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Originales
Papel del factor de crecimiento de tejido conectivo en el daño vascular asociado a hipertensión en ratas. Interacción con la aldosterona Natalia de las Herasa, Marta Ruiz-Ortegab, María Mianaa, Mónica Rupérezb, David Sanz-Rosaa, Paloma Aragoncilloc, Sergio Mezzanod, Victoria Cachofeiroa, Jesús Egidob y Vicente Laheraa a
Departamento de Fisiología. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid. España. Laboratorio de Investigación Renal y Vascular. Fundación Jiménez Díaz. Universidad Autónoma. Madrid. España. c División de Nefrología. Facultad de Medicina. Universidad Austral. Valdivia. Chile. d Departamento de Patología. Unidad II. Hospital Clínico San Carlos. Madrid. España. b
Introducción. El factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) está implicado en diversas enfermedades, como la aterosclerosis, la fibrosis de la piel y diversas nefritis experimentales y humanas. Sin embargo, el papel de este factor profibrótico en el daño vascular asociado a hipertensión no se conoce completamente. Objetivo. Estudiar el posible papel del CTGF en el daño vascular asociado a hipertensión en ratas, así como la posible interacción con la aldosterona. Método. Se utilizaron ratas macho espontáneamente hipertensas (SHR) tratadas durante 10 semanas con 2 dosis de eplerenona, un antagonista selectivo de los receptores de mineralocorticoides (30 y 100 mg/kg/día), y ratas normotensas (WKY) como grupo control. Al final del tratamiento se midió la presión arterial
Este trabajo obtuvo el premio de mención especial a una de las mejores comunicaciones presentadas en las distintas áreas del XVIII Congreso Nacional de la SEA, A Coruña, 2005. Este trabajo ha sido posible gracias a la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (SAF 2004-01884) y al Fondo de Investigaciones Sanitarias (PI02/0822 y PI02/1876). N. de las Heras es investigador posdoctoral de la Red Cardiovascular del FIS. M. Rupérez fue becaria posdoctoral del FIS. Correspondencia: Dra. N. de las Heras Jiménez. Departamento de Fisiología. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. 28040 Madrid. España. Correo electrónico:
[email protected] Recibido el 15 de junio de 2007 y aceptado el 12 de julio de 2007.
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sistólica (PAS) y la reactividad vascular en anillos de aorta. Se determinó la expresión vascular y los valores de proteína del CTGF, así como la morfometría de la aorta. Se estudió también el efecto directo de la aldosterona en células de músculo liso vascular (CMLV). Resultados. Las SHR presentaron unos valores de PAS mayores que las ratas controles WKY. Sólo el tratamiento con la dosis alta de eplerenona redujo significativamente estos valores. La expresión vascular génica y los valores de proteínas del CTGF aumentaron significativamente en las SHR respecto a las WKY. El tratamiento con ambas dosis de eplerenona disminuyó significativamente estos parámetros. La relajación dependiente del endotelio fue menor en SHR que en WKY, y el tratamiento con eplerenona normalizó esta respuesta. Las áreas del vaso, la luz y la media aumentaron significativamente en las SHR respecto a las WKY, así como la relación media/luz. El tratamiento con eplerenona redujo todas las áreas estudiadas y normalizó la relación media/luz. La incubación de CMLV con aldosterona aumentó la expresión de CTGF de forma dependiente de la dosis. Conclusiones. La aldosterona participa en las alteraciones tanto funcionales como estructurales asociadas a la hipertensión arterial. El CTGF es uno de los factores implicados en el proceso fibrótico vascular asociado a hipertensión arterial. Palabras clave: Hipertensión. Aldosterona. Antagonistas de los receptores de mineralocorticoides.
