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PIEL FORMACION CONTINUADA EN DERMATOLOGIA www.elsevier.es/piel
Original
Reaccio´n en cadena de polimerasa para detectar Mycobacterium leprae en muestras de moco nasal de convivientes de pacientes con lepra Marcelo Gabriel Medinaa,, Manuel Fernando Gime´neza, Marı´a Laura Molinaria, Marı´a de los Angeles Lo´pezb, Alicia Sorrentinob y Patrı´cia Mottab a
Centro Dermatolo´gico Dr. Manuel M. Gime´nez, Chaco, Argentina Servicio de Histocompatibilidad, Hospital Dr. Julio C, Perrando. Chaco, Argentina
b
i n f o r m a c i o´ n d e l a r t ´ı c u l o
r e s u m e n
Historia del artı´culo:
Antecedentes: El descenso mundial de la prevalencia de la lepra no ha coincidido con un
Recibido el 9 de abril de 2010
descenso de su incidencia, hecho que podrı´a explicarse por la presencia de infecciones
Aceptado el 18 de mayo de 2010
subclı´nicas bacilı´feras en la comunidad.
On-line el 16 de octubre de 2010
Objetivo: El objetivo de este estudio consistio´ en detectar Mycobacterium leprae en muestras
Palabras clave:
de moco nasal de contactos intradomiciliarios, sin signos ni sı´ntomas, de pacientes con
Lepra
lepra empleando una prueba de reaccio´n en cadena de la polimerasa anidada (n-PCR), con
n-PCR
el fin de utilizar dicha te´cnica en la monitorizacio´n de poblaciones de alto riesgo.
Subclı´nica
Me´todos: Se utilizo´ la te´cnica n-PCR utilizando un par de iniciadores LP1 y LP2 externos para
Convivientes
amplificar un fragmento de 129 pares de bases (pb) del elemento RLEP3 regio´n o secuencia X17153 de M. leprae y un segundo par de iniciadores LP3 y LP4 que hibrido´ dentro de la secuencia anterior para amplificar un producto final de 99 pares de bases. La prueba se aplico´ a 26 contactos intradomiciliarios de pacientes procedentes de a´reas con alta prevalencia de lepra. Resultados: Se detecto´ la presencia del bacilo en muestras de moco nasal de 5 (19,23%) de 26 contactos intradomiciliarios sanos. Todos los contactos intradomiciliarios de casos que resultaron positivos (n¼5) procedı´an de municipios con una prevalencia alta. Conclusiones: La te´cnica n-PCR es una herramienta u´til de deteccio´n y seguimiento precoz de posibles casos de lepra y se puede utilizar en la monitorizacio´n de poblaciones de alto riesgo. La te´cnica de PCR puede usarse en la deteccio´n subclinica de la infeccio´n por M. leprae. & 2010 Elsevier Espan˜a, S.L. Todos los derechos reservados.
Polymerase chain reaction to detect Mycobacterium leprae in samples of nasal mucus from household contacts of patients with leprosy ab st rat Keywords:
Background: While the prevalence of leprosy has declined around the world, there has not
Leprosy
been a corresponding decrease in its incidence, which could be explained by the presence
n-PCR
of subclinical bacilliferous infections in the community.
Autor para correspondencia.
Correo electro´nico:
[email protected] (M.G. Medina). 0213-9251/$ - see front matter & 2010 Elsevier Espan˜a, S.L. Todos los derechos reservados. doi:10.1016/j.piel.2010.05.004
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Subclinical
Objective: The objective of this study was to investigate the use of a nested-polymerase
Household contacts
chain reaction (n-PCR) test to detect Mycobacterium leprae in samples of nasal mucus from asymptomatic household contacts of patients with leprosy and if can be used to monitor high-risk populations. Methods: We standardized and optimized a n-PCR technique using a pair of primers LP1 and LP2 external to amplify a fragment of 129 base pairs (bp) region RLEP3 element or sequence X17153 from M. leprae and a second pair of primers LP3 and LP4 that hybridize within the above sequence to amplify a final product of 99 base pairs. We applied the PCR test to 26 healthy household contacts of leprosy patients from area where there was a high prevalence of the disease. Results: Bacillus was detected in the nasal mucus samples of 5 (19,23%) of the 26 household contacts. The PCR positive household contacts of leprosy cases were from municipalities with very high prevalence levels. Conclusions: The n-PCR is useful as a tool for detection and early follow-up of possible leprosy cases. It can be used to monitor high-risk populations. Developing and using a PCR test to detect subclinical Mycobacterium leprae infection & 2010 Elsevier Espan˜a, S.L. All rights reserved.
