promedio de 4,3 puntos que presentaron hipotonı´a (2 an ˜ os de 2) e hipogenitalismo (2 de 2), y un paciente mayor de 3 an ma´s 2 sin registro de edad que presentaron la mayorı´a de los rasgos tı´picos del sı´ndrome (tabla 5). De los 277 casos en los que el diagno´stico gene´tico descarto´ la sospecha de SPW, 117 mujeres (42,24%) y 160 varones (57,78%), se dispuso de la puntuacio´n clı´nica de 71 casos, con un promedio de 6 puntos (extremos de 2 a 10). Una puntuacio´n superior a 8 se observo´ en un 12,68% de los casos (9 de 71) con estudio gene´tico negativo.
La incorporacio´n de nuevas te´cnicas ha mejorado el diagno´stico molecular del SPW, y aumenta la sensibilidad y la rapidez de e´stas. Determinar la causa gene´tica puede requerir de te´cnicas como el cariotipo, la hibridacio´n in situ, el ana´lisis de microsate´lites y el ana´lisis de metilacio´n, bien mediante Southern blot o por MS-PCR, esta u´ltima es la te´cnica de diagno´stico molecular ma´s eficaz para la confirmacio´n del sı´ndrome. Decidir cua´l de e´stas aplicar influye en el coste por paciente, por lo que es conveniente que un laboratorio de ana´lisis gene´tico disponga de una estrategia de diagno´stico molecular. En la figura 2 se propone un algoritmo que sigue las recomendaciones del American College of Medical Genetics y del American Society of Human Genetics Test and Technology Transfer Committee25 para el diagno´stico y para la determinacio´n de la base gene´tica del SPW, que cumple los requisitos establecidos por la UK Clinical Molecular Genetics Society y la European Molecular Genetics Quality Network26. Se recomienda iniciar el estudio mediante el test de metilacio´n de MS-PCR, dado que la presencia de un patro´n de metilacio´n normal descarta el sı´ndrome con una fiabilidad superior al 99%. La MSPCR se considera una te´cnica de cribado ra´pida y de bajo coste. Sin embargo, debido a que se han descrito pacientes con SPW con un patro´n de metilacio´n normal y translocacio´n con rotura en el gen SNRPN27–30, se recomienda el ana´lisis citogene´tico en todos los casos para descartar cualquier alteracio´n en el cariotipo. La realizacio´n del cariotipo no incrementarı´a el coste, ya que se deberı´a realizar de forma habitual en la mayorı´a de los centros. La presencia de un patro´n de metilacio´n alterado, con ausencia del alelo paterno no metilado, confirma el diagno´stico del SPW. Para determinar la causa gene´tica y considerar que la delecio´n en la
Técnicas de estudio
1
Diagnóstico S. Prader-Willi
Test de metilación Normal
Se descarta SPW
Ausencia alelo paterno
Se confirma SPW
2
FISH Deleción 15q11-q13
Positivo Negativo
3
Se desccarta deleción. Proseguir paso 3
Estudio de microsatélites Ausencia de alelos paternos
DUPmat
Defecto de impronta
HBP
Deleción IC Análisis mutacional de CI Epimutación
Cariotipo Normal
Reorganizaciones cromosómicas
Alterado Figura 2. Algoritmo diagno´stico del sı´ndrome de Prader Willi.
