PRÁCTICA 10: EFECTO DE FACTORES QUÍMICOS Y AMBIENTALES EN CRECIMIENTO MICROBIANO

13 de mayo de 2013

PRÁCTICA 10: EFECTO DE FACTORES QUÍMICOS Y AMBIENTALES EN CRECIMIENTO MICROBIANO

LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

PRÁCTICA 10 Efecto de factores químicos y ambientales en crecimiento microbiano Equipo 1: Aguilar Castañeda Brian Castañeda Herrera Fernando Lastra Martos Carlos A. Martínez Cervantes Juan C. Ramírez Amador Fidel O. Martes 21 de Mayo de 2013

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Objetivo. Determinar los efectos de antibióticos, temperatura y el pH en el crecimiento de diferentes microorganismos. Introducción. El Bacteriólogo escocés Alexander Fleming, convirtió uno de sus cultivos que se habían echado a perder, en uno de los más importantes adelantos médicos de la historia. (Audesirk, 2008) Un cultivo de los que utilizó Fleming se había contaminado, con una mancha de un moho llamado penicillium. Antes de que Fleming se dispusiera a tirar la caja con el cultivo infectado, lo observó y se dio cuenta de que al parecer no crecían bacterias alrededor del moho. Por ende Fleming creó la hipótesis de que el penicillium genera sustancias que eliminan a las bacterias que crecen cerca de ásta. (Audesirk, 2008) Para comprobar esta teoría,Fleming realizó una prueba, donde cultivó penicillium en un tubo de ensaye con caldo nutritivo líquido, después de esto, filtró un poco de este líquido y lo aplicó a una muestra pura de bacterias, después de un tiempo se dio cuenta de que su hipótesis era cierta, el penicillium eliminó el crecimiento bacteriano de las muestras. Posteriormente se realizaron investigaciones posteriores que sirvieron para realizar la producción de los primeros antibióticos. (Audesirk, 2008) Dogmak y sus colaboradores, en 1946 consiguieron sintetizar la tiosemicarbazonas in vitro, la cual se utiliza contra Mycobacterium tuberculosis, lo cual sería confirmado después en estudios in vivo. (Riobó, 2007) De los estudios acerca de las reacciones antituberculosas de tiosemicarbazonas se pudo concluir que las más llamativas debido a sus propiedades contra Mycobacterium tuberculosis son las derivadas de benzaldehilo tiosemicarbazonas de las cuales la más utilizada es la tiacetazona, la cual fue empleada en África para el tratamiento de la tuberculosis. (Riobó, 2007) Waksman tenía conocimiento de los experimentos realizados por el científico francés Albert Vaudremer, el cual en 1913 pudo comprobar que los extractos de Aspergillus fumigatus inactivan la tuberculina y disminuye la virulencia ante Mycobacterium tuberculosis. (Raviña, 2008)

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Waksman se empeñó entonces en la búsqueda de antibióticos que pudieran inhibir el crecimiento o en su caso erradicar al bacilo de la tuberculosis. (Raviña, 2008) No fue sino después de cultivar y estudiar centenares de cepas que, en 1944 Waksman y sus colaboradores publican el aislamiento de la estreptomicina de un cultivo de Streptomyces griseus, el cual se convirtió en el primer antibiótico efectivo contra el bacilo de la tuberculosis y el primer antibiótico perteneciente al grupo de los amino glucósidos. (Raviña, 2008) En 1949 Waksman y Lechevalier descubrieron la neomicina, también aminoglucósidos que fueron aislados de un cultivo de Streptomyces fradiae. (Raviña, 2008) Los antibióticos son sustancias que inclusive si se encuentran en pequeñas concentraciones son capaces de inhibir el crecimiento o la multiplicación de bacterias y hongos. Las sustancias que influyen el crecimiento bacteriano se dice que tienen acción bacteriostática y en caso de hongos la acción es llamada fungistática. (Koolman, 2004) En su mayor parte los antibióticos son generados por microorganismos, en especial por Streptomyces y ciertos hongos. También existen agentes antibacterianos de origen sintético, un ejemplo de éstos es la sulfonamida. (Koolman, 2004) Un problema que se genera con la terapia mediante antibióticos, es el aparecimiento de microorganismos que presentan resistencia a éstos, esto quiere decir que ya no presentan respuesta ante los antibióticos existentes. (Koolman, 2004) Existen diferentes clases de antibióticos, los cuales son: 

Intercaladores: Éstos tienen su lugar de acción en la doble hélice del ADN, de esta forma interfieren en la replicación y transformación de las bacterias, pero debido a que atacan de igual forma a células eucariotas, es tóxico, así que solo se usan en algunos casos. (Koolman, 2004)



Inhibidores de la girasa: Influyen principalmente en la replicación y por ende sobre la multiplicación microbiana también. (Koolman, 2004)

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

Inhibidores de la traducción: Para esta clase de antibióticos el punto de acción está en los ribosomas bacterianos. (Koolman, 2004)



Antibióticos β-lactámicos: A este grupo es al que pertenece la penicilina, estos son sintetizados por hongos, se utilizan principalmente contra microorganismos Gram positivos e inhiben el crecimiento y síntesis de la pared celular en gérmenes. (Koolman, 2004)



