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1130-0108/2006/98/1/36-41 REVISTA ESPAÑOLA DE ENFERMEDADES DIGESTIVAS Copyright © 2006 ARÁN EDICIONES, S. L.
REV ESP ENFERM DIG (Madrid) Vol. 98. N.° 1, pp. 36-41, 2006
Single nucleotide polymorphisms (SNPs) at CDH1 promoter region in familial gastric cancer A. Ramos-de la Medina, H. More1, H. Medina-Franco2, B. Humar1, A. Gamboa2, L. J. Ortiz2, J. H. Donohue and P. Guilford1 Department of Surgery. Mayo Clinic. Rochester. Minnesota. EE.UU. 1Department of Biochemistry. Cancer Genetics Laboratory. University of Otago. Dunedin, New Zealand. 2Departments of Surgery and Pathology. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición “Salvador Zubirán”. México. D.F. México
ABSTRACT Introduction: gastric cancer is the most frequent gastrointestinal malignancy in Mexico and the proportion of patients younger than 40 years is one of the highest reported in the world literature. Recently several families with familial diffuse gastric cancer have been identified at the National Institute of Medical Sciences and Nutrition. Germline mutations in the E-cadherin gene (CHD1) have been described that result in the development of diffuse hereditary gastric cancer in young patients. Methods: the complete coding sequence at exons 1 to 16 and the promoter region of CDH1 was amplified by polymerase chain reaction in peripheral blood samples of two patients with early onset familial diffuse gastric cancer. Results: no germline inactivating mutations of CHD1 were found on either patient. Single nucleotide polymorphisms -160 C→A were detected in the promoter region of CDH1 in both patients. Conclusions: the polymorphism -160 C→Α theoretically confers an increased risk of developing diffuse gastric cancer. The relatives of these patients may an increased risk of gastric cancer among other tumors. There is presently not enough evidence to consider the -160 C→Α polymorphism an etiologic factor of diffuse gastric cancer in these patients since the frequency and type of genetic alterations of CDH1 are largely unknown in the Mexican population. It will be necessary to conduct epidemiologic studies in the Mexican population to determine the influence that genetic alterations have on the genesis of diffuse gastric carcinoma. Key words: Hereditary diffuse gastric cancer. E-cadherin. SNP. Genetics. Young patients.
Recibido: 06-04-05. Aceptado: 28-04-05. Correspondencia: Antonio Ramos-de la Medina. Advanced GI Surgical Fellow. Department of Surgery. Mayo Clinic College of Medicine. 200 First Street SW. Rochester, MN 55905. USA. Fax: 507-284-5196. e-mail:
[email protected]
Ramos-de la Medina A, More H, Medina-Franco H, Humar B, GamboaA, Ortiz LJ, Donohue JH, Guilford P. Polimorfismos de nucleótido único (SNPs) en la región promotora CDH1 en cáncer gástrico familiar. Rev Esp Enferm Dig 2006; 98: 36-41.
INTRODUCTION Gastric cancer (GC) represents the second most frequent neoplasm worldwide (1). The vast majority of cases of GC occur between the ages of 50 and 70 years. In Mexico, GC is the most frequent neoplasm of the gastrointestinal tract (2) and the proportion of patients younger than 40 years of age is one of the highest reported (3). The causes behind this high proportion of young patients have not been explained. In general, the development of GC is considered to be the consequence of a complex interaction between genetic, infectious and dietary factors. With increasing frequency there are reports about the influence of heredity in GC. Epidemiologic studies have shown that first degree relatives of GC patients have a risk 2 to 3 times higher of developing GC that the general population (4,5). In addition, the Scandinavian Twins Study found an increased risk for GC in the twin sibling of an affected person (6). Germline mutations of the E-cadherin gene (CDH1) associated with the development of diffuse GC were first described in 1998 (7). E-cadherin has a fundamental role in establishing and maintaining in intercellular adhesion and epithelial architecture (8). Inactivating mutations in this gene are the most frequent genetic alterations found in hereditary diffuse and sporadic GC. E-cadherin is currently considered a tumor suppressor gene and its alterations are associated with increased susceptibility to several types of cancer (9). In spite of the advances in the knowledge of pathogenesis, little is know about the effect that genetic sus-
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ceptibility has on the occurrence of gastric neoplasms. A recently published study on GC in patients younger than 40 years old at the National Institute of Medical Sciences and Nutrition “Salvador Zubirán” (NIMSNSZ) found that 17% of the cases had a history of GC in first degree relatives and identified 5 families with diagnostic criteria for hereditary gastric cancer (HGC) (3). The objective of this study is to report the absence of inactivating mutations of CDH1 and the presence of single nucleotide polymorphisms (SNP) in CDH1 in 2 members of these families and to discuss the implications that these findings have in the diagnosis and treatment of the patients.
