Producción de Poli(E-hidroxibutirato) Utilizando Glicerol y Melaza de Caña de Azúcar como Sustrato. Mauricio A. Porras1,2*, María Amelia Cubitto1, Marcelo A.Villar2 1:Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur. Bahía Blanca, Argentina 2:Planta Piloto de Ingeniería Química, PLAPIQUI (UNS-CONICET); Camino “La Carrindanga” Km. 7. (8000) Bahía Blanca, Argentina *
[email protected] Abstract Los polihidroxialcanoatos (PHA) son poliésteres biodegradables, sintetizados y acumulados como gránulos intracelulares por distintos géneros bacterianos en condiciones de cultivo desbalanceadas. El PHB es de gran interés industrial debido a que sus propiedades son similares a las del polipropileno. Uno de los factores limitantes para la producción de este biopolímero es el costo de las materias primas empleadas en las fermentaciones como fuente de carbono. Por tal motivo, se está realizando un gran esfuerzo en optimizar la producción con sustratos de bajo costo. En este trabajo se analizó comparativamente glicerol y melaza de caña de azúcar como sustratos para el crecimiento y la producción de PHAsempleando una cepa de Bacillus megateriumaislada del estuario de Bahía Blanca. La cepa produjo mayores concentra-ciones de PHA utilizando melaza como sustrato. La producción de PHA empleando melaza como sustrato fue más de tres veces mayor que al emplearglicerolcomo sustrato.
Palabras clave: PHA, poli(E-hidroxibutirato), sustrato, glicerol, melaza de caña de azúcar Sesión: Biopolímeros, polímeros en medicina y biología.
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INTRODUCCIÓN
Los poli(E-hidroxialcanoato)s (PHA) constituyen una familia de poliésteres biodegradables de origen natural producidos por bacterias, con propiedades similares a las de algunos polímeros no biodegradables de origen petroquímico como el poli(etileno) o el poli(propileno). Se acumulan como reserva de fuente de carbono y energía en gránulos intracitoplasmáticos cuando se produce la deficiencia de alguno de los nutrientes en el medio del cultivo. Uno de los factores limitantes para la producción es el costo de las materias primas empleadas como fuente de carbono: azúcares como fructosa, glucosa o sacarosa, entre otros. Por tal motivo, muchos estudios se han orientado a optimizar la producción de PHA con sustratos de bajo costo. El objetivo de este trabajo fue establecer la capacidad de producción de PHAs, empleando la cepa Bacillus megaterium BBST4, aislada del estuario de Bahía Blanca, en un medio mínimo de bajo costo, utilizando como fuente de carbono glicerol o melaza de caña de azúcar. 2
EXPERIMENTAL
Para la obtención de PHAs se utilizó la cepa Bacillus megateriumBBST4 (GenBank database accession number: HM119600.1) aislada de sedimentos del estuario de Bahía Blanca. La cepa fue seleccionada en estudios previos por
producir PHB utilizando glucosa como fuente de carbono(López Jiménez et al., 2008). Para los ensayos se preparó un medio de cultivo cuya base fue la solución de Winogradsky (Pochon y Tardieu, 1962) con el agregado de 1 g/L de urea como fuente de nitrógeno y 20 g/L de melaza de caña de azúcar (SWM) o 30 g/L de glicerol (SWG) como fuente de carbono. Como inóculo inicial se utilizó una suspensión de células de B. megateriumBBST4con una absorbancia a 550 nm de 0,2 8 (aprox. 210 células/mL) provenientes de un cultivo de 24 h a 35 ºC utilizando el medio anterior agarificado, obteniéndose una concentración final de 106 células/mL en cada medio de ensayo. Se evaluó el efecto de dos fuentes de carbono empleando un grupo de erlenmeyers con 100 mL de SWG y un grupo de erlenmeyers con 100 mL de SWM. Todos los erlenmeyers se incubaron a 30 ºC con agitación a 150 rpm y cada grupo se retiró del incubador a las 30 h de cultivo. En todos los erlenmeyers se cuantificó la biomasa total acumulada. Para esta determinación se concentró el cultivo por centrifugación y posterior-mente se secó en estufa a 65ºC hasta peso constante. La concentración de PHA se determinó cuantitativamente por extracción con cloroformo, previa lisis celular con hipoclorito de sodio al 30% durante 1 hora y lavados sucesivos con agua, acetona y etanol (Valappil et al., 2007) y cualitativamente mediante observación directa por coloración con Negro Sudan (NS) con microcopia de fondo claro. SLAP 2012. 23-26 Septiembre de 2012, Bogotá D.C., Colombia.
Biomasa (g/L)
1,8
4
1,6
3,5
1,4
3
1,2 1
2,5 2
0,8
1,5
0,6
1
0,4
¨ pH
2
5 4,5
0,2
0,5
0
0 Melaza 2%
Glicerol 3%
Fuente de carbono Figura 1. Producción de PHA empleando la cepa Bacillus megateriumBBST4 en un medio mínimocon 2 % de melaza o 3% de glicerol luego de una incubación de 30 h a 30 ºC.Referencias: Biomasa: color celeste, PHA: color violeta, 'pH:U.
