OPTIMIZACIÓN DE DEPURACIÓN MEDIANTE SISTEMAS BIOELECTROQUÍMICOS Y LA TRANSFERENCIA DE METABOLITOS ENTRE ESPECIES

1. Introducción 1.1 Tratamiento de aguas residuales actual La Directiva Marco del Agua (2000/60/CE) establece un marco común a nivel europeo para la protección de las aguas y el tratamiento de aguas residuales. En España, el aspecto de tratamiento está regulado mediante el RD 1290/2012, que en parte transpone la normativa comunitaria así como la Directiva 91/271/CE. En él se establece la obligatoriedad de contar con sistemas de tratamiento de aguas residuales para todos los municipios de más de 2000 habitantes, además, el resto de municipios deberán contar con sistemas colectores con un tratamiento adecuado. En función de su origen, los efluentes pueden tener diversas composiciones, en aguas domésticas prevalece la materia orgánica soluble, con poco contenido en grasas mientras que las aguas de origen industrial pueden contener mayores cantidades de aceites y de contaminantes inorgánicos. El tratamiento de aguas ha evolucionado enormemente con el tiempo. Se ha pasado del vertido directo a los ríos, o las fosas sépticas, a complejos sistemas de depuración. Actualmente la mayoría de aguas residuales son tratadas en reactores aerobios y siguen los mismos pasos durante su tratamiento; un tratamiento preliminar que elimina los materiales groseros, y la mayor parte de la grasa seguido de un tratamiento primario, consistente en una sedimentación del material particulado y no soluble, con remoción del resto de grasas, y por último un tratamiento secundario, donde predomina el sistema de lodos activados, en el que las aguas residuales se mantienen en movimiento en un tanque oxigenado, para que diversos microrganismos fijen la materia orgánica disuelta, para poder ser sedimentados en forma de lodo. Este sistema requiere de grandes aportes de energía, tanto para mantener el agua en movimiento como para mantenerla oxigenada. Diversos estudios cifran la energía consumida para el tratamiento entre 0,3 y 0,4 kWh/m3 (Metcalf & Eddy INC., 2003).

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El tratamiento anaerobio, por otra parte, aunque es menos eficiente a la hora de degradar la materia orgánica, presenta una serie de ventajas a tener en cuenta. Al no ser necesaria la adición de oxígeno a los reactores, los costes energéticos y de mantenimiento se reducen mucho. Así mismo, en la mayoría de sistemas anaerobios, el producto final suele ser gas metano, que convenientemente purificado puede utilizarse como recurso energético. Las etapas de un proceso de tratamiento anaerobio son: 

Hidrólisis: Las bacterias rompen el material particulado en compuestos solubles que puedan ser fermentados.



Fermentación o acidogénesis: Se produce la degradación de la materia orgánica; distintas moléculas orgánicas ejercen de donante y aceptor de electrones, por lo que el ritmo de oxidación es lento. Este proceso suele dar como productos acetato, ácidos propiónico y butírico, hidrógeno y dióxido de carbono.



Metanogénesis: Dependiendo del tipo de bacteria y de la ruta metabólica elegida, los productos son distintos. Las bacterias acetoclásticas reducen acetato para obtener metano y dióxido de carbono. Las metanógenas del hidrógeno reducen carbónico con hidrógeno para formar el metano.

1.2 Electrogénesis Microbiana aplicada al tratamiento de aguas residuales Los sistemas electrogénicos aprovechan el metabolismo bacteriano para producir corriente eléctrica. Las bacterias basan su metabolismo en la oxidación controlada de compuestos orgánicos, utilizando oxígeno como aceptor de electrones en medios aerobios y otros compuestos variados en medios anaerobios. La variedad de aceptores de electrones entre las bacterias anaerobias es muy amplia. Existen bacterias que en ausencia de oxígeno son capaces de fermentar distintos compuestos orgánicos, utilizando otros como aceptor de electrones (acetaldehído, piruvato). Aparte existen bacterias anaerobias, cuyas rutas metabólicas no requieren estrictamente de oxígeno puesto que pueden utilizar compuestos muy diversos como oxidante, sulfato, nitrato, azufre elemental o incluso iones metálicos como el Fe3+ o el Mn4+. 2

En 1910 M.C. Potter observó que utilizando levadura común, Sacharomyceps c. y proporcionándole glucosa, era posible realizar una celda galvánica funcional (M.C.Potter, 1911). Su descubrimiento pasó inadvertido hasta 1931, cuando Barnet Cohen conectó varias celdas microbianas en serie llegando a generar 35 voltios con una corriente de 2 miliamperios (Cohen, 1931). Durante más de medio siglo, este conocimiento se quedó en mera curiosidad, puesto que la transferencia de electrones entre microrganismo y electrodo se realizaba mediante mediadores redox muy específicos, como la ferricianida de potasio o el rojo neutro (Allen & Benedetto, 1993), lo que encarecía los sistemas y reducía su eficiencia. No fue hasta el año 2003 cuando Lovely y Bond demostraron que varias especies del género Geobacter eran capaces de transferir electrones directamente a un electrodo metálico (Lovley & Bond, 2003). En el medio natural, Geobacter es capaz de reducir metales como el hierro (en su forma insoluble) y el uranio y otras moléculas inorgánicas como el azufre. Aunque el mecanismo de transferencia electrónica entre un sólido conductor y una bacteria electrogénica no está completamente descrito, se conocen dos vías para realizar tal proceso: por contacto directo con el sólido conductor, y de forma indirecta a través de mediadores redox excretados por los microorganismos o añadidos artificalmente en el medio. Las bacterias del género Geobacter realizan la interacción bacteria-electrodo de forma directa a través de unas proteínas sitúadas en su membrana exterior denominadas citocromos-C, aunque también se ha especulado sobre la posibilidad de utilizar pili conductores para dicho proceso. El uso de pili (también conocidos como “nanowires”) se da principalmente entre bacterias pertenecientes a un biofilm, de esta forma las bacterias más alejadas del electrodo, o en el medio natural, del metal, transfieren mediante pili sus electrones a las más cercanas (Reguera, et al., 2005). Los citocromos-c por su parte representan el mecanismo fundamental de transferencia directa al electrodo (Esteve-Nuñez, et al., 2008). Se han observado en Geobacter una gran cantidad de estas proteínas, muchas de ellas con grupos multihemo. (Nuñez, et al., 2006); En la secuenciación de sus genes se hallaron 103 capaces de codificar citocromos c, fundamentales para la reducción de metales en el exterior de la membrana 3

