POBLACIONES MICROBIANAS EN PERFILES DE SUELOS AFECTADOS POR HIDROCARBUROS DEL PETRÓLEO EN EL ESTADO DE TABASCO, MÉXICO MICROBIAL POPULATIONS IN SOIL PROFILES AFFECTED BY OIL HYDROCARBONS AT TABASCO STATE, MÉXICO María del Carmen Rivera-Cruz1, Ronald Ferrera-Cerrato2, Víctor Volke-Haller2, Luis Fernández-Linares3 y Refugio Rodríguez-Vázquez4 1 Especialidad de Producción de Cultivos Tropicales. Campus Tabasco. Colegio de Postgraduados. Periférico Carlos A. Molina s/n Km 3.5. 86570. H. Cárdenas, Tabasco. (
[email protected]). 2 Especialidad de Edafología. Instituto de Recursos Naturales. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México. (
[email protected]). 3Investigador del Instituto Mexicano del Petróleo. México, D. F. 4Profesora Investigadora del Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados. IPN. México, D. F.
RESUMEN
ABSTRACT
La incorporación del petróleo en el suelo puede originar modificaciones de la distribución vertical de las poblaciones de bacterias y hongos. En el estado de Tabasco suceden numerosas contingencias ambientales por derrames y fugas de petróleo en suelos cenagosos y en los cuerpos de agua. Aunque existen reportes que explican el patrón de distribución de las poblaciones de bacterias y hongos en los horizontes del suelo en función de los contenidos de materia orgánica y humedad, se desconoce el efecto causado por el petróleo. Se identificaron las capas y horizontes de Gleysoles (Endoaquents e Hydraquents) influenciados por derrames y fugas de petróleo procedentes de oleoductos y presas de confinamiento de los pozos del campo petrolero La Venta y del Complejo Procesador de Gas La Venta. Se realizaron conteos totales de microorganismos mediante la técnica de cuenta viable en superficie por diluciones, aislamiento de cultivo puro y caracterización de los aislados. Los suelos tienen contenidos altos de materia orgánica, nitrógeno, fósforo, potasio y elevada capacidad de intercambio catiónico. La humedad es superior a 100% en horizontes superficiales y subsuperficiales, con elevados contenidos de hidrocarburos totales del petróleo en horizontes superficiales, y menores en los subsuperficiales. No se encontró correlación entre las poblaciones microbianas y la materia orgánica del suelo ni con los hidrocarburos totales del petróleo, pero sí con la humedad del suelo sin contaminación y en el suelo con contaminación crónica. El petróleo redujo drásticamente las poblaciones de bacterias y hongos en el suelo con contaminación crónica. Hay correlación significativa entre poblaciones de microorganismos, materia orgánica, humedad e hidrocarburos totales del petróleo en el suelo con 115 211 mg kg-1 de hidrocarburos totales del petróleo.
Oil incorporation into the soil may generate modifications to the vertical distribution of bacteria and fungi populations. Many environmental contingencies occurs in the State of Tabasco by oil leakages and spills in the marshy soils, rivers, streams and lagoons. Although there are reports that explain the distribution pattern of bacteria and fungi populations across the soil profile related to soil organic matter and humidity, the effect caused by oil is unknown. Identification of layers and horizons of Gleysols (Endoaquents and Hydraquents) influenced by oil leakages and spills from pipelines and pits for oil-gas separation was performed at oil field La Venta and Complejo Procesador de Gas La Venta. Microorganisms were counted by means of the plate count technique on surface by dilutions, isolation of pure culture and isolate characterization. Soils have high contents of organic matter, nitrogen, phosphorus, potassium and high cationic exchange capacity. Soil humidity is above 100% in superficial and underlying horizons, with high contents of total petroleum hydrocarbons in superficial horizons and lower in the underlying. No correlation was found between microbial populations and soil organic matter or with total petroleum hydrocarbons; however, correlation was found with soil humidity in soil without contamination, and in soil with chronic contamination. Oil decreased drastically bacteria’s and fungi populations in soil with chronic contamination. Significant correlation is present between microbial populations, organic matter, humidity and total petroleum hydrocarbons in soil with 115 211 mg kg-1 of total oil hydrocarbons. Key words: Bacteria, layer, oil spill, entisols, gleysols, fungi, horizon.