Las sulfonamidas: Esta clase de antimicrobianos actúan principalmente en la síntesis del ácido fólico. (Koolman, 2004)



Los antibióticos de transporte: Éstos tiene la función de canales iónicos, en su incorporación a la membrana plasmática provocan la pérdida de iones que dañan a las células bacterianas. (Koolman, 2004)

Existen organismos que presentan resistencia a algunos antibióticos. La producción de β-lactamasa es la forma en la que muchos de los estafilococos generan resistencia a la penicilina y a su vez a otros antibióticos, como la cefalosporina. (Ingraham, 1998) Algunos otros microorganismos han generado resistencia a antibióticos por otros métodos, por ejemplo en el caso de Streptococcus pneumoniae, que adquiere resistencia al generar una serie de mutaciones que afectan sus proteínas con la unión de las penicilinas. (Ingraham, 1998) Los diferentes mecanismos de resistencia a antibióticos pueden ser encontrados como genes cromosómicos o extra cromosómicos, es decir que se encuentran contenidos en el plásmido. (Ingraham, 1998) Esta resistencia se adquiere mediante mutaciones. (Ingraham, 1998) Otro factor involucrado es el pH, como concepto básico éste se define como la actividad de los iones hidrógeno que actúan dentro de una solución; en términos matemáticos equivale también al logaritmo negativo de la concentración de iones hidrógeno, es decir: pH = -log10 (H+). De esta ecuación se desprende entonces la escala de pH, en la que la concentración de iones de H + va aumentando de diez en diez desde 0 (completamente ácido) hasta 14 (completamente alcalino). (Prescott, 2002).

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Es de esperar entonces que cada microorganismo crezca a diferentes concentraciones de pH según sus necesidades metabólicas. Se conoce como acidófilos a aquellos que crecen en niveles de pH que van de 0 a 5.5; neutrófilos a los que van de 5.5 a 8; y como alcalófilos o basófilos a los que se reproducen en concentraciones más básicas de 8 a11.5. Normalmente la mayoría de los hongos por ejemplo, necesitan de condiciones ligeramente ácidas, como otras bacterias; sin embargo, se han encontrado algas como Cyanidium caldarium o la arquea Picrophilus oshimae capaces de multiplicarse aún a pH cercano a cero. Por supuesto que son pocos los seres capaces de tolerar una acidez semejante (extremófilos), algún otro microorganismo neutrófilo por ejemplo, sufre de numerosas alteraciones en su estructura al rebasar los límites de acidez que es capaz de resistir. Algunas de los cambios que pueden presentarse son: a) b) c) d)

Desintegración de la membrana plasmática. Inhibición de actividad enzimática. Inactividad de proteínas transportadoras. Modificación iónica en moléculas nutrimentales.

En ocasiones es necesario mantener los niveles de pH, dentro de un medio determinado, en un estado óptimo para facilitar así crecimiento de algún microorganismo. Para esto se utilizan los “buffer”, reguladores de pH conformados por sales, que a su vez se componen de ácidos débiles y su base conjugada. Un ejemplo de buffer y el más utilizado además es el fosfato, el cual reacciona de la siguiente manera (Prescott, 2002): H+ + HPO4OH-

HPO4 + HOH + H2PO4

Por el contrario, ciertos microorganismos aún libres en la naturaleza tienden a modificar sus niveles de pH como signo de adaptación. Esta transformación la consiguen mediante diversos sistemas antiporte (sodio-protón, potasio-protón), útiles siempre y cuando los cambios de concentración son mínimos. Pero cuando llegan a encontrarse en un medio medianamente ácido (pH=6 apróx.), se llevan a cabo mecanismos de reacción un tanto más complejos; uno de ellos consiste en la acción de la enzima ATPasa translocadora de protones, la cual, tiene como tarea realizar la respuesta protectora a la acidez produciendo mayores cantidades de ATP y expulsando protones hacia el exterior de la célula. Escherichia coli, es una de las bacterias que puede realizar este fenómeno. Así mismo, puede ser que un cierto microorganismo tenga la necesidad de alterar el pH del entorno que lo rodea para así permitirle una mayor velocidad y/o calidad de desarrollo; la formación de residuos metabólicos con diferentes concentraciones de iones H+ es una solución a esta necesidad. Durante el proceso

