Practica #1 Microbiologia Medica; Exudado faringe

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO BIOTECNOLOGO

MATERIA

CLAVE

MICROBIOLOGÍA Medica

PROFESOR Humberto A. Trigueros

CALIFICACIÓN

PRÁCTICA No.1

DURACIÓN APROXIMADA

Exudado faríngeo

9 horas

ESTUDIANTE (S)

FECHA

Avelar Barragán José Luis Gutiérrez Cantú Gabriela Infante Ramírez E. Alejandro Lizárraga Osuna Kinary

27 – 01 / Agosto – Septiembre / 2015

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Aísla e identifica bacterias de flora normal y/o patológicas, de faringe y nasofaringe, por medio de la toma de muestra de un exudado faríngeo y posterior cultivo en medios sintéticos y tinciones de GRAM y BAAR, utilizando para este fin la morfología celular, crecimiento de colonias y tipo de agrupación celular.

INTRODUCCIÓN TEÓRICA DE LA PRÁCTICA Exudado faríngeo.El exudado faríngeo es una prueba de laboratorio que tiene la finalidad de identificar y aislar aquellos microrganismos que son los causantes de una infección en la garganta. También llamada frotis faríngeo, puede ayudar a determinar las causas del dolor de garganta. Con frecuencia el dolor se debe a un virus, pero el cultivo permite determinar si se debe a una bacteria estreptocócicca, para que los médicos puedan brindar el tratamiento adecuado. De manera particular, se realiza utilizando un hisopo especial para detectar la presencia de estreptococo grupo A, que es la causa más común de la faringitis estreptocócicca. La garganta puede doler al momento del examen e igualmente se puede experimentar una sensación de náuseas cuando se toca la parte posterior de la garganta con el aplicador de algodón, pero el examen sólo dura unos cuantos segundos. Para realizar el examen, la muestra tomada de la pared posterior de la garganta se coloca en un plato especial (cultivo) que permite el crecimiento de las bacterias. El tipo específico de infección se determina utilizando análisis químicos. Si no hay crecimiento de bacterias, el cultivo es negativo y la persona no tiene una infección estreptocócicca. Un resultado anormal, cuyos resultados están listos en dos días, significa que hay presencia de bacterias u otros organismos, y esto generalmente es un signo de infección. Por el contrario, mientras este estreptococo u otra bacteria específica no sean halladas, la presencia de éstas en la boca y garganta es una situación ordinaria. En este sentido, un cultivo de garganta también puede ayudarle al médico a determinar qué

antibióticos funcionarán mejor en su caso. A manera de recomendación, antes de realizarse la prueba, evite usar enjuagues bucales antisépticos u otros medicamentos que pueden interferir con los resultados. Flora bacteriana.El hombre está libre de gérmenes al nacer, pero es rápidamente colonizado por microorganismos, que en su mayoría provienen de la flora normal de otros seres humanos (especialmente de la madre), y que adquieren por contacto directo o indirecto, o que le llegan por los alimentos. La flora es especialmente numerosa a nivel de ciertas mucosas (boca, faringe, intestino, vagina), y con menor representación en la piel. La flora humana normal es el conjunto de gérmenes que conviven con el huésped en estado normal, sin causarle enfermedad. Su composición es característica para la especie humana, tanto en los gérmenes que la componen como en su número y distribución en el organismo. Importancia de la flora normal: La flora humana normal desde diversos puntos de vista representa un importante mecanismo de defensa del huésped. Contribuye al desarrollo de la respuesta inmunológica, como ha sido demostrado en modelos animales que nacen y son criados en condiciones de esterilidad (individuos axénicos). Estos animales presentan un pobre desarrollo de los diversos componentes de su sistema inmunitario. La flora además ayuda a evitar la colonización de la piel o las mucosas por bacterias que pueden ser patógenas. Los gérmenes para iniciar la infección deben, en general, comenzar por colonizar los epitelios. Allí seguramente compiten con los integrantes de la flora por factores tales como receptores celulares y nutrientes. Flora normal de la cavidad oral y faríngea: Existen diversos nichos dentro de la cavidad oral y pueden reconocerse diferencias si se estudia la flora de dientes, lengua, mucosa yugal o surco peri odontal. La flora oral es de tipo mixto, con asociación de gérmenes aerobios y anaerobios. Las bacterias que se adhieren a la superficie dental en forma permanente y a través de diferentes polímeros de origen bacteriano como dextranos y levanos. El contenido de gérmenes anaerobios es máximo a nivel del surco gingival. Los dientes presentan superficies de adherencia que tienen la particularidad de no renovarse en forma periódica, como lo hacen los epitelios. Composición: Predominan diferentes especies de Streptococcus α hemolíticos. Streptococcus Mutans y Streptococcus Sanguis se hallan a nivel de la placa dentaria. Streptococcus Mitis se adhiere tanto a los dientes como a las mucosas; S. salivarius predomina en la mucosa lingual. Entre los gérmenes anaerobios Gram positivos pueden hallarse Actinomyces sp. a nivel de la placa, y algunas especies de Lactobacillus, en menor cantidad. La mayoría de los Gram negativos son anaerobios como Bacteroides del grupo melaninogenicus y especies del género Fusobacterium. También pueden encontrarse espiroquetas del género Treponema distintas de T. pallidum. Los cocos Gram positivos anaerobios pertenecen a los géneros Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus entre otros.