INTRODUCTION Palabras clave: Bacterias, capa, derrame de petróleo, entisoles, gleysoles, hongos, horizonte.
O
il industry in the state of Tabasco faces risks of oil and oily water spilling, leaking and filtrations, derived from operational accidents, insufficient maintenance or pipeline corrosion due to rains and prolonged floods. Oil spills and leaks, drilling wastes and
Recibido: Octubre, 2000. Aprobado: Febrero, 2002. Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 36: 149-160. 2002.
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AGROCIENCIA VOLUMEN 36, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2002
INTRODUCCIÓN
L
a industria petrolera en el estado de Tabasco tiene riesgos de derrames, fugas y filtraciones de petróleo y aguas aceitosas, originados por accidentes operativos, por mantenimiento insuficiente o por corrosión de oleoductos por lluvias e inundaciones prolongadas. Los derrames y fugas de petróleo, los desechos de perforación y aguas aceitosas alteran las propiedades químicas, físicas y biológicas del suelo. En el Estado de Tabasco la industria petrolera origina, en promedio, cada año 114 contingencias ambientales por derrames o fugas de petróleo (CIMADES, 1999). Aunque se han realizado estudios de los niveles de concentración de petróleo en los horizontes superficiales en suelos orgánicos y minerales, se desconocen las repercusiones en el subsuelo y en las poblaciones de bacterias y hongos en los horizontes del suelo. La distribución de los microorganismos en el suelo se relaciona con los contenidos de nutrientes y de oxígeno en el espacio poroso. Los hongos se encuentran principalmente en el horizonte superficial del suelo, en cambio las bacterias presentan mecanismos fisiológicos que permiten su adaptación a ambientes saturados e inundados, por lo que pueden ser aeróbicas obligadas, anaeróbicas facultativas o anaeróbicas obligadas (Alexander, 1994). Los suelos sin petróleo tienen poblaciones grandes en los horizontes superficiales, que disminuyen con la profundidad. Sin embargo, Levorsen y Berry (1967) indicaron que las poblaciones hidrocarbonoclásticas son particularmente abundantes en los suelos aledaños a tanques de almacenamiento, pozos petroleros y en los resumideros naturales de petróleo. La distribución vertical de hongos y bacterias en suelos Chernozem de climas fríos se ha correlacionado con el contenido de la materia orgánica (Mishustin, 1975). Una tendencia similar se observó en Podzoles, Chernozem y turbas (Campbell, 1987) y hasta 6 m de profundidad en suelos de turba y Podzoles (Zvyagintsev, 1994). La distribución de los microorganismos en suelos sin influencia de petróleo muestra relación con la materia orgánica; sin embargo, se desconoce la respuesta a derrames de petróleo. Los objetivos de este trabajo fueron: 1) Identificar y explicar la distribución vertical de las poblaciones de bacterias y hongos en suelos afectados por derrames de petróleo; 2) Establecer las relaciones entre materia orgánica, humedad e hidrocarburos totales del petróleo (HTP) del suelo y los tipos de microorganismos. La hipótesis fue que las cantidades de bacterias, hongos e HTP a través de los horizontes y capas del perfil disminuyen al aumentar la profundidad. Además, que estos microorganismos tienen relación con la materia orgánica, la humedad y con los HTP del suelo.
