Microorganismos en el corcho

ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGÍA DEL VINO Y LOS TAPONES DE CORCHO

Álvaro Moreno García BTC2ZC

ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGÍA DEL VINO Y LOS TAPONES DE CORCHO

Álvaro Moreno García

Estudio de la microbiología del vino y los tapones de corcho Estudio Microbiología tapones de corcho y vino.

AGRADECIMIENTOS Antes de comenzar, me gustaría nombrar y dar las gracias a aquellas personas cuya labor ha sido imprescindible en la realización de este proyecto de investigación. Principalmente, gracias al profesor Manuel Ramón Fernández Agullo, coordinador de este proyecto, por su ayuda incondicional a la hora de abordar el trabajo, por haber empleado gran parte de su tiempo libre en resolverme dudas, corregirme errores, etc. y por convencerme, en los peores momentos, de que era capaz de realizar un buen trabajo. Gracias a Ginés José Aznar Asensio, profesor del Departamento de Industrias Alimentarias del Centro Integrado de Formación y Experiencias Agrarias (C.I.F.E.A.) de Jumilla por su gran ayuda en la realización de este trabajo, tanto en la elaboración del vino como a la hora de resolver dudas, por su predisposición y su gran colaboración. Gracias a la profesora Isabel Marín Abellán por su colaboración y su ayuda a la hora de resolver cuestiones relacionadas con la fermentación del vino y demás procesos químicos. Gracias a Elisa y a sus compañeros por realizar la cata de los vinos. Gracias a Bodegas Silvano por permitirnos utilizar sus prestaciones y a sus enólogos por la resolución de algunas dudas; a Bodegas Hijos de Juan Gil por la información dada sobre el sector de los tapones de corcho y el vino; a Bodegas José María Martínez Verdú por proporcionarnos la uva con la que se realizó el vino; a Enoproma por su colaboración a la hora de comprar materiales como los tapones de corcho, botellas y cápsulas, y especialmente gracias a Pedro Carrión, miembro de Enoproma, por su colaboración y su ayuda para la resolución de dudas; al Instituto Enológico de Jumilla por los análisis realizados al vino y a Pedro Carrión, miembro de esta institución, por su colaboración.

Gracias a Mario Honrubia García, Catedrático de Biología Vegetal de Murcia, por su ayuda a la hora de la identificación de microorganismos; a Mariano Spiteri por la prestación de la maquina embotelladora. Finalmente, gracias a mi amigo y compañero Manuel Velasco Gomariz por su colaboración durante todo el trabajo y su ayuda …………. ¡GRACIAS A TODOS!

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ÍNDICE:

1. Resumen, abstract y resumé 2. Introducción 3. Hipótesis 4. Fundamento teórico 4.1. Características constitucionales de la corteza suberosa 4.2. Características del alcornoque 4.3. Estructura celular del corcho 4.4. Composición química del corcho 4.5. Microbiología del corcho 4.6. Terminología 4.7. Normas UNE 4.8. Propiedades físicas-mecánicas del corcho 4.9. Producción diferentes tipos de tapones de corcho 5. Metodología 5.1. Elaboración vino 5.2. Mediciones parámetros tapones de corcho 5.3. Aislamiento e identificación de microorganismos 6. Resultados 6.1. Elaboración vino 6.2. Parámetros tapones de corcho 6.3. Identificación de microorganismos 7. Discusión de los resultados 7.1. Elaboración vino 7.2. Parámetros tapones de corcho 7.3. Aislamiento de hongos filamentosos, levaduras y bacterias en tapones y vino 8. Conclusiones 9. Bibliografía

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1. RESUMEN Este proyecto de investigación tiene como objetivo el estudio de la microbiología del vino y de los tapones de corcho, concretamente, queremos caracterizar las diferencias microbiológicas entre vinos realizados con uvas congeladas y no congeladas y entre diferentes tipos de tapones de corcho. Para llevar a cabo nuestro objetivo hemos producido nuestro propio vino y lo hemos embotellado con diferentes tipos de tapones de corcho natural. Tras esto, hemos realizado unos medios de cultivo y hemos identificado diferentes microorganismos. Con los resultados obtenidos, podemos decir que en cuanto a la microbiota no hemos encontrado diferencias significativas entre los vinos embotellados con diferentes tipos de tapones de corcho natural. También hemos concluido que puede darse el paso de microorganismos procedentes del tapón al vino pero éstos no sobreviven en este nuevo medio, debido a que las condiciones de vida de las levaduras son muy agresivas para la vida de los microorganismos que se traspasan desde el tapón.

ABSTRACT This project of investigation takes as an aim the study of the microbiology of the wine and of the natural stoppers of cork, concretely, we want to characterize the microbiological differences between wines made with frozen and not frozen grapes and between different types of stoppers of natural cork. To carry out our aim we have produced our own wine and have bottled it with different types of stoppers of cork. After this, we have realized a few means of culture and have identified different microorganisms in the stoppers of cork and in the wine. With the obtained results, we can say that as for the microbiology we have not found significant differences between the wines bottled with different types of stoppers of natural cork. Also we have concluded that one can give the step of microorganisms proceeding from the stopper to the wine, but they do not survive in this new way due to the fact that the living conditions of the yeasts are very aggressive for the life of the microorganisms that are transferred from the stopper.