(Holmes, 2006). La elevada cantidad de citocromos, los cuales contienen un átomo de hierro por cada grupo hemo le confieren su color rosado a los cultivos de Geobacter. Los sistemas basados en la interacción bacteria electrodo se denominan Sistemas Bioelectroquímicos (SBE) o Tecnologías Electroquímicas Bacterianas (TEM o MET en inglés). Dentro de los mismos se pueden diferenciar en función del modo de trabajo en dos categorías: Celdas de Combustible Microbiana (MFC por sus siglas en inglés), o Celda de Electrolísis Microbiana (MEC por sus siglas en inglés). La estructura de una MFC es similar a la de una celda de combustible clásica. En ambas se oxida un compuesto (en el electrodo anódico) y se reduce otro (en el electodo catódico), conduciéndose el flujo de electrones de forma externa a través de un material conductor y pasando a través de una resistencia. En una MFC los electrones fluyen espontáneamente a través del sistema debido a la diferencia de potencial existente entre el ánodo y el cátodo. Si por el contrario se fuerza el flujo de una corriente eléctrica, estamos ante una MEC. Uno de los diseños más utilizados de una MEC consiste en una celda de tres electrodos con dos cámaras, separadas o no, con una membrana permeable a los protones (también es habitual el diseño de reactores con una sola cámara)(Figura 1). En una de las cámaras, mantenida en condiciones anaerobias, se sitúa el electrodo de trabajo, llamado así cuando controlamos su potencial con un equipo denominado potenciostato frente a un electrodo de referencia. En este electrodo de trabajo es donde se pretenden estimular las reacciones bioelectroquímicas deseadas y por ellos es recomendable controlar su potencial. En la otra cámara se sitúa el contraelectrodo, cuyo potencial será variable. Cuando el electrodo de trabajo actúa como ánodo, el contraelectrodo se comportará como cátodo, teniendo lugar sobre él reacciones de reducción de compuestos, como el oxígeno o los nitratos. Pese a todo, desde su descubrimiento, se han desarrollado diversas variaciones del esquema básico.

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Microor. electrógenos

CO2; H+

O2 ÁNODO CÁTODO

M.ORG

e-

Figura 1: Diseño básico de una MEC. Elaboración propia.

Los SBE han encontrado aplicación en el campo del tratamiento de aguas, tratamiento de suelos, síntesis de productos de valor añadido, etc. De entre todas ellas, su aplicación en el campo de la depuración de aguas residuales ha sido, hasta ahora, el más explorado debido a las ventajas que presenta frente a los tratamientos clásicos, tanto aerobios, como anaerobios: 

Mientras en un digestor anaerobio el aceptor último de electrones es el dióxido de carbono, que se reduce a metano y agua, y en un tratamiento aerobio es el oxígeno aportado artificialmente en el sistema, en un SBE, los electrones son transferidos al ánodo. Ante una situación de de limitación de aceptor de electrones, tanto el tratamiento anaerobio clásico, como el aerobio se verán afectados e inhibidos por esta circunstancia. Esta situación, sin embargo, no se da en un SBE ya que un ánodo es un sumidero inagotable de electrones.



Frente al tratamiento aerobio, la producción de fangos es mucho menor en un SBE puesto que el rendimiento de conversión a biomasa es mucho menor en un proceso anaerobio.



El nitrógeno puede eliminarse del sistema sin la necesidad de adicionar materia orgánica externa, puesto que un cátodo puede servir como

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fuente de electrones inagotable para los microorganismos electrogénicos. 

La monitorización de la corriente eléctrica y el potencial de los electrodos permite el seguimiento de la depuración sin la necesidad de realizar análisis de laboratorio. Además es posible controlar la calidad del efluente mediante la alteración de los parámetros electroquímicos.



Frente a la digestión anaerobia, el proceso de electrogénesis microbiana es mucho menos sensible a la presencia de agentes inhibidores como el oxígeno o el amonio.



La energía obtenida de la oxidación de materia orgánica puede ser aprovechada por el propio sistema de depuración para bombeo de gases o efluvios, remoción de lodos o mantenimiento de la temperatura. Actualmente, se están llevando a cabo diversas investigaciones de

tratamiento de aguas, para lograr la optimización del tratamiento de aguas electrogénico mediante el estudio de distintas configuraciones de reactores, la búsqueda de materiales para el electrodo que presenten mejoras en la conductividad y el área activa, el análisis de la interacción bacteria-electrodo para optimizar la fisiología de los microorganismos electrogénicos etc. Tratamientos electrogénicos empleando cultivos mixtos son capaces de degradar materia orgánica hasta el estado más oxidado (CO2), especialmente si está en forma de ácidos grasos de cadena corta, que muchos microorganismos no pueden metabolizar. No obstante, suele ser necesario instalar en los reactores bioelectroquímicos un pretatamiento de la materia orgánica que para romper las sustancias más complejas que los microorganismos electrogénicos no son capaces de degradar. Por otra parte, determinadas bacterias electrogénicas como Geobacter sulfurreducens son capaces de reducir moléculas inorgánicas como el sulfato, o como Geobacter metallireducens, de reducir el nitrato utilizando un electrodo como donador de electrones, eliminando de esta forma los nutrientes presentes en las aguas residuales. Aprovechar las capacidades de estas especies para eliminar la materia orgánica y los nutrientes de las aguas vertidas, extrayendo electricidad podría resultar en un proceso barato y eficaz de gran utilidad en estaciones de tratamiento de aguas. 6