Introduccio´n La lepra es una enfermedad infecciosa cuyo agente etiolo´gico es Mycobacterium leprae, bacteria que au´n no ha podido ser cultivada in vitro, por lo cual el diagno´stico de la lepra se basa en los hallazgos clı´nicos, junto con el examen histolo´gico y la visualizacio´n microsco´pica de los bacilos a´cido-alcohol resistentes en los frotis de tejidos1. Desde el punto de vista epidemiolo´gico, afecta a millones de personas en el mundo y presenta una prevalencia global de 1,25 casos/10.000 habitantes2. India tiene el mayor nu´mero de casos, seguido por Brasil y Birmania. De acuerdo a recientes estadı´sticas de la OMS, esta´n decreciendo en aproximadamente 107.000 casos desde el an˜o 2003. Los casos registrados de lepra fueron 286.063 y 407.791 nuevos casos en el an˜o 2004. Aunque el nu´mero de casos continu´a cayendo, hay bolsones de alta prevalencia en ciertas a´reas como Brasil, Sudeste ´ frica (Tanzania, MadagasAsia´tico (India, Nepal), partes de A car, Mozambique) y el oeste del Pacı´fico. En Argentina es ende´mico, en regiones del noreste (Formosa, Chaco, Misiones, Corrientes y Entre Rı´os) y el centro del paı´s (Co´rdoba, Santiago del Estero, Tucuma´n y Santa Fe´) y Buenos Aires. Dentro de esta a´rea ende´mica existen zonas de ma´s importante estratificacio´n epidemiolo´gica, lugares de alta densidad poblacional y hacinamiento, conformando a´reas de gran concentracio´n de casos de lepra. A pesar del descenso mundial de la prevalencia de la lepra no se ha observado un descenso de su incidencia, es decir, que no se ha podido prevenir la transmisio´n, a pesar de que se ha adoptado la poliquimioterapia en programas con seguimiento estricto3. Por otro lado, si bien son escasos los pacientes con lepra lepromatosa, la mayorı´a de los habitantes de a´reas ende´micas presentan signos de exposicio´n a M. leprae3. Esto se deberı´a al largo perı´odo de incubacio´n de la enfermedad y a las diferentes presentaciones clı´nicas, por lo tanto existe una gran proporcio´n de pacientes que se mantienen largo tiempo en la forma subclı´nica en la que pueden presentar una fase bacilı´fera de la infeccio´n primaria, localizada en la mucosa nasal, que los convierte en un foco transitorio de diseminacio´n de bacilos3. Se desconoce la importancia de la infeccio´n subclı´nica y su relevancia en
la transmisio´n de la enfermedad, la cuantificacio´n de la proporcio´n de casos subclı´nicos en una poblacio´n podrı´a aumentar el conocimiento de la diseminacio´n y transmisio´n de M. leprae y de los factores de riesgo. Las personas que esta´n en contacto permanente con los enfermos son quienes tienen mayor riesgo de contraer tanto la infeccio´n como la enfermedad4 y por lo tanto, es importante encontrar un me´todo ra´pido, sensible y especı´fico que permita realizar un diagno´stico precoz de esta infeccio´n subclı´nica entre los contactos intradomiciliarios de los pacientes, con el fin de vigilar y evaluar la importancia de tales casos en la cadena de transmisio´n de la enfermedad4. En las u´ltimas dos de´cadas, se han desarrollado como herramientas de diagno´stico confiable y sensible nuevos me´todos de biologı´a molecular, como la reaccio´n en cadena de la polimerasa para la deteccio´n de pato´genos de muchas enfermedades infecciosas, incluida la lepra. Varios investigadores usaron la PCR para amplificar varias secuencias del genoma de M. leprae con el fin de mejorar la deteccio´n de bajo nu´mero de bacterias5. Como blancos se han utilizado diferentes secuencias, como las que codifican las proteı´nas antige´nicas de 15 kDa6, 18 kDa7,8 y 36 kDa9,10, la proteı´na de 65 kDa11,12, la secuencia repetitiva RLEP13,14, la subunidad 16S del ARNr15 y la enzima supero´xido-dismutasa16. Entre sus aplicaciones se encuentra la deteccio´n de mutaciones especı´ficas en genes que le puedan conferir al bacilo resistencia a la rifampicina o a las fluoroquinolonas, como las mutaciones de los genes rpob17 y gyr A/B18, respectivamente. En este estudio se investigaron muestras de moco nasal de los contactos intradomiciliarios de pacientes con lepra que concurrieron para su atencio´n a un centro dermatolo´gico, de un a´rea de alta prevalencia de la Repu´blica Argentina, para detectar la presencia de M. leprae usando una n-PCR usando como blanco la secuencia repetitiva RLEP, que codifica proteı´nas antige´nicas del M. leprae19.