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RESUMÉ Le but de ce projet de recherche est l’étude de la microbiologie du vin et des bouchons en liège. Plus concrètement, nous voulons découvrir les différences microbiologiques entre des vins élaborés avec du raisin congelé et avec du raisin pas congelé et aussi avec différents types de bouchons. Pour mener à fin notre objectif, nous avons produit nous memes du vin et nous l’avons embouteillé avec différents types de bouchons en liège naturel. Après cela, nous avons effectué quelques milieux de culture et nous avons identifié différents micro-organismes. Avec le résultats obtenus et en ce qui concerne les micro-organismes nous pouvons dire que nous n’avons pas trouvé de différences significatives entre les vins embouteillés avec différents types de bouchons en liège natural. Nous pouvons aussi conclure que les micro-organismes du bouchon peuvent passer au vin mais ils ne survivent pas dans ce nouvel environnement parce que les conditions de vie des levares sont très agressives pour la vie des micro-organismes qui proviennent du bouchon.

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2. Introducción La idea de estudiar el término sabor a corcho resulta verdaderamente interesante y práctica debido al gran uso de esta expresión en el campo de la enología. Se denomina sabor a corcho a la sensación producida por ciertos componentes volátiles de carácter contaminante aparecidos en el vino y que tienen su origen en el tapón de corcho. Con este proyecto pretendo demostrar no el paso de compuestos volátiles al vino desde el tapón, sino el paso de los microorganismos productores de los compuestos volátiles al vino. Para ello, llevaremos a cabo una recogida de información a partir de diferentes paginas web, libros, artículos científicos y tesis relacionados con este tema. En primer lugar, produciremos nuestro propio vino, uno con uva normal y otro con uva congelada. Este vino será embotellado con diferentes tipos de tapones de corcho para comprobar si crecen diferentes tipos de microorganismos en cada tipo de tapón. A continuación, se medirán diferentes parámetros de cada tipo de tapón de corcho analizado. Posteriormente, se realizarán unos medios de cultivo con el objetivo de aislar especies de hongos filamentosos, levaduras y bacterias presentes en los diferentes tipos de tapones de corcho y en el vino analizados. También realizaremos una experiencia en el laboratorio para estudiar el rendimiento de las levaduras tras ser congeladas. Finalmente, mediante la comparación y discusión de los resultados obtenidos, redactaremos nuestras conclusiones y comprobaremos si nuestras hipótesis eran verdaderas o falsas.

La introducción anterior nos lleva a sugerirnos una serie de preguntas: 1.- ¿Cómo se producen los distintos tipos de tapones de corcho? 2.- ¿Qué características posee el corcho para que actualmente se siga utilizando como principal método/material para el embotellamiento de botellas de vino? 3.- ¿Existen grandes diferencias en la microbiología entre distintos tipos de tapones de corcho? En caso de que sea así, ¿a qué se puede deber esto? 4.- ¿Existen grandes diferencias en la microbiota del vino realizado con uva normal y uva congelada? ¿y grandes diferencias en la microbiota de los tapones que han embotellado vino realizada con uva congelada y con uva normal? 5.- ¿Pueden afectar a las características de un vino las distintas características físicas y químicas de los tapones de corcho, tales como el diámetro, longitud, pH, entre otros? 6.- ¿Disminuye el rendimiento de las levaduras tras ser congeladas?

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3. Hipótesis principal La hipótesis principal de mi trabajo de investigación es demostrar la existencia de microorganismos procedentes de los tapones de corcho que se transfieren al vino al estar en contacto con éste. De esta forma, estos microorganismos se adaptan al nuevo medio que representa el vino y se desarrollan y reproducen en él.

Hipótesis secundarias 1.- Aparición de nuevos microorganismos en los tapones de corcho que inicialmente no se encontraban ni en el tapón del corcho ni en el vino, es decir, procedentes desde el exterior, derivados de una contaminación. 2.- La presencia de ciertos microorganismos en el vino afecta a sus características. 3.- Aparición de menos microorganismos en el vino producido con uva congelada que en el producido con uva normal debido a las diferencias de temperaturas. 4.- El rendimiento de las levaduras disminuye tras haber sido congeladas. 5.- Las características físicas de un tapón de corcho no afectan a la calidad del vino. 6.- Las especies de microorganismos no varían en los diferentes tipos de tapones de corcho. 7.- Los tapones de corcho triturados representan un substrato más favorable para el crecimiento de microorganismos que los tapones de corcho enteros.

