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ORIGINAL BREVE Prevalencia del polimorfismo C77G en el exón 4 del gen CD45 en la población española
94.344
Juana Gila, José Luis Ruiz-Tíscara, Carmen Rodríguez-Sainza, Ana Hernándeza, Beatriz Santamaríaa, Félix García-Sánchezb y Eduardo Fernández-Cruza a
Servicio de Inmunología. Hospital General Universitario Gregorio Marañón. Madrid. Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid. Madrid. España.
b
FUNDAMENTO Y OBJETIVO: El cambio C77G en el exón 4 del gen CD45 produce un splicing anormal frecuente en poblaciones sanas europeas y relacionado con la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana. El objetivo de este trabajo es analizar la frecuencia de C77G en la población española. PACIENTES Y MÉTODO: Se incluyeron 517 muestras de sangre anticoagulada con ácido etilendiaminotetraacético procedentes de donantes sanos, en las que se determinó la expresión de CD45RA y CD45RO sobre linfocitos T circulantes mediante citometría de flujo. Se realizó asimismo la secuenciación del exón 4 de CD45 en las muestras con coexpresión anormal de ambas isoformas de CD45. RESULTADOS: En 6 de 517 individuos se detectó persistencia de la expresión de CD45RA en los linfocitos T memoria; todos ellos eran heterocigotos para C77G. La frecuencia alélica es del 0,58% (intervalo de confianza del 95%, 0,23-1,32). CONCLUSIONES: La mutación C77G está presente en la población sana española. Establecer su significado clínico requiere estudios con grupos de pacientes. Palabras clave: CD45. Polimorfismo. Splicing.
Prevalence of C77G polymorphism in exon 4 of the CD45 gene in the Spanish population BACKGROUND AND OBJECTIVE: A mutation (C77G) in exon 4 of the CD45 gene is the most common cause of CD45 abnormal splicing in European populations, which has been associated with an increased susceptibility to human immunodeficiency virus infection. We aimed to analyze the C77G frequency in the Spanish population. PATIENTS AND METHOD: 517 healthy donors. CD45RA and RO expression was determined in circulating T lymphocytes by flow cytometry. CD45 exon 4 sequencing was carried out in individuals with an abnormal coexpression of CD45 isoforms. RESULTS: 6/517 individuals presented CD45RA persistence on memory T cells; all of them were heterozygous for C77G mutation. The resulting allelic frequency was 0,58% (95% confidence interval, 0.23-1.32). CONCLUSIONS: C77G is present in the Spanish population. Further studies to elucidate its clinical significance are needed. Key words: CD45. Polymorphism. Splicing.
Este trabajo ha sido financiado por el proyecto FS G03/104. Correspondencia: Dra. J. Gil. Servicio de Inmunología. Hospital General Universitario Gregorio Marañón. Dr. Esquerdo, 46. 28007 Madrid. España. Correo electrónico:
[email protected] Recibido el 6-2-2004; aceptado para su publicación el 4-5-2004.