Materiales y me´todos Se realizo´ un estudio prospectivo, transversal y descriptivo, en el Centro Dermatolo´gico de Resistencia, Chaco. Se
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investigaron los contactos intradomiciliarios; sin signos ni sı´ntomas de enfermedad, que concurrieron durante octubre de 2008 a octubre de 2009. Se registraron en fichas los datos demogra´ficos y clı´nico-epidemiolo´gicos de intere´s de todos los contactos intradomiciliarios incluidos en el estudio. Posteriormente los datos se trasladaron a una base de datos Epi info. A partir de los datos consignados, se realizo´ un ana´lisis de frecuencias de las variables de intere´s. Se recolectaron muestras de moco nasal de los contactos intradomiciliarios de pacientes con lepra diagnosticados histopatolo´gica y clı´nicamente por el programa local de control de lepra de la provincia del Chaco, Argentina. Las muestras fueron tomadas en el Centro Dermatolo´gico de Resistencia, Chaco, utilizando hisopos de algodo´n y realizando movimientos rotatorios sobre el tabique nasal. Los hisopos fueron colocados en tubos de ensayo este´riles, de cierre herme´tico, y en 24 horas fueron enviados y refrigerados, en el Servicio de Histocompatibilidad del Hospital Dr. Julio C. Perrando. A cada tubo de ensayo con el hisopo se le an˜adieron 1.500 ul de buffer TE (Tris-HCL [0,01 M], PH 7,6; EDTA [0,001M] PH 8,3) se agito´ fuertemente el hisopo dentro del tampo´n y la suspensio´n obtenida se dividio´ en tres alı´cuotas de 500 ul que fueron congeladas a 70 1C hasta su utilizacio´n. Como controles positivos se utilizaron bacilos obtenidos a partir de muestras de lepromas de un paciente con lepra lepromatosa diagnosticado recientemente, usando el protocolo recomendado por la OMS para el procesamiento de las biopsias20. La cuantificacio´n de los bacilos a´cidoalcohol resistente se realizo´ en frotis ten˜idos con la coloracio´n de Ziehl-Nielsen. Como controles negativos se utilizaron muestras de agua ultrapura. El proceso de extraccio´n del ADN cromoso´mico del M. leprae se realizo´ usando bromuro de exadecil trimetil amonio (CTAB), se centrifugo´ la muestra de moco nasal o biopsia a 3.000 revoluciones por minuto (rpm) durante 5 min, se descarto´ el sobrenadante. Al pellet se le agrego´ 400 ul de solucio´n de CTAB (concentracio´n final: CTAB el 2%p/v; 2-mercaptoetanol el 0,2%p/v; Tris-HCL [1M] PH 7,8; 0,1M; Na Cl 5M, 1,4M; EDTA [0,5 M]; PH 8 0,02M). Se incubo´ toda la noche a 37 1C. Se realizo´ extraccio´n con 400 ul de cloroformo: isoamı´lico (24:1). Se agito´ y luego se centrifugo´ a 10.000 rpm durante 5 min, se recupero´ la fase acusa (superior), se trasvaso´ a otro tubo, se descarto´ el resto. Se repitio´ la extraccio´n una vez ma´s. Se agrego´ 2 volu´menes de etanol absoluto. Se centrifugo´ a 13.000 rpm 10 min. Se descarto´ el etanol. Se lavo´ el culote con etanol el 70%. Se agrego´ 2 volu´menes de etanol el 70%. Se centrifugo´ a 13.000 rpm 10 min. Se descarto´ el etanol y el ADN se seco´ durante 15 min a 50 1C, finalmente se resuspendio´ en 50 ul de Buffer Qiagen AE. Se homogeneizo´, se centrifugo´ brevemente, se fracciono´ y se guardo´ a 20 1C hasta su uso. El diagno´stico molecular del M. leprae por PCR se baso´ en la amplificacio´n de un elemento repetitivo especı´fico de M. leprae (RLEP) que se encuentra repetido 28 veces en su genoma, con una sensibilidad hasta 1.000 veces mayor que otros me´todos de amplificacio´n basados en otras secuencias. Los primers fueron disen˜ados para amplificar fragmentos de pequen˜o taman˜o (alrededor de 100 pares de bases) lo cual hace a este me´todo apropiado para su uso en pacientes tratados, o en muestras que puedan contener ADN degradado. Los oligonucleo´tidos usados fueron los primers LP1 y
