Artículo original
Rev Med Vet (B Aires) 2014, 95 (2): 27 - 34
Obtención, caracterización y almacenamiento de matriz ósea desmineralizada
Santiago A. Audisio 1*, Pablo G. Vaquero 1, Perla A. Torres2, Edgardo C. Verna 1, Laura N. Ocampo 1, Valeria Ratusnu 3, Andrea L. Cristofolini 4, Cecilia I. Merkis 4 Cátedra Técnica y Patología Quirúrgica; 2Cátedra Química Biológica; Facultad de Ciencias Veterinarias; Universidad Nacional de La Pampa. Calle 5 y 116 (6360) Gral. Pico, La Pampa, Argentina. 3 Área Microscopía Electrónica, Facultad de Agronomía y Veterinarias, Universidad Nacional de Río Cuarto, Córdoba. 4 Sección Química Forense, División Criminalística, Policía de la Provincia de La Pampa. Aires. (CONICET). *Correo electrónico:
[email protected] 1
(Recibido: 14 de julio de 2014; Aceptado: 3 de marzo de 2015) "No existen conflictos de interés"
Palabras claves: hueso, matriz ósea desmineralizada, osteoinducción, osteoconducción.
Keywords: bone, demineralized osteoconduction, osteoinduction.
RESUMEN
SUMMARY
La matriz extracelular ósea posee propiedades osteoconductivas y osteoinductivas debido a la presencia de factores de crecimiento y señales de adhesión celular. Se procedió a estandarizar un protocolo modificado para obtener matriz ósea desmineralizada y a caracterizarla. Luego se procedió a caracterizar, esterilizar y corroborar las propiedades osteogénicas de la matriz desmineralizada. Se emplearon 8 diáfisis de conejos que fueron trituradas, lavadas, los lípidos extraídos, desmineralizadas con ácido clorhídrico y conservadas en alcohol hasta su uso. La caracterización de la matriz ósea desmineralizada se realizó mediante microscopía óptica y electrónica de barrido y se constató in vivo en 10 conejos (n=10) las condiciones osteoinductivas y osteoconductivas en modelos extraesquelético y ortopédico. La microscopía óptica y electrónica demostró que la matriz se hallaba conformada por colágeno y que conservaba la arquitectura histológica del hueso de procedencia. Las pruebas extraesquelética y ortopédica indicaron que la matriz obtenida fue capaz de generar hueso, exponiendo sus capacidades osteoconductivas y osteoinductivas. El protocolo empleado generó un producto que conserva cualidades osteogénicas, factible de ser esterilizado y preservado en alcohol sin sufrir alteraciones en sus propiedades biológicas.
Obtainment, characterization and storage of demineralized bone matrix. The extracelular bone matrix has osteoconductive and osteoinductive properties due to the presence of growth factors and cell adhesión signals. The authors have standardized a protocol to obtain demineralized bone matrix. The resulting product was characterized and sterilized, and its osteogenic properties were corroborated. Eight diaphysis of rabbits were ground and washed, the lipids were extracted and the bone was demineralized with hydrochloric acid and preserved in alcohol until it was used. The demineralized bone matrix was characterized by means of optical microscopy and electronic scanning and the in vivo preservation of the osteoinductive and osteoconductive properties were verified in 10 (n=10) rabbits. Optical and electronic microscopy showed that the matrix was formed by collagen and it had retained the histological architecture of the original bone. The extraskeletal and orthopedic tests showed that the obtained matrix was able to generate bone which made the osteoconductive and osteoinductive properties available. The protocol used resulted in a product which preserved the osteogenic qualities and which can be sterilized and preserved in alcohol without suffering alterations in its biological properties.
Introducción La matriz ósea desmineralizada (MOD) alogénica posee mayor propiedad osteoinductiva que los injertos óseos12, por este motivo es empleada para tratar fracturas y resolver no uniones, osteomielitis, grandes defectos ocasionados por razones traumáticas y remoción ósea como tratamiento de neoplasias10.