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ROLE OF CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR IN VASCULAR DAMAGE ASSOCIATED WITH HYPERTENSION IN RATS. INTERACTION WITH ALDOSTERONE Introduction. Connective tissue growth factor (CTGF) is associated with distinct diseases, including atherosclerosis, skin fibrosis, and several human and experimental nephritides. However, the role of this profibrotic factor in the vascular damage associated with hypertension is not well known. Objective. To study the role of CTGF in vascular alterations associated with hypertension in rats, as well as its possible interaction with aldosterone. Method. Male spontaneously hypertensive rats (SHR) were treated with 2 doses (30 and 100 mg/Kg/day) of the mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone for 10 weeks. Normotensive rats (WKY) were used as a control group. At the end of the treatment, systolic blood pressure (SBP) and vascular reactivity in aortic rings were measured. In addition, vascular expression and protein levels of CTGF, as well as morphological lesions in the aorta, were evaluated. The direct effect of aldosterone on vascular smooth muscle cells was also studied. Results. SBP was higher in SHR than in WKY and only the high dose of eplerenone significantly reduced SBP. In the aorta of SHR, CTGF mRNA expression and protein levels were upregulated compared with WKY. Both doses of eplerenone similarly and significantly diminished CTGF upregulation. Endothelium-dependent relaxation was lower in SHR than in WKY and treatment with eplerenone normalized this response. Vessel area, lumen area and media area, as well as the media to lumen ratio, were significantly increased in SHR compared with WKY. Treatment with eplerenone reduced all the parameters studied and normalized the media to lumen ratio. Incubation of cultured vascular smooth muscle cells with aldosterone increased CTGF production in a dose-dependent manner. Conclusions. Aldosterone participates in both the functional and structural alterations associated with hypertension. CTGF is one of the factors implicated in the vascular fibrotic process associated with hypertension. Key words: Hypertension. Aldosterone. Mineralocorticoid receptor antagonist.
Introducción La hipertensión arterial (HTA) es uno de los principales factores de riesgo de presentar accidentes
cardiovasculares y cerebrovasculares, así como para el desarrollo de insuficiencia renal1-3. Esto se debe a que la HTA, al igual que otros factores de riesgo, como la diabetes o la dislipemia, favorece el desarrollo de la enfermedad arteriosclerótica, que está en el origen de la complicación trombótica, causa principal en la aparición de estos accidentes4. Además, la HTA produce alteraciones estructurales y funcionales en diferentes órganos diana (corazón, riñón y cerebro), debidas a procesos relacionados con la propia enfermedad arteriosclerótica. Diversos mecanismos se han implicado en el desarrollo de daño orgánico asociado a la HTA, entre ellos la disfunción endotelial y el aumento del estrés oxidativo, el proceso inflamatorio, el desarrollo de fibrosis y otros5-9. El factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) es un factor profibrótico que participa en la regulación del crecimiento celular, la angiogénesis, la adhesión celular, la reparación del hueso y la síntesis de matriz extracelular10. La expresión de este factor está aumentada en diversas enfermedades, como la aterosclerosis, la fibrosis de la piel, el cáncer, el daño hepático y diversas nefritis experimentales y en humanos, y en todas ellas está localizado en áreas de acumulación de matriz extracelular. La regulación del CTGF está aumentada en lesiones ateroscleróticas humanas11, así como en casos clínicos y experimentales de daño renal y cardiovascular12-17. La expresión de este factor está aumentada por la acción de agentes como el factor de crecimiento de transformación  (TGF-)12, la angiotensina II14, la endotelina 118 y el estrés mecánico10, mientras que otros factores, como el factor de necrosis tumoral ␣ (TNF-␣) y los receptores activados por proliferadores peroxisómicos ␥ (PPAR-␥) reducen su expresión10,16. Tradicionalmente, la aldosterona se ha implicado casi exclusivamente en la regulación de la excreción renal de sodio distal. De hecho, los