Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, July 2008, Vol. 22, No.7
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新型可降解人工泪小管的制备与表征 郑贵球 1
蒋丽霞 1
顾其胜 1
王晓敏 2
【摘 要】 目的 研制一种可生物降解的胶原 - 壳聚糖 - 聚乙烯醇 [poly（vinyl alcohol），PVA] 复合人工泪小管， 用于治疗因泪道阻塞导致的溢泪症。 方法 按照一定比例均匀混合胶原、壳聚糖、医用 PVA 溶液，通过反复的冻融过程 使其形成弹性凝胶，再依次经过清洗、造孔、脱水、剪切后即得 T1、T2 和 T3 组的可降解人工泪小管。光镜下观察表面形 貌和测量内、外直径。扫描电镜观察 T2 组人工泪小管凝胶态和干态的断口形貌，以及是否存在相分离现象。通过吸水溶 胀性能测试计算 3 组人工泪小管的吸水率和膨胀率。采用体外降解实验初步观察 3 组人工泪小管的降解情况。 结 果 通 过物理交联成胶的方法成功制备出内径 0.5 ～ 0.7 mm，外径 0.9 ～ 1.5 mm，长度≥ 20 mm 的胶原 - 壳聚糖 -PVA 复合人工 泪小管。扫描电镜观察到液氮脆断的人工泪小管内部成分分布均匀，内外壁表面平整，冷冻干燥的人工泪小管断口呈凝胶 态的互穿网络结构。3 组不同成分的人工泪小管在 PBS 溶液中浸泡 30 min 后均快速吸水溶胀，外径扩大 100% ～ 120%， 内径扩大 20% ～ 30%，并且随胶原含量增高，溶胀速度增快，平衡溶胀率增大。3 组人工泪小管在 37℃含 2 mg/mL 溶菌 酶的 PBS 液中浸泡 1 个月后，表面有部分细小絮状物，管口开裂，管壁变薄，透明度增加。在 70℃ PBS 溶液中加速降解 2 d 后，该小管成白色糊状。 结论 制备的新型可降解人工泪小管具有良好的力学性能和吸水溶胀性，便于手术操作，可 支撑泪道，利于泪液的流通，防止泪小管粘连，有望成为一种治疗泪道阻塞的新材料。 【关键词】 人工泪小管 泪道阻塞 胶原 壳聚糖 聚乙烯醇 中图分类号： R318.08 R777.23
文献标志码：A
PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF NOVEL DEGRADABLE ARTIFICIAL LACRIMAL CANALICULUS/ ZHENG Guiqiu 1, JIANG Lixia 1, GU Qisheng 1, WANG Xiaomin 2. 1Shanghai Qisheng Institute of Biomaterial & Technology, Shanghai, 201106, P.R.China; 2Bioengineering College, Southwest Jiaotong University. Corresponding author: ZHENG Guiqiu, E-mail:
[email protected] 【Abstract】 Objective To develop a novel biodegradable collagen-chitosan-[poly(vinyl alcohol), PVA] composite artificial lacrimal canal iculus for treating tear overflowing (epi phora) caused by canal icular obstruction. Methods Homogeneously mixing solution composed of collagen, chitosan and PVA with different ratios was prepared. After several cycles of freezing/thawing process, the mixing solution was transferred into elastic hydrogel. Then the hydrogel was rinsed, punctured, dehydrated and trimmed, and three groups (T1, T2 and T3) of novel artificial lacrimal canal iculus were obtained. The appearance and diameter of all samples were observed under optical microscopy. The cross-section before and after drying as well as phase distribution of sample T2 was observed by SEM. The water absorption