Presencia de Listeria monocytogenes y Listeria sp. en Longanizas Frescas y Curadas. Utilización de Distintas Condiciones de Tiempo y Temperatura de Incubación

J. Vet. Med. B 44, 617-624 (1997) 8 1997 Blackwell Wissenschafts-Verlag,Berlin ISSN 0931-1793 [+to.

Produccidn Animuly Cienciu de los Alimentas, Brornutologiay Mimabiolagiu de los Alimentas, Fucultud de Iyeterinunu. Universidad de Zurugqa, Zurugop, Spain

Presencia de Listena monocytogenes y Listena sp. en Longanizas Frescas y Curadas. Utilizaci6n de Distintas Condiciones de Tiempo y Temperatura de Incubaci6n C. Rc)TA, J. YANGUELA,D. BLANCO,J. J. CARRAMINANAy A. HERRERA Direcci6n de 10s autores: Dpto Produecibn Animal y Ciencia de 10s Alimentos, Bromatologia y Microbiologja de 10s Alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza C/Miguel Servet, 177. 50013-Zaragoza, Spain Con 5 tublusy 2 figuras

(KeceivedforpuhlicationAugust 8, 1995)

Summary Two different temperatures for enrichment of Listera nionoqtogenef and related species have been studied (1) cold enrichment at 4OC (2) enrichment at 30’C (FDA method). Also, two selective media for isolation were tested Acriflavine-Ceftazidime agar (A.C.) and Palcam agar. We have studied 72 samples of dry-cured sausage (called ‘longaniza’) at different stages of maduration: fresh, semicured and cured samples. The most efficient method was cold enrichment at 4°C during 5 days followed by isolation in Paleam agar, but results were only significant for fresh sausages (P < 0.05)

Resumen Se ha estudiado la eficacia de dos temperaturas de enriquecimiento diferentes e n el aislamiento de Listena monolytogenrs y

especies emparentadas; kstas han sido de 4°C (enriquecimiento por el frio) y de 30°C (recomendada por la FDA); ademas se ha ensayado el comportamiento de dos medios selectivos de aislamiento, agar Acriflavina-Ceftazidime (A.C.) y agar Palcam. La tkcnica utilizada ha sido la del doble cnriquecimiento con posterior aislamiento en medios selectivos. La metodologia de investigaci6n se ha aplicado a un total de 72 muestras de un producto carnico tipico d e la reginn aragonesa (Espaiia) denominado Iongunixu de ,4rq+n, embutido que se presenta como producto fresco, semicurado y curado. De 10s resultados obtenidos para el aislamiento de Z,i.rteriu spp. se ha deducido que a partir de produetos carnicos frescos el metodo mPs efectivo ha sido el del enriquecimiento por el frio a 4°C (I‘< 0,05) durante 5 dias con posterior aislamiento en agar Palcam.

Introduccibn El aislamiento de J.isteriu sp. a partir de alimentos que poseen una fuerte carga microbiana competitiva es muy problematico, ya que precisa de ticnicas de aislamiento selectivas mas o menos complejas (DONNliLLY y BAIGENT, 1986; DOYLEy SCHOENI, 1986; DOYLEet al., 1987) cuya aplicaci6n es dtficultosa en el analisis rutinario de 10s alimentos que hacen necesario cl us0 de mitodos de enriquecimiento cuando el numero de listerias es bajo y/o se encuentran acompafiadas de una flora asociada abundante. Los primeros estudios sobre aislamiento de listeria, a partir de muestras clinicas, utilizaron la tempcratura dc refrigeracibn para preenriquecimiento en un medio no selectivo (caldo triptosa), durante periodos de tiempo comprendidos entre 1 semana y 6 meses, seguido de aislamiento en agar sangre. El enriquecimiento por el frio, durante un largo periodo de tiempo, ~ 1 . scclpyngt)t . (:iearancc

(:enter

c,)cie statement:

0931-184X/97/4410-0617 $14.00/0

61n

R u r A et al.