oily waters alter the chemical, physical and biological properties of soil. In the state of Tabasco oil industry causes a yearly average of 114 environmental contingencies due to oil spills or leaks (CIMADES, 1999). Even though studies have been conducted on oil concentration levels in surface horizons of organic and mineral soils, impacts on subsoil and fungi and bacteria population composition in the soil horizons are unknown. The distribution of microorganisms in soil is related to nutrient and oxygen contents in the porous space. Fungi are mainly found in the soil surface horizon; bacteria, on the contrary, presents physiological mechanisms which allow its adaptation to saturated and flooded environments, therefore they can be obligated aerobic, facultative anaerobic or obligated anaerobic (Alexander, 1994). Soils without oil have large populations in the superficial horizons that diminish with depth. Nevertheless, Levorsen and Berry (1967) found that hydrocarbonoclastic populations are particularly abundant in soils close to storage tanks, oil wells and natural oil drains. Vertical distribution of fungi and bacteria in cold weather Chernozem soils has been correlated with organic matter content (Mishustin, 1975). A similar tendency was observed in Podzoles, Chernozem and peat (Campbell, 1987) and in peat soils and podzols up to 6 m in depth (Zvyagintsev, 1994). Microorganism distribution in soils without oil influence is related to organic matter; however, the response to oil spills is unknown. This research’s objectives were: 1) To identify and explain vertical distribution of bacteria and fungi populations in soils affected by oil spills; 2) To establish the relationships among organic matter, humidity and total petroleum hydrocarbons (TPHs) in soil and the kinds of microorganisms. The hypothesis was that amounts of bacteria, fungi and TPHs decreases trough horizons and profile layers as depth increases. In addition, that these microorganisms are related with soil organic matter, humidity and TPHs.
MATERIALS AND METHODS Soils and agrological profiles Three sites with different TPHs levels, breaks in pipelines, spills and filtrations of drilling wastes from confinement reservoirs were selected. The control soil was located in Teapa municipality; the contaminated soil by a pipeline break in August 1998, is located 2.4 km northwest from Villa La Venta; the strongly contaminated soil since 1963 is at a chronic oil waster, 0.25 km west from Complejo Procesador de Gas La Venta (GPC La Venta). Both contaminated soils have received the influence from La Venta oil field installations and GPC La Venta, established in Huimanguillo municipality, in the western region of Tabasco. Intensive agrological studies in the three sites were conducted.
RIVERA-CRUZ et al.: POBLACIONES MICROBIANAS EN SUELOS AFECTADOS POR HIDROCARBUROS
MATERIALES Y MÉTODOS Suelos y perfiles agrológicos Se seleccionaron tres sitios con diferentes niveles de HTP, con roturas de oleoductos, derrames y filtraciones de desechos de perforación de las presas de confinamiento. El suelo testigo se localizó en el municipio de Teapa; el suelo contaminado por rotura de oleoducto en agosto de 1998, está a 2.4 km al noroeste de Villa La Venta; el suelo fuertemente contaminado desde 1963 está en un tiradero crónico, 0.25 km al oeste del Complejo Procesador de Gas La Venta (CPG La Venta). Los dos suelos contaminados han recibido la influencia de las instalaciones del Campo Petrolero La Venta y del CPG La Venta, establecidos en el municipio de Huimanguillo, en la región occidental de Tabasco. Se realizaron estudios agrológicos intensivos en los tres sitios. Los perfiles representativos se excavaron en los sitios ubicados en las coordenadas geográficas N 17o 40’ 58” - O 93o 00’ 45” (suelo no afectado por petróleo); N 18o 06’ 52” - O 94o 03’ 18” (suelo afectado recientemente con petróleo) y N 18o 05’ 31” - O 94o 03’ 