ratio and expanding ratio in PBS solution were calculated from three swell ing behavior curves. The degradabil ity of groups T1, T2 and T3 were prel iminary analyzed by degradation experiment in vitro. Results The micro-tubes with 0.5-0.7 mm in inner diameter, 0.9-1.5 mm in outer diameter and more than 20 mm in length were fabricated successfully through physical crossl inking without addition of toxic cross-l inker. SEM result showed that the sample had uniform phase distribution and smooth surface at dried state as well as interpenetrate network structure at hydrogel state. It was seen from the swell ing behavior curves that groups T1, T2 and T3 swelled rapidly within 10-30 minutes, and formed elastic composite hydrogel pi pes. In addition, the expanding ratio of inner and outer diameter of the tube was 20%-30% and 100%-120% with swell ing, respectively. The equil ibrium water content of the hydrogel pi pes increased with increase of collagen composition. Three groups of samples were immerged in PBS solution contained 2 mg/mL lysozyme at 37℃ for 1 month, their nozzle cracked, their wall became thin and more transparent. And also, there was small floc deposited on the tube surface. The samples were degraded into mash after they were soaked in PBS solution at 70℃ for 2 days. Conclusion The novel artificial lacrimal canal iculus with good mechanical property and high water absorption is in favor of operation, tear passing and anti-conglutination. It will be a potential candidate for treating the lacrimal passage occlusion. 【Key words】 Artificial lacrimal canal iculus Canal icular obstruction Collagen Chitosan Poly(vinyl alcohol)
作者单位：1 上海其胜生物材料技术研究所（上海，201106）；2 西南交通大学生物工程学院 通讯作者：郑贵球，工程师，研究方向：天然降解生物医学材料，E-mail:
[email protected]
中国修复重建外科杂志2008年7月第22卷第7期
泪道阻塞引起的溢泪症是临床眼科中一种常见泪
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糖溶液。90℃水浴中溶解 PVA 颗粒配成 10% （w/ w）
道疾病，多因炎症、外伤、鼻腔疾病或者先天性泪道发
PVA 溶液。
育异常等引起。治疗泪道阻塞的方法很多，如反复冲
1.2.2
洗泪道、泪道串线、泪道注入凝胶、机械探通、激光探
2% 壳聚糖溶液，于冰水浴中磁力搅拌混匀，加入 25 g
通、插入人造泪管，甚至切开泪囊鼻腔直接进行手术
10%PVA 溶液，搅匀。加入 2 mol/L NaOH 溶液，调节
等
[1-9]
人 工 泪 小 管 制 备 取 30 g 胶 原 溶 液 和 20 g
。目前，从治疗效果、手术创面大小、患者承受的