fue propucsto por GRAYet al. (1948); dicho mttodo favorece el crecimiento de listeria por su caracter psicrbtrofo e inhibe a bacterias que no se desarrollan a bajas temperaturas; ademas, el almacenamiento prolongado favorece la liberacibn de listeria cuando esta localizada intracelularmente. Sin embargo, el inconveniente es el tiempo transcurrido hasta obtener resultados precisos. En la actualidad se esta intcntando reducir el tiempo de aislamiento e identificacibn de List& rnonoqtogenes mediante la utilizacibn de agentes selectivos adicionados a 10s medios de cultivo, con el fin de rcducir la flora competitiva sin que cllo incida en el desarrollo y multiplicaci6n de este microorganismo. Organismos especializados como la FDA (Food and Drug Administration) ( I , o v E ~et al., 1987) y USDA (United States Department of Agriculture) recomicndan la temperatura de preenriquecimiento de 3OoC (MCCLAIN y LEE, 1988). Actualmente el mitodo mas prometedor es un procedimiento de trabajo en serie, utilizando unos medios primarios menos selectivos seguidos de un enriquecimiento selectivo secundario y un aislamiento diferencial en piaca (WHO, 1988). El grupo de trabajo de la Organizacibn Mundial de la Salud recomienda a 10s investigadores que intentan mejorar el mttodo dc deteccion, el cual deberia someterse a evaluacibn de acuerdo a la directiva elaborada por 10s organismos internacionales como IDF, ISO, AOAC y ICMSF. Cuando hay una aka poblacion de microflora competitiva, es necesario un enriquecimiento para limitar el numero de microorganismos presentes. Hay que tener en cuenta que un medio demasiado selectivo puede que no permita el crecimiento de cklulas estresadas a causa de un calentamiento, congelacion o pHs extremos. Con el objeto de asegurar una mayor recuperacibn de listeria, el enriquecimiento se ha desglosado en dos etapas, normalmente denominadas preenriquecimiento o primer enriquecimiento y segundo enriquecimiento. El primer paso es no selectivo o no inhibidor, cxceptuando la acci6n del frio a 4"C, en el que la propia temperatura actua selectivamente. El segundo enriquecimiento es selectivo, ya que se utilizan diferentes inhibidores ( L ~ v E1988). ~ , Las tkcnicas propuestas para el enriquecimiento son, la tkcnica del enriquecimiento por el frio (GRAYet a1.1948; SEFXIGER,1961), el procedimiento de la FDA LO VET^ et al., 1987)) y el mttodo de USDA (MCCLAIN y LFX, 1988): Sobre estos tres procedimientos de analisis se han desarrollado nuevos mktodos (DOYI,II y SCHOENI,1987; S L ~ D Ey COLI.INS-T~IOMPSON, 1988). Los cstudios sobre canales, carnes crudas y carnes elaboradas, como carnes picadas y salchichas crudas, sefialan una mayor presencia de Listeria rnonogtogenes en carne de porcino que en la de vacuno, y sobre todo en la de ovino. Como es logic0 10s porcentajes aumentan conforme avanza el proceso de elaboracion de la carne, siendo mayores en las carnes que en las canales, alcanzindose globalmente porcentajes mas elevados en las carnes picadas Dado que en 10s productos carnicos crudos-curados no estdn ensayados 10s protocolos de aislamiento a partir de preenriquecimientos a bajas temperaturas, nuestro objetivo ha sido el estudio cornparativo, en longanizas de Aragon, de dos temperaturas de preenriquecimiento y dos medios selectivos de aislamiento, y Iogcamente la valoracibn de procedimientos ensayados.