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primer 5’-TGACTTCCGCAAGCTCACA-3’ at an annealing temperature of 65 °C with 2 mM of MgCl2 and 5% DMSO. A T3 tale adhered to the forward primers allowed the sequencing of the PCR products using a T3 primer labeled with IR800 (MWG-Biotech). The sequenced products were analyzed in a LI-COR 4000L DNA sequencer (LI-COR Nebraska) according to the protocol provided by the manufacturer. CDH1 variants were confirmed by independent PCR and reverse sequencing. RESULTS
MATERIAL AND METHODS The complete coding sequence of CDH1 (exons 1 to 16) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with the technique described previously by one of the authors (PG) (7) in peripheral blood samples of two patients of 25 (patient 1) and 34 (patients 2) years old respectively with histopathological diagnosis of early onset diffuse GC identified at the NIMSNSZ. Both cases were of Mexican ancestry, mestizo origin, lived in different areas of the country, were not related and had a family history of diffuse GC in at least one first degree relative diagnosed before de age of 40 years. Patient 1 came from a family with all the diagnostic criteria for HGC (Fig. 1). Patient 2 had a positive family history of diffuse GC diagnosed in his father at 38 years old. The promoter region of CDH1 was amplified by PCR using the forward primer 5’-AATTAACCCTCACTAAAGAGTGAGCCCCATCTCCAAAA-3’ and the reverse
No germline inactivating mutations of CHD1 were found on either patient. A single nucleotide polymorphism (SNP) -160 C→A was detected in the promoter region of CDH1 in both patients (Fig. 2). A sequence alteration in intron 1, nucleotide position 48 + 6T→C was detected in patient 2.
Fig. 2. - Detección del polimorfismo –160 C→A del gen CDH1 mediante análisis de PCR.
DISCUSSION
Fig. 1.- Interacción entre las moléculas de E-cadherina, las cateninas β/γ y las cateninas α con el citoesqueleto de actina.
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The identification of genes that predispose to familial cancer syndromes constitutes a fundamental advancement in the understanding of the genesis of neoplasms. In Mexico, the ratio of patients with GC younger than 40 years of age is high and a significant proportion of this population has familial aggregation (3). There are few studies that explore the influence that genetic factors have on the high frequency of GC in the Mexican population (10,11). E-cadherin is a membrane protein whose main function is the preservation of epithelial integrity by main-
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taining intercellular adhesion and cell polarity (Fig. 3) CDH1 the coding gene for E-cadherin is located in chromosome 16q22.1. E-cadherin dysfunction is associated with the development of high grade cancers, invasion and metastasis of several neoplasms (10-15).
Fig. 3. - Pedigrí del paciente 1. Cuadros, hombres, círculos, mujeres, diagonales, muertos. Todos lo pacientes en sólido han tenido diagnóstico de cáncer gástrico difuso.