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de fermentación por ejemplo, ciertos agentes microbianos producen ácidos orgánicos a base de hidratos de carbono; por otro lado, existen microbios capaces de alcalinizar su propio medio por la formación de amonio, consecuencia de la síntesis de aminoácidos. (Prescott, 2002). Otro factor importante en el crecimiento microbiano es la temperatura. La mayor parte de los microorganismos crecen bien a las temperaturas preferidas por los seres humanos. Los microorganismos se clasifican en tres grupos principales sobre la base de sus límites de temperatura preferidos: sicrófilos (afinidad al frío), mesófilos (afinidad a temperatura moderada y termófilos (afinidad al calor). La temperatura mínima de crecimiento es la temperatura más baja a la cual crecerá la especie. La temperatura óptima de crecimiento es la temperatura a la cual la especie crece mejor. Por último, la temperatura máxima de crecimiento es la temperatura más alta a la cual puede crecer. El término sicrótrofos, se refiere al grupo de microorganismos ambientales que deterioran los alimentos. También se utilizan los términos sicrófilos moderados o sicrófilos facultativos para estos microorganismos. La refrigeración es el método de conservación de alimentos en el hogar más común. Los sicrótrofos en realidad no crecen bien a temperaturas bajas, en comparación con otros organismos; sin embargo con el paso del tiempo, pueden degradar lentamente los alimentos. Los mesófilos, tienen una temperatura ideal de crecimiento de 25 a 40 °C. Suelen ser huéspedes de animales. La temperatura óptima para muchas bacterias patógenas es de alrededor de 37 °C. Los termófilos tienen normalmente temperaturas óptimas de crecimiento de 50 a 60°C. Para algunos microbios, miembros del dominio Archaea, la temperatura óptima de crecimiento es de 80°C o más. La mayor parte de estos microorganismos, que se nombran hipertermófilos o termófilos extremos, viven en fuentes termales asociadas con actividad volcánica.

Resultados. Siguiendo la metodología, primero se probará la resistencia de microorganismos a antibióticos, en la Tabla 1 se muestra los antibióticos a utilizar con sus respectivas concentraciones con las que se trabajó en la práctica.

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Tabla 1. Concentración de cada antibiótico. Cefaclor, Amoxicilina y Metronidazol en mg/ml (miligramos sobre mililitro) y Penicilina en ml (mililitros) ya que de esta última no se hicieron diluciones solo se cambió el volumen. Antibiótico Amoxicilina

Cefaclor

Metronidazol

Penicilina

C1

0.01 mg/ml

0.005 mg/ml

0.005 mg/ml

2 ml

C2

0.1 mg/ml

0.05 mg/ml

0.05 mg/ml

4 ml

C3

1 mg/ml

0.5 mg/ml

0.5 mg/ml

6 ml

C4

15 mg/ml

5 mg/ml

5 mg/ml

8 ml

C5

250 mg/ml

100 mg/ml

100 mg/ml

10 ml

Concentración

Primero se utilizó B. subtilis con cada uno de los medicamentos con sus respectivas concentraciones, para esto se utilizaron 4 cajas distintas con 5 sensidiscos en cada una.

Después de un periodo de incubación de 24 horas aproximadamente se observaron las cajas Petri, analizando los halos formados alrededor de los sensidiscos.

Caja Cefaclor. No se presenta ningún halo alrededor de los sensidiscos. Sin embargo a pesar que la caja fue inoculada con el microorganismo, B. subtilis solo creció en una zona reducida de la caja, Figura 1.

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Figura 1. Caja inoculada con B. subtilis, con cinco sensidiscos humedecidos con Cefaclor a diferentes concentraciones: 1x10-1,1x10-2, 1x10-3, 1x10-4,1x10-5 correspondientes a los sensidiscos 5, 4, 3, 2, 1 respectivamente.

Caja Amoxicilina. No se presenta ningún halo alrededor de los sensidiscos, es decir, no presenta sensibilidad al medicamento, Figura 2.

Figura 2. Caja inoculada con B. subtilis, con cinco sensidiscos humedecidos con amoxicilina con distintas -1 concentraciones: 1x10 ,1x10-2, 1x10-3, 1x10-4,1x10-5 correspondientes a los sensidiscos 5, 4, 3, 2, 1 respectivamente, sin halo.

Caja Metronidazol. Se localizaron halos en los sensidiscos 2 y 5 correspondientes a las concentraciones 1x10 -4, y 1x10-1 respectivamente. Sensidisco 2 presenta un halo de 0.036 cm mientras que el sensidisco 5 presenta

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un halo de 0.069 cm. Se omite el sensidisco número 1, debido a que en esa zona no se realizó la inoculación correctamente, Figura 3. Figura 3. Caja inoculada con B. subtilis, con cinco sensidiscos humedecidos con Metronidazol a diferentes concentraciones: 1x10-1,1x10-2, 1x10-3, 1x10-4,1x10-5 correspondientes a los sensidiscos 5, 4, 3, 2, 1 respectivamente. Se observa el halo en los sensidiscos 2 y 5 (con las concentraciones 1x104 y 1x10-1), las flechas (verde y anaranjada) apuntan la zona en la que se encuentra el halo.

Caja Penicilina. Se utilizaron volúmenes de 2,4 ,6 ,8 y 10 µl de los cuales solo el 10 presenta un halo de 0.026 cm, Figura 4.

Figura 4. Caja inoculada con B. subtilis y con cinco sensidiscos humedecidos con penicilina a distintos volúmenes (2, 4, 6, 8, 10) en mililitros. La flecha roja apunta al halo que se formó en el sensidisco con el volumen 10.

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También se aplicó dicha prueba al Staphylococcus aureus utilizando el protocolo que se siguió con el Bacillus subtilis. A continuación de mostraran cada una de las cajas Petri (Figura 5 a Figura 8) con un periodo de incubación de 24 horas aproximadamente donde se analizó cada uno de los halos que se formaron alrededor de los sensidiscos.

