Revisión de la estructura genética poblacional de una especie de un ave endémica en cinco localidades de los Ghats occidentales del sur de la India

Revisión de la estructura genética poblacional de una especie de un ave endémica en cinco localidades de los Ghats occidentales del sur de la India. Marín Camacho, V. Estudiante de Biología, Universidad del Quindío, Colombia RESUMEN La historia evolutiva de una especie puede verse afectada por condiciones imperante en diferentes periodos de tiempo. Existen cinco especies pertenecientes al género Brachypteryx, cuatro de las cuales se encuentran en la cordillera del Himalaya.La quinta, El Alicorto de vientre blanco (Brachypteryx major), es la única entre los Ghats occidentales, y tiene dos subespecies B. m major y B. m albiventris que aún están en revisión. Una forma de inferir si existen o no dichos cambios génicos, es a través de la Filogeografía o elestudio de los principios y procesos que gobiernan la distribución geográfica de los linajes genealógicos a nivel intraespecíficos mediante el uso de caracteres de ADNmt y el uso de análisis filogenéticos o redes de haplotipos. En esta revisión se utilizan diferentes metodologías para estudiar y analizar las poblaciones de cinco “sky islands” o extensiones de montañas que separan poblaciones en donde se puede evidenciar procesos evolutivos importantes que hacen parte en la historia de esta especie de ave. PALABRAS CLAVE: Filogeografía, Ghats occidentales, genética evolutiva, diversidad haplotípica. ABSTACT The evolutionary history of a species may be affected by conditions in different periods. There are five species of the genus Brachypteryx, four of which are in the Himalayas. The fifth, The Shortwing white belly (Brachypteryx major), is unique among the Western Ghats, and has two subspecies B. m major and B. m albiventris, both still under revision. One way to infer whether these genetic changes exist is through phylogeography or the study of the principles and processes governing the geographic distribution of genealogical lineages at intraspecific level using mtDNA characters and use analysis or phylogenetic haplotype networks. In this review different methodologies are used to study and analyze the populations of five "sky islands" or extensions of mountains that separate populations where it may reveal important evolutionary processes that make up the history of this species of bird. KEYWORDS: phylogeography, Western Ghats, evolutionary genetics, haplotype diversity.

INTRODUCCIÓN El proceso de especiación es principalmente un asunto de evolución de mecanismos que impiden la cruza. La divergencia genética durante el periodo de aislamiento es una condición necesaria para el nacimiento de una nueva especie, pero no es suficiente, a menos que parte de esa divergencia genética provoque el desarrollo de algo que asegure el aislamiento reproductivo (Audesirk & Byers, 2004). Uno de los principales impulsores de la especiación es el aislamiento geográfico, como se ejemplifican las especies que viven en las islas. Aunque la mayoría de las investigaciones sobre este fenómeno evolutivo, se ha asociado con las islas oceánicas, recientemente las islas continentales o “sky islands” han recibido una atención creciente (Warshall, 1994; Wikramanayake, et al. 2001). Estas sky islands son extensiones de montañas que se encuentran aisladas por planos de bosques o desiertos que asemeja el agua en los archipiélagos oceánicos, el cual actúan como una barrera para la dispersión facilitando la divergencia de poblaciones aisladas (Mccmormack, et al. 2009). La interacción entre estos procesos proporciona información valiosa al estudiar las poblaciones que se encuentran geográficamente aisladas en estas islas, como es en el caso de las montañas Ghats occidental del sur de la india, el cual forman un sistema de islas de más de 1600 kilómetros, donde representan una de las regiones ricas en biodiversidad del mundo, además de ser una región considerada hotspots en el mundo, el cual se puede encentrar especies endémicas e importantes para la conservación (Robin, et al. 2010). Por otro lado a nivel molecular el ADN mitocondrial ha sido ampliamente sugerido y utilizado como marcador molecular; su condición haploide, herencia matrilineal, alta tasas de evolución y la presencia de regiones conservadas y variables, facilitan la tipificación molecular de individuos y su uso para la diferenciación de los mismos a diferentes escalas taxonómicas, ventajas que han sido aprovechadas en estudios con diversos grupos de animales vertebrados, incluyendo a las aves. (Sperling et al. 1994; Behura, 2006). Brachypteryx es un género de aves paseriformes en la familia Muscicapidae, en donde se encontraba la especieendémica amenazada de la India Brachypteryx major. Rasmussen y Anderton en el año 2005 revisaron esta clasificación por medio de estudios genéticos y morfológicos y como resultados tuvieron que esta especie, evidenció por medio de marcadores moleculares que pertenecían a dos subespecies distintas, el cualcambió yel cual se dividió en las subespecies B. m. major (alicorto azul) y B. m. albiventris (alicorto ventriblanco). Según Birdlife International en el 2012 estas especies se encuentran en peligro ya que su hábitat es muy reducido, el cual está disminuyendo aceleradamentecomo resultado de la agricultura, fragmentación y degradación de su ecosistema. Se pueden encontrar en bosques protegidos entre 900 a 2100 m de elevación (del Hoyo et al. 2005, R. Vijayan in litt. 2010). Con el fin de investigar los impactos de las barreras biogeográficas, la estructura del hábitat y los posibles efectos de las transiciones climáticas del cuaternario sobre las especies de las islas en los Ghats occidentales, se eligió esta especie de ave y se encuentra en poblaciones discretas que están separados por el Palghat (40 km de ancho) y la Shencottah (7km de ancho), como también lagunas geográficas con más de 80 km.