10
Med Clin (Barc). 2005;125(1):10-1
El antígeno común leucocitario CD45 es una glucoproteína transmembrana con actividad tirosinfosfatasa. Esta actividad es crucial para la transducción de la señal mediada por el receptor específico de antígeno en los linfocitos, y puede desfosforilar también las cinasas Janus que intervienen en la señalización de los receptores de citocinas1. La importancia funcional del CD45 se manifiesta en los casos de deficiencia humana completa de CD45 y en los modelos murinos knock-out, en los que aparece una inmunodeficiencia grave2. La molécula CD45 presenta al menos 8 isoformas producidas por el splicing alternativo de 3 de sus 34 exones (exones 4, 5 y 6). Las isoformas de alto peso molecular (que conservan la expresión de estos 3 exones) se expresan en células T naïve circulantes y son reconocidas por anticuerpos monoclonales anti-CD45RA, mientras que la forma de bajo peso molecular (que carece de los 3 exones) se expresa en las células T de memoria circulantes y es reconocida por anticuerpos monoclonales anti-CD45RO1. Esta asociación entre fenotipo y función induce a pensar que las diferentes formas del dominio extracelular regulan la función de CD45 y que un modo de regulación podría ser la homodimerización diferencial de las distintas isoformas, dado que CD45RO dimeriza más fácilmente que las formas de mayor peso molecular y que en el homodímero un dominio inhibidor bloquea la actividad fosfatasa de la proteína contigua1. Desde 1990 se conoce la coexpresión anómala de CD45RO y CD45RA en los linfocitos T activados o de memoria de individuos aparentemente sanos3. Este patrón anormal o variante de CD45 se ha asociado en la mayoría de los casos estudiados con la transversión de una C a una G en la posición 77 (C77G) del exón 4 del gen codificante de la proteína4. Esta mutación no afecta a la secuencia de aminoácidos de la proteína, pero evita el splicing del exón 4 posiblemente impidiendo la unión de un factor que actúe en trans, necesario para el correcto splicing4. En la población sana europea, C77G está presente en frecuencias que oscilan entre menos de un 0,16 y un 1,4%, y no se ha encontrado en las poblaciones africanas estudiadas5. Tanto C77G como otra mutación recientemente descrita en el exón 4 (C→A en la posición 59; C59A), respon-
sable del mismo tipo de patrón de coexpresión anormal de CD456 se han relacionado con la esclerosis múltiple6,7. La mutación C77G se ha asociado además con una mayor susceptibilidad a la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)8. En este trabajo hemos estudiado la prevalencia de la variante C77G de CD45 en una muestra de población sana española de la Comunidad de Madrid. Pacientes y método Se analizaron 517 muestras de sangre periférica anticoagulada con ácido etilendiaminotetraacético procedentes de donantes sanos del Centro de Transfusión de Madrid. El patrón de splicing anormal se identificó por inmunofluorescencia directa sobre 25 µl de la sangre completa, utilizando un marcaje en 3 colores con anticuerpos monoclonales anti-CD45RA (clon L48) FITC / CD45RO (clon UHCL-1) PE/CD3 PercP, de Becton&Dickinson. Las muestras se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente, se adquirieron tras la lisis de los hematíes (FACSlysing, Becton&Dickinson) y 2 lavados en PBS y se analizó la coexpresión de CD45RA y CD45RO sobre las células T (CD3+) en un citómetro FACScan utilizando el programa Cellquest (Becton&Dickinson). De las muestras de sangre que presentaron un patrón de expresión de CD45RA y CD45RO anormal por citometría de flujo, se utilizaron 200 µl para la extracción de ADN genómico (Gentra Systems). El ADN se amplificó con los cebadores 5’- GACTACAGCAAAGATGCCCAGTG- 3’ y 5’-GGGATACTTGGGTGGA AGTA- 3’ en una reacción en cadena de la polimerasa de 4 min a 94 ºC, seguido de 30 ciclos a 94 ºC de 1 min, a 55 ºC de 1 min y a 72 ºC de 4 min, y una extensión final de 16 min en un termociclador Perkin Elmer 9600. Se purificaron los fragmentos amplificados (Qiagen) y se procedió a su secuenciación directa con terminadores marcados en un secuenciador automático ABI 377. Una vez obtenidas, las secuencias se evaluaron con el programa Sequencing Analysis de Applied Biosystems. Para el análisis estadístico se utilizó el cálculo de frecuencias simples e intervalo de confianza de Fleiss (Epiinfo, Epitable Statcalc).