05” (suelo con derrame crónico de petróleo). Descripción del perfil agrológico y colecta de muestras La caracterización morfológica de los perfiles agrológicos se realizó de acuerdo con Cuanalo (1981); la nomenclatura del suelo se basó en los sistemas de clasificación de ISSS-ISRIC-FAO (1998) y Soil Survey Staff (1998). Se colectaron cinco submuestras de cada horizonte o capa, se mezclaron homogéneamente y se formaron muestras compuestas de cada horizonte o capa. Las muestras compuestas para los análisis de las propiedades físicas y químicas se introdujeron en bolsas de plástico. Las muestras para la cuantificación de HTP y para las poblaciones de bacterias y hongos, se introdujeron en frascos de vidrio ámbar, se taparon con papel aluminio y se cerraron; se almacenaron en hielera y después en refrigeración a 4 oC. Se adicionó hexano a las muestras para HTP para inhibir la actividad microbiana. La calidad de las muestras se aseguró mediante las normas establecidas en la guía de campo para muestreo de suelos contaminados (Boulding,1994). Análisis de las propiedades físicas y químicas y del contenido de petróleo Las muestras para la medición de las propiedades físicas y químicas se secaron a temperatura ambiente a la sombra y se molieron con mazo de madera; las muestras orgánicas se fragmentaron con rodillo de madera y se tamizaron en malla 20 (2 mm). Las rutinas analíticas utilizadas para medir Ninorg (ppm), Kinterc (Cmol+ kg-1), capacidad de intercambio catiónico (CIC) (Cmol+ kg-1), materia orgánica (MO) (%), pHH2O 1:2.5, conductividad eléctrica (CEH2O 1:2.5) (dS m-1), textura (%) y contenido de humedad de campo (%) fueron las indicadas por van Reeuwijk (1999); P Olsen (ppm) (Olsen y Sommers, 1982); las muestras ricas de MO, por combustión seca (Nelson y Sommers, 1982). El análisis de HTP (mg kg-1) se realizó con la rutina EPA 418.1 modificada para suelos y sedimentos (EPA, 1986).
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Representative profiles were excavated on sites located in the geographic coordinates N 17o 40’ 58” - W 93o 00’ 45” (soil not affected by oil); N 18o 06’ 52” - W 94o 03’ 18” (soil recently affected by oil); and N 18o 05’ 31” - W 94o 03’ 05” (soil with chronic oil spills). Agrological profile description and sample collection Morphological characterization of agrological profiles was performed according with Cuanalo (1981); soil nomenclature is based on the ISSS-ISRIC-FAO (1998) and Soil Survey Staff (1998) classification systems. Five sub-samples from each horizon or layer were collected; and homogeneously mixed to integrate compound samples from each horizon or layer. The compound samples were introduced in plastic bags to perform physical and chemical analyses. Samples for TPHs quantification and for bacteria and fungi populations determination were introduced in amber glass flasks, then covered with aluminum, closed, later placed in an ice box and finally kept at 4 oC. To avoid microbial activity, hexane was added to samples for TPHs. Norms established in the field guide for contaminated soils sampling (Boulding, 1994) were applied to assure samples’ quality. Analysis of physical and chemical properties and oil content Samples for physical and chemical properties measurements were dried at environmental temperature in the shade and grinded with wooden stick; organic samples were fragmented with wooden roller and sieved in mesh 20 (2 mm). Analytic routines used to measure N inorg. (ppm), K exchang. (Cmol+ kg), cationic exchange capacity (CEC) (Cmol+ kg), organic matter (OM) (%), pH H2O 1:2.5, electric conductivity (EC H2O 1:2.5) (dS m-1), texture (%) and field humidity content (%) were those indicated by van Reeuwijk (1999); P Olsen (ppm) (Olsen and Sommers, 1982); samples rich in OM, by dry combustion (Nelson and Sommers, 1982). TPHs analysis (mg kg-1) was done with EPA 418.1 routine modified for soils and sediments (EPA, 