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4. FUNDAMENTO TEÓRICO

4.1. Características constitucionales de la corteza suberosa El corcho es la corteza, liviana y porosa, del Alcornoque (Quercus Saber), que en los primeros años del crecimiento del árbol es fina y lisa, pero a medida que pasan los años va engrosando poco a poco, pudiendo llegar a espesores de 25 cm. en el caso de troncos que no hayan sufrido extracción por parte del hombre.

4.2. Características del alcornoque Tiene hoja perenne y florece a mediados o finales de primavera. Suele alcanzar una media de 20 metros de altura. Su hábitat y lugar de origen lo constituye en primer lugar la zona de influencia mediterránea, encontrándose en bosques y colinas. Al terreno poblado por alcornoques se le denomina alcornocal. En cuanto a su producción, destacan Portugal y España.

4.3. Estructura celular del corcho Fue Robert Hooke en 1665 quien estudió por primera vez la estructura del corcho, llegando a la conclusión que éste está formado por lagunas poliédricas semejantes a las células de un panal. Desde que Robert Hooke observó en su microscopio la primera célula, se inició la revolución científica rigurosa de investigaciones al subuniverso celular, en los campos de los mecanismos de ciclo celular, desarrollo, transcripción de ADN y su control de reparación, sus mecanismos de secuenciación y redundancias, hasta la mitosis y su maquinaria citoesquelética. Con un microscopio de unos 500 aumentos se observa que el corcho está formado por unas especies de células. Estas células forman parte del tejido suberoso y son unidades muertas y llenas de aire. La oquedad de las mismas se debe a que durante el crecimiento y suberificación, las membranas pierden el contenido celular. La disposición que presentan las células es bastante regular, en hiladas radiales y encajadas unas en otras gracias a su forma geométrica, formando conjuntos en tandas circulares superpuestas. Debido a esta disposición celular, posee el corcho gran parte de sus cualidades, como elasticidad y resistencia. La membrana celular contribuye a las características especiales del corcho. Esta pared que separa los huecos citados anteriormente se haya formada por cinco capas: dos celulósicas (que son las que están en contacto con la cavidad celular), otras dos suberificadas (de espesor notablemente mayor) Álvaro Moreno García

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y la quinta, lignificada, que es la que se encuentra más al interior de todas y se encuentra a su vez formada por dos tabiques de espesor microscópico íntimamente ligados.

Ilustración 1 Estructura celular del corcho

4.4. Composición química Actualmente es muy difícil dar una idea exacta de la composición química del corcho, tanto por su complejidad intrínseca como porque la composición varía considerablemente según la procedencia, edad del corcho, etc. Sería un error considerar que esta falta de información se debe al poco interés y trabajo prestado a esta investigación ya que por el contrario son muchos los trabajos, estudios e investigaciones a los que ha sido sometido el corcho tanto en el terreno de la química pura como aplicada. Fue el investigador Guillermonat, quien obtuvo los siguientes compuestos y sus proporciones: Suberina

45%

Lignina

27%

Polisacáridos, celulosa

12%

Taninos

6%

Ceras

5%

Otros (minerales, agua, glicerina, etc)

5%

Tabla 1 Composición del corcho

La suberina es un polímero natural (biopolímero) producido por las paredes celulares de algunas células de las plantas. Debido a las propiedades dadas por las paredes de las células suberizadas y su estructura celular asociada el corcho tiene increíbles propiedades como: baja densidad, baja

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permeabilidad a los gases y agua, baja conductividad del calor alta elasticidad y estabilidad química. La lignina es el constituyente intercelular cementante de las células fibrosas de los vegetales. Funciona como relleno para impartir rigidez al tallo de la planta. Son polímeros mixtos, de moléculas grandes ramificadas y resistentes, tanto al ataque de las substancias químicas como a la acción de los microorganismos. La celulosa es un polímero de D-glucosa unidas por enlace glucosídico B1-4 La celulosa forma la parte leñosa y resistente de muchos vegetales.

Ilustración 2 Enlace glucosídico B1-4 entre monómeros de glucosa

Los taninos son compuestos polifenólicos de estructura química diversa que tienen la propiedad de ser astringentes, es decir, precipitan las proteínas y su capacidad de curtir la piel. Las ceras son ésteres de los ácidos grasos con alcoholes de peso molecular elevado. En vegetales las ceras recubren en la epidermis de frutos, tallos, junto con la cutícula o la suberina, que evitan la pérdida de agua por evaporación en las plantas. De todos los componentes, quizás el más importante sea la suberina. Esta sustancia fue identificada por primera vez en 1807 por Cheureul. Se trata de la sustancia fundamental que compone el tejido suberoso y está compuesta por una mezcla de ácidos grasos (de los que se desconoce por el momento la composición química de algunos de ellos). Entre estos ácidos grasos se encuentra el ácido felónico: HOCH 2 - (CH 2 )O – COOH (es el más abundante), el ácido floinólico y el ácido subérico. La suberina es inflamable e insoluble en agua, éter, cloroformo, ácido sulfúrico, amoniaco y es el mayor determinante de las numerosas cualidades del corcho.