Material y Metodos Muestras El presente estudio se ha realizado a partir de muestras de longaniza de Aragon, embutido crudocurado tipico de la region Aragonesa; dicho producto cirnieo es definido como embutido de carnc, elahorado con mezclas de carnes picadas de cerdo, vacuno o de cerdo y vacuno y tocino y/o grasa dc cerdo, adicionado de sal, especias y aditivos, amasada y embutida en tripas naturales o artificiales, en su caw, que han sufrido un proceso de maduracibn-desecaci6n que le asegura una buena estahilidad, asi como un olor y sabor caracteristico y cuyo calibre esta comprendido entre 20 y 40 mm. Se analizaron un total de 72 muestras, de las que 23 eran frescas, 23 semicuradas y 26 curadas; todas ellas fueron adquiridas en carnicerias-salchicherias y en industrias carnicas de la Comunidad Aragonesa. Fueron consideradas como longanizas frescas aquellas en las que han transcurrido menos de 4 dias entre la fabricacion y comercializacion de dicho producto; semicuradas, entre 4 y 15 dias y curadas a partir dc 10s 15 dias.

Presencia de Iisteria monocytogenes y Listeria sp. en longanizas frescas y curadas

619

MetodoLo& Aislamiento de Listeriu monogtogenesy especies emparentadas. La metodologia utilizada ha sido la de doble enriquecimiento (Figura nO1), seguida del aislamiento en medios selectivos. Con el enriquecimiento en dos etapas se pretende conseguir una mayor recuperacion de microorganismos del G” Lsteriu. La fase de preenriquecimiento se ha realizado en caldo nutritivo n02 (Oxoid) a dos temperaturas diferentes: d o c ( B U N C O et al., 1991; HAYMet al., 1986) y 30°C (LOVETT, 1988). El enriquecimiento selectivo posterior se realizo, en ambos casos, en un caldo selectivo y a temperatura de 37’C durante 12 horas. Para el aislamiento se utilizaron dos medios especificos: agar acriflavina-ceftazidime (agar A.C.) (BANNERMAN y BII.I.I!,1988) y agar PAILAM(Merck). El caldo de enriquecimiento selectivo utilizado tuvo la siguiente formulacion: caldo nutritivo n”2 (25 g/l), acido nalidixico (100 pg/ml) y tiocianato potasico (0,0375 g/ml) La eomposicion del agar acriflavina-ceftazidime fue: agar Columbia (Difco) 44 g/l, clorhidrato de acriflavina (Sigma) 0.001 mg/l y ceftazidime (Glaxo) 0.005 mg/L Las muestras (25 9)fueron tomadas por duplicado de cada una de las muestras de longanizas y homogeneizadas con 225 ml de caldo nutritivo n02 durante 2 minutos, incubindose a 4°C y 30T, respectivamente, durante 7 &as. Los dias 1, 3, 5 y 7 se realizci enriquecimiento selectivo por siembra de 1 rnl de homogeneizados a 4OC y 30OC en tubos con 9 ml de caldo selectivo con posterior incubacion de ambos a 37°C durante 12 h El aislamiento se realizo por siembra de 0,l ml y extension con asa de Drigalski en 10s agares A.C. y Palcam o mediante dilucion decimal en solucion Ringer al cuarto (a partir de 1 ml de caldo selectivo) y siembra en 10s medios indlcados. Las placas se incubaron a 37OC durante 48 h.

Identificacidn bioquimica A las colonias seleccionadas como pertenecientes a 1 2 e r i u sp. se Ies realizb para su confirmacion las et al., siguientes pruebas: tincion de Gram, movilidad en estado fresco, oxidasa y catalasa (ROCOURT 1987). Las colonias Gram +, oxidasa negativas, catalasa positiva y que presentaban la movdidad tipica (‘pirueta’ o ‘barrilete’) se sometieron a otras pruebas sefialadas por 10s autores precedentes, tales como: roio metilo, Voges-Proskauer, produccion de indol y reduccion de nitratos. Ademas se realiz6 la movilidad en agar Motility GI Medium (Difco) a 22OC; tras la incubacibn Listeria presenta un crecimiento en forma de ‘paraguas’ (121;.E y MCCIAIN, 1986; REDIN et al., 1987). Todas las pruebas se realizaron incubando a 37OC durante 48 h, a excepcibn de la movilidad que se efectuo a 22°C durante 72 h. Para la diferenciacihn de las especies de Listeriu seguimos las pruebas bioquimicas (MCLAUCHLIN, 1987): hemolisis espontanea, reduccicin de nitratos (ya realizada), test de CAMP frente a StaphLoeoccus a a r w y Rhodococcus equi, y fermentacion de 10s azucares: D-manitol, L-ramnosa, D-xilosa y a-meul-D-mannosido.