Tabla 1 – Secuencia de oligonucleo´tidos usados en los primeros para amplificar el elemento repetitivo especı´fico de Mycobacterius leprae Primer
Residuo
Secuencia (50 – 30 )
LP1 LP2 LP3 LP4
490–509 618–599 505–522 603–586
TGCATGTCATGGCCTTGAGG CACCGATACCAGCGGCAGAA TGAGGTGTCGGCGTGGTC CAGAAATGGTGCAAGGGA
LP2 o primers externos que amplificaron una secuencia de de 129 pb del elemento RLEP. El segundo set primers LP3 y LP4 hibrido´ dentro de la secuencia anterior para amplificar un producto final de 99 pb (tabla 1). La amplificacio´n por n-PCR de la composicio´n final de la mezcla de PCR (50 ml) fue: Buffer verde Promega Go Taq 5X; MgCl2 Promega 1,5 mmol; Tween 20 0,01%v/v; dNTPS 200 mmol (c/u); y Go Taq ADN polimerasa Promega 1,25 unidades. Los primers se usaron a una concentracio´n final de 60 nM (a partir de la te´cnica de Donoghue et al se ensayaron las concentraciones de primers enzima, Mg2þ y dNTPS hasta alcanzar el nivel o´ptimo de la reaccio´n. En el primer paso de amplificacio´n se emplearon los primers externos LP1 y LP2 y como templado 5 ml de ADN extraı´do de la muestra. En el segundo paso de amplificacio´n se emplearon los primers internos LP3 y LP4 y como templado (5 ml) del producto de amplificacio´n del primer paso. La amplificacio´n se realizo´ de la siguiente forma; despue´s de un paso de desnaturalizacio´n de 4 min a 94 1C, le siguieron 25 ciclos de amplificacio´n, 94 1C por 40 segundo, hibridacio´n de 58 1C por 1 min y extensio´n de 72 1C por 20 segundos con un incremento de 1 segundo por ciclo. Finalmente una extensio´n de 1 min a 72 1C20. Para visualizar los productos de la PCR se emplearon geles de agarosa al 2% en TBE buffer (0,09 M trisborate y 0,002M EDTA), con bromuro de etidio 10 mg/ml cada 100 ml de agarosa. Para el control de calidad de la muestra y presencia de inhibidores se utilizo´ la amplificacio´n del gen de la B- globina humana.
Resultados Se obtuvieron muestras de moco nasal de 26 contactos intradomiciliarios de 26 pacientes con lepra diagnosticados clı´nica e histopatolo´gicamente entre octubre de 2008 a octubre de 2009 por el programa local de control de lepra de la provincia del Chaco; 20 pacientes fueron clasificados como multibacilares (MB) y 6 como paucibacilares (PB), segu´n la clasificacio´n de la OMS (3). Se procesaron 26 muestras de moco nasal de los contactos intradomiciliarios de los pacientes y se detecto´ ADN de M. leprae en 5 de ellas (19,23%). El ADN de los controles positivos incluidos se amplifico´ en todos los casos. El agua ultrapura utilizada como controles negativos no se amplificaron en ningu´n caso. Se obtuvieron resultados iguales en cuanto a la positividad de las muestras y a la ausencia de inhibidores de la reaccio´n. Todos los contactos estudiados, sin signos ni sı´ntomas de enfermedad, provenı´an de a´reas de alta prevalencia de lepra; 12 de ellos (46,15%) eran contactos intradomiciliarios de casos MB, y 14 (53,84%) de casos PB; el 42,31% eran hombres y el
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57,69%, mujeres y los antecedentes de vacunacio´n con BCG fueron positivos en el 69,23%, negativos en el 30,77%, de los cuales se detecto´ positividad para M. leprae en 5 convivientes de pacientes con lepra MB 4 casos y PB 1 caso; siendo de sexo femenino 4 de los 5 casos detectados y no presentaron antecedentes de vacunacio´n con BCG. El 100% de los contactos tenı´an un parentesco en primer grado con el caso ı´ndice. La mayorı´a de los contactos eran de procedencia urbana. El promedio de convivientes por caso ı´ndice fue de 3. El 50% de los convivientes tenı´an un promedio de 32 an˜os, mientras que el 50% de los casos ı´ndice tenı´an 46 an˜os. Los convivientes habı´an vivido con el caso ı´ndice una media de 15 an˜os. Todos los convivientes procedı´an de municipios con alta prevalencia.