Para los ensayos de caracterización se empleó el biopolímero obtenido usando un pH 8 para ambas fuentes de carbono en el medio luego de 30 h de incubación. ElPHA obtenido fue caracterizado molecularmentepor Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR) y por Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC). La caracterización mediante FTIR se llevó a cabo en un equipo NicoletNexus empleando ventanas de NaCl sobre las cuales se depositó una película delgada del polímero mediante la evaporación de una solución del biopolímero en cloroformo. Los ensayos de DSC se llevaron a cabo empleando un equipo Perkin Elmer Pyris 1. Se realizaron barridos de temperatura entre 30 y 180 ºC y los resultados reportados corresponden al segundo calentamiento a 10 ºC/min luego de un primer calentamiento para borrar la historia térmica del material y un enfriamiento a 10 ºC/min.
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Figura 2. Espectros FTIR correspondientes al PHA producido por la cepa Bacillus megaterium BBST4 empleando glicerol y melaza como fuentes de carbono y urea como fuente de nitrógeno. Referencias: Glicerol: línea roja, Melaza: línea azul.
experimentales fue de 0,025 g/Lh y de 0,0088 g/L h cuando se utilizó melaza y glicerol como fuente de carbono respectivamente. La disminución del pH fue muy pronunciada en el cultivo SWM debido, probablemente, a la alta concentración de azúcares que poseeeste medio. Cabe destacar que en todos los cultivos el número de células esporuladas fue menor al 1%. Los espectros FTIR correspondientes al biopolímero obtenido (Figura 2) coincidieron con el reportado por López Jiménez (2011) empleando la misma cepa y glucosa como fuente de carbono y con el reportado por otros autores para PHB obtenido con otras cepas como Bacilluscereus (Valappil et al., 2007). En la Figura 3 se presentan los termogramas correspondientes al segundo calentamiento obtenidos por DSC. El biopolímero obtenido en todos los ensayos presentó una temperatura de fusión y grado de
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La cepa ensayada produjo mayores concentraciones de PHA utilizando melaza de caña de azúcar como sustrato en un mediodefinido mínimo (Figura 1). La producción de PHA (g/L) empleando melaza de caña de azúcar fue más de tres veces superior a la producción observada empleando glicerol como sustrato.En los cultivos empleando melaza de caña de azúcar (SWM) un 17% en peso de la biomasa posee gránulos de PHA, mientras que este valor se reduce a un 7% en los cultivos en los cuales se empleó glicerol (SWG) como sustrato. Además la producción de biomasa fue 30% menor cuando se utilizó glicerol como única fuente de carbono. La productividad de PHA determinada en estas condiciones
Figura 3. Caracterización térmica del PHA producido por la cepa Bacillus megaterium BBST4 empleando glicerol (línea continua negra) y melaza de caña de azúcar (línea continua naranja) como fuente de carbono y urea como fuente de nitrógeno.
SLAP 2012. 23-26 Septiembre de 2012, Bogotá D.C., Colombia.
Tabla 2.Caracterización molecular y térmica del PHA producido porBacillusmegateriumBBST4 a pH 8 y 30 h de incubación o
Sustrato
T f,p ( C)
ȴH f (J/g)
X c (%)
Glucosa
170,6
91,8
61,5
Glicerol
160,2
83,6
56,0
4
170,4
Melaza
169,9
cualidades para favorecer el crecimiento y la producción de PHA por parte de la cepa B.megaterium BBST4. Las propiedades moleculares y térmicas del PHA obtenido podrían ser aprovechadas en aplicaciones biomédicas como la ingeniería de tejidos, entre otras.