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4.5. Microbiología del corcho El corcho es un substrato natural y de origen vegetal cuya naturaleza permite la colonización y el mantenimiento de microorganismos en las lenticelas 1 de sus células. También se debe tener en cuenta que el corcho ya posee una microbiota natural que puede desarrollarse durante el proceso de elaboración de los tapones, por lo que se deben realizar controles microbiológicos que consisten en el recuento de hongos y bacterias. Igualmente, se debe tener en cuenta la posibilidad de que los hongos miceliares desarrollados elaboren y acumulen micotoxinas que puedan difundir y acumularse en el corcho. Numerosos autores han descrito la microbiota del corcho, entre ellos cabe destacar a Agut et al en 1996, Calvo et al en 1993, Falco y Sampo en 1993, Lefebvre et al en 1983, Moreau en 1978 y Suárez et al en 1997 entre otros. La diversidad fúngica está representada mayoritariamente por hongos filamentosos y levaduras pertenecientes a los Deuteromycotina y Zigomycotina.

En la siguiente tabla se enumeran los principales hongos filamentosos, levaduras y bacterias aislados e identificados por los autores citados anteriormente en tapones y arandelas de corcho.

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Protuberancia que aparece en la superficie de las ramas de los vegetales leñosos y permite el intercambio gaseoso entre la planta y el exterior.

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Estudio de la microbiología del vino y los tapones de corcho Estudio Microbiología tapones de corcho y vino. Hongos filamentosos

Levaduras

Penicillium

Aspergillus

Alternaria

P. adametzi

A.conicus

P. brevi-

A.flavus

Bacterias

Candida

Bacillus

Amillaria mellea

C.ciferri

B.cereus

Aureobaisidium

C.famata

B.circulans

alternata

compactum

pullulans

P.citrinum

A.fumigatus

Cladosporium

Cryptococcus sp

B.lentus

P. citro-viride

A.glaucus

C.cladosporioides

Kluyveromyces

B.firmus

veronae P. corylophilum

A.nidulans

C.herbarum

Rhodotorula

B.sedentarius

p. Chrysogenum

A.niger

Chrysonilia

R.candida

B.pantothenticus

R.glutinis

Achromobacter

sythophila P.Decumbens

A.ochraceus

Fusarium

spp P. echinulatum

A.parasiticus

F.moniliforme

Sporidiobolus johnsonii

P. expansum

A.ruber

F. solani

Saccharomyces

P. fellutanum

A.sydowii

Rizhopus arrhizus

S.cerevissiae

P. frequentans

A.terreus

Scopulariosis

S.italicus

P.Granulatum

A.versicolor

P. lilacinum

Mucor

S.rouxii

P.meleagrinum

M.hiemalis

S.ludwigii

P.multicolor

M.plumbeus

Trichosporum

candida

S.heterogenicus

pullulans P.purpurescens

M.racemosus

P. roqueforti

Trichoderma

P.

T.hamatun

simplicissimun P.variable

T.longibranchiatum

P.viridicatum

T.viride

Tabla 2 Microbiología del corcho

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4.6. Terminología En este apartado, procederemos a explicar detalladamente los materiales, procesos, reactivos, conceptos reactivos empleados en este proyecto. 1. Materiales: - Máquina despalilladora – estrujadora: Aparato con el que se trocea la uva y se le quitan los racimos.

Ilustración 3 Máquina despalilladora-estrujadora

- pH-metro: Sensor utilizado en el método electroquímico para medir el pH de una disolución. La determinación de pH consiste en medir el potencial que se desarrolla a través de una fina membrana de vidrio que separa dos soluciones con diferente concentración de protones. Una celda para la medida de pH consiste en un par de electrodos, uno de calomel (mercurio, cloruro de mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolución de la que queremos determinar el pH. - Mostímetro/ Densímetro: Instrumento para medir densidades en líquidos. En Enología se utiliza más el Aerómetro, que mide la densidad directamente en la escala de Baumé. Se utiliza para ir midiendo temporalmente la densidad del mosto y, por tanto, su grado de fermentación. El mosto es menos denso según se va transformando en vino.

Ilustración 4 Mostímetro

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- Ebullómetro: Aparato para medir la temperatura a la cual hierve un cuerpo. - Termómetro: instrumento de medición de temperatura que utilizaremos en el seguimiento de la fermentación alcohólica.

Ilustración 5 Termómetro

- Regla graduada: objeto que relaciona la temperatura de ebullición de una bebida alcohólica con el grado de alcohol del mismo.

Ilustración 6 Regla circular graduada

-

Báscula: Aparato que sirve para medir la masa de un cuerpo.

Ilustración 7 Báscula

- OenoFossTM: Instrumento de análisis que proporciona un control de calidad del vino. Analiza el vino proporcionando hasta siete parámetros principales de calidad (azúcares, pH, acidez total, azúcares reductores, ácido málico, etanol y acidez volátil) con una sola gota en dos minutos. Es necesario conectarlo a un ordenador para obtener dichas medidas. El diseño OenoFoss incorpora

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el interferómetro FTIR (Espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier) más pequeño del mundo. La muestra se analiza en dos longitudes de paso óptico con calibración patentada y automática del instrumento tras cada medición.