Resultados De los 517 individuos analizados, en 511 encontramos un patrón de expresión normal (fig. 1a). En 6 individuos apareció el patrón de expresión asociado con el splicing anormal de CD45 (fig. 1b), donde la molécula CD45RA se mantiene sobre los linfocitos de memoria y se coexpresó con CD45RO sobre las células T circulantes. Al secuenciar el exón 4 en estos 6 casos, confirmamos que todos presentaban el polimorfismo C77G en heterocigosis (fig. 1d) y que no había cambios en la posición 59 de este mismo exón. La frecuencia genotípica resultante en la población analizada es del 1,16% (intervalo de confianza del 95%, 0,47-2,63). En la tabla 1 22
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GIL J, ET AL. PREVALENCIA DEL POLIMORFISMO C77G EN EL EXÓN 4 DEL GEN CD45 EN LA POBLACIÓN ESPAÑOLA
se muestra la frecuencia alélica correspondiente al 0,58% (intervalo de confianza del 95%, 0,23-1,32), así como la comparación con las frecuencias descritas en otras poblaciones sanas.
23
C
C
C
G
C
102 101 100 0 10 101 102 103 104 CD45RA FITC
B
D
104
C
A
C
C
N
G
C
CD45RO PE
3
10
102 101 100 100
101 102 103 104 CD45RA FITC
Fig. 1. Expresión de las isoformas RA y RO de CD45 y secuenciación del exón 4 del gen. Análisis de la coexpresión CD45RA y CD45RO sobre los linfocitos T periféricos de un individuo representativo del fenotipo normal (a) y con la mutación C77G (b). Secuencias de las posiciones 73-79 del exón 4 de CD45 de un individuo con el genotipo normal (c) y un portador heterocigoto del cambio C por G en la posición 77 (d).
bio C59A produce el mismo patrón de splicing anormal que C77G6, únicamente se ha descrito en un paciente de origen alemán con esclerosis múltiple y en algunos miembros de su familia6, y no se detectó en ninguno de los 206 controles sanos alemanes6. Se han tratado de establecer asociaciones entre la presencia del alelo C77G y enfermedad. Existe un trabajo que asocia C77G con el desarrollo de esclerosis múltiple, aunque en otros trabajos no se ha confirmado tal asociación7. Un grupo británico ha encontrado un aumento significativo de la frecuencia de C77G en individuos infectados por el VIH-18, hallazgo de gran interés dada la implicación de las células T de memoria en la patogenia y progresión de la infección por el VIH9,10. Es importante conocer la prevalencia de C77G en una muestra de nuestra población sana antes de iniciar estudios en cohortes de pacientes españoles con estas u otras enfermedades de base inmunológica.
Frecuencia del polimorfismo C77G en la población sana española (Comunidad Autónoma de Madrid) y revisión de las frecuencias obtenidas en otras poblaciones
España Alemania Reino Unido Suecia EE.UU. Asia Central Pamiris Tailandia Sur de Asia Uganda
A
103
TABLA 1
Población estudiada
C
C
CD45RO PE
Discusión En los últimos años varios grupos han hecho el esfuerzo de caracterizar la prevalencia del alelo C77G en diversas poblaciones sanas5. Merece especial mención una población que vive en Tadjikistán, los pamiris, en los que se ha encontrado la mutación C77G con una frecuencia del 6,7%5. La frecuencia del alelo C77G que hemos encontrado para la población española es inferior a la que se ha descrito en otras poblaciones sanas europeas o asiáticas, y superior a la de todos los grupos africanos estudiados5. Ni en nuestro estudio ni en los otros realizados hasta ahora se han descrito individuos homocigotos para esta mutación. La frecuencia con la que aparece el polimorfismo en poblaciones caucásicas es baja; la ausencia de homocigotos pudiera deberse a una frecuencia genotípica muy baja, no al efecto nocivo del gen en