Conocer los mecanismos que regulan la degradación bioquímica de estos compuestos en un reactor electrogénico permite el desarrollo de nuevas tecnologías limpias encaminadas a favorecer el desarrollo sostenible. 2 Objetivo del estudio El objetivo de este TFG ha sido estudiar la influencia de un sistema bioelectroquímico en un reactor anaerobio de tratamiento de aguas residuales. Para ello se han comparado tres sistemas bioelectroquímicos: -Un SBE de 3 electrodos no conectados inoculado con lodo procedente de un reactor anaerobio de una estación depuradora (R3). -Un SBE de 3 electrodos conectados inoculado con Geobacter sulfurreducens (R2). -Un SBE de 3 electrodos conectados inoculado con lodo procedente de un reactor anaerobio de una estación depuradora (R1). Dentro del objetivo de estudio se ha querido estudiar desde los siguientes puntos de vista el efecto de un SBE sobre el proceso de depuración: -Se ha analizado cómo afecta la polarización de los electrodos a la calidad del efluente. -Se ha estudiado el proceso de depuración con un reactor con un preinóculo de Geobacter adaptado a la oxidación del acetato utilizando el electrodo de trabajo como aceptor final de electrones. -Se ha analizado la posibilidad de de utilizar un reactor inoculado con Geobacter como una segunda etapa en el tratamiento de aguas residuales en el que el influente tenga un alto contenido en ácidos grasos de cadena corta. 3. Materiales y métodos 3.1 Instalación experimental El sistema montado consistió en 3 reactores de tratamiento de aguas con un sistema de 3 electrodos en su interior, alimentados por un extremo 7

lateral con agua residual por una bomba. Por el extremo opuesto del reactor, el efluente salía del recipiente por rebose y se recogía en botellas de vidrio. A continuación se describen cada uno de los elementos del sistema. Reactores Se escogió un tanque de metacrilato con espacio suficiente para ser dividido en tres compartimentos iguales, cada uno de ellos de forma prismática con unas medidas de 13x40x23 cm y un volumen de 11,9 L. Se seleccionó dicho diseño ya que se asemeja a la etapa anaerobia (o también denominada anóxica, por tener lugar el proceso de desnitrificación en ella) de un reactor clásico de una planta de tratamiento de aguas residuales. Los compartimentos se separaron mediante planchas de metacrilato de 0,5 cm de espesor, con sellante de silicona, según se muestra en la figura 2.

Figura 2: Reactor antes de introducírsele medio de cultivo

Para la realización del estudio se construyeron tres reactores con distintos inóculos y distintos medios de cultivo, manteniéndose el mismo tipo de electrodo en los tres, pero diferentes condiciones de operación, según se muestra a continuación: -R1: Se polarizó el electrodo a +600mV. Fue inoculado con aguas residuales. Se alimentó de agua residual sintética. 8

-R2: Se polarizó el electrodo a +600mV. Fue inoculado con Geobacter. En su primera etapa se alimentó con medio de aguas dulces enriquecido con acetato, y posteriormente con los efluvios de R1. -R3: Se mantuvo el circuito abierto. Fue inoculado con aguas residuales. Se alimentó con agua residual sintética. Electrodos El electrodo de trabajo consistió en una estructura construida a partir de malla de titanio grado 1 de 0,2 cm de espesor y realizada a partir de una sola pieza. La estructura se encontraba abierta por debajo de manera que el agua residual pudiera acceder al interior del electrodo y no se creara una zona muerta en este espacio. Esta estructura metálica sirvió tanto de colector de corriente como de soporte físico del material conductor biológicamente compatible. Se pegó un cable a este colector con una resina conductora, que después se aisló eléctricamente mediante una capa de resina aislante. El titanio se cubrió con una tela conductora de fibra de carbono Tafetán de 160 g/m2 y entrelazada con hebras de una densidad de 3.000 hebras/cm de la marca Resinas Castro. El volumen interior de la estructura fue de aproximadamente 30 cm3 y la superficie geométrica de cada uno de estos electrodos fue de 2400 cm2 contando con las dos caras de la tela de fibra de carbono. Para el cálculo de la superficie no se ha tenido en cuenta la superficie individual de las fibras puesto que éstas se encuentran entrelazadas. El contralectrodo consistió en un electrodo formado por dos láminas de fieltro de carbono de 80 cm2 soportadas en una estructura de titanio con forma de “T”, y realizada a partir del mismo material que en el electrodo de trabajo. La parte inferior de las dos láminas se mantuvo separada por un trozo de plástico común. La conexión del cable se realizó de idéntica manera que en el electrodo de trabajo. El electrodo de referencia utilizado en cada reactor fue uno de Ag/Cl (+200 mV frente a electrodo de referencia de H2) de la marca HANNA. Se colocó junto al electrodo de trabajo puesto que se fijó el potencial de este último. 9

Sistema de alimentación Durante la fase de alimentación en continuo, los reactores recibían un flujo constante de medio de cultivo. Al utilizarse dos medios distintos para los tres reactores se ideó un sistema con dos bidones de 10 y 25 litros(el de menor volumen para el medio mínimo Fresh Water (ver medios) para el reactor R2, y el mayor para el agua residual sintética para los reactores R1 y R3). Los bidones se conservaban en una nevera a 5ºC junto al reactor, y el medio era bombeado mediante una bomba peristáltica multicanal con flujo regulable Watson & Marlow 205S. 3.2 Equipos Para la monitorización del sistema, así como para el análisis de los efluentes se utilizaron los equipos que figuran en la tabla 1. Tabla 1: Equipos empleados a lo largo de toda la experimentación. Equipo

Características

Medida

Multímetro multicanal

Keithley 2700

Potencial electrodos, corriente

Potenciostato

Nanoelectra 1.0

Polarización de electrodos

Potenciostato

µAutolab tipo III

Voltametrías cíclicas

Bruker 430 G-C

Ácidos grasos volátiles en efluentes.

Cromatografo FID

Columna: Agilent 20-160 Varian 3350 Columna Porapack N/80/100

Metano, CO2 e hidrógeno en los reactores.