El objetivo de este trabajo es el de revisión y comparación los resultados en donde se analiza la estructura de la poblacion de las dos especies B. m major y B. m albiventris para investigar si las brechas geográficas afectan a su estructura poblacional y si la estructura genética de estas confirman la especiación evolutiva que causaron las sky islands en el oeste de la india del complejo montañoso Ghats.

MATERIALES Y MÉTODOS Este trabajo está basado en el artículo “Ancient Geographical Gaps and Paleo-Climate Shape the Phylogeography of an Endemic Bird in the Sky Islands of Southern India” (Robin, et al. 2010). Para los análisis filogeográficos se utilizaron los tres marcadores mitocondriales (citocromo b, citocromo oxidasa subunidad 1 y la región de control D-loop) y uno nuclear, el intrón deshidrogenasa marcador nuclear gliceraldehído-3-fosfato (G3PDH), en total 2.594 pb, obtenidas por 33 individuos que reportan los autores en cinco islas indias: Bababudan Hills Karnataka (n = 1), Ooty - Nilgiri (n = 2), Grasshills – Anamalai Hills (n = 7), Kodaikanal Anamalai / Palni Hills (n = 2), High -Wavies - Cardamomo Hills (n = 11) y Peppara – Agasthyamalai Hills (n = 10), las cuales todas se conocen como reservas o parques para la conservación de esta especie de alicorto azul. Se utilizaron las secuencias de los autores por medio de los códigos de acceso en la base de datos de secuencias genéticas (genebank), las cuales fueron editadas manualmente y ensambladas utilizando el editor del software MEGA ver 6.0. Fueron alineadas todas las secuencias de cada uno de los cuatros marcadores genéticos, utilizando Muscle (comparando con la metodología de alineación del artículo base), el cual se utilizaron los parámetros por defecto. Los análisis de distancia genética y búsqueda de sitios conservados, variables y filogenéticamente informativos se realizaron con el programa MEGA (Tamura et al., 2007). Para comprender y entender mejor la estructura de la población, distancias genéticas entre los grupos se calcularon utilizando el modelo de sustitución nucleotídica Kimura-2 en MEGA 6.0, seleccionando la opción de eliminar los gaps en comparaciones a pares. Estas distancias se calcularon para cada una de las tres regiones mitocondriales (COI, cyt b, D-lopp) por separado y para el marcador nuclear G3PDH. Seguido de esto mediante el programa DNAsp ver 5, se generaron los ficheros con extensión Nexus y Fasta, para realizar los cálculos de diversidad molecular y la generación de los output para la construcción de la redes haplotípicas de parsimonia estadística (Rozas et al. 2003). Por medio de las secuencias de los dos marcadores que se utilizó en este estudio, se realizó la construcción de un árbol filogenético, utilizando el programa Mega, en donde se analizó tomando en consideración el test de Máxima parsimonia e inferencia Bayersiana (Maximum Likelihood tree) con la finalidad de estimar una filogenia que mostrara la historia evolutiva de esta ave endémica. Se utilizó el programa en Java de FigTree ver 1.4.2 para modificar el árbol que resultó del análisis anterior.