Ilustración 8 OenoFossTM

- Mechero Bunsen: Mechero que da una llama oscura y muy calórica, gracias a la mezcla de aire y gas combustible utilizado en laboratorios científicos para calentar o esterilizar muestras o reactivos químicos.

Ilustración 9 Mechero Bunsen

-

Presentador visual: es un dispositivo que captura imágenes con una cámara de vídeo montada en posición vertical sobre una base. La imagen de vídeo se convierte en una señal electrónica que puede ser transmitida a otros equipos como un ordenador. En nuestro trabajo lo utilizamos para realizar las fotos de los microorganismos vistas al microscopio.

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Ilustración 10 Presentador visual

- Papel de filtro Whatman 113: papel de filtro cuyo grado es 113: 30 µm ultra alta capacidad de carga con una retención partículas haciéndola ideal para su uso con gruesas o gelatinosa precipita. Mayor caudal del grado cualitativo. Rizados superficie. Papel de filtro más gruesa en la gama cualitativa. Este filtro está también disponible en el FilterCup, un práctico y desechable 70 mm filtro embudo con 250 ml de capacidad, de polipropileno moldeado integrante con servidumbre calor, filtro. También disponible como grado 113V. En la siguiente tabla se muestran sus características: Propiedades típicas - Fortalecimiento cualitativo Húmedos Grados Grado 113

Descripción

Velocidad de filtración (aprox.) herzberg (s)

flujo de aire (s/100 ml/in2)

típico espesor (µm)

Base peso (g/m2)

28

1.3

420

125

Rápido, rizados 30*

* retención de partículas estrellas en 98% de eficiencia

Tabla 3 Propiedades papel de filtro Whatman 113

- Agar Sabouraud: medio de cultivo utilizado para el cultivo de hongos y levaduras y para la numeración de estos microorganismos en alimentos, muestras clínicas y otros materiales. En el medio de cultivo, la pluripeptona y la glucosa, son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH ácido (5,6), favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de bacterias. Composición por Litro: ƒ

Digestivo pancreático de caseína - 5g

ƒ

Peptona de tejido digestivo - 5g

ƒ

Dextrosa - 40g

ƒ

Agar - 15g

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- Titrador de Sulfuroso: Valorador automático que tiene un electrodo de platino de doble alambre sensible al SO2, similar a un pHmetro, pero con un funcionamiento diferente. Con este aparato mediremos la cantidad de sulfuroso total y libre presente en un vino.

I 2. Procesos: - Despalillado: Consiste en separar el grano del raspón, con el fin de que durante la maceración necesaria para la toma de color, no se transmitan sabores herbáceos y amargosos de esta parte leñosa del racimo. - Pie de cuba: Proceso por el cual se añaden las levaduras al mosto para que estas realicen la fermentación alcohólica. Se distinguen tres etapas: 1) Rehidratación: hidratación con agua y azúcar de las levaduras a unos 37- 40 ºC. 2) Adaptación: etapa en la que las levaduras se acostumbran al medio ácido del vino. 3) Multiplicación: Inoculación de las levaduras en el depósito tras la multiplicación de las mismas. - Bazuqueo: Operación realizada durante la fermentación alcohólica con el fin de mezclar las partículas sólidas y las líquidas. - Trasiego: Operación consistente en separar el vino de las materias sólidas depositadas en el fondo de los recipientes, tanto durante la fermentación como durante las diferentes etapas de la crianza. En el primer trasiego tras el prensado, se separan las lías 2 gruesas, y en el segundo las lías finas. - Eliminación dióxido de carbono (CO2): Eliminación del gas carbónico para la medición de la densidad durante la fermentación alcohólica. Debemos tener en cuenta que al sumergir el mostímetro en la muestra de vino, este gas disuelto "empuja" el mostímetro hacia arriba, con lo que la lectura que realizamos en el menisco de la varilla graduada del aparato es incorrecta. Para corregir este error se elimina la mayor cantidad de CO2 posible agitando enérgicamente la probeta y destapándola alternativamente para que se vaya desgasificando. - Cromatografía en capa fina: método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas. Su objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo

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Residuo que se deposita en los recipientes que contienen vino después de la fermentación