La matriz ósea está comprendida por dos fases, una inorgánica y otra orgánica. La fase inorgánica la conforman depósitos minerales de hidroxiapatita y representa el 65% del peso; en tanto la fase orgánica constituye el 25% del peso del hueso, y el 10% restante de la matriz es agua. El 95% de la fase orgánica está comprendida por colágeno tipo I y el 5% restante son proteínas no colágenas. Entre las proteínas no colágenas se
bone
matrix,
encuentran las proteínas morfogénicas del hueso (BMP por su sigla en inglés), osteocalcina, ostepontina y osteonectina1,2,3,11,20. Estas proteínas le confieren a la MOD propiedades osteoinductivas de diferenciación de células mesenquimáticas en osteoblastos, y osteoconductivas, ejerciendo quimiotaxis sobre los osteoblastos del hueso hospedador hacia la MOD13. 27
El proceso de desmineralización de la matriz provoca ligera alteración de la arquitectura ósea4, a la vez expone a los factores de crecimiento a las células precursoras de los osteoblastos5,21,28 y disminuye las reacciones inmunogénicas al destruir los antígenos de superficie11. Por esta razón, cuando la MOD es comparada con otros tipos de injertos y materiales sustitutos de hueso, posee mayor capacidad osteoinductiva 7,17,28. Por sus propiedades biológicas osteoinductivas y osteoconductivas, la MOD es empleada en cirugía ortopédica, odontológica, craneofacial y de columna1,3,15,28. Conserva la organización del tejido original que le otorga el contenido de colágeno tipo I que se comporta como un elemento de sostén biológico a las células precursoras de los osteoblastos a pesar de la pérdida de fuerza estructural que aporta la fase mineral preexistente14. La capacidad osteoinductiva de la MOD varía con la edad, las condiciones fisiológicas, el estado farmacológico del donante y con las condiciones relacionadas con los protocolos de procesamiento y esterilización. El objetivo del presente trabajo consistió en obtener MOD empleando un protocolo modificado, establecer las características del producto obtenido y corroborar la preservación de las propiedades biológicas de osteoinducción y osteoconducción.
Materiales y métodos Obtención de MOD Se emplearon diáfisis de huesos de conejos procedentes de frigorífico, a los que inmediatamente les fueron extraídos los fémures (n=4), las tibias (n=4) y los húmeros (n=4) en condiciones de asepsia. Las diáfisis fueron tratadas en un solo grupo, que incluyó remoción de los tejidos blandos, luego se lavaron con abundante agua destilada a 4ºC para prevenir la acción enzimática en los tejidos23. Las diáfisis se seccionaron en piezas de 5 a 10 mm y luego fueron fragmentadas en un molino de cuchillas a 20.000 rpm (Yellowline A10, IKA, Alemania) hasta obtener partículas de 100 a 750 µm. Al hueso triturado le fueron extraídos los lípidos sumergiéndolo en una solución de cloroformo:metanol en proporción 1:1 durante 12 horas, manteniendo una relación 1:30 de hueso:solución. El hueso fue lavado con agua destilada a 4ºC y luego fue sometido a la acción de una solución de ácido clorhídrico (HCl) 0,6N a razón de 25 meq/g de hueso durante 48 horas con agitación permanente a 4 ºC. La MOD obtenida se lavó con agua destilada hasta estabilizar el pH en 7,0 y conservada en
alcohol etílico 95º a 4ºC hasta su uso en proporción de 30 partes de alcohol por cada parte de matriz. La MOD obtenida se dividió en tres partes. A la primera le fueron determinados residuos lípidos, la segunda fue analizada mediante microscopía óptica, microscopía de alta resolución (MOAR) y electrónica de transmisión (SEM); y la tercera se empleó para comprobar las propiedades osteoinductivas y osteoconductivas. Determinación de residuos lipídicos La muestra de MOD fue suspendida en dicloremetano y luego centrifugada. Una fracción del centrifugado se analizó con cromatógrafo gaseoso con detector de masa (Shimadzu QP 2010, Japón) que emplea helio como gas carrier. Microscopía óptica y microscopía de alta resolución (MOAR) Para la microscopía óptica la muestra se deshidrató en una batería de etanol en concentraciones crecientes, luego se sumergió en xileno y embebió en