25 g + 225 ml caldo nutritivo np2 homogtneizaci6n2 min 4OU hasta 7 das lld

25 g + 225 ml caldo nutritivo n?? homo eneizaci6n 2 min 30fU hasta 7 das lld

caldo selcctivo (9 ml) 37OU12h.. Alml Soluci6n Ringer al cuarto

Agar AC Agar Palcam 37OU48 h. Figura 1. Procedimiento d e aislamiento de Listeria spp. ensayado en productos clrnicos

620

RO'rA et al.

Resultados y Discusi6n de lus dus tenperuturus ensuyudus en e/ uislumiento dr Listeriu sp. en Lonpniyus Hn la Tabla no 1 se exponen 10s resultados obtenidos comparando las dos temperaturas de preenriquecimiento utilizadas (4°C y 30°C). Puede comprobarse como el numero de muestras positivas fue muy superior cuando se utilizb el preenriquecimiento a 4°C tanto en las longmizas frescas (9 vs. 1) como en las semicuradas (5 vs. 2), mientras que para las muestras curadas (4 vs. 3) el porcentaje de aislamiento se aproximh. Verificandose como 10s resultados obtenidos a las dos temperaturas ensayadas son casi coincidentes conforme aumenta el tiempo de maduracihn. Iin el total de las 72 muestras analizadas, se detectaron microorganismos del C" Listeriu en 18 cuando se preenriquecio a 4"C, mientras que solo pudo aislarse este grupo microbiano en 6 muestras con el preenriquecimiento a 30°C. Esta marcada diferencia se ve confirmada aplicando el estadistico que demuestra la existencia de diferencias significativas entre 10s dos sistemas de preenriquecimiento (P = 0,007). Sin embargo, cuando se realiza este test entre 10s diferentes tipos de longaniza, se observa unicamente diferencia significativa en las longanizas frescas (P = 0,0042). Iista diferencia es marcada para L. monoytogenes, ya que la cspecie patbgena es aislada en 10 muestras cuando la temperatura es de 4°C y tan solo en una cuando se utiliza la de 30°C. DOYLEet al. (1987) realizaron un estudio comparativo de tres sistemiticas difcrentes de aislamiento de Listerin mono$ogenes en queso blando de superficie madurada: enriquecimiento por el frio a 4°C y mktodo FDA (LovF.'~T et al., 1987) y mktodo SRP (D(IYtA17,y SClK)BMl, 1986) en 10s que se utilizan como temperatura de enriquecimiento 30°C. A1 igual que en nuestro estudio, para estos autores el mejor procedimiento result6 ser el del enriquecimiento por el frio, desputs de una semana de incubacibn. Ademas, BKKERS et al. (1987) indican que la temperatura de enriquecimiento a 30°C durante un tiempo prolongado podria enmascarar posiblemente el crecimiento de la bacteria debido a la presencia de una flora competitiva. Nuestros resultados tambikn son apoyados por dos trabajos en 10s que comparan el y CORRY,1991a) y con el USDA enriquecimiento por el frio con el mttodo de la FDA (LEWIS (HAYES et al., 1991), observando que la mayoria de las muestras positivas se obtienen mediante la aplicaci6n del mktodo de enriquecimiento por el frio a 4°C; tambitn se llega a esta conclusihn en un estudio realizado en carne de pollo (LEWIS y CORKY, 1991b) y en salami (JOlINSON et al., 1988). GLASSy DOYIX (1989), sefialan la importancia en la prevencion de contaminaciones por Listeria monocytogmes en productos carnicos ya elaborados, ya que la refrigeracibn de 4" a 7°C no previene el crecimiento de microorganismos pathgenos. E@to

x2,

Iistudio dr djfirentrs tiempos de incuhuridn n temperuturu de 4'C' en e l uislumiento de Listeriu q. en /onymipjrescu

