PRACTICA 9 COLORACION GRAM

PRACTICA 9
Hans Christian Gram
(1853-1938)

TINCION DE GRAM

INTRODUCCIÓN:

La tinción diferencial requiere más de un tipo de colorante y se
utiliza para distinguir entre varios tipos de células bacterianas. Una
tinción diferencial típicamente consiste de tres pasos principales: primero
un colorante primario, el cual se utiliza para teñir a todas las células en
la tinción; enseguida un paso de decoloración, el cual remueve el colorante
solo de ciertos tipos de células y finalmente un colorante de contraste, el
cual tiñe las células recién decoloradas pero no tiene efecto sobre las
células que aún retienen el colorante primario.
La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es
una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que
clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y
Gram negativas

FUNDAMENTO

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las
paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a
estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano,
ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular
bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que
las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se
debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en
solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa
de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el
complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto
este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por
el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más
resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a
la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los
poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.


Coloración.
Esta coloración permite la clasificación de las bacterias en gram
positivas y gram negativas según la composición de su pared celular.


Tinción diferencial
Es aquella donde usas más de un colorante. Con esta tinción se puede
ver morfología, tamaño, organización de las bacterias y además categorizar
los microorganismos en varios grupos, según su afinidad con el colorante
que se está utilizando. Hay varios tipos de tinción diferencial pero las
mas se usa es la tinción de gram o coloración de gram.


Bacterias Gram Positivas.

Aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la
tinción de Gram. La pared externa de la envoltura celular de una bacteria
Gram positiva tiene como base química fundamental el peptidoglucano, que es
un polímero.
"Las capas que rodean a la célula bacteriana se conocen en su"
"conjunto con el nombre de envoltura celular. "
" "
" " "



Bacteria Gram Negativas.
Se caracterizan por presentar una membrana celular interna la cual se rodea
por una pared celular delgada de peptidoglicano y, hacia el lado externo
del cuerpo de la célula una membrana celular externa que recubre la pared
celular en estas bacterias.
Envoltura celular Gram negativa.
Envoltura celular Grampositiva.
Los flagelos de las bacterias, localizados en la envoltura son
componentes que permiten la motilidad de las mismas.

" "



Laboratorio.
Materiales:
Mechero.
Microscopio.
Vaso precipitado.
Laminilla portaobjetos.
Asa.
Medios de cultivo (Cepas)
Bandeja.
Agua de chorro.
Cristal Violeta o violeta de genciana.
Solución de Lugol.
Alcohol –Acetona.
Safranina
Aceite de inmersión.


Recomendación: previamente a realizar cualquier práctica de microbiología
se debe de limpiar el mesón de trabajo con creolina y algodón.

Preparación del frotis:
1. Calentar el asa hasta que este al rojo para esterilizarla.



2. Con la ayuda del asa ya esterilizada agregar una gota de agua sobre
la lámina portaobjeto.







3. Calentar nuevamente el asa para desinfectarla.



4. Tomar la porción de la muestra que se va a examinar por medio de un
asa.


5. Colocar la muestra sobre el portaobjetos, de igual manera expandir
la muestra de forma delgada y homogénea.


6. Fijar el frotis pasándolo tres veces a través de la llama con la
muestra hacia arriba.




Coloración- Técnica
1. Agregar violeta de genciana o cristal violeta sobre la preparación y
dejar actuar por 1 minuto.






2. Enjuagar con agua de chorro y escurrir.




3. Agregar la solución de Lugol y dejar actuar por 1 minuto.



4. Lavar con agua de chorro y escurrir.




5. Agregar el alcohol-acetona (Decolorar) y dejar actuar por 30 segundos
a 1 mn y enjuagar con agua de chorro.

6. Agregar la solución de Safranina y dejar actuar por 1 minuto,
enjuagar, escurrir y dejar secar al aire.




Observar al microscopio óptico 100x (aceite de inmersión)


Observar la preparación al microscopio.

Lámina 1. Observación de cocos y bacilos Gram positivos.















Lámina 2.Observación de bacilos Gram negativos.



Lámina 3. Observación de bacilos Grampositivos y Gram negativos.