parafina y resina sintética. Se realizaron cortes de 5 μm que fueron montados en portaobjetos de vidrio y teñidos con hematoxilina y eosina (HE). La muestra destinada a MOAR se procesó para microscopía electrónica de transmisión (SEM). Se utilizaron 10 cortes semifinos de 0,25 μm que fueron montados sobre un portaobjetos de vidrio y se tiñeron con azul de toluidina sobre platina termostatizada. Los cortes histológicos teñidos con HE y azul de toluidinia se observaron en un microscopio óptico Axiophot (Carl Zeiss, Alemania). La adquisición de las imágenes se realizó con una cámara digital Powershot G6 de 7.1 megapixels (Canon INC, Japón) adosada al microscopio óptico. Éstas se procesaron con el software AxioVision Release 4.6.3 (Carl Zeiss, Alemania). Microscopía óptica y electrónica de transmisión (SEM) La muestra se fijó con glutaraldehido al 2,5% y más tarde se procedió a deshidratarla con etanol en una serie de concentración creciente. Luego fue secada por punto crítico empleando dióxido de carbono (Denton Vacuum DCP1), fijada con cinta bifaz sobre soporte de aluminio y recubierta con oro Denton Vacuum DeskIV (22-24 nm de espesor). La muestra se examinó en un microscopio JEOL Modelo JSM 6480 LV SEM (Japón). La adquisición de imágenes y las mediciones morfométricas se realizaron con software original del equipo. Se procedió a colocar la primera muestra sobre un portaobjetos para observar las partículas en el microscopio óptico a pequeño aumento y establecer
sus
dimensiones
y
características.
Determinación de las propiedades biológicas de la MOD Las condiciones experimentales se realizaron en conformidad con las normas de ética de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Pampa. Se emplearon 10 conejos de la raza neozelandesa, sexualmente maduros, de 2,5 a 2,8 kg, los que fueron mantenidos en jaulas individuales, alimentados con una fórmula balanceada comercial y agua potable ad-libitum. Las condiciones de bienestar animal así como las condiciones experimentales de los animales fueron aprobadas por el Comité de Ética de la Universidad Nacional de Río Cuarto. Los animales se dividieron en grupo tratamiento (GT) n=8 y grupo control (GC) n=2 para proceder a realizar las intervenciones quirúrgicas. Los individuos fueron sedados y anestesiados con 1,5 mg/kg de xilacina y 40 mg/kg de ketamina IM, y uno de los miembros torácico y el pelviano ipsilateral se acondicionaron para ser intervenidos en condiciones de asepsia. En el miembro torácico se procedió al bloqueo nervioso del plexo braquial y se creó un defecto ortopédico de tamaño crítico en uno de los radios. Un defecto de tamaño crítico es aquel cuyas mínimas dimensiones impiden la reparación espontánea durante la vida del animal, su longitud mínima es 1,5 veces el diámetro del hueso24. Los defectos del GT se rellanaron con aproximadamente 50 mg de MOD, en tanto que los animales del GC no recibieron tratamiento. Los implantes intramusculares se realizaron en los mismos conejos y en el mismo acto quirúrgico. Se procedió a efectuar una incisión en la piel de la región del muslo. En el músculo bíceps femoral (m. biceps femoris) se efectuó un bolsillo por inciso punción con hoja de bisturí Nº 24 para mango Nº 4 que se rellenó con 100 mg de MOD. El músculo y la piel se suturaron con poligalactina. Luego de las intervenciones los animales recibieron terapia antiinflamatoria (ketoprofeno 0,1 mg/kg IM; Calmavet, Lab. Zoovet) y antibioticoterapia de amplio espectro (clorhidrato de oxitetraciclina, 50 mg totales IM) durante 3-5 días. Se tomaron radiografías empleando 60kVp y 10 mA a una distancia de foco de 40 cm y tiempo de exposición de 0,4 segundo. Se realizaron proyecciones látero-medial de los antebrazos intervenidos a los 7,15,30 y 60 días posquirúrgico y a los 30 días, de las regiones del muslo implantado. Se estableció que un defecto se encontraría reparado cuando éste se hallara ocupado por 28
hueso nuevo uniendo ambos extremos de la osteotomía. La observación de una imagen radiodensa en el sitio del implante extraesquelético sería considerada como positiva a la presencia de hueso nuevo.