utilidad de esta te´cnica de PCR sera´ la posibilidad de poner en pra´ctica un sistema de vigilancia que permita realizar una monitorizacio´n de las poblaciones de alto riesgo para detectar precozmente la enfermedad, mejorar la bu´squeda activa de los casos y mantener los logros alcanzados por los programas locales de control de la lepra25, tal como lo sugiere la Organizacio´n Panamericana de la Salud26; lo que se propone en este estudio es hacer uso de las nuevas tecnologı´as que permitan interrumpir la cadena de transmisio´n de esta enfermedad27.
Discusio´n
La deteccio´n por biologı´a molecular del M. leprae en muestras de moco nasal de contactos intradomiciliarios sanos de pacientes con lepra constituye un valioso me´todo para detectar la presencia de infeccio´n subclı´nica. En el futuro podrı´a ser una herramienta ma´s para ayudar a mejorar el funcionamiento de los programas de control de lepra.
En este estudio se detecto´ M. leprae en el moco nasal utilizando la te´cnica n-PCR descripta por Donoghue et al, con algunas modificaciones; esta te´cnica tiene una sensibilidad hasta 1.000 veces mayor que otros me´todos de amplificacio´n donde la cantidad y calidad de ADN es baja, segu´n refieren numerosos autores. La aplicacio´n de esta prueba a los contactos intradomiciliarios permitira´ detectar nuevos casos antes que la baciloscopı´a21. En el presente estudio utilizamos muestras de moco nasal teniendo en cuenta que las vı´as respiratorias altas, y especialmente la mucosa de las fosas nasales, son una de las principales vı´as de transmisio´n22. Como han sugerido previamente varios investigadores15, no se puede descartar la posibilidad de encontrar )portadores pasivos*, que sin tener infeccio´n subclı´nica, tengan bacilos en sus fosas nasales; sin embargo, esto no invalida la utilidad de la prueba para la monitorizacio´n poblacional de comunidades de alto riesgo. Controlando todos los factores inhibidores presentes en la muestra y optimizando todas las condiciones necesarias ya descritas, se obtiene una buena amplificacio´n. El porcentaje de casos positivos detectados en este estudio es del 19,23%; es similar al registrado en estudios anteriores23 que tambie´n utilizaron la PCR en el moco nasal, lo cual confirma la utilidad de esta prueba en la deteccio´n de la infeccio´n subclı´nica. Respecto de la distribucio´n por sexo de los convivientes positivos por PCR se observo´ predominio femenino, coincidiendo con otros estudios24; la edad media de los convivientes fue de 42 an˜os y la media del tiempo de conviviencia fue de 15 an˜os, estos datos son similares a los reportados en otros estudios24. Los convivientes de primer grado tienen una probabilidad de infeccio´n mayor que el resto de los convivientes, debido a que se requiere un contacto cercano y prolongado para una transmisio´n o´ptima21. Otra observacio´n llamativa pero que no llego´ a ser significativa, posiblemente por el pequen˜o taman˜o de la muestra, fue la mayor procedencia rural de los convivientes infectados con el bacilo, detectados por PCR positiva, esto se explicarı´a por la mayor posibilidad de supervivencia del bacilo en condiciones subo´ptimas de la vivienda, como fue descripto por otros autores21. No obstante, al revisar las estadı´sticas argentinas de los nuevos casos de lepra se observa que son principalmente urbanos, discrepancia que seguramente puede explicarse por la centralizacio´n de la atencio´n3. Creemos que la principal
Conclusio´n
B I B L I O G R A F I´ A
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