Tras comprobar que la temperatura de 4°C es mas efectiva para longanizas frescas que la de 30"C, se ha estudiado el numero de muestras que han resultado positivas con la aplicacibn de esta temperatura durante 10s dias lo, 3", 5" y 7" de preenriquecimiento (Tabla n" 2) Tabla 1. Aislamiento de Iisteria sp. y Listevia monoqtogenes en longanizas utilizando dos temperatutas de preenriquecimiento

Muestras (no.)

Listem+

%o

Temperatura 4°C 30°C 4°C 30°C 4 "C 30°C 4°C 30°C

Frescas (23)

9

39,lO

Semicuradas (23)

6

26,08

Curadas (26)

7

29,92

22

30,55

'rota] (72)

no. 9 1 5 2 4 3

18 6

Yo

L monolyfogener

100,00 11,ll 83,33 33,33 57,14 42,85 81,81 27,27

7 0 3 1 0 0 10 1

Prcsencia de Iistcria monocytogenes y Listeria sp. cn longanuas frescas y curadas

621

Tabla 2. Presencia de Listeria en longanizas frescas mantenidas en preenriquecimiento a 4°C IXas incubacibn

LA monogtagenes

Yo

no. muestras+

66,66 66,66 55,55 33,33

Como puedc observarsc dcl total de muestras positivas (nueve), seis pudieron detectarse el primer y terccr dia, cinco el quinto dia y tres el stptimo. La distribucibn de 10s aislamientos cs poco homogtnea, por lo que resulta dificil elegr un tiempo apropiado de preenriquecimiento; si hien y a la vista dc 10s resultados nos inclinariamos por un tjempo de preenriquecimiento de hasta 5 dias, ya que de proseguir 10s dias dcl preenriquecimiento se alarga la o b t c n c i h de resultados y no parece mejorar la tecnica. DOYLE< y SCH0I:MI (1986), en el aislamiento de Liketia nzonocytogenes a partir de queso blando, obtiencn que la mayoria de 10s aislamientos se realizaron mediante el procedimiento dcl enriquccimiento por el frio a 4°C y durante la primera semana (7 dias). J:stndio dr d+rentts f i r n p s dr incuhridn u temperuturus de 4"Cy 3O0Cen el uishmiento dr Listeriu sp. en Ionganizus semicmuduJj cnrudas

Tras observar quc no existen diferencias significativas entre las dos temperaturas de preenriquecimiento para las longanizas semicuradas y curadas, hemos estudiado el comportamiento de 10s cuatro tiempos de preenriquecimiento (1,3,5 y 7 dias) para cada tipo de derivado carnico. E n la Tabla no 3 se exponen las muestras positivas en 10s dlstintos tiempos ensayados. Como puede comprobarse el reparto de 10s aislamientos es muy diverso, no coincidlendo practicamente en ninhhn caso las muestras positivas de unos y otros, lo que imposibilita la cleccihn de un tiempo y temperatura de incubacibn. Rsta Clara incohercncia es concordante con 10s datos aportados en la literatura internacio-

Tabla 3. Aislamientos de microorganismos del Go I&eriu en longanizas semicuradas y curadas a lo largo de diferentes tiempos de preenriquecimiento a 4°C y 30°C -

Dias de preenriquecimiento

T i p de muestra (no.) Semicuradas S8 s21 s22 S25 S26 s29 Curadas c22 C26 c33 C34 C41 C42

1

3

4°C 5

7

1

3

3OoC 5

7

ROTA et al.