Figura 5. Caja inoculada con S. aureus, con cinco sensidiscos humedecidos con Amoxicilina a diferentes concentraciones: 1x101 ,1x10-2, 1x10-3, 1x10-4,1x10-5 correspondientes a los sensidiscos 5, 4, 3, 2, 1 respectivamente.

Se observa que en cada uno de los sensidiscos presentan (indicados por las circunferencias de color rojo) un halo cada uno de diferente diámetro.

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Figura 6. Caja inoculada con S. aureus, con cinco sensidiscos humedecidos con Cefaclor a diferentes concentraciones: -1 -2 1x10 ,1x10 , 1x10-3, 1x104 ,1x10-5 correspondientes a los sensidiscos 5, 4, 3, 2, 1 respectivamente.

Se observa que en cada uno de los sensidiscos presentan (indicados por las circunferencias de color rojo) un halo cada uno de diferente diámetro especialmente los sensidiscos C4 y C5.

Figura 7. Caja inoculada con S. aureus, con cinco sensidiscos humedecidos con Metronidazol a diferentes concentraciones: 1x101 ,1x10-2, 1x10-3, 1x10-4,1x10-5 correspondientes a los sensidiscos 5, 4, 3, 2, 1 respectivamente.

Se observa que esta vez a comparación con las fotografías anteriores (Figura 5 y 6) aquí solo los sensidiscos C1, C2 y C5 presentan un halo (indicado por las circunferencias de color rojo).

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Figura 8. Caja inoculada con S. aureus, con cinco sensidiscos humedecidos con penicilina a distintos volúmenes (2, 4, 6, 8, 10) en mililitros.

Se observa que en cada uno de los sensidiscos presentan (indicados por las circunferencias de color rojo) un halo cada uno de diferente diámetro.

A continuación se presenta una tabla (Tabla 2) con la medida del diámetro de cada uno de los halos presentes en las cajas de Petri. Tabla 2. Medida de el halo formado alrededor de cada sensidisco según su concentración (filas) y el antibiótico del que se trate (columnas). Los casos en que no hubo halo se marcaron con /. Antibiótico Amoxicilina

Cefaclor

Metronidazol

Penicilina

C1

5 mm

8 mm

10 mm

8 mm

C2

10 mm

11 mm

/

9 mm

C3

12 mm

13 mm

/

14 mm

C4

18 mm

15 mm

3 mm

11 mm

C5

27 mm

15 mm

9 mm

13 mm

Concentración

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Como tercer microorganismos ahora se aplicara la prueba de resistencia a antibióticos a la Salmonella sp., siguiendo el mismo protocolo que en la cepas anteriores. Después de dejar pasar 24 horas de incubación se revisaron las cuatro cajas de Petri, obteniendo los siguientes resultados: al utilizar el primer antibiótico (Metronidazol) se pudo observar que no hubo inhibición alguna (Figura 9).

Figura 9. Caja inoculada con Salmonella sp, con cinco sensidiscos humedecidos con Metronidazol a diferentes concentraciones: 1x10-1,1x10-2, 1x10-3, 1x10-4,1x10-5 correspondientes a los sensidiscos 5, 4, 3, 2, 1 respectivamente. Inhibición de crecimiento nula en la aplicación de sensidiscos impregnados con diferentes concentraciones de metronidazol.

Con el segundo antibiótico (Penicilina) si se presentó una inhibición efectiva (Figura 10).

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Figura 10. Caja inoculada con Salmonella sp., con cinco sensidiscos humedecidos con penicilina a distintos volúmenes (2, 4, 6, 8, 10) en mililitros.

Inhibición de crecimiento microbiano, mediante la aplicación de sensidiscos impregnados con Penicilina a diferentes concentraciones (en colonias de Salmonella) siendo estos indicados por circunferencias de color rojo.

El Cefaclor presentó una actividad antibacteriana bastante buena, mientras más concentración haya, mayor es la efectividad del antibiótico (Figura 11).

Figura 11. Caja inoculada con Salmonella sp, con cinco sensidiscos humedecidos con Cefaclor a diferentes concentraciones: 1x10-1,1x10-2, 1x10-3, 1x10-4,1x10-5 correspondientes a los sensidiscos 5, 4, 3, 2, 1 respectivamente. Se puede observar la efectividad del Cefaclor al inhibir el crecimiento de Salmonella indicando esta con circunferencias de color rojo, aunque en 2 sensidiscos presento resistencia (sensidiscos 1 y 2)

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La efectividad de la Amoxicilina al inhibir el crecimiento fue incluso mayor que el Cefaclor, solo que fue visible hasta que se usó con mayores concentraciones de antibiótico (Figura 12). Figura 12. Caja inoculada con Salmonella sp, con cinco sensidiscos humedecidos con Amoxicilina a diferentes concentraciones: 1x10-1,1x10-2, 1x10-3, 1x10-4,1x10-5 correspondientes a los sensidiscos 5, 4, 3, 2, 1 respectivamente.

Se percibe inhibición de crecimiento microbiano efectuado por el antibiótico (Amoxicilina) siendo este indicado por las circunferencias de color rojo.

