Producción de ácido Láctico a partir de almidón de yuca por bacterias acidolácticas del género Lactobacillus

Ortíz, Camilo; Ospina, Lizeth; Sánchez, Sara / UJTL 2014

Producción de ácido Láctico a partir de almidón de yuca por bacterias acidolácticas del género Lactobacillus
Ortíz, Camilo; Ospina, Lizeth; Sánchez, Sara
Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano
Facultad de Ciencias Naturales e Ingeniería
Programa de Ingeniería Química

Resumen
La yuca es uno de los cultivos más eficientes y ricos en términos de producción de carbohidratos, siendo una planta tropical que puede crecer sobre suelos pobres o carentes de grandes nutrientes. La conversión microbiana de materias primas renovables a productos útiles es un importante objetivo de la industria biotecnológica. Ácido láctico fue producido a partir de almidón de yuca por bacterias acidolácticas del género Lactobacillus, variando las concentraciones de sustrato de 60, 90 y 120 g/L. La mayor concentración de ácido láctico fue de 51,15 g/L obtenida al tercer día de fermentación con una concentración de almidón de yuca hidrolizado de 120 g/L. El máximo rendimiento (Yps) se obtuvo a una concentración de 60 g/L al tercer día de fermentación, con un valor igual a 84,81 % (mol/mol) ó 42,03% (g/g) teniendo como base el sustrato hidrolizado (glucosa).
Palabras claves: almidón de yuca, ácido láctico, fermentación, Lactobacillus, biotecnología.
Abstract
Cassava is one of the most efficient and rich crops in terms of carbohydrate production, which is a tropical plant that grows on poor or depleted soils. Microbial conversion of such a renewable raw material to useful products is an important objective in industrial biotechnology. Lactic acid was produced form cassava powder by lactic acid bacteria from Lactobacillus gender, changing substrate concentrations such as 60, 90, 120 g/L. The higher concentration of lactic acid was 10.231 g / L obtained on the third day of fermentation with a concentration cassava starch hydrolyzed 120 g / L and the maximum yield was obtained at a concentration of 60 g / L of substrate on the third day fermentation.
Key words: Cassava starch, Lactic acid, fermentation, Lactobacillus, biotechnology.
Introducción

El AL es un ácido orgánico natural con una gran historia de aplicación en los alimentos, el cuero, los cosméticos y la industria farmacéutica. Además de esto, el AL láctico es un precursor del PLA, un plástico renovable y biodegradable, el cual ha incrementado continuamente la demanda de L-AL (Wang, y otros, 2010). Los principales métodos para la producción comercial del AL son vía fermentación y síntesis química. El proceso de síntesis química implica la producción de lactonitrilo seguido de una hidrólisis con ácido sulfúrico; usualmente produce una mezcla L y D-ácido láctico. En contraste, producir un isómero deseado del AL puede lograrse vía fermentativa, usando microorganismos selectivos. La producción de AL por medio de varios sustratos (ej. glucosa, almidón de yuca, sacarosa, suero de queso, almidón de maíz, caña de azúcar, remolacha, y residuos de papel) ha sido estudiado en el décadas pasadas con el fin de satisfacer la creciente demanda de dicho producto (Cui, Li, & Wan, 2011).
Los costos de producción del L-AL pueden ser significativamente reducidos usando materias primas económicas, como almidón, materiales celulósicos y melazas. De estos, el almidón y la celulosa han venido recibiendo gran atención por ser materiales abundantes, renovables y económicos. Así pues, la yuca es uno de los materiales más eficientes para la producción de AL, en términos de producción de carbohidratos; es una planta tropical que crece sobre tierras pobres, en donde los rendimientos que presentan otros cultivos son muy bajos en comparación con ésta (Abdel-Rahman, Tashiroc, & Sonomotoa, 2011)
La producción de ácido láctico incrementa con un aumento en la concentración de sustrato. Para el trabajo de (Cui, Li, & Wan, 2011) se obtuvo un rendimiento máximo de 0.86 g/g para una concentración inicial de harina de yuca de 100 g/L, 0,85 g/g para una concentración inicial de glucosa de 100 g/L y 0,97 g/g para una concentración inicial de harina de maíz de 150 g/L.
En este estudio, se seleccionó el almidón de yuca como sustrato para la producción de AL por bacterias acidolácticas. El rendimiento del proceso bajo diferentes concentraciones de sustrato se investigó. Así pues, el objetivo de este estudio fue analizar el efecto de la concentración de sustrato, para desarrollar un proceso fermentativo económico y eficiente de AL usando bacterias acidolácticas del género Lactobacillus, aisladas del Yogurt.
Métodos
Aislamiento del microorganismo