Germline mutations of CDH1 responsible for the development of high grade diffuse GC in young patients were described for the first time in 1998 (7). These mutations have an autosomal dominant pattern of inheritance with incomplete penetrance. The efficacy of endoscopic screening for this form of diffuse GC is poor because it tends to present as submucosal infiltration instead of as an exophytic mass. To date there are only 3 reports on the use of prophylactic gastrectomies in 11 patients with inactivating germline mutations of CDH1 (16-18). CDH1 mutations are considered the most frequent somatic alteration found in diffuse GC since they are present in more than 50% of the cases (19). In the present study no germline inactivating mutations of CDH1 were identified, hence the difficulty of giving recommendations regarding followup and management for these patients and their families based on this. Recently, Li et al. described a SNP C→A at position -160 in the promoter region of CDH1 with a direct effect in the transcriptional regulation of CDH1 in a prostate cancer cell line. This polymorphism is associated with a 68% reduction of the CDH1 transcriptional activity in vitro (20). A recent study on Italian patients showed that the -160 C→A polymorphism at the CDH1 promoter region confers and increased risk of developing sporadic diffuse GC (21). This study performed polymorphism genotyping at positions -160C→A, 48+6T→C y 2076Χ→Τ, finding that haplotype A-T-C is associated with an increased risk. Two other studies, one in Korean patients and other in Taiwanese patients did not find any
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association between the -160C→A polymorphism and GC (22,23). The disagreement between these studies could be secondary to differences in genetic backgrounds and environmental factors among ethnic groups. The most common genetic variation is the SNP which occurs with a frequency of at least 1 for every 1.000 base pairs of the approximately 3.2 billion than form the human genome. For a variation to be considered a SNP it needs to occur in at least 1% of the population. Most SNPs occur at non-coding regions of the genome and hence do not manifest phenotypically (24), nevertheless, it has been shown that when SNPs occur at the promoter region of a gene, they can have an important effect on transcription (25). The identification of the -160C→A polymorphism in these 2 patients theoretically confers them an increased risk of GC. The family members of these patients have an increased risk of diffuse GC and other neoplasms. Although there is not enough evidence to consider the -160C→A polymorphism as an etiologic factor of diffuse GC, its relationship to an increased risk in the carriers may be secondary to association with one or more additional polymorphisms within or near the CDH1 gene. Since the frequency and type of mutations in CDH1 in the Mexican population is unknown, it is difficult to estimate the risk that this polymorphism confers. Careful screening in the family members of these patients is of utmost importance. Nevertheless, despite frequent endoscopic evaluation with multiple biopsies, one family member of patient 1 was recently diagnosed with diffuse GC with submucosal extension and peritoneal metastasis. The use of prophylactic gastrectomy in the patients at risk is not recommended in the absence of inactivating mutations of CHD1. One option that has been explored by some groups is the use of chromo-endoscopy and biopsy of suspicious areas. It will be necessary to conduct epidemiologic studies in the Mexican population to determine the influence that genetic alterations have on the genesis of diffuse gastric carcinoma.
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Polimorfismos de nucleótido único (SNPs) en la región promotora CDH1 en cáncer gástrico familiar A. Ramos-de la Medina, H. More1, H. Medina-Franco2, B. Humar1, A. Gamboa2, L. J. Ortiz2, J. H. Donohue y P. Guilford1 Departamento de Cirugía. Mayo Clinic. Rochester. Minnesota. EE.UU. 1Departamento de Bioquímica. Cancer Genetics Laboratory. University of Otago. Dunedin, Nueva Zelanda. 2Departamentos de Cirugía y Patología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición “Salvador Zubirán”. México. D.F. México.
RESUMEN Introducción: el cáncer gástrico es la neoplasia más frecuente del tracto gastrointestinal en México y la proporción de pacientes menores de 40 años es una de las más altas reportadas en la literatura mundial. Recientemente se han identificado en el Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición varias familias con cáncer gástrico difuso familiar. Múltiples mutaciones germinales del gene de E-cadherina (CHD1) han sido descritas en relación al desarrollo de cáncer gástrico difuso hereditario en pacientes jóvenes. Métodos: la secuencia codificadora completa exones 1 al 16 y la región promotora de CDH1 fueron amplificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa en muestras de sangre periférica de dos pacientes con diagnósticos de cáncer gástrico de aparición temprana familiar. Resultados: en ninguno de los 2 pacientes se detectaron mutaciones germinales inactivadoras de CDH1. Se encontraron poli-
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morfismos de nucleotido único C→A en la región promotora de CDH1 en la posición –160 en ambos pacientes. Conclusiones: el polimorfismo –160 C→A confiere teóricamente un aumento en el riesgo de desarrollar cáncer gástrico difuso. Los miembros de las familias presentan un riesgo mayor para cáncer gástrico difuso al igual que otras neoplasias. No existe actualmente evidencia suficiente para considerar al polimorfismo –160 C→A como un factor etiológico determinante de cáncer gástrico difuso debido a que la frecuencia y tipo de alteraciones en el gen CDH1 en población mexicana se desconocen. Será necesario llevar a cabo estudios epidemiológicos en población mexicana que determinen la influencia de diversas alteraciones genéticas en la génesis de esta neoplasia. Palabras clave: Cáncer gástrico hereditario difuso. E-cadherina. SNP. Genética. Pacientes jóvenes.