Pueden además aislarse especies de Mycoplasma y levaduras del género Cándida. Dado que se trata de un complejo ecosistema, existen también complejas interrelaciones entre los distintos integrantes. A nivel de la placa dentaria, las bacterias se hallan en grandes concentraciones, formando micro colonias y disponiéndose en estratos. La flora de la cavidad oral está involucrada en la patogenia de enfermedades como la caries y periodontitis. En el desarrollo da la caries dental intervienen no sólo las bacterias sino también factores como el pH ácido resultante de la descomposición de hidratos de carbono de la dieta, etc. La periodontitis resulta de la agresión de la flora normal a los tejidos de sostén del diente. Los gérmenes de la boca también causan procesos como abscesos periodontales y de cuello. Pacientes con válvulas cardíacas patológicas pueden desarrollar endocarditis bacteriana en la que están implicados Streptococcus α hemolíticos. Esta enfermedad suele ser una infección endógena, causada por bacterias de la cavidad oral que pasan al torrente sanguíneo debido a manipulaciones odontológicas, y colonizan válvulas cardíacas alteradas. La actinomicosis cérvico-facial es una entidad que reconoce como agente etiológico especies de Actinomyces provenientes de la boca. Orofaringe Difteroides Neisserias saprófitas Estreptococo viridans Estreptococo piógeno Estafilococo aureus Branhamela catarrhalis

SUSTANCIAS, MATERIAL Y EQUIPO  Solución Salina Fisiológica (SSF.)  H2O Destilada.  Agares; Sal manitol. Nutritivo. EMB.  Caldo nutritivo.  Paciente.

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Cajas de Petri estériles. Papel estraza. Cinta testigo. Pipetas graduadas estériles. Matraz con tapa de rosca. Espátula. Mechero bunsen. Hisopos.

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Autoclave Microscopio Balanza. Incubadora. Equipo de tinción Gram y BAAR.  Asa.

DESARROLLO Desinfectar el área de trabajo y mantener todos los medio y materia dentro del área estéril.  Toma de muestra. 1. Colocar al paciente por debajo del nivel de la vista. 2. Pedir que incline un poco la cabeza hacia atrás y abra la boca y que diga “ah” (si no se logra ver la laringe con ayuda de un abate lengua bajar la lengua.) 3. Hacer un raspado con un hisopo estéril aun lado de la úvula (hacer el rapado en la parte más roja o donde presente puntos blancos.)  Siembra de muestra. 1. Llevar el hisopo al radio estéril del mechero y hacer una descarga en un extremo del agar sangre. 2. Sumergir el hisopo al caldo nutritivo (no olvide flamear la boquilla del antes y después de cerrarlo). 3. Tomar un asa estéril y el agar sangre hacer el sembrado por estriado a partir de la descarga del hisopo. 4. Con un asa estéril y tomar muestra del caldo nutritivo inoculado para sembrar todos los