1986). Microbiological analysis They were performed in four stages: material sterilization, bacteria and fungi population’s evaluation in each horizon and layer, axenic culture and fungi identification. Glass material was sterilized in oven for 5 h with dry heat at 180 oC. Culture mediums were sterilized with humid heat in a pressure steam cooker for 18 min at 1.3 kg cm2 (Ingraham and Ingraham, 1998). Culture of microorganisms was done by the viable count technique of live cells by surface sowing (Madigan et al., 1998) Serial dilutions base 10 were used; 10 g of soil were diluted in 90 mL-1 sterile water, up to 1/108 for bacteria and 1/105 for fungi. 0.1 mL of each dilution was placed in the center of a Petri plate with specific and complex culture mediums, and was later L shaped distributed with a sterilized glass stick. This procedure was carried out thrice. Culture mediums used were: agar nutrient for total bacteria (Difco Manual, 1953, in Johnson and Curl, 1972); combined coal (Rennie, 1981) for nitrogen assimilating and fixing bacteria; modified combined coal (Rennie, 1981) for oil tolerant bacteria, replacing the sources of
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AGROCIENCIA VOLUMEN 36, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2002 Análisis microbiológicos
Se realizaron en cuatro etapas: esterilización de material, evaluación de las poblaciones de bacterias y hongos por horizonte y capa, cultivo axénico, e identificación de hongos. El material de vidrio se esterilizó durante 5 h a calor seco a 180 oC en estufa. Los medios de cultivo se esterilizaron en calor húmedo a 121 oC, en olla de presión de vapor a 1.3 kg cm2 durante 18 min (Ingraham e Ingraham, 1998). El cultivo de microorganismos se realizó con el método de conteo viable de células vivas por siembra en superficie (Madigan et al., 1998). Se utilizaron diluciones seriadas con base en 10, se diluyeron 10 g de suelo en 90 mL-1 de agua estéril, hasta 1/108 para bacterias y 1/105 para hongos. Se tomó 0.1 mL de cada dilución y se colocó en el centro de la caja Petri con medios de cultivo complejos y específicos, se distribuyó con una varilla de vidrio esterilizado en forma de L. El procedimiento, se realizó por triplicado. Los medios de cultivo utilizados fueron: agar nutriente para bacterias totales (Manual Difco, 1953, citado por Johnson y Curl, 1972); carbón combinado (Rennie, 1981) para bacterias asimiladoras y fijadoras de nitrógeno; carbón combinado modificado (Rennie, 1981) para bacterias tolerantes a petróleo, reemplazando las fuentes de carbono por un cuadro (1.5 x 1.5 cm) de papel filtro impregnado con petróleo Maya (300 mg L-1) y adherido en el interior de la tapa de la caja Petri; carbón combinado modificado (Rennie, 1981) para bacterias tolerantes a benzo(a)pireno (BaP), reemplazando las fuentes de carbono por BaP (Sigma B-1760), grado HPLC, pureza mínima 97% (20 mg L-1) diluida con acetona y asperjada a la caja Petri; papa dextrosa agar (Riker y Riker 1936, citado por Johnson y Curl, 1972), celulosa agar modificado (Eggins y Pugh, 1962, citados por Johnson y Curl, 1972) para hongos tolerantes a petróleo, reemplazando las fuentes de carbono, por la adición de 300 mg L-1 de petróleo Maya en cuadro de papel filtro; celulosa agar modificado (Eggins y Pugh, 1962, citados por Johnson y Curl, 1972) para hongos tolerantes a BaP, reemplazando las fuentes de carbono por 20 mg L-1 de BaP. El conteo de viables se realizó contando las unidades formadoras de colonias (UFC) expresadas en la superficie de la caja, luego se transformó a UFC g-1 de suelo seco. El conteo se efectuó con contador de colonias Darkfield Quebec (Cia. American Optical). Las bacterias se caracterizaron por los rasgos morfológicos externos: forma, color, elevación, bordes, movilidad, textura, tinción gram y forma microscópica. Los hongos se clasificaron a nivel de género con base en microcultivos según la técnica de Ridden (Mejía y Ramírez, 1998) y también se identificaron (Barnett y Hunter,1987). Análisis estadístico Las variables evaluadas fueron nitrógeno (Ninorg), potasio (K), capacidad de intercambio catiónico (CIC), materia orgánica (MO), pH, conductividad eléctrica (CE), textura, contenido de humedad, fósforo (P) e hidrocarburos totales del petróleo (HTP). Se utilizó el procedimiento de Tukey para comparar las medias (nivel de significancia de 5%) según la profundidad de los horizontes y capas del perfil para las poblaciones de bacterias totales (BT), bacterias asimiladoras de nitrógeno (BAN), bacterias fijadoras de nitrógeno (BFN), bacterias
carbon by a 1.5 x 1.5 cm square filter paper embedded with Maya oil (300 mg L) and adhered on the Petri plate top inside; modified combined coal (Rennie, 1981) for benzo(a)pyrene (BaP) tolerant bacteria, replacing the sources of carbon by BaP (Sigma B-1760), HPLC grade, minimum purity 97% (20 mg L) diluted with acetone and sprinkled into the Petri plate; potato dextrose agar (PDA), (Riker and Riker 1936, in Johnson and Curl, 1972); modified cellulose agar (Eggins and Pugh, 1962, in Johnson and Curl, 1972) for oil tolerant fungi, replacing the sources of carbon by adding 300 mg L-1 of Maya oil on square paper filter. In modified cellulose agar (Eggins and Pugh, 1962, in Johnson and Curl, 1972) for BaP tolerant fungi, the carbon -1 sources were replaced by were replaced for 20 mg L of BaP. Counting of viables was performed by enumeration of colony forming units (CFU) expressed on the surface of the dish, transformed to FCU g-1 of dry soil. Counting of colonies was performed with a Darkfield Quebec colonies counter (American Optical Comp.). Bacterias’ characterization was made by morphological external features; shape, color, elevation, borders, texture, Gram tinction and microscopic shape. Fungi were classified to genera level based on micro-cultures according to Ridden is technique (Mejia and Ramirez, 1998) and identified as well (Barnett and Hunter, 1987). Statistical analysis Evaluated variables were nitrogen (N inorg), potassium (K), cationic exchange capacity (CEC), organic matter (OM), pH, electrical conductivity (EC), texture, humidity content, phosphorus (P) and total petroleum hydrocarbons (TPHs). Tukey’s multiple comparison procedure (5% level of significance) was applied according to horizon and profile layers depth distribution for populations of: total bacteria (TB), nitrogen assimilating bacteria (NAB), nitrogen fixing bacteria (NFB), TPHs tolerant bacteria (TPHsTB), BaP tolerant bacteria (BaPTB) total fungi (TF), BaP tolerant fungi (BaPTF) and TPHs tolerant fungi (TPHsTF). A simple correlation analysis (SAS, 1989) was performed to evaluate the association between microorganisms and TPHs concentration, OM and humidity.
RESULTS AND DISCUSION Bacteria and fungi populations in soil not affected by oil Chemical properties evaluation, jointly with the distribution and presence of epipedons and horizons in field diagnosis, indicated the soil is an Histi- orthieutric Gleysol (ISSS-ISRIC- FAO, 1998), also named Typic Endoaquents (Soil Survey Staff, 1998). Results for chemical analysis showed favorable chemical properties for microbial growth in this soil, which is rich in nutrients (Table 1). Salinity and acidity decreases as depth increases; presence of abundant sapric vegetal material in the third horizon (Oe) occur, apparently accumulated by fluvial transport, deposited and buried in the sediments during floods.
RIVERA-CRUZ et al.: POBLACIONES MICROBIANAS EN SUELOS AFECTADOS POR HIDROCARBUROS
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Cuadro 1. Características físicas y químicas, y poblaciones de bacterias y hongos en horizontes del Gleysol histi-orthiéutrico sin influencia petrolera. Table 1. Physical and chemical properties, and bacteria and fungi populations in horizons of the uncontaminated Histi-orthieutric gleysol.