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regio´n 15q11-q13 causa la mayorı´a de los casos, es recomendable proseguir el estudio con la te´cnica de FISH por medio del empleo ˜ al en uno de los homo´logos de la sonda SNRPN. La ausencia de sen confirma la delecio´n en la regio´n 15q11-q13. Aunque su coste es elevado esta´ justificado porque la mayorı´a de los casos la presentan. Si el resultado de la te´cnica de FISH es negativo se prosigue con el ana´lisis de microsate´lites para determinar si la causa es una DUPmat. La ausencia del alelo paterno confirmarı´a la DUPmat y la presencia de los alelos paterno y materno, es decir, una herencia biparental serı´a la sospecha de un DI. El ana´lisis de microsate´lites externos e internos de la regio´n crı´tica tambie´n permite diferenciar la DUPmat de la delecio´n en la regio´n 15q11q13. El ana´lisis de microsate´lites es menos costoso que la te´cnica de FISH, pero requiere de ADN de los padres, que no siempre esta´ disponible, y en muchos casos los marcadores empleados pueden ser no informativos. En el caso de concluir que la causa del sı´ndrome es un DI, es necesario realizar el ana´lisis del centro regulador de la impronta para determinar si ha ocurrido una delecio´n en e´ste o bien si el DI es de causa epigene´tica. Tambie´n es aconsejable realizar un estudio de la secuencia de la regio´n del SPW-SRO del centro regulador de la impronta para descartar posibles mutaciones puntuales. En aquellos casos en los que se confirme la presencia de delecio´n en el centro regulador de la impronta, es imprescindible realizar el estudio del padre para confirmar si la delecio´n es de novo, en este caso el riesgo de recurrencia es o1%, o bien, si e´sta se ha heredado, el riesgo de recurrencia es del 50%. Normalmente este ana´lisis se realiza en centros especializados. Con la aplicacio´n de las diferentes te´cnicas moleculares se ha determinado la causa gene´tica en 64 pacientes, que presentaron delecio´n un 71,87%, DUPmat un 25% y DI un 3,12%, frecuencias similares a las descritas en la bibliografı´a13. En conjunto, la serie de 374 pacientes con sospecha clı´nica de SPW ha presentado una frecuencia de alteraciones moleculares del 20,59%, inferior a la descrita por otros autores15, debido a que no se dispuso de un protocolo clı´nico de un nu´mero elevado de casos, se incluyeron pacientes con puntuacio´n inferior a la requerida para confirmar el diagno´stico clı´nico, pero el registro clı´nico no lo realizo´ el mismo clı´nico. Actualmente se esta´ desarrollando una nueva te´cnica para el diagno´stico del SPW, mu´ltiple ligacio´n dependiente de la sonda de amplificacio´n-metilacio´n especı´fica (MS-MLPA ), que permite valorar simulta´neamente el patro´n de metilacio´n y diferenciar pacientes con delecio´n de pacientes con DUP o DI, aunque no permite diferenciar entre una DUP y un DI. Debido a que se usan 43 sondas para detectar variaciones en el nu´mero de copias, es posible detectar deleciones en el centro regulador de la impronta31,32. Su coste au´n es elevado, pero sera´ el test gene´tico alternativo actual, ya que con una sola te´cnica se confirma el diagno´stico y se confirman las principales causas gene´ticas. Los microarrays sera´n otra plataforma que, en un futuro cada vez menos lejano, permitira´ una mayor comprensio´n de co´mo ˜ os cambios en la secuencia del genoma pueden ser pequen significativos en la manifestacio´n clı´nica. El SPW se considera un sı´ndrome multige´nico que afecta a genes contiguos, son ası´ varios los genes o secuencias de ADN los causantes de e´ste. El efecto que causa cada uno de e´stos no esta´ del todo claro, pero sı´ que el fenotipo no depende de un solo gen. El principal candidato ha sido el locus SNURF-SNRPN, aunque ˜ os nucleolares u´ltimamente se han descrito secuencias de pequen de a´cido ribonucleico (snoARN) que pueden tener ma´s relevancia de la considerada hasta ahora, como es el caso del snoARN HBII85, en que la delecio´n es la u´nica alteracio´n gene´tica observada en un paciente que manifiesta los principales rasgos del SPW33. No obstante, algunos rasgos atı´picos en este paciente indican que otros genes en esta regio´n contribuyen sutilmente en el fenotipo.