otros agares. 5. Incubar a las condiciones estándares parta los medios.  Identificación de bacterias. 1. Observar todas las características macroscópicas de las colonias. 2. Tomar con un asa estéril muestra de la colonia más aislada y realizar tinción gram y baar. Gram BAAR Colocar violeta cristal 1 min. Colocar fucsina y colocarla a la llama dejarla Hacer un lavado con agua. emitiendo vapores durante 3 o 5 min, no dejar Agregar lugos 1min. que la muestra se desehidrate. Lavar con sln alcohol – cetona Decoloar con alcohol acido. Lavar con agua. Lavar con agua. Agregar safranina por 1 min. Colocar verde malaquita por 1 min. Lavar con agua Lava con agua.

TABLAS, GRÁFICAS Y/O DIAGRAMAS PARA REGISTRAR RESULTADOS Exudado faringe.Observación de muestra al microscopio Muestra #1 (Kinary) Muestra #2 (Gabriela)

Se pueden apreciar una pequeña cantidad de bacilos BAAR (-).

En esta muestra se localizaron los bacilos BAAR (-) rodeando una celula epitelial.

Sembrado.Sal-Manitol Agar Muestra #1 Muestra #2

EMB Agar Muestra #1

Muestra #2

No hubo crecimiento.

Hubo crecimiento de una colonia de forma circular, mucosa y cóncava color amarillo.

Agar Nutritivo Muestra #1 Muestra #2

No se mostró ningún crecimiento,

El color del agar cambio, sin embargo, no hubo crecimiento de colonias microbianas.

Agar Sangre Muestra #1 Muestra #2

Hemolisis beta (α) Hubo crecimiento de colonias de forma circular, mucosa y cóncava color amarillo en toda la zona donde se colocó el hisopo y en las primeras estrías.

Hemolisis alfa (α) Hubo crecimiento de colonias de forma circular, mucosa y cóncava color amarillo en toda la zona donde se colocó el hisopo y en las primeras estrías.

Observación al microscopio.Observación al microscopio de colonias obtenidas

Tinción de Gram, mostrando estafilococos Gram (-) de la muestra #2 del agar Sal Manitol.

Tinción de Gram, mostrando estafilococos Gram (-) de la muestra #2 del agar Sangre.

Tinción de BAAR, mostrando estafilococos BAAR (-) de la muestra #1 del agar Sangre.

Tinción de Gram, mostrando estafilococos Gram (+) de la muestra #1 del agar Sangre.

Nota.- En esta ocasión, las tinciones no daban los colores característicos (Rojo y azul para Gram) debido a posibles contaminaciones en los reactivos, ya que el tiempo y la técnica aplicada para las 3 tinciones fue la adecuada, sin embargo, al observar al microscopio, la coloración era diferente. Basándonos en que un color rosa representaba Gram (-) y un color morado representaba Gram (+), pudimos clasificar nuestras muestras.

PREGUNTA/CUESTIONARIO A RESOLVER 1. ¿Cuáles son los microorganismos más frecuentes en infecciones faríngeas y nasofaríngeas? Son estreptococos β-Hemolíticos del grupo A como, S. pneumoniae, S. aeurus.

2. ¿Cuál es la importancia de identificar el agente causal? Una vez identificado el agente, se pude iniciar con un protocolo para poder erradicar al mismo con los antibióticos o antivirales especificos.

3. ¿Cuál es la flora normal de vías respiratorias altas y bajas? S. pneumonie, S. aeurus, klebsidia, también podemos encontrar de la familia de enterobacteriace como cocos anaerobios y bacterias fusiformes.

4. ¿Qué géneros de bacterias se pretende identificar con la Tinción de BAAR? Morfológicamente son bacilos o cocobacilos ligeramente curvados o rectos, no forman esporas, no presentan flagelos ni cápsula. Son ácido alcohol resistentes (presentan resistencia frente a la decoloración de ácido clorhídrico al 3%) por este motivo se les identifica como bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) Las especies pertenecientes a este género se consideran aerobios estrictos y su velocidad de crecimiento es mucho más lenta que la mayoría de las bacterias. La pared celular es la estructura más estudiada de estos microorganismos, por su complejidad y gran contenido lipídico.

