Mutación puntual del gen supresor de tumores TP53 en lesiones preneoplásicas y neoplásicas del estómago: cross- sectional study in a high risk region

Mutación puntual del gen supresor 
de tumores TP53 en lesiones 
preneoplásicas y neoplásicas del 
estómago
Juan Carlos Araya O, Juan Carlos Roa S, 
Miguel Angel Villaseca H, Iván Roa E, Pablo Guzmán G, 
César Alvarado Ca, Angélica Melo Ab.
Mutations of TP53 suppressor gene 
in pre-neoplastic and neoplastic 
lesions of the stomach: cross- 
sectional study in a high risk region
 
 
 
 
 
 
 
 
Background: In the current model for the development of gastric cancer, regions of multifocal atrophic gastritis give rise to intestinal metaplasia, dysplasia and finally, adenocarcinoma. Aim: To study the frequency and characteristics of TP53 gene mutations in preneoplastic and neoplastic lesions of the stomach. Material and methods: DNA sequencing of the TP53 gene was performed in 46 patients with gastric carcinoma. Normal mucosa, intestinal metaplasia and invasive adenocarcinoma tissues were obtained by scraping 6-µm histological sections from formalin-fixed and paraffin-embedded tissue. Results: DNA sequencing of exons 5-9 of the TP53 gene demonstrated a mutation in 31% of patients. These findings were seen both in tumoral tissue (13 cases) and in intestinal metaplasia (2 cases). Most mutations were found in exons 5 and 8, and the majority of them were transitions (10 out of 19 mutations). Discussion: Patients with gastric cancer showed a frequency of TP53 mutations similar to that previously communicated in populations with low gastric cancer risk. Moreover, there was a predominance of transitions, genetic alterations that are identified with carcinogenesis associated with N-nitrosamine compounds. Finally, mutations of TP53 gene were detected in areas of intestinal metaplasia (Rev Méd Chile 2003; 131: 359-65).
(Key Words: Adenocarcinoma; Genes, supressor, tumor; Metaplasia)
Recibido el 7 de octubre, 2002. Aceptado en versión corregida el 11 de marzo, 2003. 
Trabajo parcialmente financiado por FONDECYT 1970371 y 1970874. 
Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, 
Temuco, Chile. aAlumno de Medicina, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera. 
bTecnólogo Médico.
Desde un punto de vista biológico, la génesis y la progresión del carcinoma gástrico de tipo intestinal se caracterizan por la aparición de mutaciones y alteraciones genéticas que ocurren durante un largo tiempo1-3. Desde un punto de vista histológico la lesión inicial sería la llamada gastritis atrófica multifocal (GAM)4, la cual es seguida por metaplasia intestinal y, eventualmente, displasia gástrica5. Después de un período de 30 a 50 años algunos pocos individuos portadores de GAM desarrollan mutaciones sucesivas que proporcionarían una ventaja proliferativa6, expansión clonal7 y, finalmente, desarrollo tumoral8.
El cáncer gástrico presenta frecuentes inactivaciones de múltiples genes supresores de tumores, incluyendo a los genes TP53, APC y DCC9,10. Tal inactivación se produciría por pérdida de la heterozigosidad, inestabilidad microsatelital o por mutación puntual. El gen TP53 presenta tales lesiones entre 20 y 60% de los casos estudiados3,11-14, lo cual varía de acuerdo al tamaño de la muestra y el método empleado para su detección9,10,15. Por otro lado, el momento en que ocurre cada una de estas lesiones en la cascada carcinogenética aún no está del todo establecida, a diferencia de lo que se ha descrito en otras localizaciones3.
El propósito del estudio fue analizar la frecuencia de mutaciones puntuales del gen supresor de tumores TP53, en mucosa gástrica de pacientes con carcinoma gástrico y en mucosa adyacente con GAM.
Material y método
Muestra: se seleccionaron 46 pacientes consecutivamente operados por cáncer gástrico. Todos los casos fueron obtenidos del archivo de biopsias del Departamento de Anatomía Patológica del Hospital de Temuco. Se realizaron cortes histológicos seriados de los bloques de parafina de tejidos previamente fijados en formalina tamponada. De acuerdo al nivel de infiltración en la pared los tumores fueron categorizados en incipientes (mucosa y submucosa), intermedios (túnica muscular propia) y avanzados propiamente tales (subserosa y serosa)16. La metaplasia intestinal fue estudiada en 20 de 46 piezas de gastrectomía, todos con carcinoma gástrico de tipo intestinal. No se consideraron áreas con displasia epitelial por la multifocalidad y el pequeño tamaño de las lesiones, lo que no permitió obtener DNA para realizar secuenciación.
Procesamiento del DNA y secuencia de gen TP53: se seleccionaron y rasparon manualmente desde los cortes histológicos sin desparafinizar áreas de linfocitos estromales (control), mucosa gástrica normal, mucosa gástrica atrófica, metaplasia intestinal y carcinoma, guiado por un corte histológico consecutivo teñido con hematoxilina y eosina. La extracción de DNA se efectuó con DNA Isolation Kit (Gentra, USA), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La amplificación de los exones 5, 6, 7 y 8/9 del gen supresor de tumores TP53 fue hecha con los pares de iniciadores mostrados en la Tabla 1 17. Previo a la secuenciación del DNA todo el producto de PCR fue separado en un gel de poliacrilamida al 12% por medio de electroforesis, con el propósito de aumentar la pureza y la concentración. La secuencia directa de todos los productos de PCR fue realizada con Sequenase versión 2.2(Amersham Life Science Laboratories, USA), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La electroforesis de los productos marcados con S35 fue realizada en un gel de poliacrilamida al 6% a 55°C. Posteriormente, los geles fueron fijados en una solución al 10% de metanol/ácido acético por 12 min y luego lavados por otros 12 min en agua deionizada. Finalmente, los geles fueron secados al vacío a 80°C y expuestos para autorradiografía por 24 a 48 h a temperatura ambiente (Kodak Biomax MR-1, USA).
Análisis estadístico: El análisis estadístico se realizó por medio de prueba de Fisher y chi cuadrado. Se consideró diferencia significativa toda vez que el valor p 0,05, Tabla 2). Por otro lado, de acuerdo al nivel de infiltración no encontramos mutaciones del gen TP53 en carcinomas incipientes o intermedios. Si se segregan los casos de acuerdo al nivel de infiltración, de acuerdo a si estos son avanzados propiamente tales (infiltración hasta la subserosa o serosa) y no avanzados (mucosa, submucosa o intermedios) se observan diferencias significativas en la frecuencia de mutaciones del gen TP53 (Fisher, p