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identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. En el vino pretendemos distinguir el ácido málico y el láctico, y observar el estado de la fermentación maloláctica. - Estabilización por frío: Procedimiento utilizado para eliminar las sustancias que pudieran sedimentarse en la botella de vino. Al enfriar el vino las sustancias sólidas sedimentan pudiendo ser retiradas fácilmente. Se enfría el vino de - 4ºC a - 6ºC cuando finaliza la fermentación maloláctica. - Prensado: Proceso al que se somete el mosto aún con residuos sólidos para separarlos del líquido. Consiste en estrujar las uvas mediante una prensa tras la fermentación alcohólica. - Embotellado: procedimiento por el cual se introduce el vino final en una botella de vino y se tapona con un tapón de corcho a fin de evitar su oxidación. 3. Reactivos: - Hidróxido sódico (NaOH): Compuesto químico del tipo hidróxido que está formado por un metal (Na) y un anión hidroxilo (OH). Al tener carácter básico frente al vino (ácido), se utiliza para medir la acidez total, que se expresa en miliequivalentes de sosa capaces de neutralizar la acidez de un litro de vino. -Anhídrido Sulfuroso (SO2): Compuesto químico de azufre y oxígeno que mezclado con el vino en la cantidad adecuada realiza funciones antioxidantes, antisépticas, desinfectantes y depuradoras del color. Puede aparecer en el vino en dos formas: combinado inactivo (sulfuroso total) y sulfuroso libre. -Metabisulfito potásico (K2S2O5): Conservante utilizado en la industria del vino que se añade tras el despalillado para impedir que ciertas bacterias crezcan en el vino. -Saccharomyces cerevisiae: es la levadura responsable de la transformación del azúcar en alcohol, el fenómeno más trascendental en la producción de vinos. Esta levadura se encuentra sobre el hollejo de la uva. Para que comiencen a transformar el azúcar en alcohol necesitan de ciertas condiciones ambientales: 1) Temperatura: una levadura puede resistir temperaturas muy bajas. El calor excesivo, sin embargo, las mata. Un mosto que supera los 35 grados es un ambiente aniquilador de Saccharomyces cerevisiae. Si la temperatura comienza a aumentar, la actividad de las levaduras se

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vuelve más y más lenta y lo que se debe hacer es tratar de bajarla, ya que además no puede soportar los cambios bruscos de temperatura. 2) Oxígeno: esta levadura necesita oxígeno para poder vivir y multiplicarse pero puede estar sin él por un tiempo razonable. Esporádicas aireaciones en los tintos más la suma de levaduras externas, si es necesario, asegurarán una buena cantidad de levaduras que se multiplicarán y harán bien su trabajo cuando el aire falte. 3) Alcohol: Saccharomyces cerevisiae puede trabajar bien en medios alcohólicos como lo son los mostos transformándose en vino, aunque no resiste extremos, puesto que más allá de los 14 grados de alcohol, su trabajo se hace muy lento. 4) Anhídrido sulfuroso: esta sustancia es importantísima para hacer un buen vino, pero a dosis controladas estas levaduras no pasan problemas, a diferencia de otras bacterias que si mueren. -Etanol (C2H6O): es un alcohol que resulta el principal producto del vino tras la fermentación alcohólica.

Ilustración 11 Etanol

-Bacterias lácticas: Son un tipo de bacterias utilizadas en enología para efectuar la fermentación maloláctica. Dichas bacterias deben pertenecer a los tipos Oencococcus (Leuconostoc), Lactobacillus y Pediococcus y deben haber sido aisladas de las uvas, los mostos o de los vinos. Una bacteria láctica utilizable en enología debe transformar el ácido málico del mosto o del vino en ácido láctico y en dióxido de carbono, no debe producir aminas biógenas 3 , a menos que sea en cantidades mínimas y no debe trasmitir gusto extraño ni producir substancias nocivas para la salud humana. -Yoduro potásico (KI): sal cristalina que se usa en enología para determinar la cantidad de sulfuroso total presente en el vino.

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Amina formada por la descarboxilación de ciertos aminoácidos fisiológicamente importantes

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4. Conceptos básicos: - Sombrero: Materias sólidas de la uva que suben a la superficie de los mostos en fermentación formando una especie de sombrero. - Baumé: Escala que sirve para medir el azúcar de un mosto o vino. Se calcula con un mostímetro, y corresponde a un valor constante de alcohol potencial, que permite determinar, con una precisión de dos décimas, la cantidad de azúcar de un mosto o de un vino. - Hollejo: Piel que envuelve la pulpa o parte carnosa de la uva. Durante el estrujado se rompe esta parte de la uva para que libere más fácilmente su jugo. - Lías: Sólidos o restos de compuestos orgánicos que posee el vino tras el prensado y se sedimentan en el fondo del depósito en el que se encuentra el caldo. Se distinguen: lías gruesas, que son los residuos formados 24 horas después del movimiento del vino; y las lías finas, que son los depósitos restantes tras ese día. - Cabernet-sauvignon: Variedad tinta de uva que más éxito ha tenido en todo el mundo. Esta cepa se desarrolló en Burdeos y su nombre comenzó a ser conocido hacia finales del siglo XVI y comienzos del XX. La Cabernet-Sauvignon sólo se cultiva donde se pretende obtener un vino de calidad, debido a su bajo rendimiento. Sus frutos son muy oscuros, pequeños y con una piel gruesa, lo que da lugar a un vino austero, tánico y muy coloreado. Esta variedad también tiene una maduración tardía, lo que limita su cultivo a zonas templadas con otoños suaves. Los catadores la identifican por su color: rojo sombrío con una nota violácea durante su primera juventud, que deriva al rojo ladrillo con el tiempo. Su aroma recuerda al de las grosellas en los vinos jóvenes y la madera de cedro en los más evolucionados. Por otra parte, el gusto de los vinos jóvenes de CabernetSauvignon es bastante áspero, a causa de sus taninos. Además de en los Burdeos, la encontramos en otros vinos franceses del suroeste, en los vinos del Midi y del Loira. En el resto de Europa, en España y en el centro y norte de Italia, es de introducción reciente, aunque ciertas parcelas como las de La Rioja tienen un siglo de existencia. Está también presente en Bulgaria, Rumania, Moldavia, Rusia, Georgia, Grecia, Turquía y Líbano, también existe en California (EEUU) y en Chile, así como en Australia y Nueva Zelanda.