Resultados Residuos lipídicos Los fragmentos de MOD analizados no poseían residuos de lípidos. Microscopía óptica y SEM El azul de toluidina tiñó de forma homogénea los cortes MOAR (Figura 1), en tanto los cortes teñidos con HE se mostraron eosinofílicos (Figura 2). En ambos tipos de cortes se identificaron los osteones y sus elementos constitutivos. Las observaciones realizadas con SEM mostraron que las partículas obtenidas poseían forma cuadrangular, y la dimensión media fue de 532,42 µm
(±181,14). En la superficie de las partículas se reconoció la disposición horizontal de los osteones, y en los cortes transversales se identificaron los conductos de Haver, que midieron 13,45 µm (±6,49), y las láminas concéntricas (lamelas), conteniendo las lagunas (lacunae) (Figura 3). Propiedades biológicas de la MOD Ninguno de los animales implantados mostró reacciones inflamatorias o complicaciones posoperatorias locales o sistémicas. Los conejos dieron apoyo a los miembros torácicos intervenidos de forma inmediata y hasta que concluyó el experimento. A los 7 días no se observaron cambios radiológicos en los extremos de los fragmentos óseos ni en el interior de los defectos. A los 15 días se apreció incremento de la radiodensidad de las corticales óseas relacionadas al
defecto y la presencia de una imagen compatible con hueso nuevo en cada extremo de las osteotomías, de forma triangular, orientada hacia el centro de los defectos. Hacia el día 30 se hallaban fusionadas entre sí y a la cortical inmediata de la ulna. A los 60 días (Figura 4), el defecto se encontraba completamente reparado. En los animales del GC los defectos no curaron y se pudo observar que en los extremos de las osteotomías se produjo reacción periostal. En los controles sucesivos los extremos de los fragmentos óseos se aguzaron y los bordes se suavizaron (Figura 5). Las radiografías tomadas de los miembros posteriores mostraron la presencia de una imagen radiodensa fusiforme en el sitio de implante compatible con hueso y en correspondencia con el sitio de implante (Figura 6).