Bomba multicanal

Watson-Marlow 205S

Alimentación de los reactores

Espectrofotómetro

Spectroquant Nova 60

Determinación de la DQO

pH-metro portátil multifunción

CRISON

pH, temperatura

Cromatógrafo de gases

3.3 Medios de cultivo e inóculos. . 10

Medios de cultivo Los reactores R1 y R3 fueron alimentados con agua residual sintética, formulada sobre una modificación de la norma alemana DIN-38412-26 (tabla 1), el reactor R2 fue alimentado con medio mínimo Fresh Water Medium, (FWM, por sus siglas en inglés) (tabla 2). Durante la operación de este reactor en modo discontinuo este medio contenía una concentración de 80 mM de fumarato, con la finalidad de cultivar el microorganismo Geobacter dentro del reactor. Posteriormente, mediante la adición de un donador de electrones en exceso (acetato), se estimuló la adhesión de Geobacter al electrodo. En ambos medios se ajustó el contenido de materia orgánica para que la DQO fuera de aproximadamente 500 mg O2/l. Tras su preparación, ambos medio se esterilizaron en un autoclave y se conservaron refrigerados hasta su posterior uso. El influente de los reactores era ajustado a un pH de 7 mediante la adición de NaOH 1m o HCl 1M. Debido a la tendencia a la basificación del reactor R2, este medio se tamponó con una concentración de 50 mM de buffer fosfato.

Tabla 2: Composición de medio mínimo Fresh Water Medium

NaHCO3 NH4Cl NaH2PO4·2H2O KCl Stock Vitaminas (Tabla 4) Stock Mineral (Tabla 3) Acetato Buffer Fosfato

FWM 2,5 g/l 0,5 g/l 0,41 g/l 0,1 g/l 10ml/l (tabla X.X.X) 10ml/l(tabla X.X.Y) 4,8 g/l 50 mM

Tabla 2: Composición de medio de agua residual sintética.

Peptona Urea NaCl

ARS (DIN-38412-26 mod.) 0,16 g/l 0,03 g/l 0,007 g/l 11

CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O K2HPO4 Na2CO3 Glucosa

0,004 g/l 0,002 g/l 0,028 g/l 0,02 g/l 0,3 g/l

Tabla 4: Composición por litro de stock mineral NTA (forma ácida)

1,5 g

MgSO4-7H2O

3,0 g

MnSO4-H2O

0,5 g

NaCl

1,0 g

FeSO4-7H2O

0,1g

CaCl2-2H2O

0,1g

CoCl2-6H2O

0,1g

ZnCl

0,13g

CuSO4-5H2O

0,01 g

AlK(SO4)2-12H2O

0,01 g

H3BO3

0,01 g

Na2MoO4

0,025 g

NiCl2-6H2O

0,024 g

Na2WO4-2H2O

0,025 g

Tabla 5: Composición del stock de vitaminas por litro. Biotina

2 mg

Ácido fólico

2 mg

Piridoxina-H2O

10 mg

Riboflavina

5 mg

Tiamina

5 mg

Niacina

5 mg

Ácido pantoténico

5 mg

Cianocobalamina

0,1 mg

Ácido p-aminobenzoico

5 mg

Ácido Tióctico

5 mg

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Inóculos El reactor R2 fue inoculado con 25 ml de cultivo puro de la cepa DL1 de Geobacter sulfurreducens. El cultivo se preparó en una botella llevada a anaerobiosis con una mezcla de gas N2/CO2 (80:20) con medio FWM estéril con 20 mM de acetato y 50 mM de fumarato y fue inoculado en R2 en la fase estacionaria (tras 7 días de crecimiento). En R1 y R3 se inocularon en cada uno 100 ml de la biomasa sedimentada de un reactor anaerobio de tratamiento de aguas residuales obtenida de la estación experimental de tratamiento de aguas de la fundación CENTA en Carrión de los Céspedes (Sevilla). 3.4 Metodología Protocolo experimental Previamente a la inoculación de los reactores, se realizaron las conexiones de todos los electrodos a los potenciostatos y se configuró el sistema de almacenamiento de datos en el multímetro Keithley. Inicialmente se realizaron controles abióticos empleando diversas técnicas electroquímicas, como la voltametría cíclica, para estudiar la posible presencia de procesos redox externos al metabolismo bacteriano electrógeno. Los tres reactores se inocularon el mismo día, en un intervalo de una hora, con el sistema de electrodos de R2 y R3 ya conectado. En el momento de la inoculación, el medio de los reactores se encontraba en anaerobiosos debido a un burbujeo previo del mismo con gas nitrógeno. Tras operar el sistema durante 28 días en modo discontinuo y observarse una reducción de la materia orgánica en su interior acoplada a una producción de corriente en R1 y R2, se procedió a alimentar el sistema en modo continuo, empleándose una bomba peristáltica para ello. Dicha bomba fue calibrada con el fin de operar los reactores con un tiempo de retención de 5 días. El caudal se controlaba diariamente a través del volumen de los efluentes. Tras un mes en continuo se comenzó a estudiar la composición gaseosa de la parte aérea del reactor, para lo cual se extrajeron cada dos días dos muestras

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de 200 µl de mezcla de gases, que eran inmediatamente analizadas mediante cromatografía. Protocolos analíticos -Toma de muestras: Durante la operación en modo discontinuo, se tomaron dos muestras diarias de cada reactor, de 5 ml cada una, pinchando con una aguja de 15 cm a través de la cubierta de silicona del reactor, manteniendo la aguja a 1 cm de la zona de salida del efluente. Al operar las muestras en modo continuo las muestras se obtenían de la salida de los efluentes. Todas las muestras fueron filtradas con un filtro de 0,22 µm y se conservaron congeladas a -18ºC hasta su posterior análisis. Durante todo el experimento se tomaron datos de diferencia de potencial, cada 10 minutos, de los reactores R1 y R2, mientras que del reactor control se tomaban datos de potencial de circuito abierto. Parámetros medidos -Variables electroquímicas: Se realizaron voltametrías cíclicas. Durante toda la fase de experimentación se obtuvieron datos cada 10 minutos de un multímetro con software dedicado. Se extrajeron datos de diferencia de potencial entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia, corriente producida en cada sistema de electrodos conectado ( a través de la diferencia de potencial entre una resistencia de 1 Ω conectada en serie en el electrodo de trabajo). A partir de los datos de corriente obtenidos con el tiempo se calculó la carga total diaria procedente de la oxidación electrogénica de la materia orgánica. Conociéndose la reducción de DQO, y los moles de electrones asociados a la oxidación de dicha DQO, se obtiene la carga eléctrica total. Si se compara la carga total procedente de la oxidación, con la corriente obtenida es posible obtener la carga procedente de oxdación electrogénica. -Variables químicas: El pH se controló diariamente mediante un peachímetro portátil. La medida sobre la muestra se realizaba inmediatamente después de ser extraída. El equipo se calibraba previamente a la medición, que se realizaba por triplicado, y de la que se extraía una media.