5. ¿Qué estructuras bacterianas se tiñen con la Tinción de BAAR? Su pared celular debido a que estas tienen una composición aproximadamente de 60% de lípidos y ácidos grasos un tanto ausente de péptido glucano.

6. ¿Qué medios de cultivo se utilizan por lo general para el aislamiento de colonias, provenientes de un exudado faríngeo? Los medios de cultives deben de ser de preferencia los más nutritivos como agar sangre o agar chocolate, aunque también se puede utilizar McConkey.

7. ¿Qué nos puede indicar la presencia de un Enterobacilo en una muestra de Exudado faringeo? Puede ser que una bacteria oportunista haya cambiado su ubicación o una infección de esta zona haya proliferado o la presencia de Klebsiella.

8. ¿Qué medidas previas debe de tomar el paciente para la correcta toma de la muestra? Tiene que evitar el enjuague o el lavado de la cavidad que se va explorar antes de la toma de muestra y al momento de la exploración se debe de pedir la mayor relajación para evitar que el reflejo nauseoso sea fuerte. En el cuadro de desarrollo se puede apreciar de forma más detallada.

9. ¿Qué tipo de sustancias están contraindicadas que el paciente tome antes de realizar la toma de la muestra? Las que ataque a MO presentes en cavidad oral como enjuagues o pastas germicidas.

10. ¿Qué características típicas presentan las colonias de bacterias de interés clínico? Se observan las características macroscópicas de las colonias de la bacteria como su color preferencialmente que sean verde, blanco, grisáceo o amarillas también si logran presentar algún tipo de hemolisis.

11. ¿Qué es una beta hemólisis? Es una hemolisis completa causada por una lisis total de los eritrocitos, se logra ver a través del agar.

12. ¿Qué diferencia hay entre una beta y una alfa hemólisis? La hemolisis alfa no es total ya que esta transforma la hemoglobina en una sustancia llamada biliverdina y su % de lisis de eritrocitos es menor mostrando un halo de coloración verde alrededor de la colonia, mientras que la hemolisis beta es total y presenta un color amarillento.

CONCLUSIONES DEL ESTUDIANTE Al realizar una técnica de exudado faríngeo se tiene que cuidar el muestreo correcto, para así, aislar las bacterias infecciosas y evitar las que están presentes en la flora normal y cuidar siempre el área de trabajo que todo esté limpio y estéril. Para poder determinar un tipo de bacteria, se tiene que saber un antecedente de como sucedió la infección, de no ser así, su clasificación dependerá de sus características y su crecimiento, y en los medios que lo hará (por eso es importante utilizar medios de crecimiento correctos), así como su adecuada tinción, diferenciación y observación (de colonias en agar y al microscopio). De esta manera podremos identificar la bacteria que está causando la infección y podemos saber cómo combatirla porque una mal medicación puede provocar que la bacteria mute otorgándole una resistencia a un medicamento y resistencia sea transferida a otras, haciendo mas difícil su erradicacion y dándole una patogenicidad mayor teniendo que usar otro antibiótico que contenga un mayor espectro y haga un desgaste en el metabolismo del paciente.

INDICACIONES PARA EL MANEJO DE LOS RESIDUOS DE LA PRÁCTICA Desecho de cultivos; para desechar los cultivos se somete a esterilizar en la autoclave para matar a las bacterias y así poderlas desechar en su contenedor especial biológico, lavar y guardar el material utilizado y limpiar nuestra área de trabajo.

BIBLIOGRAFÍA BÁSICA Torres Ma. E. RELACIÓN HUÉSPED PARASITO: FLORA HUMANA NORMAL. Bioquímica Medica UNAM. 2009. Ossa G. Quilodrán S. “FLORA NORMAL” [UNIDAD DE INFECTOLOGÍA] Universidad de La Frontera. J. Manuel Reyes “Exudado faríngeo detecta infecciones” http://www.salud180.com/saludz/exudado-faringeo-detecta-infecciones (Recuperado 13-Sep-15) http://www.britanialab.com/productos/234_inserto_es.pdf http://www.britanialab.com/productos/362_hoja_tecnica_es.pdf

Información sobre medios Nutritivo Agar Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos. Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria. Fundamento Medio de cultivo no selectivo, en la cual la pluripeptona y el extracto de carne constituyen la fuente de carbono, nitrógeno y aporta nutrientes para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificarte.