Figura 1
Microfotografía de corte MOAR teñido con azul de toluidina. Se aprecia uniformidad de distribución de la tinción así como la presencia de conductos de Haver
29
Figura 2
Microfotografía de corte de una partícula de MOD teñida con HE a 40X. En la fotografía se aprecian los osteones conformados por los conductos de Haver y laminillas (flechas)
Figura 3
Microfotografía de SEM de una partícula de MOD con magnificación de 100X (recuadro superior izquierdo) y detalles de un osteón (flecha) observado a 700X 30
Figura 4
Controles radiológicos de los miembros intervenidos, efectuados a los 7, 15, 30 y 60 días
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Figura 5
Radiografía de un animal del GC en la que se observa el defecto sin reparar y los extremos aguzados del radio
Figura 6
Presencia de imagen radiodensa compatible con hueso extraesquelético en el sitio de implante de MOD en el m. bíceps femoral
Discusión Desde que Urist25 protocolizó por primera vez un procedimiento para obtener MOD, numerosos autores introdujeron diversas modificaciones. Éstas consistieron en cambios de temperatura a la que se realizan los procedimientos, utilización de diversos solventes para extraer lípidos, adición de enzimas inhibidoras de la colagenasa, uso de EDTA para acomplejar el calcio, sustitución de ácido clorhídrico por ácidos orgánicos y variaciones en la técnica de esterilización8,9,19,26. El protocolo comunicado no requirió
equipamiento de complejidad y demandó aproximadamente 36 horas en total. El proceso de extracción de lípidos se realizó luego de haber sometido a molienda al hueso con el fin de incrementar la superficie de exposición a los solventes. La ausencia de lípidos por cromatografía señala que el desgrasado fue eficaz. La selección de la concentración de HCl respondió a los cambios estructurales que éste provoca sobre la matriz en el proceso de desmineralización. A mayor concentración de ácido, más elevada es la tasa de desmineralización pero con alteraciones en la estructura de la
matriz. Los cambios que se registran son aumento del tamaño y cantidad de poros y contracción del colágeno debido a los espacios que deja la hidroxiapatita4. Los resultados positivos obtenidos en los desafíos biológicos efectuados sugieren que la MOD obtenida ofrece a las células osteoprogenitoras un medio que conjuga similitud morfológica, sumada a las señales adhesivas que brindan el colágeno tipo I, fibronectina y vitronectina22, y la exposición a las proteínas morfogénicas del hueso. La MOD pierde sus capacidades de osteoinducción y osteoconducción cuando es esterilizada en autoclave, 32
en tanto que se preservan cuando es esterilizada mediante radiación gamma, óxido de etileno y alcohol etílico8. A bajas dosis, la radiación gamma no afecta las propiedades biológicas, pero exacerba la actividad osteoclástica27. La esterilización de la MOD del experimento se realizó empleando alcohol etílico 95º y además constituyó el medio de conservación durante 30 días desde la obtención hasta el uso en los miembros. La MOD liofilizada y conservada durante 5 semanas a 65 ºC pierde el 90% de las propiedades osteogénicas9. Los resultados obtenidos en las pruebas biológicas sugieren que el alcohol etílico constituyó un medio eficaz y económico no sólo para esterilizar a la MOD, sino también para conservarla. Los protocolos de obtención de MOD parcialmente desmineralizada generan imágenes de radiodensidad variable18. La MOD aquí comunicada fue radiolúcida en los controles posquirúrgicos
inmediatos. Esta condición fue una ventaja para realizar evaluaciones radiológicas posquirúrgicas mediante constatación del progreso de la reparación y cuantificar la evolución mediante la mineralización del hueso nuevo que rellena los defectos. La MOD preparada para el experimento conservó sus propiedades osteoinductivas y osteoconductivas. La presencia de imágenes radiodensas en muslo evidencia las condiciones osteoinductivas y osteoconductivas. Los biomateriales sustitutos de hueso deben brindar un marco tridimensional viable, susceptible de ser colonizado por vasos sanguíneos nuevos y células osteoprogenitoras, ser osteoinductivo y tener integridad estructural6,16. Los resultados biológicos informados sugieren que la MOD reúne todas las condiciones a excepción de la integridad estructural. La ausencia de integridad estructural quedará sujeta al empleo
de medios adecuados de estabilización ortopédica cuando sea utilizada en la clínica. En el modelo empleado la ulna fue el elemento que brindó estabilidad al radio. Las evidencias radiológicas demostraron que los defectos ortopédicos se hallaban totalmente rellenos de hueso nuevo al cabo de 60 días, superando ampliamente el parámetro de Lane et al14, quienes consideran que un defecto ortopédico se halla curado cuando el hueso nuevo ocupa más del 25% del volumen del defecto.
Conclusión Los autores obtuvieron, mediante el protocolo de procesamiento, esterilización y conservación, matriz ósea desmineralizada que preserva las características osteoinductivas y osteoconductivas.
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