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INTRODUCCIÓN El cáncer gástrico (CG) representa la segunda neoplasia más frecuente a nivel mundial (1). La gran mayoría de los casos de CG ocurren entre los 50 y 70 años de edad. En México, el CG es la neoplasia más frecuente del tracto gastrointestinal (2) y la proporción de pacientes menores de 40 años es una de las más altas reportadas (3). Las causas de esta alta proporción no han sido dilucidas. En general, se considera que el desarrollo de CG es consecuencia de una compleja interacción entre factores genéticos, infecciosos y dietéticos. Cada vez con mayor frecuencia se reporta sobre la influencia de los factores hereditarios en el CG. Estudios epidemiológicos han demostrado que los parientes en primer grado de un paciente con CG tienen un riesgo 2 a 3 veces mayor de desarrollarlo que la población general (4,5). Así mismo, el estudio Escandinavo de gemelos encontró un incremento en el riesgo de CG en el gemelo de una persona afectada (6). En 1998 se describieron por primera vez mutaciones germinales en el gen codificador de E-cadherina (CDH1) asociados al desarrollo de CG difuso (7). La E-cadherina juega un papel fundamental en el establecimiento y mantenimiento de la adhesión intercelular y de la arquitectura de los epitelios (8). Las mutaciones inactivadoras de este gen son las alteraciones genéticas más frecuentes en CG difuso hereditario y esporádico. Actualmente la E-cadherina es considerada un gen supresor tumoral y sus alteraciones se asocian a aumento en la susceptibilidad a otros tipos de cáncer (9). A pesar del avance en el conocimiento sobre patogénesis, es poco lo que se sabe sobre el efecto de la susceptibilidad genética en el desarrollo de las neoplasias gástricas. Un estudio recientemente publicado sobre CG en pacientes menores de 40 años en el Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutrición “Salvador Zubirán” (INCMNSZ) identificó que 17% de estos pacientes tienen antecedentes de CG en familiares de primer grado y encontró 5 familias con criterios de cáncer gástrico hereditario (CGH) (3). El objetivo de este estudio es reportar la ausencia de mutaciones inactivadoras de CDH1, la presencia de polimorfismos de nucleótido único (SNP) en el gen CDH1 en 2 miembros de estas familias y comentar sobre las implicaciones de estos hallazgos en el diagnóstico y tratamiento de estos pacientes. MATERIAL Y MÉTODOS La secuencia codificadora completa de CDH1 (exones 1 a 16) fue amplificada mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la técnica previamente descrita por uno de los autores (PG) (7) en muestras de sangre periférica de dos pacientes de 25 (paciente 1) y 34 (paciente 2) años respectivamente con diagnóstico histopatológico de CG difuso de aparición temprana identificados en el INCMNSZ. Ambos casos de ascendencia mexicana, de origen mestizo, habitantes de diferentes en-
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tidades federativas sin parentesco entre sí y con antecedentes de CG difuso en al menos un familiar en primer grado diagnosticado antes de los 40 años. El paciente 1 proviene de una familia que cumple todos los criterios de CGH (Fig. 1). El paciente 2 tiene el antecedente de CG difuso en su padre, diagnosticado a los 38 años de edad. La región promotora de CDH1 fue amplificada mediante PCR utilizando el iniciador en sentido anterior (forward primer) 5’-AATTAACCCTCACTAAAGAGTGAGCCCCATCTCCAAAA-3’ y el iniciador en sentido reverso (reverse primer) 5’-TGACTTCCGCAAGCTCACA-3’ a una temperatura de alineación (annealing temperature) de 65° C con 2 mM de MgCl2 y 5% DMSO. Una cola T3 adherida a los iniciadores en sentido anterior permitió que los productos del PCR fueran secuenciados utilizando un iniciador T3 marcado con IR800 (MWG-Biotech). Los productos secuenciados fueron analizados en un secuenciador de DNA LI-COR 4000L (LI-COR, Nebraska) de acuerdo al protocolo provisto por el fabricante. Las variantes de CDH1 fueron confirmadas mediante PCR independiente y secuenciación reversa. RESULTADOS En ninguno de los 2 pacientes se detectaron mutaciones germinales inactivadoras de CDH1. Se encontró un sitio de polimorfismo C→A en la región promotora de CDH1 en la posición –160 en ambos pacientes (Fig. 2). En el paciente 2 se encontró una alteración en el intrón 1, posición de nucleótido 48+6T→C. DISCUSIÓN La identificación de genes que predisponen a síndromes de cáncer familiar constituye un avance fundamental en la compresión de las génesis de las neoplasias. En México, la proporción de pacientes con CG menores de 40 años es alta y una proporción significativa de esta población presenta agregación familiar (3). Existen pocos estudios que exploren