Con los resultados obtenidos, se realizó una tabla donde se registraron los radios de inhibición generados por cada sensidisco impregnado con diferentes concentraciones de distintos antibióticos (Tabla 3).

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Tabla 3. Medición de radios de inhibición de crecimiento microbiano con diferentes concentraciones de antibióticos (siendo la concentración 5 la más concentrada). Concentración C1

C2

C3

C4

C5

Metronidazol

RESISTENCIA

RESISTENCIA

RESISTENCIA

RESISTENCIA

RESISTENCIA

Cefaclor

RESISTENCIA

RESISTENCIA

10.5 mm

12.5 mm

18 mm

Penicilina

9 mm

14 mm

9 mm

12 mm

------

Amoxicilina

RESISTENCIA

RESISTENCIA

11.5 mm

17 mm

22 mm

Antibiótico

Nuestro último microorganismo para la aplicación de la prueba a resistencia de antibióticos fue la Escherichia coli. AL iguales que las veces anteriores se siguió el protocolo inoculando dicha bacteria en cuatro cajas de Petri y en cada una de ellas se puso a prueba cada uno de los antibióticos.

Después de una incubación de 24 horas aproximadamente se obtuvieron los siguientes resultados.

Caja 1 – Amoxicilina: La caja presenta un crecimiento uniforme, sin embargo solo existe halo de inhibición (indicada por una circunferencia de color rojo) en la concentración C5, Figura 13.

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Figura 13. Caja inoculada con Escherichia coli, con cinco sensidiscos humedecidos con Amoxicilina a diferentes concentraciones: 1x10-1,1x10-2, 1x10-3, 1x10-4,1x10-5 correspondientes a los sensidiscos 5, 4, 3, 2, 1 respectivamente.

Caja 2 – Cefaclor: Esta caja es la única que presenta halos visible de inhibición (Tabla 4), siendo estos indicados por las circunferencias de color rojo, y al igual que la caja 1 el crecimiento es uniforme (Figura 14).

Figura 14. Caja inoculada con Escherichia coli, con cinco sensidiscos humedecidos con Cefaclor a diferentes concentraciones: 1x10-1,1x10-2, 1x10-3, 1x10-4,1x10-5 correspondientes a los sensidiscos 5, 4, 3, 2, 1 respectivamente.

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Tabla 4. Tabla con los radios de inhibición del Antibiótico: Cefaclor. Halos observados en caja de Mueller- Hullton, inoculada con Escherichia coli. Concentración

Halo de inhibición

C1

1 mm

C2

1 mm

C3

11 mm

C4

21 mm

C5

30 mm

Caja 3 – Metronidazol: Esta caja al igual que la caja 1 no presento halos de inhibición pero el crecimiento fue uniforme (Figura 15).

Figura 15. Caja inoculada con Escherichia coli, con cinco sensidiscos humedecidos con Metronidazol a diferentes concentraciones: 1x10-1,1x10-2, 1x10-3, 1x10-4,1x10-5 correspondientes a los sensidiscos 5, 4, 3, 2, 1 respectivamente.

Caja 4 – Penicilina: De igual manera en esta caja el crecimiento fue uniforme pero tampoco se observa halo de inhibición, Figura 16.

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Figura 16. Caja inoculada con Escherichia coli, con cinco sensidiscos humedecidos con penicilina a distintos volúmenes (2, 4, 6, 8, 10) en mililitros.

Para una de las pruebas (Temperatura y pH) se utilizaron 2 cepas distintas, siendo estas Escherichia coli (Cepa A) y Staphylococcus aureus (Cepa B). De acuerdo con la metodología cada en cada una de ellas se inoculo 5 tubos con características diferentes teniendo un total de 10 por cada prueba. Para la prueba de temperatura se etiquetaron los tubos de la siguiente manera: 

Tubo 1: Incubación a 4°C



Tubo 2: Incubación a Temperatura Ambiente



Tubo 3: Incubación a 25°C



Tubo 4: Incubación a 35°C



Tubo 5: Incubación a 50°C

Para la prueba de pH los tubos se etiquetaron de la siguiente manera: 

Tubo 1: pH 3



Tubo 2: pH 5



Tubo 3: pH 7

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

Tubo 4: pH 9



Tubo 5: pH 11

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A continuación se presentara lo obtenido en cada una de las pruebas correspondientes, comenzando con la de pH, mencionando que los tubos se inocularon a una temperatura de 35°C. Para tener un mejor análisis entre muestras, no solo de negativo y cepa A o cepa B, se compararan ambas sepas entre sí en orden ascendente de pH. Figura 17. Fotografías de los Tubos 1, de la Cepa A (E. coli) y Cepa B (S. aureus), incubados aproximadamente un periodo de 28 horas en tubos con caldo nutritivo modificado a un pH 3.

Comparando dichos tubos con el control negativo nos podemos dar cuenta que no un cambio aparente entre cada tubo conservado su apariencia cristalina.