89,0
59,6
T f,p : temperatura de fusión (pico), ѐ, f : calor de fusión; X c : % cristalinidad
cristalinidad similares a los reportados para el PHB (Tabla 1). Sin embrago, en el termograma correspondiente al PHA producido a partir de glicerol se observa un segundo pico de fusión a menor temperatura el cual puede ser atribuido a cristales imperfectos de PHB o a la presencia de un comonómero en este polímero. Por otra parte con ambas fuentes de carbono, el valor de temperatura de fusión correspondiente al segundo pico resultó similar al obtenido con esta cepa empleando glucosa como fuente de carbono (López Jiménez, 2011) pero menor que el valor reportado en la literatura para el PHB, entre 173 y 180 ºC (Hahn et al., 1995). El porcentaje de cristalinidad del biopolímero obtenido fue calculado en base a la entalpía de fusión de un cristal perfecto de PHB, 149,37 J/g, reportado por Barham et al. (1984). El porcentaje de cristalinidad del PHB obtenido en este trabajo es menor que el correspondiente al PHB producido con esta misma cepa empleando glucosa como fuente de carbono (López Jiménez, 2011). Una disminución en la temperatura de fusión incrementa la procesabilidad sin degradación del biopolímero. Por otra parte, una disminución en el porcentaje de cristalinidad aumenta la velocidad de degradación dado que las regiones amorfas se degradan más rápidamente que las regiones cristalinas (Valappil et al., 2007). La cepa Bacillus megaterium BBST4 empleada en este estudio produce PHA en un medio mínimo con dos fuentes económicas de carbono, como el glicerol y la melaza de caña de azúcar cuando se produce una deficiencia en el contenido de nitrógeno en el medio. Sin embargo, se observa una mayor producción de PHA empleando melaza de caña de azúcar como sustrato, indicando que esta fuente de carbono posee mejores
CONCLUSIONES
La cepa Bacillus megaterium BBST4 aislada del estuario de Bahía Blanca es capaz de crecer y producir PHAs en un medio mínimo con glicerol o melaza de caña de azúcar como única fuente de carbono y urea como fuente de nitrógeno. De los dos sustratos estudiados, la melaza de caña de azúcarprodujo un mayor crecimiento y producción de PHAs. La productividad de PHA obtenida con esta técnica de extracción empleando glicerol como sustrato fue 2,8 veces inferior a la obtenida empleando melaza de caña de azúcar como sustrato.Aunque con éste último sustratose obtuvieron valores menores a los reportados para una cepa de B.megateriumBA-019 utilizando un medio similar con melaza (Kulpreechaet al. 2009). Por otra parte, la productividad de PHA obtenida en este trabajo fue 1,5 veces superior a la obtenida con la cepa Azohydromonas lata MTCC 2311 utilizando la misma concentración de melaza en el medio de cultivo y con la cual se obtuvo la mayor productividad del ensayo (Zafar et al.2012). En contraste con estos resultados con una cepa de Escherichia coli recombinante se han obtenido altos porcentajes de producción de PHA (mayores a 60%) empleando glicerol en medios complejos sin observarse producción de PHA a partir de melaza (Mahishi et al. 2003). Los resultados obtenidos serán optimizados de modo tal de identificar las condiciones de cultivo que maximicen la producción del polímeroempleando una fuente de nitrógeno disponible y de bajo costo como la urea y fuentes de carbono que constituyen subproductos de la producción de biodiesel (glicerol) o de la obtención de azúcar refinada (melaza).
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AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al CONICET y a la Universidad Nacional del Sur (UNS) por el apoyo económico brindado para este trabajo.
SLAP 2012. 23-26 Septiembre de 2012, Bogotá D.C., Colombia.
REFERENCIAS BARHAM, P., KELLER, A., OTUN, E.L., HOLMES, P., Crystallization and morphology of a bacterial thermoplastic: poly-3-hydroxybutyrate. Journal of Materials Science, 19, 2781-2794 (1984). HAHN, S.K., CHANG, Y.K., LEE, S.Y., Recovery and characterization of poly (3-hydroxybutyric acid) synthesized in Alcaligens eutrophus and recombinant Escherichia coli. AppliedEnvironmental Microbiology, 61, 34-39 (1995). KULPREECHA S., BOONRUANGTHAVORN A., MEKSIRIPORN B., THONGCHUL N., Inexpensive fedbatch cultivation for high poly(3-hydroxybutyrate) production by anew isolate of Bacillus megaterium. Journal of Bioscience and Bioengineering,107(3), 240245 (2009). LÓPEZ JIMÉNEZ, J.A., CUBITTO, M.A., VILLAR, M.A., Biosíntesis y caracterización de poli(Ehidroxibutirato) producido por Bacillus sp., XI Simposio Latinoamericano de Polímeros, SLAP’08 y IX Congreso Iberoamericano de Polímeros, CIP’08, Lima, Perú, 2008. LÓPEZ JIMÉNEZ, J.A.,Biopolímeros de Interés Industrial. Síntesis y Caracterización de Polihidroxibutirato (PHB), Tesis Doctoral, Universidad Nacional del Sur, 2011. MAHISHI, L.H., TRIPATHI, G., RAWAL, S.K., Poly(3hydroxybutyrate) (PHB) synthesis by recombinant Escherichia coli harbouring Streptomyces aureofaciens PHB biosynthesis genes: Effect of various carbon and nitrogen sources.MicrobiologyResearch,158,19-27 (2003). POCHON, J., TARDIEU, L., Techniques d’analysis en microbiologie du sol. De la Tourelle, Paris, 1962. VALAPPIL, S.P., MISRA, S.K., BOCCACCINI, A.R., KESHAVARZ, T., Large-scale production and efficient recovery of PHA with desirable material properties, from newly characterized Bacillus cereus SPV.Journal of Biotechnology, 132, 251-258, 2007. ZAFAR, M., KUMAR, S., KUMAR, S., DHIMAN, A.K., Artificial intelligence based modeling and optimization of poly(3-hydroxybutyrateco-3hydroxyvalerate) production process by using Azohydromonas lataMTCC 2311 from cane molasses supplemented with volatile fatty acids:A genetic algorithm paradigm. Bioresource Technology, 104, 631–641 (2012).
SLAP 2012. 23-26 Septiembre de 2012, Bogotá D.C., Colombia.