Se fijaron las condiciones óptimas en el medio de cultivo selectivo Agar Rogosa Merck®, manteniendo un pH de 5.5. El medio de cultivo fue esterilizado a 121 °C por 15 min. Posterior a esto se inoculó directamente en el medio con una muestra de Yogurt Alpina® y 2 disoluciones (1×10-1 & 1×10-2) Figura 3.1 & 3.2 respectivamente. El tiempo de incubación fue de 48 horas. Se realizó un conteo bacteriano al finalizar el periodo de incubación en cajas de Petri, determinando las unidades formadoras de colonias (UFC).
Hidrólisis enzimática del almidón

Se prepararon 3 soluciones con diferentes concentraciones de almidón de yuca (60, 90 y 120 g/L). Con ayuda de buffer fosfato 0.1 M se ajustó el pH en 6. Las muestras fueron pre tratadas por medio de un proceso de gelatinización del almidón de yuca a 65°C por aproximadamente 5 min. Se adicionó la enzima comercial Termamyl α-Amilasa (Novozymes®), teniendo en cuenta las proporciones adecuadas de enzima/sustrato, Tabla 3.1 (Mera & Carrera, 2005).
Posterior a la gelatinización, se hidrolizaron las muestras, a una temperatura de 70°C y por150 min (Mera & Carrera, 2005). Finalmente, se esterilizaron las soluciones para desnaturalizar la enzima.
Fermentación

Se preparó el medio de fermentación de acuerdo a las siguientes proporciones: extracto de levadura 5g/L, sulfato de magnesio heptahidratado 0.6g/L, sulfato de manganeso hidratado 0.03g/L, acetato de sodio 1g/L, fosfato de sodio 0.5g/L, Monofosfato de potasio 0.5g/L Se esterilizó dicha medio por 15 min a 121°C. La sales presentes en el medio de fermentación se prepararon y esterilizaron por aparte con el fin de evitar la precipitación de éstas (Arraya, Rojas, & Velázquez, 2010). La concentración de sustrato se varió en tres muestras.

La fermentación se llevó a cabo anaerobiamente a una temperatura de 37°C y 100 rpm por 3 días (Figura 2.1). Finalmente se tomaron muestras de los medios de fermentación cada 24 horas durante tres días y se almacenaron a 4°C.

Figura 2.1. Medios de fermentación inoculados y agitados bajo condiciones apropiadas para la producción de ácido láctico.
Métodos analíticos

Cuantificación del consumo de sustrato y la producción de ácido láctico

La cuantificación del consumo de sustrato y la producción de ácido láctico se realizó por medio de cromatografía HPLC. Se utilizó la columna HPX-87H a una temperatura de 65°C usando una fase móvil de ácido sulfúrico 0,005 M.

Resultados y discusión
Aislamiento del microorganismo

Se observó que la tercera disolución presentó la mayor cantidad de unidades formadoras de colonia (UFC) por mililitro, obteniendo 150 UFC/ml (Figura 3.1), comparada con la segunda disolución, con 50 UFC/ml.