溶液 pH 为 6.5 ～ 7.0，低温冷藏，静置 12 h 脱泡。将
痛苦程度来看，激光探通联合插入人造泪道管是较好
混合液注入模具中，于－ 20℃冷冻 12 h，室温解冻后再
的治疗方法 [10-11]。但是，硅胶管不降解，当探通部位愈 合后，需进行二次手术将硅胶管取出，取出过程的摩擦 对初愈部位以及正常泪道内壁造成创伤，不仅带给患 者痛苦，而且可能引起泪道再粘连或狭窄，影响疗效。 胶原和壳聚糖均是可降解的天然高分子材料。胶 原是生物体内一种纤维蛋白，大量存在于骨、软骨、 肌腱及皮肤中。天然胶原聚集体不仅是止血剂，也是 ECM 的重要成分，对支撑组织、调控细胞等方面有重
置于－ 20℃冷冻，循环 5 次。取直径 0.7 mm 穿刺针插 入成型的弹性复合凝胶中，置于水中漂洗 30 min 去除 残留碱液。自然干燥、脱模、修剪两端即得胶原 - 壳聚 糖 -PVA 复合人工泪小管（图 1）。调整胶原、壳聚糖、 PVA 的含量，制备 3 种人工泪小管（T1、T2、T3），其成 分及含量见表 1。
要生物学功能 [12-14]。壳聚糖是甲壳质脱乙酰基后的一 种天然多糖，在体内可降解吸收，具有黏弹性及止血作 用，能抑制成纤维细胞生长，促进上皮细胞生长 [15-17]。 医 用 聚 乙 烯 醇 [poly（vinyl alcohol），PVA] 是 一 种 水 溶性高分子，具有良好生物相容性、力学性能以及成膜 性，PVA 水凝胶具有高透明度和润滑性，可制成人工角 膜和人工韧带 [18-22]。将 PVA 作为添加剂加入到胶原 及壳聚糖中制备多孔支架材料或生物膜，力学性能明
图 1 胶原 - 壳聚糖 -PVA 复合人工泪小管样品 Fig.1 Picture of collagen-chitosan-PVA composite artificial lacrimal
显提高。我们实验选用胶原、壳聚糖和 PVA 作为原材
canaliculus with translucence
料，通过反复冻融的物理交联成胶法，试制一种生物相 容性良好的可降解人工泪小管替代硅胶管，避免二次 手术取出，减轻患者的痛苦，以提高疗效。
表 1 3 种胶原 - 壳聚糖 -PVA 复合人工泪小管的成分及含量（g） Tab.1 Composition and contents of three novel biodegradable collagenchitosan-PVA composite artificial lacrimal canaliculus (g)
1 1.1
材料与方法 主要试剂及仪器 胶原溶液和壳聚糖（脱乙酰度为 97%，上海其胜生
物制剂有限公司）；PVA-124（国药集团化学试剂有限 公司）；溶菌酶（鸡蛋清，相对分子质量为 1.44 × 103，酶 活力≥ 2 × 104 U/mg，上海东风生化技术有限公司）；冰 乙酸、NaOH（上海祥德精细化工厂）；Na2HPO4（上海 光铧科技有限公司）；NaH2PO4（上海新华化工厂）。实 验中所用水均为注射用水。 S21-3 型磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）； PL2002 和 AL204 电 子 天 平（Mettler Toledo 公 司， 瑞 士） ；pHS-25 型 pH 计（上 海 雷 磁 仪 器 厂）；JSM5900OLV 扫描电镜（Jeol 公司，日本）。 1.2
实验方法
1.2.1 溶液配制 取 100 g 洗净的牛跟腱（上海牛羊肉
PVA溶液
组别 Group
胶原溶液 Collagen solution
壳聚糖溶液 Chitosan solution
PVA solution
T1
70
30
50
T2
30
20
25
T3
27
27
27
1.3
观察指标
1.3.1 一般观察 采用直尺测量 3 组人工泪小管长度。 用刀片将 3 组样品剪切为长约 1 mm，垂直置于带标尺 的光镜下观察，并测量管径（内径 Ødi 和外径 Ødo）及壁 厚。将 3 组样品剪切成约 40 mm 长，镊子夹住两端，将 人工泪小管弯曲约 90°，然后放开镊子，观察其回复程 度以及是否折裂。 1.3.2 扫描电镜观察 3 组一般观察结果基本相同， 故 在 T2 组中随机抽取 1 根人工泪小管，置于液氮中脆断，
公司提供）经醋酸溶液抽提，胃蛋白酶消化后得胶原溶
将新断口朝上，固定于样品台上，喷金镀膜，于 20 kV
液。2% 乙酸溶液溶解壳聚糖，制备为 2% （w/ w）壳聚
工作电压下，扫描电镜观察其断口和内、外壁形貌。取
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T2 组中 1 个脱水前的凝胶样品进行冷冻干燥，然后按
3 组人工泪小管在 PBS 溶液中浸泡后，表面光滑，
相同方法观察断口形貌。 1.3.3 吸水溶胀性能测试 将 3 组人工泪小管剪切
浸泡 30 min 快速吸水溶胀，2 h 后趋向溶胀平衡，平