Propiedades físicas y químicas SN-inorgánico (ppm) P aprovechable (ppm) K intercambiable (Cmol+ kg-1) Cap. Interc. Catiónico (Cmol+ kg-1) Materia orgánica (%) pH Conductividad eléctrica (dS m-1) Hidrocarburos Totales Petróleo (ppm) Humedad de campo (%) Arcilla (%) Textura Microorganismos (UFC g-1 suelo seco) Bacterias totales Bacterias fijadoras de nitrógeno Bacterias asimiladoras de nitrógeno Bacterias tolerantes a BaP Bacterias tolerantes a HTP Hongos totales Hongos tolerantes a BaP Hongos tolerantes a HTP
Horizonte Op (0-24/25 cm)
Horizonte Cg (24/25-38/43 cm)
Horizonte Oe (38/43-43/46 cm)
Horizonte 2Cg’ (43/46-70 cm)
155 13.6 0.40 47 28.34 5.1 3.7 98 126 18.7 Mig-limosa
83 6.6 0.35 63 19.09 5.9 1.9 100 155 36 Arc-migajosa
69 8.2 0.40 74 69.86 5.4 1.5 141 232 9.8 Mig-limosa
27 6.0 0.20 26 7.60 6.3 1.3 59 254 38 Arc-migajosa
1366 x 103 a 200 x 103 a 597 x 103 a 333 x 103 a 203 x 103 a 27 x 102 a 20 x 102 a 2 x 102 a
22 x 103 c 8 x 103 c 34 x 103 c 79 x 103 b 30 x 103 b 0b 0b 0b
387 x 103 b 57 x 103 b 297 x 103 b 256 x 103 a 31 x 103 b 0b 0b 0b
5 x 103 c 0.3 x 103 c 10 x 103 c 37 x 103 b 10 x 103 c 0b 0b 0b
Letras diferentes en sentido horizontal indican medias estadísticamente diferentes (Tukey, p=0.05) indicates means statistically different (Tukey p=0.05).
tolerantes a HTP (BTHTP), bacterias tolerantes a BaP (BTBaP), hongos totales (HT), hongos tolerantes a BaP (HTBaP) y hongos tolerantes a HTP (HTHTP). La asociación entre los microorganismos y la concentración de HTP, MO y humedad se evaluó con análisis de correlación simple (SAS, 1989).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Poblaciones de bacterias y hongos en suelo no afectado por petróleo La evaluación de las propiedades químicas, conjuntamente con la presencia y distribución de los epipedones y horizontes en los diagnósticos de campo, indicaron que el suelo es un Gleysol histi-orthiéutrico (ISSS-ISRICFAO, 1998), denominado también Endoaquents típico (Soil Survey Staff, 1998). Los resultados de los análisis químicos evidenciaron que es un suelo con propiedades químicas favorables para el crecimiento microbiano. El suelo es rico en nutrientes (Cuadro 1), la salinidad y la acidez disminuyen con el incremento de la profundidad; hay presencia de material vegetal sáprico abundante en el tercer horizonte (Oe), aparentemente acumulado por el transporte fluvial, depositado y enterrado por los sedimentos durante las inundaciones. Las propiedades físicas no son propicias para la multiplicación de las bacterias y hongos, y destaca el contenido de humedad muy
❖
Different letters in horizontal direction
Physical properties are not favorable for bacteria and fungi multiplication and it is remarkable the very high humidity content in all the profile, which results in oxygen removal from the porous space. Mean comparison of bacterial populations from the four horizons showed significant differences (p=0.05) (Table 1). 