622

nal, en el sentido de que son necesarios varios dias de preenriquecimiento y varios aislamientos para conseguir un miximo de Cxitos. IAIVEIT (1988), inform0 que la FDA habia modificado el tiempo de incubacihn para la recuperacibn de la bacteria a partir del caldo Listeria enrichment broth (LEB) a 1 y 7 dias. Estos cambios se basan en 10s datos aportados por laboratorios estatales y privados de Francia, donde se observb un increment0 del2OYo en la recuperacibn de listeria de quesos, cuando se comparb 7 dias con 1 dia de incubacicin. Algunos autores como KNIGHTet al. (1988) sugieren que la reduccibn de tiempo de 7 dias a 2 y 4 dias mejoraria 10s resultados del procedimiento. Los datos de BA11,aY et al. (1990) estan de acuerdo con las observaciones de KNIGHTet al. (1988), ya que no encontraron diferencias en 10s niveles de recuperacibn en ninghn &a de muestreo. Sin embargo estos datos estin realizados a partir de cultivos puros de Listeria monoytogenes y no de muestras comerciales como es nuestro caso. La FDA ha modificado el procedimiento y ahora recomienda el caldo LEB tras 1 dia y 2 dias de incubacicin a 30°C. Otros estudios estin de acuerdo con el procedimiento de la FDA. fistudio de lvs medios qbeapcos ugurudos en el uislumientv de Lsteriu sp. en Lvngunips

Se ha evaluado el comportamiento de dos medios especificos, agar Acriflavina-Ceftazidime (A.C) y agar Palcam, a temperatura de enriquecimiento de 4OC,observando que el numero de aislamientos en longanizas frescas es mayor en el agar Palcam que en el medio A.C. (Tabla no 4). Este mismo comportamiento del medio Palcam se observa tanto en longanizas semicuradas como curadas y a las diferentes temperaturas de preenriquecimiento estudiadas, si bien 10s dos agares demuestran la misma efectividad a 4°C para la variedad curada vabla no 5) Ambos medios de aislamiento han sido ensayados con &xito por diferentes autores, comparandolos con otros medios selectivos a partir de cepas aisladas de carne y productos cirnicos, pero nunca habian sido comparados entre si. Aunque continuos estudios comprueban la eficacia del agar Palcam para el aislamiento de Listeria monoytogenes a partir de alimentos que contienen una gran poblacihn microbiana (CASSIDAY y BRACKEIT, 1989) WUANGet al. (1992) estudiaron la efectividad de dos medios de aislamiento de Listeria monoytogencs en muestras de carne (agares Palcam y Oxford) y se observb que el medio Palcam fue mis eficaz que el agar Oxford. En otro estudio comparativo de cuatro agares diferentes: McBride modificado, Oxford y Palcam (citados anteriormente) y el agar Vogel Johnson (BUCHANAN et al., 1987, 1988) tanto para el aislamiento como recuento de Listeeria innocua en Tabla 4.Presencia de Listeria en muestras de longaniza fresca, preenriquecida a 4"C, en diferentes medios de aislamiento Medios

no.

AC Palcam

5/9 9/9

I,. mvno$ogenes

/n'

55,55 tO0,00

1 /9 ?/9

Tabla 5. Presencia de Iisteria en muestras de longaniza curada y semicurada, preenriquecida a 4'C y 3OoC, en diferentes medios de aislamiento 4OC I.. mvnoytogenes

Muestras

Iisteriu sp.

Semicuradas

A(:: 2/6 (33,33 %) Pal: 5 / 6 (83,33 Yn) AC: 3/? (42,85Yn) Pal: 3/7 (42,85Yn)

Curadas

216 (33,33 /'n) 3/6 (50 'Yn) 0/7 (0,OO Yn) 0/7 (0,00 ?h)

30OC Lzssteriu

sp.