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La DQO se midió mediante el método del dicromato de potasio. La oxidación de las muestras en medio ácido en presencia de mercurio, provoca la reducción del dicromato a Cr3+, que produce un cambio mensurable de color. La reacción con el dicromato se mantiene durante 45 minutos en ebullición y las medidas se realizan en frío mediante un espectrofotómetro Spectroquant equipado con detector de absorbancia. El propio instrumento transforma los datos de absorbancia en valores de DQO (mg/l) a través de su software interno. Los ácidos grasos volátiles se cuantificaron mediante cromatógrafo de gases (FID) Bruker 430 G-C (ver Tabla 1).. Las muestras se ionizaron mediante la adición de 0,2 ml de ácido málico 0,01M por cada 1 ml de muestra en un vial de vidrio. La composición de la parte aérea del reactor se midió en un cromatógrafo de gases Varian indicado en la sección de equipos. En cada medida se extrajeron dos muestras de cada reactor con una jeringa de vidrio previamente homogeneizada con el gas del interior de cada reactor. Se inyectaron 200 µl de cada muestra en el cromatógrafo. El equipo se calibró previamente mediante la realización de una recta de calibrado con una mezcla de gases patrón. Este método permitió detectar hidrógeno y metano. -Variables físicas: Se controló el tiempo de retención de los reactores durante la operación en continuo mediante la medida con una probeta de 25 ml del caudal de salida de los reactores en función del tiempo. En virtud de los resultados, la bomba se ajustaba diariamente. 4 Resultados 4.1 Etapa 1: Modo de operación discontinuo Producción de corriente Tras inocular los reactores, éstos permanecieron durante 21 días sin recibir aporte alguno de materia orgánica más que la que ya contenía el medio con el que se llenaron. Durante ésta fase se observó un comportamiento distinto entre los tres reactores. El sistema R3, al estar en circuito abierto no 15

pudo ser estudiado desde el punto de vista electroquímico En el reactor R1, inoculado con aguas residuales, se produjo flujo eléctrico desde el primer día del experimento, alcanzando el máximo (90 mA) en el día 10. Los valores de corriente negativa que se observan en la Figura 3 son debidos a un error en la polarización de los electrodos y que produjo que el electrodo de trabajo funcionara como cátodo. El reactor R2, inoculado con Geobacter, no produjo corriente durante los primeros 10 días, tras los cuales se observó un crecimiento exponencial de este parámetro hasta alcanzar un máximo de 230 mA pasados 15 días. Es interesante comparar este crecimiento de la corriente con el de un cultivo bacteriano típico, ya que en ambas curvas se pueden diferenciar la fase de latencia, la fase exponencial, la fase estacionaria y la de muerte celular.

Figura 3: Intensidad de corriente en ambos reactores durante la fase en batch.

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Análisis de la materia orgánica en el efluente Se observó en R3 y R1 una capacidad inmediata de degradación de materia orgánica en términos de DQO. Entre los días 0 y 6 del experimento, R1 redujo la DQO en 213 mg O2/l, aproximadamente un 35% de la inicial. Si se integra la corriente producida en este periodo se obtienen 1400 culombios, lo que equivale a 0,015 moles de electrones. De esto se deduce que el electrodo de trabajo redujo la DQO en 11,6 mg O2/l. Por lo que aproximadamente un 5,4% de la DQO fue eliminada por la vía electrogénica. Durante el mismo periodo de tiempo, R3, inoculado con el mismo lodo que R1 pero el sistema de electrodos en circuito abierto, eliminó 117 mg O2/l. Es decir, menos de un 20% de la DQO inicial. Pese a que apenas un 5,4% de la DQO fue eliminada en R1 por vía electrogénica, es posible que la sola presencia de los electrodos polarizados favorezca el proceso de degradación de materia orgánica, por ejemplo, estimulando el metabolismo de las diferentes comunidades bacterianas y permitiendo una transferencia de metabolitos entre ellas facilitada por la presencia de un material conductor polarizado. En R2 se observó también un descenso en la cantidad de materia orgánica disuelta pasados varios días, aún sin observarse producción alguna de electricidad. Esto puede deberse a la presencia en el medio de fumarato, añadido para potenciar el crecimiento del cultivo de Geobacter en su primera fase. El fumarato es un aceptor de electrones para la bacteria y por tanto un competidor para el electrodo, El inicio de la producción de electricidad en el reactor R2 fue probablemente debido al agotamiento de fumarato en el medio y a la adaptación del microorganismos a la respiración del electrodo.

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DQO fase batch 1600

DQO (mg O2/l)

1400 1200 1000 800

R1

600

R2

400

R3

200 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tiempo en días desde inóculo

Figura 4: Variación de la DQO en los tres reactores durante la fase Batch

4.2 Etapa 2: Modo de operación continuo Producción de corriente En el decimoséptimo día del experimento se comenzaron a alimentar los reactores de forma continua. Con el comienzo de la alimentación en continuo se observó un descenso en la corriente producida en R2 y R3, y que

Comentario [U1]: Esto ya lo pones en el protocolo experimental

posiblemente fue debido a la introducción de oxígeno en el sistema con el flujo de alimentación Este compuesto pudo resultar tóxico para los organismos anaerobios presentes en los reactores, o bien simplemente actuó como aceptor de electrones para los microorganismos. Durante los primeros días de la fase de alimentación en continuo ocurrieron varias paradas accidentales de la alimentación, que repercutieron en la corriente producida. Asímismo, entre los días 16 y 43 del experimento se obtuvieron valores anómalos en la corriente producida por el reactor 3. Tras una inspección en las conexiones de los electrodos se encontró una conexión defectuosa entre el cable y el electrodo de trabajo. Tras subsanarse el problema, los valores obtenidos resultaron menos variables y más estables.