Figura 3.1. Segunda disolución.
Hidrólisis enzimática del almidón

Durante la hidrólisis se observó una mayor viscosidad y turbidez en la muestra con mayor concentración de almidón de yuca (120g/L). Una vez terminado el periodo de hidrolizado se cuantificaron azúcares por el método DNS. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3.1.
Los resultados obtenidos arrojaron rendimientos mayores al 100%. Así pues es necesario aplicar un factor de corrección a los datos. Para enzimas de éste tipo, que rompen macromoléculas como el almidón, su actividad enzimática está por encima del 100% lo cual es incorrecto. Se ofrece un factor de corrección a la actividad de la enzima de 0.6, obteniéndose aproximadamente una actividad enzimática del 93% y unas concentraciones de azúcares reductores presentados en la Tabla 3.1. Esto se puede explicar con base en la estructura del almidón. Ésta macromolécula contiene n moléculas de glucosa unidas por enlaces glicosídicos alfa 1-4. La hidrólisis del almidón podría generar n moléculas de azucares reductores y aumentar la concentración de ésta bruscamente.
Tabla 3.1. Cuantificación de AR obtenidos en la hidrólisis enzimática con alfa-amilasa para 3 soluciones con distintas concentraciones de almidón de yuca.
Muestra
Concentración almidón de yuca; g/L
alfa-amilasa; µL
AR; g/L




1
60
100
69,5652174
2
90
150
93,2298137
3
120
200
123,354037

En la Figura 3.3 se puede evidenciar claramente que la muestra con mayor concentración de almidón, 120g/L, presentó una mayor concentración de azúcares reductores.

Figura 3.2. Concentración de glucosa hidrolizada para 3 muestras con diferentes concentraciones de almidón
Fermentación

Para llevar a cabo la fermentación, se variaron las concentraciones de glucosa al inicio de ésta, manteniendo constantes los demás componentes del medio fermentativo. Se tomaron las muestras 1, 2 y 3 descritas anteriormente para dicho propósito.
Es necesario resaltar que cada uno de los componentes adicionados en el medio de fermentación es de crucial importancia para la obtención del metabolito de interés y la reproducción de las células. Las sales tienen la función de servir como cofactores para los procesos metabólicos y la estabilización del pH y las células a lo largo de la fermentación. La fuente de carbono (almidón de yuca hidrolizado) y la fuente de nitrógeno (extracto de levadura) son estrictamente necesarias para la obtención del AL (Barreiro & Sandoval, 2006).
Consumo de sustrato

Teniendo en cuenta los resultados ilustrados en la Figura 3.3 se puede observar que durante las primeras 24 horas de fermentación se dio el mayor consumo de sustrato por parte de la bacteria. Estos resultados son coherentes con la producción de AL, los cuales se presentan en la sección 3.3.2. Además de esto, se puede ver que el comportamiento de las tres muestras es similar, indicando que el consumo de glucosa se da rápidamente el primer día, independiente de las concentraciones de almidón de yuca estudiadas.


Figura 3.3 Consumo de glucosa para diferentes concentraciones de almidón de yuca
Producción de ácido láctico

Como se puede observar en la Figura 3.5, la mayor producción de ácido láctico se obtuvo con la muestra de 120 g/L de almidón de yuca, seguida de la de 90 y 60 g/L.
A pesar de estos resultados, es necesario relacionar el consumo de sustrato por parte de la bacteria y la producción del metabolito de interés por medio del Yps, así se puede conocer el rendimiento que se obtuvo en cada muestra. Los resultados se presentan en la Figura 3.6.
La muestra que obtuvo un mayor rendimiento transcurrido el periodo de fermentación fue aquella con una concentración de 60 g/L de almidón de yuca, aunque la diferencia de los rendimientos entre las otras dos muestras es pequeña.
Partiendo de esto, se tomó la muestra de 60 g/L para determinar la velocidad de producción de AL. En la Figura 3.7 se evidencia que el ritmo de producción de AL es significativamente relevante en las primeras 24 horas de fermentación. Comparando con el consumo de glucosa (Figura 3.3), se puede apreciar que la disponibilidad de sustrato ésta fuertemente ligada a la producción del AL.


Figura 3.5.Producción de AL a través del tiempo de fermentación


Figura 3.6 % de Rendimiento producción AL vs consumo de sustrato


Figura 3.7 Velocidad de producción del AL para la muestra de 60 g/L de almidón de yuca
La velocidad de consumo de sustrato para una concentración de almidón de yuca de 60 g/L fue de 55,6gL día, para 90 g/L fue de 71,06gL día y para 120 g/L de 90,2gL día. Con estos datos se puede demostrar que a mayor concentración de sustrato, las bacterias presentes en el medio de fermentación presentan una mayor tasa de consumo de sustrato.