Los valores de diversidad genética (H) y nucleótida (Pi) se obtuvieron mediante el software DNAsp. El análisis de filogenia intraespecífica utilizando "networks" o redes de haplotípos fue realizado con el programa NETWORK (Bandelt et al., 1999) con el algoritmo "median joining" en los marcadores Cyt b y COI, este se hizo con el fin de comprender mejor como esta organizadas estas poblaciones por haplotípos gráficamente. Por último se utilizó programa ARLEQUÍN ver 3.5.1.2el cual se realizó una comparación de pares nucleotídicas Fst entre las poblaciones de Brachypteryx, evaluando también la diferenciación poblacional y flujo génico. Los valores de significación se determinaron con 1000 permutaciones en el mismo software. Para este análisis también se utilizaron los mismos grupos de población y los mismos marcadores en el análisis anterior. RESULTADOS Y DISCUSION: Se encontró que las barreras geográficas en los Ghats occidentales indios, intervinieron significativamente en la estructura de la población de esta especie de ave. La distancia genética (kimura-2 parámetro) dentro de los grupos analizados, se puedo ver que la mayoría de los grupos de diferentes regiones tenían muy baja variación dentro del grupo, lo que no sucede con todos los marcadores D-loop. Las mayores distancias que se presentaron en los grupos separan a las poblaciones Bababudan y Ooty del complejo de Palghat Gap Anamalai que se compone por Grasshills y Kodaikanal. Para el caso de los marcadores mitocondrial D-loop y nuclear G3PDH, no se excluyeron estos resultados, ya que algunas bases nucleotídicas no se encontraban completas o estaban indefinidas, que al hacer el análisis de diversidad haplotípica, estos se sobrestimaron. Los valores de diversidad haplotípica Los valores de diversidad haplotípica (Hd) (Tabla. 1) alta con un rango entre 0.6553 – 0.8551 indicando una alta cantidad de haplotípos únicos y exclusivos con una tamaño muestral bajo en las poblaciones, bajo esta condiciones los cálculos de diferenciación genética puede ser subestimados. A nivel de marcadores moleculares el análisis de diversidad haplotípica arrojó para el caso de citocromo b un mayor porcentaje. Larizza y colaboradores en el 2002) consideraron importante la región mitocondrial por contener el origen de replicación, igualmente está involucrado en el transporte de electrones en la cadena respiratoria de la mitocondria, lo que demuestra su utilidad en estudios complejos de especie, especies morfológicamente similares e incluso al interior de especies (Meyer, 1994) como es en el caso de esta ave presente en esta revisión.

Marcador Cytb Cox-1 D-loop G3PDH

Diversidad Genética (Número De Haplotípos) 15 7 -

Diversidad Haplotípica (H) 0.8851 0.6553 -

Tabla 1. Diversidad haplotípica y diversidad genética obtenidos a partir de los marcadores estudiados y analizados.

Los gráficos de construcción filogenética bajo el enfoque MJ (Median-Joining Network) mostraron una red reticulada con múltiples conexiones entre los haplotipos. En cuanto a la red de haplotípos del marcador cyt b y Cox-1 se puede evidenciar que las poblaciones en cada lado del complejo montañoso muestran que las barreras geográficas juegan un papel importante en la estructuración de la variación genética en las especies en estas localidades. En el haplotípo 6 (Fig. 1) se puede deducir que las localidades Grasshills, Kodiakanal y Highwavies está sucediendo las principales fuerzas evolutivas (las que cambian las frecuencias de las mutaciones o los haplotípos en la población) como lo son la mutación, selección, migración y deriva, aunque otras fuerzas también tienen un efecto importante, como la recombinación (y otros procesos derivados) u otros tipos de flujo génico (e.g., introgresión, transferencia horizontal), lo que puede haber sucedido entre esta especie, ya que geográficamente están muy cercanas a las demás, lo que no se pudo observar en los demás haplotípos y localidades lejanas. Localidad

# De Haplotípo;#individuos

Números De Acceso (Genbank)

Bababudan Hap_1[1] GU644572 Ooty Hap_2[1];Hap_3[1] GU644573-GU644575 Grasshills + Kodiakanal Hap_4[1];Hap_5[1];Hap_6[7];Hap_7[1];Hap_8[1] GU644576- GU644584 Highwavies Hap_9[6]; Hap_10[1]; Hap_11[1] GU644585- GU644592 Peppara Hap_12[7]; Hap_13[1]; Hap_14[1]; Hap_15[1] GU644593- GU6446002 Tabla 2: Resultados análisis de haplotípos de cyt b de alicorto en las cinco localidades del sur de la India

Bababudan Ooty Grasshills + Kodiakanal Highwavies Peppara

Figura 1. Red de haplotípos de la especie de alicorto azul: marcador Cyt b (1067 pb). Utilizando el algoritmo de Network median-joining (MJ).