antagonistas de los receptores de mineralocorticoides como la espironolactona se han utilizado durante años como diuréticos con capacidad ahorradora de potasio19. En los últimos años se han publicado estudios que indican que la aldosterona podría desempeñar un papel importante en las alteraciones vasculares asociadas a la HTA20-22. Especialmente importante parece ser la participación de la aldosterona en el desarrollo de fibrosis vascular, renal y cardíaca en modelos experimentales, y más recientemente, en el desarrollo de aterosclerosis23-26. Asimismo, diversos estudios sugieren que la aldosterona es un factor fibrótico que participa de manera importante en el desarrollo de hipertrofia ventricular izquierda asociada a la HTA y en el desarrollo de insuficiencia cardíaca22,27,28. Clin Invest Arterioscl. 2007;19(5):232-9
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Estudios clínicos han demostrado que el tratamiento con antagonistas de los receptores de mineralocorticoides disminuye la morbimortalidad en pacientes con insuficiencia cardíaca, lo que sugiere un papel de la aldosterona en los procesos y alteraciones asociados a esta afección29. Asimismo, estudios experimentales han demostrado que estos antagonistas reducen los valores de la presión arterial así como la disfunción vascular y la hipertrofia en modelos de hipertensión inducidos por angiotensina II y regaliz, así como en ratas espontáneamente hipertensas (SHR)20,21,30. Sin embargo, no se conoce bien la interacción entre la aldosterona y el CTGF en el daño vascular asociado a la hipertensión arterial. Por ello, el objetivo del presente trabajo fue estudiar el posible papel del CTGF en el daño vascular asociado a la hipertensión, así como la posible interacción con la aldosterona. Para ello, estudiamos el efecto de la eplerenona, un antagonista de los receptores de mineralocorticoides, en la función y la estructura vascular, así como sobre la expresión del CTGF en la aorta de SHR. Materiales y método Se utilizaron ratas macho (n = 16) SHR de 18 semanas de edad, tratadas durante 10 semanas con 2 dosis del antagonista selectivo de los receptores de mineralocorticoides, eplerenona, 100 mg/kg/día (Eple-100) y 30 mg/kg/día (Eple-30), y ratas normotensas Wistar Kyoto (WKY) (n = 8) como grupo control (Harlan Interfauna Ibérica, S.L., Barcelona, España). Las ratas estuvieron en instalaciones adecuadas con ciclos de luz y oscuridad de 12 h, en condiciones de temperatura controlada y con acceso libre al agua y alimento (dieta estándar, A. 04 Panlab, Barcelona, España). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la normativa de la Unión Europea para el tratamiento ético de los animales de experimentación.
Presión arterial La presión arterial sistólica (PAS) se midió de manera indirecta en la arteria caudal de las ratas con un esfigmomanómetro (Narco Bio-Systems, Houston, TX, Estados Unidos). Para obtener un valor fiable de la presión arterial, las ratas fueron acostumbradas diariamente a este método. El valor definitivo de la PAS fue la media aritmética de la toma de 8 medidas sucesivas en 2 días consecutivos y a la misma hora.
Estudio de la función vascular en anillos aórticos La función vascular fue estudiada evaluando la respuesta vasodilatadora dependiente de endotelio a acetilcolina (Ach; 10–10-10–6 mol/l), y la respuesta vasodilatadora independiente de endotelio a nitroprusiato sódido (NPS; 10–10-10–6 mol/l) en anillos precontraídos con fenilefrina (FE; 10–6 mol/l) como previamente describimos31.
Morfometría vascular Se utilizaron cortes de aorta torácica fijados en formaldehído al 10%, incluidos en parafina y cortados en secciones (4 m). Se determinaron las áreas del vaso, la luz y la media, introduciendo el factor de corrección L2/4 donde L es la longitud de la lá-
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mina externa o interna. Este método se usó para evitar errores de cálculo en el área del vaso y la luz, debido a que los segmentos aórticos podrían deformarse durante su manejo. Los cortes teñidos se captaron con una videocámara conectada a un microscopio, se digitalizaron y se valoró la morfometría de la muestra. Las mediciones se realizaron con un analizador de imagen LEICA Q 500IW (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, Reino Unido) como previamente describimos32.