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Comentario [U2]: El oxígeno se reduce fácilmente en el electrodo (por debajo de potenciales de 0.6 V). Pero si hay reducción, tienes que ver una corriente negativa. Si la corriente es positiva, solo hay procesos de oxidación., ya que la corriente va solo en una dirección u en otra, no en dos sentido.

Producción de corriente en R1 (modo continuo)

Corriente (mA)

100 80 60 40 20 0 23 26 29 32 35 38 41 44 47 50 53 56 59 62 65 68 71 74 77 80 83 86 Tiempo (días)

Figura 5: Producción de corriente en R3 en modo continuo.

La corriente producida en R2 aumentó de manera exponencial tras el descenso producido al iniciar la etapa en modo continuo. Durante los primeros 30 días de la fase de alimentación en continuo los valores de corriente mostraron ciclos de subidas y bajadas en este sistema. En los picos más altos se llegaron a alcanzar valores de hasta 420 mA, que en densidad de corriente suponen 1,75 A/m2. Los descensos en la producción eléctrica coincidieron con la preparación de nuevo medio de cultivo, y por lo general coinciden con procesos de basificación del medio. El rango de pH para el crecimiento de Geobacter se encuentra entre 6,2 y 7,4 por lo que resulta fundamental su monitorización. El pH se controló diariamente y pronto se observaron aumentos en el pH de R2. Dicho fenómeno no se dio en ninguno de los otros reactores. El día 28 del experimento alcanzó un valor de 8,5 tras lo cual se ajustó a 7 mediante la adición de ácido clorhídrico al medio del reactor. Pese al ajuste, el reactor volvía a tender basificarse por lo que finalmente se tamponó el medio de alimentación mediante la adición de 50 mM de buffer fosfato. Pese a que las reacciones de oxidación que tienen lugar en el electrodo de trabajo producen protones, es probable que tuvieran más peso las reacciones de reducción en el contraelectrodo y en el propio medio (producción de iones hidroxilo). 19

Figura 6:Producción de corrientede corriente en R2 en modo conitnuo

Figura 7: Variación de pH en R2 en modo continuo.

Análisis de la materia orgánica en el efluente Se analizaron cuantitativamente los ácidos grasos volátiles presentes en los efluentes de los reactores. En R1 se destacó la presencia de ácido fórmico en concentraciones bastante superiores a la del resto de AGVs (figuras 8 y 9). En este reactor el fórmico se presentaba, por lo general, en concentraciones de entre 1 y 4 mM, mientras el resto de ácidos se mantuvieron por debajo de 1 mM. La presencia de ácidos más largos que el propiónico resultó prácticamente 20

indetectable en la mayor parte de las muestras en este sistema. Sólo se detectaron ácido butírico e isovalérico en muestras aisladas. La presencia de fórmico, acético y propiónico se detectó en la mayoría de muestras.

Concentración ácido fórmico R1 7

Concentración (mM)

6 5 4 3 2 1 0 20

30

40

50

60

70

80

Tiempo (días) Figura 8: Concentraciones de ácido fórmico en el efluente del reactor 1 entre los días 20 y 80 de alimentación continua.

AGV en R1 Concentración (mM)

0,7

0,6 0,5 0,4

Á. Acético

0,3

Á. Propiónico

0,2

Á. Butírico

0,1

Á. Isovalérico

0

20

30

40

50

60

70

80

Tiempo (días) Figura 9: Concentración de ácidos acético, propiónico, butírico e isovalérico en el efluente del reactor 1 entre los días 20 y 80 de alimentación continua.

21

En el sistema R2, apenas detectó otro ácido que no fuera ácido acético como era de esperar debido a que el medio de cultivo contenía como fuente de carbono y donador de electrones únicamente acetato (figura 10). Se detectó en cantidades traza, y de forma aislada, ácido fórmico, propiónico, e isovalérico. El acético se mantuvo en valores aproximados de entre 1 y 2 mM durante las fases de muestreo.

AGV en R2

Concentración (mM)

5 4

Á. Acético

3

Á. Fórmico

2

Á. Propiónico

1

Á. Isovalérico

0 20

30

40

50

60

70

80

Tiempo (tiempo)

Figura 10: Concentración de ácidos grasos volátiles en el reactor 2.

El sistema R3, por su parte, mostró una mayor heterogeneidad en los ácidos detectados, aunque destacó la alta concentración de ácido fórmico también (entre 2 y 4 Mm). Se encontró una mayor variedad de ácidos en el efluente, además del ácido acético, ácido fórmico, butírico y propiónico, también se detectaron los ácido isobutírico y valérico (compuestos de cadena más larga) a diferencia de en los otros dos sistemas electrogénicos (Figura 11) El ácido acético se encontró en concentraciones de 1 mM aproximadamente, y el propiónico se detectó en la mayoría de las muestras. Si comparamos los compuestos encontrados en el efluente de R3 con respecto a los detectados en el efluente de R1, los AGV se encuentran en mayor cantidad y además se detectan ácidos de cadena más larga en el reactor con los electrodos no polarizados. El SBE R3 ha sido capaz de oxidar hasta sustancias más sencillas la materia orgánica alimentada.

22

Ácidos grasos volátiles en R3 Concentración mM

10 8

Á. Acético

6

Á. Fórmico

4

Á. Propiónico

2

Á. Isobutírico

0

Á. Butírico 45

50

55

60

65

70

75

Á. Isovalérico

Tiempo en días desde el inicio del experimento

Figura 11: Concentración de ácidos grasos volátiles en el reactor R3.