Figura 18. Fotografías de los Tubos 2, de la Cepa A (E. coli) y Cepa B (S. aureus), incubados aproximadamente un periodo de 28 horas en tubos con caldo nutritivo modificado a un pH 5. Se aprecia con gran facilidad que el tubo inoculado con E. coli (Cepa A) presenta una coloración diferente al control negativo además en la superficie de este se aprecia turbidez (indicado con una circunferencia de color azul)

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Ahora, como se aprecia en la Figura 18-Cepa B presenta turbidez en todo el tubo, indicado por las flechas y circunferencias de color rojo, pero conserva la coloración como en el control negativo cosa que no sucede en la Cepa A.

Figura 19. Fotografías de los Tubos 3, de la Cepa A (E. coli) y Cepa B (S. aureus), incubados aproximadamente un periodo de 28 horas en tubos con caldo nutritivo modificado a un pH 7.

Al igual que en la figura 18, los tubos con caldo nutritivo en pH 7 también presenta turbidez, ambas en la superficie del líquido. Esta vez la coloración del caldo en el tubo de la Cepa B (S. aureus) cambio, siendo esta más opaca comparándola con el Control Negativo.

Figura 20. Fotografías de los Tubos 4, de la Cepa A (E. coli) y Cepa B (S. aureus), incubados aproximadamente un periodo de 28 horas en tubos con caldo nutritivo modificado a un pH 9. A comparación con los tubos anteriores (Figura 18 y 19), esta vez los tubos con un pH 9 presentan menos turbidez estando esta sedimentada en el líquido (indicada por la circunferencia azul y roja).

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Además de que presentan menos turbidez la coloración de cada tubo fue diferente a la anterior (Figura 19) en comparación al Control Negativo. El tubo de la Cepa A (Figura 20) tiene una coloración más amarillenta pero con apariencia un poco cristalina, en el tubo de la Cepa B también presenta una apariencia cristalina pero con una coloración blanquecina.

Figura 21. Fotografías de los Tubos 5, de la Cepa A (E. coli) y Cepa B (S. aureus), incubados aproximadamente un periodo de 28 horas en tubos con caldo nutritivo modificado a un pH 11. Esta vez la turbidez de los tubos tanto de la Cepa A (E. coli) y Cepa B (S. aureus) es escasa pero la coloración de ambos tubos aun presentan una apariencia opaca. Al igual que en la prueba de pH en la prueba de Temperatura se manejó el mismo número de tubos teniendo como referencia un Control Negativo.

Figura 22. Fotografías de los Tubos 1, de la Cepa A (E. coli) y Cepa B (S. aureus), incubados aproximadamente un periodo de 28 horas a una temperatura de 4°C.

A pesar de que se incubara un poco más de un día ambas sepas, ninguna presento turbidez o cambio de coloración aparente en el caldo nutritivo.

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Figura 23. Fotografías de los Tubos 2, de la Cepa A (E. coli) y Cepa B (S. aureus), incubados aproximadamente un periodo de 28 horas a Temperatura ambiente que el día 12 y 13 de mayo oscilaba de los 13°C y 28°C Ambas tuvieron presencia de turbidez aunque en el tubo con el inóculo de la Cepa A (E. coli) la contenía dispersa en el medio y no solo en la superficie del líquido que fue lo que pasó con el tubo de la Cepa B. A pesar de que presentaron turbidez no hubo un cambio de coloración muy aparente en el caldo nutritivo aunque se perdió un poco la cristalinidad.

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Figura 24. Fotografías de los Tubos 3, de la Cepa A (E. coli) y Cepa B (S. aureus), incubados aproximadamente un periodo de 28 horas a una temperatura de 25°C.

A pesar de que la temperatura incremento comparando con los resultados de la Figura 22 aquí tampoco se aprecia la aparición de turbidez, aunque, el tubo de la Cepa A tiene una coloración un poco blanquecina tomando más una apariencia opaca cosa que no sucede con el tubo de la Cepa B que su cambio de coloración es poco notable.

Figura 25. Fotografías de los Tubos 4, de la Cepa A (E. coli) y Cepa B (S. aureus), incubados aproximadamente un periodo de 28 horas a una temperatura de 35°C. Esta vez la temperatura de incubación se incrementó y efectivamente los tubos presentaron turbidez, en la superficie del caldo (indicado por la circunferencia azul y roja), aunque la coloración del medio la conservo tal como el tubo del Control negativo.

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Figura 26. Fotografías de los Tubos 5, de la Cepa A (E. coli) y Cepa B (S. aureus), incubados aproximadamente un periodo de 28 horas a una temperatura de 50°C.

Al igual que los tubos 1 y 2 (Figura 6 y 7), tampoco se aprecia signo de turbidez. En tanto en la coloración del medio tampoco hubo cambio aparente.

Además de las dos cepas anteriores estas mismas pruebas (Temperaturas y pH) fueron aplicadas para Bacillus subtilis y Salmonella sp. Tras una incubación de 28 horas, se observó para Bacillus subtilis una mayor turbidez en los tubos con pH de 9 y 7, seguidos por los tubos de pH 11 y 5 (el tubo de pH 11 denota una coloración más intensa debida al proceso de calibración de pH), mientras que en el tubo con pH 3 se observa una coloración clara con poca turbidez (ver figura 27). En tanto a lo que a Salmonella sp. se refiere se notó crecimiento en todos los tubos de los distintos pH, que en comparación con el crecimiento presentado por Bacillus subtilis es más notorio, teniendo mayor turbidez en los tubos de pH 9 y 7, después siguieron los tubos de pH 11 y 5, (el tubo de pH 11 posee un color más intenso debido a la calibración del pH, caso parecido al tubo de Bacillus subtilis), y el tubo de pH 3 fue aquel que presentó menor turbidez de los 5 tubos (ver figura 28).