Inmunohistoquímica del factor de crecimiento de tejido conectivo Se utilizaron cortes de aorta torácica fijados en paraformaldehído al 4%, incluidos en parafina y cortados en secciones (4 m). La presencia de CTGF se determinó por inmunohistoquímica usando un anticuerpo anti-CTGF purificado en conejo (Torrey Pines Biolabs, San Diego, CA, Estados Unidos). Los cortes se desparafinaron en xilol y se rehidrataron en un gradiente decreciente de etanol. Se bloqueó la peroxidasa endógena (metanol/H2O2 al 3%) y la tinción inespecífica (4%BSA/PBS1x; suero) de los tejidos. Las secciones se incubaron con los anticuerpos primario y secundario (anti-IgG conjugado con HRP), y tras el lavado de las muestras se reveló la reacción con técnicas estándar. En cada experimento, se utilizaron controles negativos sin anticuerpo primario para comprobar la tinción inespecífica. Finalmente, se tiñeron los cortes con hematoxilina para obtener una tinción de contraste, se deshidrataron y se montaron junto con el cubreobjeto para su posterior análisis por microscopia óptica (Nikon Eclipse E400). La valoración de la inmunohistoquímica se determinó con un analizador de imagen (3.0 KZ 300 Zeiss, MunchenHallbergmoos, Alemania), que calcula el porcentaje de área teñida respecto al área total. Para cada muestra, la media del área teñida se obtiene del análisis de 20 campos diferentes (⫻ 40).
Aislamiento de ácido ribonucleico Las aortas congeladas fueron pulverizadas en nitrógeno líquido y posteriormente 100 mg de tejido se homogenizaron con 1 ml de Tri Reagent (Molecular Research Center Inc. Cincinnati, OH, Estados Unidos). El aislamiento de ácido ribonucleico (ARN) se llevó a cabo según la metodología de Chomczynski33. El ARN se cuantificó por densitometría óptica a 260 nm, con la ayuda de un Biofotómetro (Eppendorf, Alemania). El ARN se conservó a –80 ºC hasta su utilización.
Transcriptasa inversa
Se utilizaron 5 g del ARN total en la reacción de retrotranscripción. Se calentó previamente con 2 M Random Hexamer, a 70 ºC durante 5 min, y se colocó rápidamente sobre hielo. A continuación, se añadió una mezcla de inhibidor de ARNasa 0,7 U, 25 mM Tris HCl (pH 8,3), 37 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM DTT, nucleótidos trifosfato (dNTP) 0,4 mM y 2,5 U de Maloney Murine leukemia virus (MMLV), se incubó a 37 ºC durante 60 min; seguidamente, se calentó la mezcla a 95 ºC durante 10 min y se colocó en hielo. La mezcla se completó con agua libre de ADNasa hasta un volumen final de 50 l.
Análisis por reacción en cadena de la polimerasatranscriptasa inversa cuantitativa Para cuantificar los valores de ARN mensajero se realizaron reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativas y en tiempo real, utilizando un termociclador Real Time PCR Smart Cycler (Cepheid, Sunnyvale, California, Estados Unidos). Para este análisis se utilizaron sondas TaqMan. La sonda del CTGF
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(5´-AgCCAACTgCCTggTCCAgACCA-3´) modificada con una molécula fluorescente en el extremo 5´ y con un quencher en el 3´ se añadió a la reacción. En las condiciones de anillamiento, la sonda hibridó con el ADN molde. En la extensión de los cebadores del CTGF (sense: 5´-TggCCCTgACCCAACTATgAT-3´; antisense: 5´-gCACTTTTTgCCCTTCTTAATgTT-3´), la actividad exonucleasa de la Taq ADN polimerasa degrada la sonda resultando en la emisión de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia se corresponde con la cantidad de producto amplificado. Los valores obtenidos se normalizaron con la expresión de la GAPDH y se analizaron mediante el método de 2-⌬⌬CT34.
Aislamiento y cultivo de células del músculo liso vascular de la rata El cultivo de CMLV se realizó a partir de aortas de ratas Wistar mediante digestión con colagenasa14. Las células se cultivaron en medio Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) con un 10% de STF y se usaron entre los pases cuarto y séptimo, y se deplecionaron durante 48 h previamente a la realización de los experimentos. Las CMLV se caracterizaron por microscopia de contraste de fase, tinción positiva para ␣-actina y tinción negativa para el antígeno relacionado con el factor VIII.