La capacidad de degradación de DQO se midió en todos los reactores durante esta fase. Pese a la variabilidad de medios entre R1/R3 y R2, la eliminación de DQO fue similar en todos los reactores, tendiendo a aumentar en todos con el tiempo y alcanzando el estado estacionario alrededor del día 50 (Figura 12). La eliminación de la DQO se sitúo, en estado estacionario entre un 70 y un 80% en todos los reactores.

Porcentaje de DQO eliminada en los tres reactores

100%

%DQO eliminada

80% 60% 40% 20% 0% 21 26 31 35 40 45 52 55 60 63 68 74 81 84 89 94 97 102

Tiempo (días) Eliminación DQO R1

Eliminación DQO R2

Figura 12: Porcentaje de la DQO eliminada en todos los reactores.

23

Eliminación DQO R3

En lo que respecta a la oxidación de materia orgánica acoplada a la producción de corriente, los valores obtenidos son variables, especialmente en R2. Esto puede ser debido a que estamos trabajando con un cultivo puro y su sensibilidad será mayor que la de un cultivo mixto a cualquier perturbación del sistema (Figura 12). Estos valores se calcularon a partir de la conversión de la cantidad de electrones obtenidos diariamente y procedentes de la oxidación de materia orgánica a moléculas de oxígeno equivalentes capaces de oxidar esa materia orgánica. Esta concentración de oxígeno se convirtió en unidades de DQO (mg/l O2) que, al dividirla entre la DQO de cada influente, se obtiene el porcentaje de DQO eliminada mediante el proceso de electrogénesis microbiana. En R1 la tendencia de este parámetro fue decreciente, indicando que posiblemente se estuvieran favoreciendo en el sistema otros procesos biológicos no dependientes de la respiración de los electrodos, como por ejemplo, la metanogénesis. En el reactor R2, que operaba con acetato como fuente de electrones y con un inóculo de Geobacter (microorganismo modelo en el fenómeno interaccion bacteria-electrodo), se obtuvieron valores mayores de actividad electrogénica.

%DQO eliminada

Porcentaje de DQO eliminada a través del electrodo 60 50 40 30 20 10 0

R1 R2 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 Tiempo (días)

Figura 12: Porcentaje de DQO eliminada electrogénicamente.

Análisis de gases Durante la fase de operación en continuo también se midió la concentración de subproductos gaseosos como el metano, el dióxido de carbono o el hidrógeno.Las medidas analíticas en los tres sistemas muestran una producción de hidrógeno y metano que indican una presencia de bacterias 24

metanogénicas en el medio. Parte de este hidrógeno puede provenir del metabolismo de las bacterias anaerobias (mediado o no por el cátodo) y parte de los procesos de reducción puramente electroquímicos que tienen lugar en el cátodo (contraelectrodo). En el sistema R1, las cantidades de hidrógeno medidas se hallaron en concentraciones de entre 0,1 y 0,5 mmoles por litro de aire a presión atmosférica (Figura 13). El volumen de aire en cada reactor era de aproximadamente 1,5 litros. El metano se halló en concentraciones inferiores, entre 0,07 y 0,2 mmoles por litro de aire.

Concentración (mM)

Gases en R1 0,5 0,4 0,3 0,2

mMol H2

0,1

mMol CH4

0 68

69

70

71

72

73

74

75

84

87

89

94

95

Tiempo (días)

Figura 13: Concentración de gases en el reactor R1

En el reactor R2 el metano se mantuvo por debajo de 0,1 mmol durante todo el periodo de experimentación, y el hidrógeno producido fue algo mayor que en R1, aunque su evolución fue inestable. Se En R3 la cantidad de metano producidoes ligeramente mayor que en los otros dos sistemas, lo cual puede deberse a una mayor actividad de bacterias metanogénicas. La tendencia durante los últimos 10 días de operación de este sistema fue ascendente en cuanto a producción de metano se refiere. No se pudieron obtener suficientes medidas válidas de hidrógeno como para apreciarse diferencias entre los tres reactores (Figura 14)

25

Concnetración (mM)

Gases en R2 0,5 0,4 0,3 0,2

mMol H2

0,1

mMol CH4

0 68

69

70

71

72

73

74

75

84

87

89

94

95

Tiempo (días) Figura 14: Concentración de gases en el reactor R2.

Concentración (mMol)

Gases en R3 0,6 0,5 0,4 0,3

mMol H2

0,2

mMol CH4

0,1 0 68

69

70

71

72

73

74

75

84

87

89

94

95

Tiempo (días) Figura 13: Concentración de gases en el reactor R3.

4.3 Etapa 3: Operación de R2 como etapa secundaria de un proceso de depuración de aguas En el día 93 del experimento en continuo se comenzó a alimentar el efluente de R1 como influente en R2, con el fin de evaluar la capacidad de Geobacter de oxidar los compuestos orgánicos más simples procedentes de una primera etapa de depuración anaerobia electrogénica. Los datos muestran que las bacterias presentes en el reactor R2 (asumimos que ya no se trata de un cultivo puro) fueron capaces de aprovechar esa materia orgánica degradada, como ácido fórmico, propionato o acetato.

26

DQO en R2 alimentado con efluente de R3 350

DQO (mgO2/l)

300 250 200 150

DQO entrada

100

DQO salida

50 0 112 115 116 117 118 119 122 123 124 125 126 129 130 131 Tiempo (días)

Figura 14: Variación de la DQO con el tiempo en el reactor de Geobacter alimentado con el efluente de R1. Se empieza a alimentar con efluente en t=114 .

Durante esta fase del experimento, la producción de electricidad se redujo notablemente al hacerlo también la carga orgánica alimentada en este reactor. Si durante la mayor parte del experimento en continuo, el reactor había mostrado valores de intensidad eléctrica de entre 50 y 200 mA, tras el cambio de alimentación estos valores se situaron en torno a 7 mA.

Corriente en R2 antes y después de la etapa 3 de experimentación 120

Corriente (mA)

100 80 60 40 20

0 103 105 107 109 111 113 115 117 119 121 123 125 127 129 131 133 135 Tiempo (días)

Figura 15: Producción de corriente antes y después de alimentar el reactor con el efluente de R1. La línea roja indica el momento del cambio.