la influencia que los factores genéticos tienen en la alta frecuencia de CG en la población mexicana (10,11). La E-cadherina es una proteína de membrana cuya principal función es la preservación de la integridad epitelial a través del mantenimiento de la adhesión intercelular y la polaridad celular (Fig. 3). El gen CDH1 codificador de E-cadherina se localiza en el cromosoma 16q22.1. La disfunción de la E-cadherina se asocia al desarrollo de tumores de alto grado, invasión y metástasis en múltiples neoplasias (10-15). En 1998 se describieron por primera vez mutaciones germinales en el gen CDH1 responsables del desarrollo de CG difuso de alto grado en pacientes jóvenes (7). Estas mutaciones presentan un patrón de herencia autosómico dominante con penetrancia incompleta. La eficacia
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POLIMORFISMOS DE NUCLEÓTIDO ÚNICO (SNPs) EN LA REGIÓN PROMOTORA CDH1 EN CÁNCER GÁSTRICO FAMILIAR
de la vigilancia endoscópica en el CG difuso es pobre debido a que estos tumores suelen presentarse como una infiltración submucosa en vez de formar masas exofíticas. Hasta la fecha existen sólo 3 reportes sobre el empleo de gastrectomías profilácticas en 11 pacientes portadores de mutaciones germinales inactivadoras de CDH1 (16-18). Las mutaciones de CDH1 son consideradas las alteraciones somáticas más frecuentemente encontradas en el CG difuso, pudiéndose detectar en más del 50% de los casos (19). En el presente análisis no se identificaron mutaciones germinales inactivadoras de CDH1 por lo que es difícil dar recomendaciones con respecto a vigilancia y manejo de estos pacientes y sus familias basados en este único hallazgo. Recientemente, Li y cols. describieron un SNP C→A en la posición –160 de la región promotora de CDH1 con efecto directo en la regulación transcripcional de CDH1 en una línea celular de cáncer de próstata. Este polimorfismo se asocia a una reducción de 68% en la actividad transcripcional de CDH1 in vitro (20). Un estudio reciente en pacientes italianos demostró que el polimorfismo –160 C→A en la región promotora de CDH1 confiere un aumento en el riesgo de desarrollar CG difuso esporádico (21). En ese estudio se realizó la genotipificación de los polimorfismos en las posiciones –160 C→A, 48+6T→C y 2076C→T, encontrándose que el haplotipo A-T-C se asocia a un aumento en el riesgo. Otros 2 estudios, uno en pacientes coreanos y otro en pacientes taiwaneses no encontraron asociación entre el polimorfismo –160 C→A y CG (22,23). Estas discordancias entre estudios pueden deberse a los diferentes antecedentes genéticos y ambientales entre grupos étnicos distintos. La variación genética más frecuente es el SNP, el cual ocurre con una frecuencia de al menos uno por cada 1.000 pares de bases de las aproximadamente 3,2
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billones que conforman el genoma humano. Para que una variación sea considerada un SNP debe ocurrir en al menos 1% de la población. La mayor parte de los SNPs ocurren en las regiones no codificadoras del genoma y por ende no se manifiestan fenotípicamente (24), sin embargo, se ha demostrado que los SNPs que ocurren particularmente en la región promotora pueden tener un efecto importante en la trascripción de su gen (25). La identificación del polimorfismo –160 C→A en estos 2 pacientes confiere teóricamente un aumento en el riesgo de desarrollar CG difuso. Los miembros de las familias presentan un riesgo mayor para CG difuso al igual que otras neoplasias. Si bien no existe evidencia suficiente para considerar al polimorfismo –160 C→A como un factor etiológico determinante de CG difuso, es probable que su relación a un riesgo incrementado en los portadores se deba a una asociación con uno o más polimorfismos adicionales dentro o cerca del gen CDH1. Debido a que la frecuencia y tipo de mutaciones del gen CDH1 en población mexicana se desconocen, es difícil estimar el riesgo que este polimorfismo confiere. La vigilancia estrecha de los familiares de estos pacientes es de vital importancia. Sin embargo, a pesar de endoscopias frecuentes con múltiples biopsias, un familiar del paciente 1 fue diagnosticado recientemente con CG difuso con extensión submucosa y metástasis peritoneales. El uso de gastrectomía profiláctica en los individuos con riesgo no se recomienda en ausencia de mutaciones inactivadoras de CDH1. Una opción que ha sido explorada por algunos grupos es la realización de cromo-endoscopia y biopsias de sitios sospechosos. Es necesario llevar a cabo estudios epidemiológicos en población mexicana con el fin de analizar la influencia que diversas alteraciones genéticas conocidas o no tienen en la génesis del carcinoma gástrico difuso.