成 3 根长约 10 mm 样本，称干重 W0 后，室温浸泡入 PBS 溶液（pH7.48）中，在时间 t 取出，用滤纸吸表面沾
越高，平衡溶胀率越大（图 4）。光镜观察吸水溶胀后， 3 组人工泪小管的内、外直径均扩大，内径扩大率为
附水珠，称湿重 Wt。计算溶胀率（%）＝（Wt － W0）/ W0 × 100%。并将上述 3 组达溶胀平衡后的人工泪小
20% ～ 30%，外径扩大率为 100% ～ 120%。
衡溶胀率为 270% ～ 370%。人工泪小管中胶原含量
2.4
体外降解实验
管横向切取约 1 mm 长，按照 1.3.1 中的一般观察方法
3 组人工泪小管在 37℃含 2 mg/mL 溶菌酶的 PBS
测量其内径 Øsi 和外径 Øso，计算人工泪小管的内径扩
溶液中浸泡 1 个月后，人工泪小管表面有部分细小絮
大率（%）＝（Øsi － Ødi）/Ødi × 100%，外径扩大率（%） ＝
状物，管口开裂，管壁变薄，透明度增加。于 70℃ PBS
（Øso － Ødo）/Ødo×100%。 1.3.4 体外降解实验 取 3 组长约 10 mm 人工泪小管
溶液中加速降解 2 d 后，T2 组人工泪小管变为白色糊 状物。
各 1 根，浸泡于含 2 mg/mL 溶菌酶的 PBS 液中，置于 37℃恒温培养箱中，隔周换液，持续 1 个月，观察人工 泪小管的形状变化及是否胀裂或溶解。另取 T2 组中 3 根长约 10 mm 人工泪小管，浸泡于 PBS 溶液中，置于 70℃烘箱中加速降解 2 d，观察其形状变化以及是否胀 裂或溶解。 2 2.1
结果 一般观察 通过形成水凝胶途径制备出的 3 组人工泪小管均
表面光滑，呈半透明，长度≥ 20 mm。光镜下观察其 Ødi 为 0.5 ～ 0.7 mm，Ødo 为 0.9 ～ 1.5 mm。3 组 人 工 泪小管弯曲 90° 后均能快速回复，无折裂。 2.2 扫描电镜观察 液氮脆断后的 T2 组人工泪小管断口较平整，内部
Fig.4
图 4 3 组人工泪小管在 PBS 溶液中的溶胀行为曲线 Swelling behavior curves of T1, T2 and T3 collagen-chitosan-PVA
composite artificial lacrimal canaliculus in PBS solutions
3
讨论
成分分布均匀，无相分离现象，内壁平整光滑，外壁微
胶原、壳聚糖和医用 PVA 溶液均匀混合后，不添
观凹凸不平，外围可见细小的收缩皱纹（图 2）。冷冻干
加任何化学交联剂，不改变胶原和壳聚糖的生物学性
燥后的 T2 组人工泪小管断口呈凝胶态的互穿网络结
能，通过简单的物理交联，形成弹性复合凝胶柱，然后
构（图 3）。 2.3 溶胀性能测试
造孔、清洗、风干、脱模后即制得半透明状人工泪小管。 PVA 是一种水溶性的高分子，分子链上含有大量
图 2 液氮脆断的 T2 组人工泪小管形貌扫描电镜观察 a 断口（× 70） b 人工泪小管内壁表面（× 500） c 人工泪小管外壁（× 500） 图 3 冷 冻干燥后的 T2 组人工泪小管断口形貌（扫描电镜 × 150） Fig.2 SEM observation of collagen-chitosan-PVA composite artificial lacrimal canaliculus after breaking in liquid nitrogen (T2) the tube (× 70) b Inner surface of the tube (× 500) hydrogel (T2) after freeze drying (SEM × 150)
c Outer surface of the tube (× 500) Fig.3
a Cross-section of
Cross-section morphology of collagen-chitosan-PVA
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羟基，经反复冷冻 / 解冻后，分子间可发生物理交联，
吸收的胶原和壳聚糖与生物相容性和力学性能良好的
形成弹性性能良好的凝胶。胶原和壳聚糖也具有丰富
医用 PVA 复合，通过简便快速的成型和造孔方法制备
的活性基团，如羧基、羟基和氨基。在解冻过程中，凝
出的胶原 - 壳聚糖 -PVA 可降解人工泪小管，代替不可
胶处于近中性，且室温条件下（约 25℃），胶原会在一定
降解的医用硅橡胶制成泪道再通管，植入探通后的泪
程度上发生自组装，胶原分子间及胶原、壳聚糖和 PVA
道内，当泪道功能恢复正常后，人工泪小管逐渐降解随
之间也会形成大量氢键，进一步促进复合凝胶的形成，
泪液流出，有望成为新型可降解的人工泪小管广泛应
增强凝胶的弹性
[23-24]
。经过反复的冷冻 / 解冻过程，分
用于眼科泪道手术中。
子间的相互作用使胶原、壳聚糖和 PVA 分子形成一种 互穿网络结构，胶原和壳聚糖分子穿插在 PVA 的网络 空隙中