1366 x 103 FCU g dry soil was the largest population and was found in TB in the superficial horizon Op (0 to 25 cm), resulting 273 times bigger than that of the population (5 x 103 FCU g-1 dry soil) from the deepest horizon 2Cg’ (46 to 70 cm) (Figure 1a), which presents saturated conditions, unsuitable for aerobic bacterial growth. Fungi were isolated in the Op superficial horizon (0 to 23 cm), obtaining higher quantity for TF than for both BaPTF and TPHsTF (Figure 1b); groundwater presence (at 0.25 m depth) reduced fungi multiplication, maybe because of the humidity excess in sub-superficial profile horizons. Eighteen bacteria from the four horizons were isolated; nine proceeded from the superficial Op horizon and five from Oe horizon, which has 68.9% organic matter and 232% humidity. Two fungi species, isolated from Op superficial horizon, which belong to Trichoderma and Penicillium genera, were identified. TPHs contents did not exceed 141 mg kg-1 in the profile (Figure 1c) and, apparently, they are related to biogenic hydrocarbons of both vegetal and
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-1
1000
2000
3000
0
0-25
0-25
25-38
25-38
Profund idad (cm)
Profundidad (cm)
0
38-46
46-70
B. totales B. fijadores N B. asimiladoras N B. tolerantes BaP B. tolerantes HTP
HTP (mg kg-1 )
Hongos (102 ufc g-1 ss)
Bacterias (10 UFC g ss)
10
20
30
38-46
46-70
a) Bacterias
0
Profundidad (cm)
154
H. totales H. tolerantes BaP H. tolerantes HTP b) Hongos
50
100
0-25
98
25-38
100
200
141
38-46
46-70
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c) Hidrocarburos totales del petróleo
Figura 1. Distribución vertical de bacterias, hongos e hidrocarburos totales del petróleo en el Gleysol histi-orthiéutrico sin contaminación. Figure 1. Vertical distribution of bacteria, fungi and total petroleum hydrocarbons in the uncontaminated Histi-orthieutric gleysol.
alto en todo el perfil, el cual repercute en el desplazamiento del oxígeno del espacio poroso. La comparación de las medias de las poblaciones bacterianas de los cuatro horizontes mostraron diferencias significativas (p=0.05) (Cuadro 1). La población más grande (1366 x 103 UFC g-1 suelo seco) correspondió a las BT del horizonte superficial Op (0 a 25 cm) y fue 273 veces mayor que la población (5 x 103 UFC g-1 suelo seco) del horizonte más profundo 2Cg’ (46 a 70 cm) (Figura 1a), que tiene condiciones saturadas, no aptas para el crecimiento bacteriano aeróbico. Los hongos fueron aislados en el horizonte superficial Op (0 a 23 cm), los HT en mayor cantidad que los HTBaP y HTHTP (Figura 1b); la presencia del manto freático (a 0.25 m de profundidad) redujo la multiplicación de los hongos, posiblemente por el exceso de humedad en los horizontes subsuperficiales del perfil. Fueron aisladas 18 bacterias de los cuatro horizontes, nueve procedieron del horizonte superficial Op y cinco del horizonte Oe, que tiene 68.9% de materia orgánica y 232% de humedad. Los hongos identificados fueron dos especies de los géneros Trichoderma y Penicillium, aislados del horizonte superficial Op. Los contenidos de HTP no excedieron 141 mg kg-1 en el perfil (Figura 1c) y, aparentemente, están relacionados con hidrocarburos biogénicos de origen vegetal y de microorganismos (Blumer, 1976; Edwards, 1983; Madigan et al., 1998; Wakeham et al., 1980) y con la combustión in situ de material vegetal.
microorganisms origin (Blumer, 1976; Edwards, 1983; Madigan et al 1998; Wakeham et al, 1980) and with in situ combustion of vegetal material. Soil TPHs, OM and humidity had positive correlation, although non significant, in the soil profile with FCU of TB, NAB, NFB, BaPTB, TPHsTB, TF, BaPTF and TPHsTF. Significant associations were those of TPHs with BaPT (r=0.611, p