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Ilustración 12 Uva Cabernet - Sauvignon

- Ácido tartárico (C4H6O6): compuesto orgánico polifuncional formado por dos grupos carboxílicos y dos grupos alcohol en una cadena de hidrocarburo lineal de longitud cuatro. Se trata de un producto natural procedente de los subproductos de la uva. Está incluido en la lista de aditivos alimenticios con el código E334 y es utilizado como acidificante. En los mostos y vinos se emplea para elaborar vinos más equilibrados desde el punto de vista gustativo, consiguiendo un aumento de la acidez de titulación y disminuyendo el PH de los mismos.

Ilustración 13 Ácido tartárico

- Ácido acético: Resultado de la oxidación del alcohol etílico a ácido o fermentación acética. Junto con los ácidos propiónico, butírico y sulfúrico compone la acidez volátil del vino. En boca se percibe como un sabor que recuerda el vinagre. Está presente en las botellas con el corcho mal colocado o en mal estado, por ello es necesario que sea muy tímida su presencia en el vino.

Ilustración 14 Ácido acético

- Normas UNE: sus siglas significan Una Norma Española, son un conjunto de normas tecnológicas creadas por los Comités Técnicos de Normalización (CTN).

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- Partes por millón (ppm): es una unidad de medida de concentración. Se refiere a la cantidad de unidades de la sustancia que hay por cada millón de unidades del conjunto. Se podría tomar la siguiente equivalencia: 10.000 ppm = 1 %

5. Fermentación alcohólica y maloláctica: En este apartado procederemos a explicar el fundamento teórico de las dos fermentaciones que se llevan a cabo en el proceso de elaboración del vino: la fermentación alcohólica y la maloláctica. - Fermentación alcohólica: La fermentación alcohólica es la parte fundamental del proceso de la elaboración del vino. Esta fermentación tiene como principal efecto la conversión de los azúcares del mosto en alcohol etílico, mediante la siguiente ecuación:

Para llevar a cabo este proceso es necesaria la presencia de levaduras, hongos microscópicos que se encuentran, de forma natural en los hollejos. 4 El oxígeno es el desencadenante inicial de la fermentación, ya que las levaduras lo van a necesitar en su fase de crecimiento. Sin embargo al final de la fermentación conviene que la presencia de oxígeno sea pequeña para evitar la pérdida de etanol y la aparición en su lugar de acético. Los organismos capaces de llevar a cabo este proceso son las levaduras del género de las Saccharomyces, siendo las más abundantes la S. cerevisiae y la S. bayanus. Cada una de ellas es objeto de una selección artificial hecha durante tiempo con el objetivo de mejorar aspectos sutiles de la tolerancia a ciertos niveles de pH, contenido de alcohol, dióxido de azufre (SO2), etc. La fermentación se hace en recipientes (cubas de acero inoxidable) y pasa por cuatro fases: 1. Fase de demora: Las levaduras se aclimatan a las condiciones del mosto, es decir, a las altas concentraciones de azúcares, bajo valor de pH, temperatura y SO2. 2. Crecimiento exponencial: Las levaduras ya acondicionadas al entorno, empiezan a multiplicarse exponencialmente, alcanzando el máximo de su densidad de población, que suele estar

4

Piel que envuelve la pulpa o parte carnosa de la uva.