[25-30]
，形成均匀复合凝胶。凝胶缓慢脱水过程
中，随着网络间大量水分的挥发，凝胶不断收缩，逐渐 依附在针上干燥成管状。液氮脆断的人工泪小管断口 显微照片中未见有相分离现象，表明均匀复合凝胶的 形成。管内壁紧贴具有光滑表面的穿针，干燥后脱模 得到内壁平整光滑的人工泪小管，其表面的微细划痕 是脱模时与穿刺针表面相互摩擦所致。而脱水过程中， 管外壁无束缚物，其横向会有局部收缩不均，导致外表 面有细小收缩皱纹。 因人工泪小管是由互穿网络结构的水凝胶经脱水 而得，且所含的胶原、壳聚糖和 PVA 均具有良好的亲 水性能，将其浸泡于 PBS 溶液中，在渗透压的作用下， 大量水分子进入互穿网络结构的复合凝胶中，人工泪 小管快速吸水溶胀，形成柔软的弹性凝胶管。由于胶 原分子链上含有大量的羧基，而带负电荷的解离态羧
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人工泪小管吸水率越大。随着人工泪小管体积的膨
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胀，内壁向外扩张，内径扩大，管壁增厚，外径增加。这 种溶胀行为是在无外加压力的条件下自由溶胀的结 果，预计将该人工泪小管插入泪道后，因其受到泪道内 壁的压迫作用，溶胀率会有所减小。根据溶胀性能测 试结果可推测该人工泪小管插入泪道后，外径的扩大 可起到有效的机械定位作用，内径的增大有利于泪液 的畅通，达到插入人工泪小管后快速解决溢泪症状的 目 的。 在 37℃含 2 mg/mL 溶菌酶的 PBS 溶液中，壳聚糖 和胶原在溶菌酶的酶解作用下，缓慢分解成小分子，导 致在人工泪小管表面附着大量絮状物。当均匀分布在 互穿网络结构的凝胶管中的胶原和壳聚糖被生物降解 后，凝胶管的透明度增加，随之其中未发生物理交联的 PVA 分子溶解到 PBS 溶液中，最终导致整个互穿网络 构架破坏，泪小管降解，形成可流动的糊状物。而人工 泪小管在 70℃的 PBS 溶液中加速降解 2 d 后，胶原和 壳聚糖快速分解，PVA 大量溶解，成白色糊状物，表明 人工泪小管的可降解性。 结合前期的实验研究结果，选用可生物降解和可
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（本文编辑：刘丹 董奇男）
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•信
息•
中国康复医学会修复重建外科专业委员会 第十六次学术交流会征文通知 中国康复医学会修复重建外科专业委员会定于 2008 年 9 月 18 日－ 22 日，在河北省石家庄市召开第十六次学术交流大会。会 议由中国康复医学会修复重建外科专业委员会主办，河北医科大学附属第三医院承办， 《中国修复重建外科杂志》编辑部、上海市 新力会展公司协办。欢迎全国各地从事修复重建外科工作及相关专业的医务人员踊跃投稿，会议期间聘请国内著名专家进行专题 讲 座。 会议期间将召开中国康复医学会修复重建外科专业委员会第五届委员会，选举产生中国康复医学会修复重建外科专业委员会 第六届委员会。召开《中国修复重建外科杂志》第四届编委会，请学会委员、专家委员会委员、青年委员会委员及杂志编委务必出 席会议。 会议主题：①组织移植与器官再造；②严重创伤的治疗及并发症处理；③颅颌面畸形的治疗及失败病例报道；④干细胞与组织 工程；⑤关节功能重建与人工关节置换。会议将邀请国内外著名专家做精彩专题报告。 征文范围：骨科、整形外科、烧伤科、手外科、显微外科、头颈外科、肿瘤外科、口腔颌面外科、美容外科、普外科、神经外科、泌尿 外科、康复科、眼科、五官科、皮肤科等学科领域从事组织器官修复与重建的基础研究、临床工作总结、生物材料研制与开发。 征文内容：机体组织器官缺损修复与再造的基础理论、实验研究及临床工作报告；创伤愈合机制的实验研究与临床研究；组织 器官损伤后功能康复；生物材料在修复重建外科领域的研究开发及应用；周围神经损伤修复的研究及进展；影像技术及三维模拟 技术在修复重建外科领域的应用；颅颌面畸形的临床治疗成果；骨、软骨、肌腱、角膜、皮肤、神经等组织工程学的研究成果及进展； 显微外科技术的应用及研究进展；躯干及四肢畸形的矫形外科治疗等方面的内容。 征文要求：投稿论文要求全文在 4 000 字以内，论文摘要 400 ～ 600 字，用 Word 打印，以便审稿、修稿和编辑学术论文集。截 稿日期：2008 年 5 月 31 日。 投稿地点：上海市黄浦区制造局路 639 号，上海交通大学医学院附属第九人民医院整形外科颜俊洁收，邮编：200011。请在 邮件表面注明“会议征文”字样。联系人：张余光教授，电话：021-63138341-5646，13301800773。电子邮箱：qizuolianglih@yahoo. com.cn，
[email protected]。 中国康复医学会修复重建外科专业委员会 2007-12-20