Western blot Las células se homogeneizaron en un tampón de lisis. Se extrajeron las proteínas y se cuantificaron por el método de ácido bicinconínico (BCA). A continuación, se hizo una electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (un 12% de Lauryl Sulfate [SDS]) y se transfirieron las proteínas a membranas de nitrocelulosa (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos). Las membranas se preincubaron para rebajar el fondo y posteriormente se incubaron con el anticuerpo primario anti-CTGF. Después de varios lavados se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa y finalmente las proteínas específicas se detectaron por quimioluminiscencia (enhanced chemiluminescence [ECL] kit, Amersham). La angiotensina II (10–7 mol/l) se usó como control positivo de la producción de CTGF14 (datos no mostrados). Las membranas se “escanearon” en un densitómetro (GS-800 Calibrated Densitomete, Quantity One, Bio-Rad, España) y se midió su densidad óptica mediante el programa SCION IMAGE. Los valores obtenidos se normalizaron con los datos de la expresión de la ␣-tubulina.
Análisis estadístico Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar de la media (DEM) de los 8 animales de cada grupo. Los resultados de los valores de ARNm y proteínas se muestran como el aumento del número de veces respecto al control, en unidades arbitrarias densitométricas, expresados como la media ± DEM de los experimentos llevados a cabo. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía, seguido de una prueba de comparación múltiple de medias (test de Bonferroni), cuando se encontraron diferencias (SPSS 12.0; Statoft Inc., Tulsa, Oklahoma, Estados Unidos). La hipótesis nula se rechazó cuando p < 0,05.
Resultados Presión arterial sistólica Las ratas SHR presentaron valores de PAS más elevados que las WKY (208,1 ± 4,9 frente a 130,3 ±
0,6 mmHg; p < 0,05). El tratamiento con ambas dosis de eplerenona redujo estos valores en las SHR (204,3 mmHg [Eple-30]; 168,3 ± 2,9 mmHg [Eple-100]) de manera dependiente de la dosis. Sólo la dosis más alta de eplerenona tuvo diferencias significativas respecto a las SHR no tratadas. Estudio de la función vascular en anillos aórticos La relajación dependiente de endotelio inducida por Ach fue menor (p < 0,05) en SHR que en WKY, y el tratamiento con ambas dosis del antagonista selectivo de los receptores de mineralocorticoides, eplerenona, normalizó (p < 0,05) esta respuesta (fig. 1A). Por otro lado, la respuesta vasodilatadora al nitroprusiato sódico, un donante de óxido nítrico, no se vio modificada en las ratas SHR respecto a sus controles (WKY), y el tratamiento con Eple30 y Eple-100 tampoco modificó la respuesta (fig. 1B). Morfometría vascular El área de la luz, de la media y del vaso fueron significativamente mayores en las SHR respecto a las WKY. Asimismo, la relación media/luz fue mayor en las SHR que en las WKY (p < 0,05). El tratamiento con el antagonista selectivo de los receptores de mineralocorticoides (Eple-30 y Eple-100) redujo (p < 0,05) todas las áreas valoradas y normalizó la relación media/luz (fig. 2). Expresión del ARNm y niveles de proteína del factor de crecimiento de tejido conectivo en aorta La expresión vascular del ARNm del CTGF evaluada por RT-PCR en tiempo real aumentó significativamente en las SHR respecto a las ratas WKY. Los valores del CTGF en aorta medido por inmunohistoquímica de ratas SHR fue significativamente mayor que en las normotensas. La tinción fue localizada principalmente en las CMLV. El tratamiento con ambas dosis de eplerenona redujo (p < 0,05) de manera similar tanto la expresión del ARNm (fig. 3A) como la tinción del CTGF en la aorta de las ratas SHR (fig. 3B). Efecto directo de la aldosterona en la expresión del factor de crecimiento de tejido conectivo en células de músculo liso vascular La incubación de células de músculo liso vascular de rata in vitro con aldosterona aumentó la expresión de la proteína del CTGF de manera dependiente de la dosis, y la respuesta máxima se observó con 100 nmol/l de aldosterona (fig. 4A). El efecto del antagonista de los receptores de mineralocorticoides, espironolactona, redujo de manera Clin Invest Arterioscl. 2007;19(5):232-9
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B 0
25
50
75
100 10
9
8
7
6
WKY
Relajación (porcentaje de la concentración a FE)
Relajación (porcentaje de la concentración a FE)
A
SHR SHR Eple-30 SHR Eple-100
0 x 25
50
75
100 10
Ach (-Log mol/l)
9
8
7
Ach (-Log mol/l)
5
6
Figura 1. A) Relajación inducida por la acetilcolina (Ach), 10–10 – 10–6 mol/l. B) Nitroprusiato sódico (NPS), 10–10 – 10–6 mol/l, en anillos de aorta precontraídos con una concentración submáxima (10–6 mol/l) de fenilefrina (FE) de ratas normotensas (WKY), ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y SHR tratadas con eplerenona, 30 mg/kg/día (Eple-30), y 100 mg/kg/día (Eple-100). Los valores se expresaron como la media ± desviación estándar de la media. ap < 0,05 frente a WKY. b p < 0,05 frente a SHR.