AC:0/6 (O,00 (YO)

L. monvytogenes

0/6 (0,OO Yn) Pal: 2/6 (33,33Yo) 1/6 (16,66Yn) AC: 1/7 (4,28%I) 0/7 (O,OO Yn) Pal: 3/7 (42,85%) 0/7 (0,OO 'Yn)

Presencia de Listeria monocytogenes y Listeria sp. en longanizas frescas y curadas

623

homogeneizaci6n2 min 4'Ul. 3 y 5 dfas

37OU12h: l l d

'

Agar PaIc.m 37OU48 h. Figura 2. Procedimiento recomendado en el aislamiento de listeria para productos cirnicos frescos

queso T a l c d o , se observaron que 10s mejores resultados fueron obtenidos con el agar Oxford

y Palcam (GARZAROLI y RONDINIMI,1992) T~WAFU y ALDENWRATH(1990) estudiaron la efectividad del agar A.C. en el aislamiento dc Lzsteria monogvtogenes frente a otros medios, e n productos carnicos, observando que el agar A.C. era eficaz a1 90% junto con 10s agares Oxford y LPM, cuando el enriquecimiento era realizado a temperatura de 30°C durante 2 &as. El agar A.C. consiguib mayor nfimcro de aislamientos de listerias, mas rapidamente y con mayores cantidades que el agar d e McBridc. BANNERMAN y BIUE (1 988) comprobaron que el agar A.C. fue un medio altamente sensible para la recuperacion de Listeria sp. a partir de productos alimenticios contaminados. Los agentes selectivos parece ser que tiencn diferente comportamiento, dependiendo de la temperatura de incubacibn; asi, se comprobb que las cepas de Listenu seelkeri crecian bicn e n el agar Oxford cuando kste era incubado a tcmperatura de 30°C, sin embargo eran inhibidas a 37°C (CURTISet al., 1989). A partir de 10s resultados obtenidos y tras el estudio y comparaciones correspondientes proponemos para productos cirnicos (especialmente para productos frescos) la metodologia expuesta en la Figura 2 para el aislamiento de Listenu monoytogenes y especies emparentadas. Con cllo pretendemos cubrir la laguna que existe en estc tip0 de alimentos.

Agradecimientos Queremos manifestar nuestro agradecimiento a la Srta. Nieves Ortega, oficial de laboratorio, por su eficaz colaboracion en la preparacibn de 10s medios de cultivo utilizados en este trabajo. Este estudio ha sido financiado por la DGICYT mediante el proyecto de investigacion no PM890083.

Bibliografia BAILEY,J.S., D.L. FLETCHE,and N.A. Cox, 1990: Effect of enrichment media sampling protocol on recovery of List& monolytogenes.J. Food Prot. 53, 505-507. BANNERMAN, E., and J. BILJJ~,1988: A new selective medium for isolating I h r i u spp. from heavily contaminated material. Appl. and Environ. Microbiol. 165-1 67. B E C ~ ~ R SH.I., , P.S.S. SOENTORO,and E.H.M. DELFGOV-VANand ASCH, 1987: The occurrence of L s t c r i u monocytogenes in soft cheeses and raw milk and its resistance to heat. Int. J. Food Microbiol. 4, 249-256. BLANCO, G., C. ROTA, D. BLANCC), C. PEREZ, J. YANGUELA, and A. H ~ K R E R A 1991: , Listeriu en productos Iicteos: intento de mejora del mktodo de deteccion. I11 Congreso Mundal de Tecnologia de Alimentos, Barcelona, p: 113. BUCHANAN, R.L., ].IA. SMITH,H.G. STAHL,and D.L. ARCHER,1988: Listeriu methods development research at the Eastern Regional Research Center, US. Dep. Agric. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 651-654. BCICHANAN,R.L., H.G. STHAL,and L. DDVORAN,1987: Improved plating media for simplified quan~ rfoods. Food Microbiol. 4, 269-275. titative detection o f Listeriu 7 m n o ~ t o p in

624

ROTA et al

CASSJDAY,P.I