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Figura 27. Prueba de pH para Figura 28. Prueba de pH para crecimiento crecimiento bacteriano con Bacillus bacteriano con Salmonella sp inoculada. subtilis inoculada.

En ambos casos los tubos se encuentran ordenados según su nivel de pH (de más ácido a más alcalino) de manera creciente de izquierda a derecha. Y para las pruebas de temperatura del crecimiento bacteriano, las mismas cepas bacterianas se inocularon en 5 tubos con caldo Dextrosa-Sabouraud, y fueron sometidas a temperaturas de 4°C, 25°C, temperatura ambiente, 35°C y 50°C, incubadas durante 28 horas. En las pruebas de temperatura para Bacillus subtilis, se observó una mayor turbidez en el tubo de 35°C debido a que fue el tubo que presentó una mayor coloración de los 5 tubos incubados, seguido del de temperatura ambiente, 50°C y 25°C, respectivamente, y el tubo que se incubó a 4°C fue el que presentó una menor coloración de los 5 tubos de la prueba. Y finalmente, para la prueba de temperatura para Salmonella sp, de los 5 tubos realizados en la prueba, el tubo el 35°C fue el que presentó una mayor coloración, por lo tanto, fue el que obtuvo una mayor turbidez, seguido de los tubos de 25°C, temperatura ambiente y de 50°C, respectivamente, el tubo incubado a 4°C fue el que presentó la menor coloración de entre todos los tubos aplicados en la prueba para la Salmonella sp.

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Figura 29. Prueba de temperatura para Figura 30. Prueba de temperatura para crecimiento bacteriano con Bacillus crecimiento bacteriano con Salmonella subtilis inoculada. sp inoculada.

En ambos casos los tubos se encuentran ordenados según su temperatura de manera creciente de izquierda a derecha.

Discusión. Al momento de hacer las diluciones de los medicamentos, se calculó exactamente la cantidad que la práctica indicaba, y hasta ese punto todo marchaba bien, hasta que llegó el momento donde se llevaron a cabo físicamente. Hubo varios factores que pudieron haber incrementado el margen de error en las diluciones. El tamaño de los tubos Eppendorf fue un problema, ya que la disolución madre debía ser de 500mg/mL, y efectivamente la pastilla de los medicamentos contenía 500 mg, lo cual hizo suponer aún más facilidad para la preparación de las disoluciones, sin embargo esa facilidad se descartó cuando al vertir el contenido de la pastilla en el tubo Eppendorf, el cual contenía 1mL de agua destilada y esterilizada, el volumen del contenido ocupaba prácticamente un mililitro, dejando

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sin lugar al agua restante para hacer la disolución, por lo que se tuvo que descartar la disolución madre y dejar como ésta a la primera disolución de la práctica, la cual fue de 250mg/ml. Se pensó medir con la balanza analítica la mitad de la pastilla para la obtención de los 250mg, pero debido al tiempo, no fue posible medir exactamente el soluto que se iba a diluir en la disolución madre, por lo que se tuvo que acudir al tanteo al momento de vaciar la mitad del contenido de la pastilla. Inclusive con esa reducción del soluto, ésta última disolución quedó demasiado espesa, lo que dificultó la dilución siguiente, ya que el líquido era tan espeso que obstruía el conducto de la punta de la micro pipeta. Afortunadamente a pesar de ese contratiempo se pudieron hacer las siguientes diluciones con sus respectivos cálculos. Dado la presencia de tantos contratiempos, el tiempo invertido en las diluciones se alargó, e incluso se llegó a pensar la posibilidad de que las diluciones no fueran a servir, pero posterior a la práctica, ya que los sensidiscos habían sido hechos y puestos en los medios de cultivo, se confirmó debido a los radios de los halos creados por los sensidiscos, que las diluciones fueron realizadas correctamente, ya que el tamaño de los halos disminuía de acuerdo a la concentración. En cuanto a las cepas encoladas se obtuvieron diversos resultados mediante la comparación Se cree que las placas inoculadas con bacillus subtillis fueron realizadas incorrectamente, dado que al momento de observar los resultados, tres de las cuatro placas inoculadas presentaban un estriado mal realizado, mientras que la otra caja (la cual contenía Amoxicilina) no presentó indicio de crecimiento alguno, lo cual da a entender que existe la probabilidad de que dicha no haya sido inoculada. Se pudo llegar a diversas conclusiones mediante las observaciones de los resultados, comparando los microorganismos y su manera de responder ante los antibióticos, el pH y la temperatura. Se pudo observar que E. coli tiene una gran capacidad de crecimiento, ya que ésta creció en diferentes condiciones, esto nos confirma su ubicuidad alrededor del planeta, ya que es capaz de desarrollarse a diferentes temperaturas y pH. Con respecto a los sensidiscos, también se observó que todos los microorganismos sufrieron inhibición, sin embargo se presentaron casos donde el microorganismo demostró gran resistencia ante el antibiótico.