WKY
a
SHR 4
b a
mm2
3
a b
b
SHR Eple-30
a
SHR Eple-100
b a
a
2 a b a
1
b a a
b
b
0 Área de la luz
Área de la media
Área del vaso
significativa la producción de CTGF inducida por aldosterona en CMLV de rata (fig. 4B). Discusión Los resultados de este trabajo muestran que el remodelado vascular y la disfunción endotelial observada en las SHR están asociados a un aumento en la expresión vascular del CTGF. Además, la aldosterona aumentó la expresión proteica del CTGF en cultivos de CMLV a través de la activación de los receptores de mineralocorticoides y la localización de este factor de crecimiento fue principalmente en la capa media de la aorta, lo que sugiere su participación en las alteraciones estructurales vasculares observadas en la hipertensión. Numerosos estudios clínicos y experimentales6,9,35 han sugerido que la hipertensión está asociada con remodelado vascular debido, entre otras 236
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Media/luz
Figura 2. Área de la luz, área de la media, área del vaso y relación media/luz en aorta de ratas normotensas (WKY), ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y SHR tratadas con eplerenona, 30 mg/kg/día (Eple-30), y 100 mg/kg/día (Eple-100). Los valores se expresan como media ± error estándar de la media. ap < 0,05 frente a WKY. bp < 0,05 frente a SHR.
causas, a un aumento de la producción de matriz extracelular que lleva a un engrosamiento de la media, así como a un aumento en la relación media-luz. El remodelado vascular parece ser un mecanismo protector de la pared vascular contra los valores elevados de presión arterial, ya que un aumento del grosor de la capa media reduce la tensión de la pared36. Asimismo, los valores elevados de presión arterial se asocian a disfunción endotelial, caracterizada principalmente por una reducción de la relajación dependiente del endotelio. Éste parece deberse, probablemente, al aumento de las fuerzas de cizallamiento sobre el endotelio vascular, provocando alteraciones funcionales que afectan a la producción, liberación y respuesta de los distintos factores vasoactivos37 y a la reorganización de los componentes de la pared vascular por cambios en las células del músculo liso y deposi-
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A
B 250 a
200
b a
100
b a
Densidad/mm2 (%)
Expresión relativa (%)
300
a
200 150
b
b
100 50
0
0 WKY
SHR
SHR Eple-30
SHR Eple-100
WKY
SHR
SHR Eple-30
SHR Eple-100
Figura 3. A. Expresión vascular del ARNm del factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) por reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) en tiempo real. Los valores se expresaron como el porcentaje de la expresión relativa respecto al grupo control (WKY). B. Valores de proteína del CTGF en aortas. Los resultados se expresan en densidad por mm2. Todos los valores se expresan como la media ± desviación estándar de la media en ratas WKY, ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y SHR tratadas con eplerenona, 30 mg/kg/día (Eple-30), y 100 mg/kg/día (Eple-100). a p < 0,05 frente a WKY. bp < 0,05 frente a SHR.