Esta complejidad puede estar relacionada con el hecho de que estas secuencias tienen una funcio´n reguladora de otros genes, por lo que el efecto cascada puede implicar a otros genes, algunos incluso no directamente relacionados con la regio´n 15q11-q13. La presencia de ciertos rasgos clı´nicos permite al especialista sospechar del SPW y solicitar un estudio gene´tico para confirmarlo. Gracias al avance en gene´tica molecular y a la experiencia clı´nica, se ha podido observar que los criterios propuestos en 1993, a pesar de una sensibilidad aceptable de muchos de e´stos, pueden ser demasiado exclusivos. Se ha observado que el 16,7% de los pacientes con un diagno´stico molecular positivo no los cumple7–34. En nuestra serie ha sido el 12,9% (4 de 31) de los pacientes ˜ os diagnosticados de SPW los que han presentado mayores de 3 an una puntuacio´n inferior a 6, por lo que un sistema de puntuacio´n menos estricto, como proponen Gunay-Aygun et al7 permitirı´a diagnosticar casos que no se hubieran incluido segu´n los criterios de Holm para realizar un test gene´tico. En un trabajo reciente sobre el SPW, Cassidy y Driscoll comentan esta estrategia y recomiendan que´ aspectos evaluar en el diagno´stico clı´nico inicial35. ´ nicamente se han podido incluir 48 de 77 pacientes para la U correlacio´n fenotipo y genotipo debido a que los protocolos clı´nicos estaban incompletos o bien no se enviaron. Esto ha condicionado que 29 de los 77 pacientes no este´n introducidos en la serie para la correlacio´n fenotipo y genotipo. Se ha propuesto que, aunque no hay diferencias significativas para la mayorı´a de los rasgos, los pacientes con delecio´n son los que presentan el fenotipo ma´s grave. Estarı´a justificado por el hecho de que han perdido un fragmento de ADN de unos 4 Mb, donde, adema´s de los genes asociados con el SPW y regulados por impronta geno´mica, se encuentran otros genes. Una sola copia de estos otros genes explicarı´a que los pacientes con delecio´n de tipo ˜ o, presenten ma´s problemas psicolo´gicos, de I, la de mayor taman comportamiento, menor habilidad en la lectura, matema´ticas e integracio´n visual motora que los pacientes con delecio´n de tipo 10 II . La diferencia entre estas 2 deleciones es un fragmento de 500 Kb, distancia entre el BP1 y el BP2, en la que se han localizado 4 genes no regulados por impronta geno´mica, NIPA1, NIPA2, CYF1P1 y GCP5, que estarı´an implicados en las diferencias fenotı´picas entre los pacientes con delecio´n de tipo I respecto a las otras causas gene´ticas36. En los pacientes con DUPmat, a diferencia de los pacientes con delecio´n, no ha ocurrido la pe´rdida fı´sica de 4 Mb de ADN, sino la pe´rdida funcional de genes regulados por impronta geno´mica que se encuentran silenciados por metilacio´n. Otros genes dentro de esta regio´n de 4 Mb no se ven afectados y su expresio´n biparental o doble dosis puede explicar una manifestacio´n ligeramente moderada del fenotipo. Por ejemplo, 2 copias del gen OCA2 conllevan a que los problemas oculares37 y la hipopigmentacio´n sean menos frecuentes, como ocurre con los pacientes con DUPmat de esta serie, que ninguno de e´stos la presenta. Tambie´n esta´ la hipo´tesis de que la doble dosis del gen de expresio´n materna UBE3A podrı´a conferir un efecto beneficioso en la memoria visual38. Puede parecer que la doble dosis ge´nica no es tan perjudicial como una sola copia; sin embargo, no es ası´ para todos los rasgos. Algunos se presentan con ma´s gravedad en los pacientes con DUPmat, por ejemplo, peor procesado visual de estı´mulos complejos39 y mayor propensio´n a alteraciones afectivas y rasgos psico´ticos en adultos40. En esta serie, en la que se han tenido en cuenta u´nicamente los criterios de Holm, puede observarse co´mo, respecto a los pacientes con delecio´n, los pacientes con DUPmat presentan una frecuencia menor, pero no significativa, en problemas de alimentacio´n, facies caracterı´stica, obesidad, movimientos fetales disminuidos y ninguno de e´stos ha presentado hipopigmentacio´n. Otros autores tambie´n han propuesto la menor frecuencia de estos
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rasgos en los pacientes con DUPmat41–43 y puede ser en otros rasgos no recogidos en los criterios de Holm donde se observen diferencias significativas. La alteracio´n molecular en el centro de la impronta, bien por delecio´n o por defecto epigene´tico, causa un efecto muy parecido a la DUPmat, es decir, el silencio de genes paternos regulados por impronta geno´mica. De modo que la clı´nica de los pacientes con DI se parece mucho a la de los pacientes con DUPmat. En esta serie, la paciente con delecio´n en el centro de la impronta presento´ un fenotipo que destaca por su hiperactividad y por su vulnerabilidad psı´quica, fenotipo ma´s grave que el descrito en los pacientes con DI44,45. Sin embargo, este fenotipo ma´s grave tambie´n se ha descrito en los pacientes adultos con DUPmat40. La paciente con defecto epigene´tico manifiesta un fenotipo tı´pico de SPW con ausencia de hipopigmentacio´n e hipogenitalismo, similar al de los pacientes con DUPmat. Tener bien caracterizada