homocigosis, que se ha discutido pudiera ser incompatible con la vida. Suponiendo que nuestra población esté en el equilibrio de Hardy-Weinberg, la frecuencia esperada de homocigotos para C77G sería de 0,00582, es decir, de 3,364 × 10–5, lo que equivale a decir que aproximadamente uno de cada 29.000 individuos sería homocigoto. Por tanto, cabe la posibilidad de que haya individuos homocigotos para C77G y que aún no se hayan encontrado, dado que el número de individuos estudiados en total es muy inferior a esta cifra (tabla 1). El estudio de una población endógama como los pamiris asiáticos5 puede resultar interesante para dilucidar el papel de esta mutación en homocigosis, ya que con una frecuencia alélica para C77G del 6,7%, se esperaría que uno de cada 225 individuos sea homocigoto. La amplificación y la secuenciación del exón 4 en nuestro estudio incluyen la posición 59, que ha sido normal en todos los individuos analizados. Aunque el cam-
104
A
N.o total de individuos
Individuos C77G
Frecuencia alélica (%)
517 303 236 1.044 244 279 75 143 60 93
6 0 4 30 9 9 10 0 1 0
0,58 < 0,16 0,85 1,4 1,8 1,6 6,7 < 0,35 0,83 < 0,53
Estudio
Tchilian et al5 Tchilian et al5 Tchilian et al5 Tchilian et al5 Tchilian et al5 Tchilian et al5 Tchilian et al5 Tchilian et al5 Tchilian et al5
Agradecimientos Agradecemos a la Dra. E.Z. Tchilian su consejo experto para las técnicas de amplificación utilizadas, y al Dr. J.L. Vicario, su colaboración en la obtención de muestras de este estudio y discusión de los resultados. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Hermiston ML, Xu Z, Weiss A. CD45: a critical regulator of signaling thresholds in immune cells. Ann Rev Immunology. 2003;21:107-37. 2. Tchilian EZ, Wallace DL, Wells RS, Flower DR, Morgan G, Beberley PCL. A deletion in the gene encoding the CD45 antigen in a patient with SCID. J Immunol. 2001;166:1308-13. 3. Schwinzer R, Wonigeit K. Genetically determined lack of CD45R- T cells in healthy individuals. J Exp Med. 1990;171:1803-8. 4. Zilch CF, Walker AM, Timón M, Goff LK, Wallace DL, Beberley PCL. A point mutation within CD45 exon A is the cause of variant CD45RA splicing in humans. Eur J Immunol. 1998;28:22-9. 5. Tchilian EZ, Dawes R, Ramaley PA, Whitworth JA, Yudasheva N, Wells RS, et al. A CD45 polymorphism associated with abnormal splicing is absent in African populations. Immunogenetics. 2002;53:980-3. 6. Jacobsen M, Hoffmann S, Cepok S, Stei S, Ziegler A, Sommer N, et al. A novel mutation on PTPRC interferes with splicing and alters the structure of the human CD45 molecule. Immunogenetics. 2002;54:158-63. 7. Gómez-Lira M, Liguori M, Magnani C, Bonamini D, Salviati A, Leone M, et al. CD45 and multiple sclerosis: the exon 4 C77G polymorphism (additional studies and meta-analysis) and new markers. J Neuroimmunol. 2003;140:216-21. 8. Tchilian EZ, Wallace DL, Dawes R, Imami N, Burton C, Gotch F, et al. A point mutation in CD45 may be associated with an increased risk of HIV-1 infection. AIDS. 2001;15:1892-4. 9. Carbone J, Gil J, Benito JM, Navarro J, Muñoz-Fernández A, Bartolomé J. et al. Increased levels of activated subsets of CD4+ T cells add to the prognostic value of low CD4+ T cell counts in a cohort of HIV-infected drug users. AIDS. 2000;14:2823-9. 10. Resino S, Navarro J, Bellón JM, Gurbindo D, León JA, Muñoz Fernández MA. Relación de las subpoblaciones de linfocitos T con los marcadores pronósticos de la infección pediátrica por el virus de la inmunodeficiencia humana. Med Clin (Barc). 2001;117:216-7. Med Clin (Barc). 2005;125(1):10-1
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