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Conclusión: Se logró determinar los efectos de antibióticos, temperatura y el pH en el crecimiento de diferentes microorganismos. Cuestionario. 1.- Explique 4 procesos biológicos por los que un microorganismo puede adquirir resistencia a un antibiótico. 

Selección Natural: los microorganismos más fuertes sobreviven al proceso del antibiótico.



Mutaciones bacterianas por la proteína LexA.



Mutación del gen genofórico que modifica la diana celular.



La infección de la bacteria por medio de un plásmido.

2.‐ Explique el modo de acción de cada uno de los antibióticos usados en la práctica. R= 

Metronidazol: Este medicamento ataca al ADN del microorganismo mediante un grupo llamado 5-Nitro, lo que provoca el rompimiento de las bases nitrogenadas.

 Cefaclor: Este medicamento forma la transpeptidasa, la cual provoca un rompimiento

en

el

anillo

betalactámico

e

inhibe

la

síntesis

de

peptidoglicano.

 Amoxicilina: Este medicamento inhibe la síntesis de proteínas, ya que se une al ribosoma, afectando desde ambas Gram positivas y negativas.

3.‐ Explique un proceso de resistencia antimicrobiana que se haya reportado para cada uno de los antibióticos usados en la práctica. Tomaremos a Bacillus subtillis para analizar su respuesta a los antibióticos. 

Amoxicilina: podemos suponer que ésta inhibió la producción de proteínas de Bacillus s.

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

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Metronidazol: es posible que este medicamento haya atacado el ADN de Bacillus s.



Penicilina: mediante un cambio de porinas, Bacillus s. pudo haber conseguido que la penicilina no entrara a él.



Cefaclor: el mecanismo pudo haber sido muy parecido al que siguió con la penicilina.

4.‐ Explique en qué consiste la “prueba de E”. R= También llamada epsilómetro o E-test, es una prueba que utiliza tiras portadoras de antibiótico pero con un gradiente de concentración, de esta manera al colocarlas en el medio inoculado con agar, es posible observar la diferencia en la inhibición del microorganismo en las diferentes regiones de la tira, y así determinar la mínima concentración de antibiótico para inhibir el crecimiento del microorganismo.

5.‐ Compare sus resultados con las tablas del NCCLS actualmente CLSI. Al comparar los resultados con las tablas, se puede ver que Bacillus s. presenta resistencia a los tres medicamentos con excepción a la penicilina.

6.‐ Discuta los efectos en salud pública por el reciente surgimiento de MRSA en hospitales. El resurgimiento es atrivuido a un posible polimorfismo que terminó siendo una mutación de S. aureus, el cual puede presentar ahora más resistencia a medicamentos que antes lo erradicaban sin problemas, debido a eso se tienen que tomar nuevas medidas para su control

7.‐ Proponga un método para tratar enfermedades infecciosas bacterianas, distinto a la quimioterapia por antibióticos.

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R= Cambiar la temperatura del medio, es decir, elevar la temperatura del paciente hasta el punto en el que el microorganismo no pueda resistir esta temperatura. Realizar una hemodiálisis, cambiar el Ph, restaurarlo e introducirlo de nuevo en el organismo.

8.‐ Discuta la importancia de la reforma al artículo 226 Fracción Fr. IV de la Ley General de Salud.

R= La fracción IV del artículo 226 de la Ley General de la Salud expresa textualmente lo siguiente: “Los medicamentos, para su venta y suministro al público, se consideran: Medicamentos que para adquirirse requieren receta médica, pero que pueden resurtirse tantas veces como lo indique el médico que prescriba. La reforma a este artículo es necesaria, ya que no siempre las recetas médicas hechas por los doctores son correctas, y en algunos casos, puede provocar la mutación del microrganismo patógeno, haciéndolo inmune al medicamento

9.- Describa un método por el cual se pueda obtener la temperatura óptima de crecimiento de un microorganismo.

R= El método sería parecido a lo hecho durante la práctica. Suponiendo que se tiene un microorganismo desconocido y se desea averiguar su temperatura óptima de crecimiento, es posible averiguar ésta última mediante la inoculación del microorganismo en investigación en varias placas con las mismas condiciones (mismo pH, concentración de nutrientes etc…), la diferencia entre ellas será la temperatura a la cual serán incubadas. Suponiendo que fueran 5 placas, cada una sería incubada a una temperatura diferente, y posteriormente, la placa donde se observa el mayor crecimiento será la que arroje la temperatura óptima de crecimiento del microorganismo.

10.- Describa un método por el cual se pueda obtener el pH óptimo de crecimiento de un microorganismo.

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R= El método a seguir sería muy similar al descrito en la pregunta anterior. En este caso, el microorganismo sería inoculado en diferentes tubos de ensayo pero con las mismas condiciones, la diferencia en este caso será únicamente el pH de los medios, los cuales serán incubados a la misma temperatura, y el tubo que presente el mayor crecimiento, será el que tenga el pH ótpimo del microorganismo.

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