27

Discusión Al principio de este trabajo se pusieron en cuestión diversas hipótesis acerca de las celdas de combustible microbianas y sus posibles aplicaciones en el tratamiento de aguas residuales. En e presente estudio se han generado una gran variedad de resultados, pero su análisis arrojan puntos inconcluyentes que dificultan establecer conclusiones. La presencia de microrganismos electrogénicos en aguas residuales se trató de estimular mediante el control de la diferencia de potencial entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia La polarización de los electrodos no produjo diferencias significativas en la cantidad de materia orgánica degradada en términos de DQO, ya que los datos obtenidos al respecto resultan similares en los reactores 1 y 3. Al operar inicialmente en modo continuo sí que se apreció una ligera diferencia en cuanto a eliminación de DQO se refiere entre el sistema R1 con operando en modo electrolítico, y el sistema R3 operando en circuito abierto. A lo largo de la operación de los tres sistemas en modo continuo, la variabilidad de los datos de DQO de los efluentes ha sido notable debido a diversas perturbaciones que tuvieron lugar sobre los sistemas (uno de los electrodos de R1 no estuvo completamente conectado, hubo que sustituir un electrodo de referencia en R2, cortes de luz en el laboratorio, la interrupción de la alimentación, detención del sistema que generaba los datos de corriente producida). A pesar de ello, no se han observado diferencias significativas en la eliminación de DQO de los tres sistemas al operarse en modo continuo. Sí que se observan diferencias en los ácidos encontrados en los efluentes de R1 y R3. Se ha visto que el sistema R1 ha sido capaz de oxidar hasta compuestos más simples la materia orgánica alimentada al encontrar solamente ácido fórmico, acético y,propiónico en las muestras de efluente. En cambio, en el sistema operando en circuito abierto, se han encontrado ácidos de cadena más larga (valérico, isobutírico) y, los de cadena más corta, en cantidades mayores, especialmente el acetato. Es definitiva, el sistema con electrodos polarizaros no ha eliminado una mayor 28

cantidad de materia orgánica pero si lo ha llevado este proceso de oxidación a estados más avanzados. En cuanto a las medidas de gases obtenidas, se detectado una ligera mayor producción de metano en R3 que en R1. Es decir, que la actividad metanogénica ha sido mayor en el sistema funcionando con los electrodos en circuito abierto. Como era de esperar al trabajar con un microorganismos especialista en el proceso de transferencia de electrones a un sólido conductor, el reactor R2 produjo corrientes notablemente mayores al alimentar la misma carga orgánica que en R1 y R3, y además, carga orgánica de estructura más simple (acetato). La degradación de acetato electrogénica en R2 fue baja: menor del 10 % de media, y con picos del 20 y 30 %. Esto es debido a la operación en condiciones no estériles y por tanto la proliferación de otros microorganismos capaces de degradar acetato, como los metanogénicos. El análisis de gases de este sistema ha confirmado la presencia de estos microorganismos. En la etapa 3 se ha observado la capacidad de Geobacter de asimilar materia orgánica muy degrada, incluso en concentraciones muy reducidas. Otros autores (Lovley, 2011) (Lovley, 2011) (Lovley, 2011) estudiaron la capacidad de Geobacter y otras especies de aprovechar metabolitos procedentes de fermentación, como el ácido fórmico, acético o acetato. En nuestro caso no se han cuantificado los compuestos degradados por el reactor R2 en esta última etapa. Con el fin de profundizar en este tema, sería recomendable realizar nuevos experimentos en los que se analicen cualitativa y cuantitativamente todos los metabolitos presentes a la entrada y a la salida de ambos reactores. Sería interesante realizar el mismo estudio operando en paralelo un reactor sin ningún tipo de material conductor en su interior con el fin de observar si, polarizado o no, la presencia de este material es capaz de estimular per se la degradación de materia orgánica y de oxidarla a compuestos de cadena corta. En varios estudios se ha especulado sobre la capacidad de diversas especies de transferirse electrones y/o metabolitos de forma directa entre ellas, y sobre el efecto estimulador que tiene en este fenómeno la presencia de un electrodo en el medio (Lovley, 2011). Por ello, 29

queda la duda de si la ausencia de diferencias en capacidad depurativa en R1 y R3 es debida a que en ambos sistemas existe un efecto estimulador de los electrodos sobre el metabolismo microbiano, o, por el contrario,es debida a que la electrogénesis microbiana no ha sido favorecida en las condiciones bajo las que se ha operado. Conclusiones A continuación se resumen las conclusiones que se pueden extraer del presente estudio: -

Los reactores R1 y R3, ambos con presencia de material conductor

eliminaron de forma efectiva la materia orgánica del sistema -

La presencia de electrodos polarizados no afectó a la eliminación de

DQO al alimentar agua residual sintética en un reactor operado con un cultivo mixto. -

La polarización de los electrodos en un sistema alimentado con agua

residual sintética fue capaz de oxidar hasta compuestos más sencillos la materia orgánica alimentada en el sistema. -

Manteniendo la misma configuración de reactor que R1 y R3, el sistema

operado con el cultivo puro Geobacter y alimentado con acetato fue capaz de acoplar la oxidación de este sustrato a la producción de corriente, y depurar de forma efectiva el influente alimentado. -

El reactor R3 inoculado con Geobacter y alimentado inicialmente con

acetato fue capaz de utilizar los productos finales de fermentación de un tratamiento anaerobio electrogénico inicial para producir electricidad y reducir así el contenido de materia orgánica del influente. Por ello, existe la posibilidad de utilizar un reactor inoculado con Geobacter como una segunda etapa en el tratamiento de aguas residuales con influentes con bajas cargas orgánicas y compuestos sencillos Agradecimientos No quisiera finalizar este trabajo sin antes agradecer a todo el equipo del grupo de Bioelectrogénesis de la Universidad de Alcalá por todo su apoyo y asesoramiento durante la realización del experimento, y en especial a Sara 30

Tejedor, ingeniera química e investigadora predoctoral en tratamiento de aguas residuales con sistemas bioelectroquímicos. También a IMDEA-Agua por facilitar el uso de equipos analíticos.

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Real Decreto 1290/2012

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