Figura 3.8 Cromatográma resultado de las muestras con 60 g/L de almidón de yuca.
La Figura 3.8 conduce a los resultados de las concentraciones de ácido láctico producido y glucosa consumida de la muestra que tiene 60 g/L de almidón de yuca. Los otros picos observados en la gráfica antes del correspondiente tiempo de retención de la glucosa experimental, pueden pertenecer a los compuestos rafinosa, estaquiosa, maltotriosa, que teóricamente poseen el tiempo de retención reportado la figura mencionada. Estos compuestos se obtienen por la acción al azar sobre los enlaces glicosídicos del almidón de la enzima alfa-amilasa y son reconocidos por la prueba con el reactivo DNS ya que poseen poder reductor.


Conclusiones


La producción de ácido láctico a nivel biotecnológico es posible a partir de diferentes sustratos y microorganismos. En este trabajo se evidencia que el almidón hidrolizado es buena fuente de carbono utilizado por la bacteria lactobacillus aislada a partir del Yogurt.

La gelatinización del almidón de yuca es un tratamiento que facilita la acción enzimática de la alfa amilasa para obtener los monómeros de glucosa. A mayor concentración de almidón hidrolizado, se obtiene mayor ácido láctico.

Como la acción de la enzima no es ordenada, si no al azar, pueden obtenerse otros oligosacáridos que las bacteria usadas no pueden asimilar, produciendo una baja en la eficiencia de la fermentación.

La preparación del medio de cultivo es importante en la fermentación para la producción del metabolito en interés, ya que los microorganismos deben tener a su disposición los nutrientes necesarios para mantener una producción constante de ácido láctico.

El rendimiento obtenido en la fermentación con la bacteria lactobacillus aislada del yogurt para producir AL es relativamente baja, comparada con los reportados en la literatura, donde usaron otros microorganismos, sustratos y estrategias de fermentación.

Recomendaciones

Se recomienda un estudio exhaustivo en la etapa de hidrólisis, proceso vital en la obtención de AL planteado en este trabajo.





Referencias

Abdel-Rahman, M., Tashiroc, Y., & Sonomotoa, K. (2011). Lactic acid production from lignocellulose-derived sugars using lactic acid bacteria: Overview and limits. Journal of Biotechnology, Vol 156, pág 286– 301.
Arraya, C., Rojas, C., & Velázquez, C. (2010). Síntesis de ácido láctico a traves de la hidrólisis enzimática simultánea a la fermentación de un medio a base de un desecho de piña (Ananas comosus), para su uso como materia prima en la elaboración de ácido poliláctico. Revista Iberoamericána de Polímeros, Vol 11, Pág 407-416.
Barreiro, J., & Sandoval, A. (2006). Operaciones de conservación de alimentos por bajas temperaturas. Baruta, Miranda, Venezuela: Equinoccio, Universidad Simón Bolivar.
Cui, F., Li, Y., & Wan, C. (2011). Lactic acid production from corn stover using mixed cultures of Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus brevis. Bioresource Technology, Vol 102, Pág 1831-1836.
Mera, I., & Carrera, J. (2005). Obtención de glucosa a partir de almidón de Yuca Manlihot sculenta. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Univerisidad del Cauca, Vol 3, pág 54-63.
Wang, L., Zhao, B., Liu, B., Yang, C., Yu, B., Li, Q., . . . Ma, Y. (2010). , Bo Zhao, Bo Liu, Chunyu Yang, Bo Yu, Qinggang Li, Cuiqing Ma, Ping Xu, Yanhe Ma, Efficient production of l-lactic acid from cassava powder by Lactobacillus rhamnosus. Bioresource Technology, Vol 101, pág 7895-7901.







AL: Ácido Láctico.
PLA: Ácido Poliláctico.
AR: Azúcares reductores.
Velocidad de producción de AL para la muestra de 60 g/L de almidón de yuca
Tiempo; dias
Velocidad producción ; g / L dia
Yps a diferentes concentraciones de sustrato
concentración: g/L
Yps (%)
Consumo de glucosa para diferentes concentraciones de almidón de yuca
Tiempo; dias
[Glucosa]; g/L
Producción de AL a través del tiempo
Tiempo; dias

[Ácido láctico]; g/L



Concentración de glucosa hidrolizada para 3 muestras con diferentes concentraciones de almidón

Muestra

Concentración; g/L