Figura 2. Red de haplotípos de la especie de alicorto azul: marcador COX (714 714 pb). Utilizando del algoritmo de Network median median-joining (MJ) En el caso específico de la Palghat Gap en los Ghats Occidentales, que es conocido por ser una barrera para el flujo de genes enes de diferentes organismos como los E Elefantes y cecilias (Gower et al 2007), y para algunas plantas (Baulikar et al, 2004), se puede decir que este trabajo reafirma la hipótesis de que las barreras geográficas, participan en un proceso de especiaciónespeciación vicarianza en estas poblaciones aisladas, y que a medida de los millones de años que pasaron, estas especies se dividieron ieron en subespecies.

B

O

G+K H P

Figura 3. Árbol filogenético del alicorto Brachypteryx myiomela, en sky islands (Ghats Occidentales) del sur de la India basado en el marcador Cytb. B – Bababudan, O – Ooty, (G - Grasshills + K- Kodaikanal) – Anamalai, y H –HighWavies, P – Peppara.

La población Bababudan mostró un alto nivel de diferenciación en comparación con todas las otras poblaciones para la mayoría de las regiones (Fig 3.), pero esto no fue estadísticamente significativo, posiblemente debido al bajo tamaño de la muestra. Las poblaciones Bababudan, Ooty y Peppara forman clados filogenéticos separados y estaban todos en diferentes localidades, lo que se puede deducir que las barreras geográficas de este complejo montañoso (Ghats Occidentales) interfieren en el intercambio genético de esta especie. El árbol filogenético para el marcador COX-1, mostró el mismo patrón de distribución, lo que puede indicar que estas dos regiones moleculares están estrechamente relacionadas entre sí, esto puede estar evidenciado a que la tasa alta de evolución a nivel de secuencias de nucleótidos, puede estar prácticamente nula la recombinación, el cual puede haber una herencia estrictamente materna. (Krzywinski & Besansky, 2003). Fst Cyt b BaBd

Ooty

Grhl

Kodi

Hiwv

Ooty

1.000

-

-

-

-

GrHI

0.994

0.992

-

-

-

Kodi

1.000

1.000

0.000

-

-

HiWv

0.996

0.993

0.013

0.000

-

Pepr

1.000

1.000

0.989

1.000

0.989

BaBd

Ooty

Grhl

Kodi

Hiwv

Ooty

0.000

-

-

-

-

GrHI

0.990

0.981

-

-

-

Kodi

0.989

0.959

0.032

-

-

HiWv

0.983

0.978

0.233

0.173

-

Pepr

0.991

0.985

0.972

0.973

0.962

Cox1

Tabla 3. Kimura-2-parametros: distancia genética (marcador: Cyt b y Cox1) en poblaciones de B. myiomela en los Ghats occidentales.

Sobre el plumaje y algunas características morfológicas diferentes entre las poblaciones de alicorto, ha habido cierto debate, con respecto a la validez de dos subespecies Brachypteryx m. major y B. m albiventris. Los anteriores resultados de esta revisión muestran claramente que la distancia genética entre estas poblaciones es mayor que el aceptado para dos poblaciones de aves para ser considerados como dos especies diferentes basados en el análisis genético de la del citocromo oxidasa subunidad 1 (COI). Encontramos que las dos poblaciones son mutuamente monofilético y por lo tanto, puede ser clasificado como dos especies diferentes. El análisis estadístico Fst mostró similaridad con los datos que obtuvieron los autores en el artículo base, en cuanto a las distancias genéticas obtenidas por los dos marcadores (Cyt b, Cox1), lo que se puede decir que la comparación de metodologías entre el alineamiento en Clustal y Muscle no fue relevante. Se pudo observar que aquellas distancias genéticas que estuvieron entre un 0.989 y 1.000 pueden indicar que estas poblaciones están relacionadas filogenéticamente, lo que respalda a los datos obtenidos anteriormente.Sin embargo hubieron poblaciones en donde no hubo correlación con otras, tendiendo una distancia nula o no significativa. En conclusión los datos molecular jugaron un papel crítico y distintivoentre los escenarios evolutivos, los marcadores genéticos son neutrales, el cual pudo proporcionar un medio para estimar el tiempo de divergencia y la reconstrucción de la historia de la divergencia entre las sky islands y la especie de Brachyperyx myiomela. AGRADECIMIENTOS Agradezco a Juan David Carvajal por su conocimiento en bioinformática y apoyo constante a esta revisión.

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