la causa gene´tica esta´ permitiendo estudios comparativos entre los pacientes con SPW para valorar rasgos clı´nicos no considerados hasta el momento. Conocer la evolucio´n del sı´ndrome segu´n la alteracio´n gene´tica esta´ repercutiendo en mejorar la calidad de vida de estos pacientes y permite actuar en aquellos aspectos que tienen ma´s debilitados. Se pueden ofrecer opciones terape´uticas para prevenir y tratar la obesidad, como proporcionar una dieta adecuada y estimular ha´bitos de alimentacio´n y la realizacio´n de ejercicios apropiados para reducir problemas relacionados con la obesidad (diabetes, hipertensio´n y problemas respiratorios), los cuales son las principales causas de morbimortalidad durante la adolescencia. Asimismo, el tratamiento con la hormona del crecimiento esta´ aportando importantes beneficios en la altura, masa muscular, agilidad y funcio´n respiratoria. El tratamiento integral debe comprender, adema´s, una estimulacio´n precoz y rehabilitacio´n, logopedia, ortopedia e intervencio´n en los trastornos de la conducta, ası´ como una prestacio´n de apoyo educacional, laboral y familiar. Bibliografı´a 1. Whittington JE, Holland AJ, Webb T, Butler J, Clarke D, Boer H. Population prevalence and estimated birth incidence and mortality rate for people with Prader-Willi syndrome in one UK Health Region. J Med Genet. 2001;38:792–8. 2. Cassidy SB. Prader-Willi syndrome. Curr Probl Pediatr. 1984;14:1–55. 3. Holm VA, Cassidy SB, Butler MG, Hanchett JM, Greenswag LR, Whitman BY, et al. Prader-Willi syndrome: Consensus diagnostic criteria. Pediatrics. 1993;91:398–402. 4. Robinson WP, Bottani A, Xie YG, Balakrishman J, Binkert F, Machler M, et al. Molecular, cytogenetic, and clinical investigations of Prader-Willi syndrome patients. Am J Hum Genet. 1991;49:1219–34. 5. Gillessen-Kaesbach G, Gross S, Kaya-Westerloh S, Passarge E, Horsthemke B. DNA methylation based testing of 450 patients suspected of having PraderWilli syndrome. J Med Genet. 1995;32:88–92. 6. Erdel M, Schuffenhauer S, Buchholz B, Barth-Witte U, Kochl S, Utermann B, et al. Routine screening for microdeletions by FISH in 77 patients suspected of having Prader-Willi or Angelman syndromes using YAC clone 273A2 (D15S10). Hum Genet. 1996;97:784–93. 7. Gunay-Aygun M, Schwartz S, Heeger S, O’Riordan MA, Cassidy SB. The changing purpose of Prader-Willi syndrome clinical diagnostic criteria and proposed revised criteria. Pediatrics. 2001;108:E92. 8. Butler MG, Bittel DC, Kibiryeva N, Talebizadeh Z, Thompson T. Behavioral differences among subjects with Prader-Willi syndrome and type i or type ii deletion and maternal disomy. Pediatrics. 2004;113:565–73. 9. Gimelli G, Pujana MA, Patricelli MG, Russo S, Giardino D, Larizza L, et al. Genomnic inversions of human chromosome 15q11-q13 in mothers of Angelman syndrome patients with class ii (BP2/3) deletions. Hum Mol Genet. 2003;12:849–58. 10. Christian SL, Fantes JA, Mewborn SK, Huang B, Ledbetter DH. Large genomic duplicons map to sites of instability in the Prader-Willi/Angelman syndrome chromosome region (15q11-q13). Hum Mol Genet. 1999;8:1025–37. 11. Ungaro P, Christian SL, Fantes JA, Mutirangura A, Black S, Reynolds J, et al. Molecular characterization of four cases of intrachromosomal triplication of chromosome 15q11-q14. J Med Genet. 2001;38:26–34. 12. Purvis-Smith SG, Saville T, Manass S, Yip MY, Lam-Po-Tang PR, Duffy B, et al. Uniparental disomy 15 resulting from )correction* of an initial trisomy 15. Am J Hum Genet. 1992;50:1348–50.
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Glosario BP1, BP2 y BP3: del ingle´s breakpoint, son secuencias repetitivas en las que tienen lugar los puntos de rotura de las deleciones. SPW-SRO: secuencia del centro regulador de la impronta que determina el establecimiento de la impronta en la lı´nea germinal. Locus D15S63: localizado en la regio´n 15q11-q12 del centro regulador de la impronta upstream del gen SNURF-SNRPN. Se utiliza en el test de metilacio´n mediante Southern blot al presentar metilacio´n diferencial, el alelo materno esta´ metilado y el paterno no esta´ metilado. ˜ os nucleolares Gen SNURF-SNRPN: codifica 2 polipe´ptidos y un conjunto de pequen de a´cido ribonucleico. La presencia de metilacio´n diferencial en el exo´n 1 y en el intro´n 1 se utiliza en la te´cnica especı´fica de metilacio´n de la reaccio´n en cadena de la polimerasa y para el ana´lisis de deteccio´n de microdeleciones del centro regulador de la impronta respectivamente. ´n: cambio que no afecta a la secuencia del a´cido Defecto epigene´tico o epimutacio desoxirribonucleico, pero sı´ a su estructura a trave´s de la metilacio´n, acetilacio´n, etc.