Fórmula (en gramos por litro) Pluripeptona 5.0 Extracto de carne 3.0 Cloruro de sodio 8.0 Agar 15.0 pH final: 7.3 ± 0.2

Instrucciones Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución. Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

Siembra En superficie o por la técnica de pourplate, según el uso a que se destine. En superficie: inocular directamente la muestra por estría. En profundidad: inocular una alícuota de la muestra directa o de su dilución. Verter un volumen del medio de cultivo fundido y enfriado a 40-45°C. Homogeneizar mediante movimientos de vaivén y rotación. Dejar solidificar. Incubación En el tiempo, la temperatura, y la atmósfera de incubación, dependerán del microorganismo que se quiera recuperar.En General en aerobios es 35-37ºC durante 18 a 24hrs. Resultados Observar las características de las colonias.

SANGRE AGAR BASE Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de numerosos microorganismos. Al ser suplementado con sangre ovina, permite el crecimiento de microorganismos nutricionalmente exigentes y la clara visualización de reacciones de hemólisis. Fundamento La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante.

Siembra Por inoculación directa del material en estudio, estriar sobre la superficie del medio de cultivo.

Resultados Observar las características de las colonias. Para el medio de cultivo conteniendo sangre, observar las reacciones de hemólisis: Hemólisis alfa: lisis parcial de los glóbulos rojos. Se observa un halo de color verdoso alrededor de la colonia en estudio. Es debido a la oxidación de la hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de color verdoso) por el peróxido de hidrógeno generado por los microorganismos. Hemólisis beta: lisis total de los glóbulos rojos. Se observa un halo claro, brillante alrededor de la colonia en estudio. Hemólisis gamma: ausencia de lisis de los glóbulos rojos. El medio de cultivo no presenta modificaciones de color y aspecto alrededor de la colonia en estudio

E.M.B. AGAR (CON EOSINA Y AZUL DE METILENO) Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Instrucciones Suspender 36 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos. Calentar con agitación frecuente y llevar a ebullición hasta su disolución total. Esterilizar en autoclave 121°C durante 15 minutos. Distribuir en placas de Petri estériles. Siembra En superficie, por estriado directo a partir de la muestra

MANITOL SALADO AGAR Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos a partir de diversas muestras. Fundamento En el medio de cultivo, el extracto de carne, la peptona de carne y la tripteína, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales que promueven el desarrollo microbiano. El manitol es el hidrato de carbono fermentable.

Siembra Sembrar en superficie un inóculo denso de la muestra por estría. Incubación En aerobiosis, a 35-37 °C durante 18-24 horas. Si a las 24 horas las placas presentan resultado negativo, incubar otras 24 horas. Resultados Microorganismos fermentadores de manitol: colonias de color amarillo rodeadas o no de un halo amarillo. Microorganismos no fermentadores de manitol: colonias del color del medio, rojas rodeadas o no de halo rojizo-púrpura.

Nutritivo

Caldo.

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos. Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria. Fundamento Medio de cultivo no selectivo, contiene pluripeptona (una mezcla de partes de peptona de carne y de caseína) y el extracto de carne constituyen la fuente de carbono, nitrógeno necesaria para el desarrollo bacteriano. Además, puede ser utilizado en a búsqueda de salmonella spp. a partir de alimentos, ya que permite recuperar células dañadas, diluir metabolitos tóxicos y sustancia inhibidoras.

Fórmula (gr/L) Pluripeptona

5.0

Extracto de carne

3.0

Instrucciones Emplear 8 g de polvo por litro de agua destilada. Si es necesario, calentar hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.

pH final: 6.9 ± 0.2 Siembra Por inoculación directa de la muestra o del microorganismo en estudio. Incubación En aerobiosis a 35-37ºC. Resultados Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea necesario, subcultivas en medios solidos apropiados y realizar la identificación bioquímica.