Relatório

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Medicina – 148 Turma C

Relatório de Aula Prática
Bioquímica Celular
"PROTOCOLO PARA PURIFICAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL DE BACTÉRIAS (MÉTODO DE MINI-PREP OU LISE ALCALINA"


Eduardo Brasil
Fabrícia Figueiredo
Fernanda Souza
Gustavo Melo
Juliana Arruda









SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 3
2 DESENVOLVIMENTO....................................................................................... 4
3 OBJETIVO....................................................................................................... 5
4 METODOLOGIA............................................................................................ 6


















1 Introdução
Todos os organismos vivos possuem DNA genômico, ele contém os genes responsáveis pelo funcionamento e pela sobrevivência da célula, já que estes genes são responsáveis por codificar proteínas, como enzimas e proteínas estruturais. O tamanho do DNA genômico varia dependendo da espécie, um DNA genômico humano possui em torno de 3 bilhões de pares de bases (pb) organizadas em 46 cromossomos, já o DNA genômico de Escherichia coli possui em torno de 4.6 milhões de pb. Além disso, o DNA genômico difere não só no tamanho, como também no formato. A maioria dos organismos, assim como os humanos, possui DNA genômico linear, enquanto que o DNA genômico bacteriano é circular.
A maioria das bactérias possui, além do DNA genômico, múltiplas cópias de um pequeno DNA circular chamado DNA plasmidial, ou simplesmente plasmídeo (figura 2). Em pouquíssimas bactérias este plasmídeo é linear. Estes são responsáveis por desempenhar diversas funções, que podem, por exemplo, permitir a sobrevivência da bactéria em condições extremas, e mais, possuem genes que codificam substâncias que irão causar a morte de outros microorganismos, inclusive bactérias, impedindo o crescimento destes no meio, isso é observado na natureza quando ocorre a competição por nutrientes.







2 Desenvolvimento
Para extração de DNA plasmidial, podem ser utilizados dois procedimentos diferentes: lise alcalina e método de "boiling". O método utilizado na aula prática para o isolamento e purificação do DNA plasmidial foi o da lise alcalina. Esse método é muito robusto e apresenta bons resultados qualitativos e quantitativos sob diversas condições. O método de isolamento por lise alcalina baseia-se na diferença em desnaturação, em condições alcalinas (pH~12), entre o DNA plasmidial circular e o cromossômico de alto peso molecular.
Após a separação do DNA plasmidial, foi feita a eletroforese em gel de agarose, técnica utilizada para a visualização dos fragmentos de DNA, após este ser extraído. Ela é utilizada para separar, identificar e isolar os fragmentos de DNA a partir da influência de um campo elétrico aplicado. Como os fragmentos de DNA possuem aproximadamente a mesma carga é necessária a utilização de um meio viscoso para que este seja separado por tamanho, por isso utiliza-se este gel, os quais formam uma malha, que possibilita a separação de fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho.










3 Objetivo
Extrair o DNA genômico e plasmidial da bactéria Escherichia coli.
Analisar a função de cada reagente utilizado e as diferenças entre as três técnicas realizadas.
Realizar, em gel de agarose, eletroforese do DNA extraído e, a partir de fotografia do gel, compreender os resultados apresentados.

















4 Metodologia
4.1 Materiais
Tubos de microcentrífuga;
Pipetas;
Tips;
Tubo de descarte;
Microcentrífuga;
Fonte de eletroforese;
Banho Maria;
Banho de gelo;
Cuba de eletroforese
Reagentes
4.2 Métodos
4.2.1 Centrifugar 1,5ml da cultura de bactéria em microtubos a 12.000g por 5min, retirar o sobrenadante, acrescentar novamente 1,5ml da mesma cultura e centrifugar novamente.
4.2.2 Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento (pellet) com 100 μL de solução 1; Agitar vigorosamente e pipetar várias vezes para obter uma suspensão homogênea.
Solução 1: 50mM glicose; 25mM Tris.HCl (pH8); 10mM EDTA (pH 8)
4.2.3 Adicionar 200 μL de solução 2. Misturar delicadamente, invertendo os tubos.
Solução 2: 0,2M NaOH; 1% SDS
4.2.4 Adicional 150 μL de solução 3 gelada. Misturar delicadamente, invertendo os tubos; colocar no gelo por 5min.
Solução 3: 5M acetato de potássio; ácido acético gracial suficiente para ajustar o pH para 5.
4.2.5 Centrifugar a 12.000g por 5min e transferir 400 μL do sobrenadante para um tubo novo.
4.2.6 Precipitar o DNA com 400 μL de isopropanol 100% (400 μL por tubo) , misturar bem e incubar por 2 min em temperatura ambiente.
4.2.7 Centrifugar a 12.00g por 10 min, remover o sobrenadante com cuidado para não perder o sedimento de DNA e acrescentar 1ml de etanol 70%.
4.2.8 Após rápida centrifugação (12.00g por 2 min), retirar o etanol com cuidado para não deslocar o DNA (sedimento branco), secar o tubo e ressuspender o DNA em 20 μL de tampão TE (Tris.HCl 10mM/EDTA 0,1 mM).
4.2.9 O gel de agarose foi preparado previamente. A voltagem aplicada foi de 100V e prosseguiu a corrida até que os corantes tenham migrado uma distância de aproximadamente 10cm no gel. O gel foi examinado por luz ultravioleta e fotografado pela professora para análise posterior.












5 Resultados

Questão 2) Com base nos tamanhos conhecidos dos fragmentos no padrão de peso molecular, calcule o tamanho (em pares de bases) do plasmídeo e o tamanho do fragmento que foi inserido entre os sítios de EcoRI nesse plasmídeo:
Com base na fita padrão, o tamanho do plasmídeo se encontra na faixa de 4kb, e o fragmento inserido entre os sítios EcoRI possui comprimento aproximado de 0,8kb.
Questão 3) Explique por que o plasmídeo não tratado com a enzima não apresenta um padrão de migração no gel compatível com o tamanho calculado.
O DNA circular possui uma menor afinidade ao gel de eletroforese se comparado com o DNA linear (obtido por meio da atividade da enzima EcoRI, que cliva a molécula de DNA no sítio de seis bases nucleotídicas específicas, cuja sequência é GAATCC), ou seja, o DNA circular corre mais rapidamente pelo gel. Lembrando que o DNA linear e circular apresentam mesma massa, neste caso, a influência para a diferença de velocidade da corrida consiste no formato do material genético. Há outra justificativa para essa diferença: alguns plasmídeos apresentam mais de uma forma, podendo variar do mais relaxado ao mais enovelado, o que altera a sua velocidade na corrida se comparado ao DNA linear.