ción de matriz extracelular. El estrés hemodinámico debido a la presión arterial elevada producido en las CMLV induce un aumento en la expresión de fibronectina y colágeno mediado por la activación del factor de transcripción nuclear AP-138. Además de estas proteínas, la producción vascular de facto-
A
res de crecimiento, como el CTGF, está aumentada en modelos experimentales de hipertensión por infusión de angiotensina II14,39, e hipertensión inducida por ciclosporina A y una dieta alta en sodio40. En el presente trabajo observamos un aumento en la expresión vascular del ARNm del CTGF, así
B 4
5 Niveles de proteína del CTGF (n-veces)
Niveles de proteína del CTGF (n-veces)
a
3
2
1
a
4
3
2
b
1
0
0 Control
Aldo 1 nmol/l
Aldo Aldo 10 nmol/l 100 nmol/l
Control
Aldo Aldo 100 nmol/l 100 nmol/l + Spiro 2,5 Mmol/l
Figura 4. A. Expresión del factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) en células de músculo liso vascular por Western blot, estimuladas con aldosterona (1-100 nmol/l) durante 48 h. B. Expresión del CTGF en células de músculo liso vascular por Western blot, estimuladas con aldosterona (100 nmol/l) durante 48 h. Las CMLV fueron pretratadas con espironolactona (2,5 mol/l) durante 1 h. Los resultados de la producción total de CTGF se obtuvieron mediante análisis densitométrico y se expresan como la relación CTGF/␣ tubulina. a p < 0,05 frente a control. bp < 0,05 frente a aldosterona, 100 nmol/l. Clin Invest Arterioscl. 2007;19(5):232-9
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como en la producción proteica de este factor en la aorta de SHR. Se ha descrito que la regulación del CTGF está mediada, entre otros factores, por las fuerzas de estiramiento y de rozamiento que componen el estrés mecánico41. Asimismo, numerosos estudios indican que el CTGF es un potente factor profibrótico en diferentes situaciones patológicas, como fibrosis cardíaca tras infarto de miocardio y fibrosis renal42,43. La principal fuente de producción de este factor son las células del músculo liso vascular, como se muestra con la técnica de la inmunohistoquímica. Estos datos confirman observaciones previas en las que mostraban la capacidad de estas células de sintetizar este factor14,44. La administración crónica de eplererona redujo la PAS en las SHR de manera dependiente de la dosis. Este hecho supone que la aldosterona participa en el mantenimiento de la hipertensión en las SHR. Estos efectos se asociaron a una mejora en la relajación dependiente del endotelio y a una disminución en todas las áreas valoradas, así como la normalización de la relación media-luz. Asimismo, la reducción de la presión arterial fue acompañada por una disminución de la expresión del ARNm del CTGF y de la producción proteica de este factor en la aorta de SHR. Es importante resaltar que ambas dosis de eplerenona redujeron las alteraciones vasculares y la sobreexpresión del CTGF en la aorta de SHR, pero sólo la dosis más alta (100 mg/kg/día) redujo de manera significativa los valores de presión arterial. Estos resultados destacan la importancia de la aldosterona en la regulación del CTGF, en el remodelado vascular y en la disfunción endotelial en este modelo de hipertensión multifactorial, con independencia de la reducción del estrés mecánico debido al descenso de la presión arterial. Para apoyar la idea de que la aldosterona podría estimular el CTGF, se hicieron cultivos de CMLV incubadas con aldosterona. La incubación de CMLV con aldosterona aumentó de manera dependiente de la dosis la producción de CTGF. Este efecto fue máximo con la dosis de 100 nmol/l de aldosterona después de 48 h de incubación. El bloqueo del receptor de los mineralocorticoides con espironolactona redujo el aumento de la expresión del CTGF causado por la aldosterona, lo que indica que la aldosterona era capaz de provocar la estimulación directa del CTGF. La activación de diferentes señales intracelulares a través de las rutas de las proteincinasas activadas por mitógenos se ha asociado a este efecto45,46. En resumen, todos estos resultados sugieren que la aldosterona, junto con el estrés hemodinámico producido por los valores elevados de presión arte238
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rial, participa en la regulación vascular del CTGF en SHR. Además, estos resultados podrían sugerir que la aldosterona, mediante la estimulación del CTGF, podría participar en las alteraciones funcionales y estructurales vasculares asociadas a la hipertensión y sugiere un nuevo mecanismo de la aldosterona en el daño vascular en la hipertensión. Agradecimientos Agradecemos la asistencia técnica de Sandra Ballesteros y Antonio Carmona.
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