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en torno a los 100 millones de levaduras por centímetro cúbico. Debido al consumo que hacen las levaduras del azúcar presente en el mosto, las concentraciones del mismo declinan rápidamente. 3. Fase estacionaria: La población de levaduras ha llegado a su máximo valor admisible, lo que hace que se alcance un valor estacionario y que la fermentación se mantenga a una velocidad constante. El calor formado por la fermentación hace que temperatura de la cuba durante esta fase sea igualmente constante. 4. Fase declinante: La carestía de azúcares o la elevada concentración de alcohol etílico empieza a matar las levaduras y la población disminuye y con ello la velocidad de fermentación. - Fermentación maloláctica: Proceso por el cual el ácido málico se transforma químicamente en ácido láctico; por medio de bacterias de origen láctico existentes de forma natural en el entorno, o en el interior de la fruta misma. En el caso del proceso de vinificación esta fermentación, que se produce después del prensado, es objeto de interés. El principal efecto de la fermentación maloláctica en la elaboración de vinos es la reducción de la acidez, y si se controla, puede aumentar la calidad del vino, proporcionándole un sabor característico que "llena la boca". Las bacterias que realizan este proceso se llaman “Oenococcus oeni”, que pertenecen a la familia de las “Leuconostocaceae”. Estas bacterias lácticas son de las pocas capaces de crecer en entornos ácidos (pH < 5), alimentándose de ácido málico y produciendo el ácido láctico. La reacción química maloláctica simplificada es: HOOC-CH2-CHOH-COOH → CH3-CHOH-COOH + CO2 El efecto final de la fermentación es elevar el pH del entorno, haciendo que sea más alcalino, ya que el ácido láctico es más débil que el málico, y también la reacción libera al ambiente cantidades de CO2 en forma de gas. 6. Parámetros Los parámetros físicos y biológicos que hemos analizado en nuestro vino, son los siguientes: - pH: El pH es el grado de acidez de una sustancia, es decir, la concentración de iones de H+ en una solución acuosa. Este término proviene del francés “Pouvoir Hydrogène” que significa “poder del hidrógeno”. El pH también se expresa a menudo en términos de concentración de iones hidronio [H3O+]. Al ser las concentraciones de iones H+ de y OH- muy pequeñas, en 1909, el

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químico danés Sorensen definió el potencial hidrógeno (pH) como el logarítmo negativo de la concentración molar de los iones hidrógeno. Esto es: pH = - log [H+] El pH es una escala logarítmica que va del 0 al 14, y dependiendo de su valor distinguimos tres tipos de sustancias: -Ácidas: si poseen un pH menor que 7, como es el caso del vino. -Neutras: si poseen un pH de 7. -Básicas: si poseen un pH mayor que 7.

Ilustración 15 Escala del pH

- Acidez total: Suma de los ácidos en estado libre que existen en el vino y que sean valorables, cuando se realiza la neutralización hasta pH=7,0, por adición de una disolución alcalina. Generalmente es del orden de 5 g/l expresada en ácido tartárico, o 3,25 g/l expresada en ácido sulfúrico. Los ácidos que se valoran son de naturaleza orgánica, siendo los principales los siguientes: a.

b.

d.

c.

e.

Ilustración 16 a) Ácido tartárico b) Ácido láctico c) Ácido málico d) Ácido cítrico e) Ácido succínico

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- Densidad: Magnitud escalar referida a la cantidad de masa contenida en un determinado volumen. En el Sistema Internacional se expresa en kilogramos por metro cúbico (Kg/m3), y su fórmula es:

- Grado de alcohol: Expresión en grados del número de volúmenes de alcohol (etanol) contenidos en 100 volúmenes del producto, medidos a la temperatura de 20 °C. - Anhídrido Sulfuroso (SO2): Compuesto químico de azufre y oxígeno que mezclado con el vino en la cantidad adecuada realiza funciones antioxidantes, antisépticas, desinfectantes y depuradoras del color. Puede aparecer en el vino en dos formas: combinado inactivo (sulfuroso total) y sulfuroso libre. - Molaridad: Cantidad de soluto por unidad de volumen de disolución. Su fórmula es:

- Normalidad: Número de equivalentes de soluto por litro de disolución. Siendo el número de equivalentes. - Acidez volátil: Conjunto de ácidos formados durante la fermentación o como consecuencia de alteraciones microbianas. Estos ácidos son, principalmente el acético, el propiónico, el butírico y el sulfúrico. Si la acidez volátil, presente en todos los vinos, es muy elevada el vino se picará y avinagrará con el paso del tiempo. Es conveniente que la acidez volátil de un vino sea lo más baja posible. -Azúcar reductor: Pentosas y hexosas que contienen naturalmente los vinos, que se denominan reductores porque reducen al licor de Fehling y al Ferricianuro de potasio. La cantidad de azúcares reductores que permanecerá en el vino, influirá en la evolución, la conservación y la calidad del producto final. Azúcares residuales demasiado altos, al final de la fermentación, podrían activar especies microbianas que a menudo son causa del aumento de la acidez volátil en el vino. Además, con él podemos valorar de forma precisa el contenido del extracto, para la preparación de los vinos amables, dulces, de aguja y de licor.

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4.7. Normas UNE Las normas UNE contenidas en este trabajo de investigación son las siguientes: •

UNE 56921:2003

Tapones de corcho natural para vinos tranquilos. Métodos de ensayo y especificaciones

•

UNE 56922:1998

Tapones de corcho aglomerados para vinos tranquilos. Métodos de ensayo y especificaciones

•

UNE 56926:2001

Tapones de corcho de tres piezas. Métodos de ensayo y especificaciones

4.8. Propiedades físicas-mecánicas del corcho -

Baja densidad: El entresijo del corcho posee un elevado porcentaje de aire, que se sitúa en el 89 %. Se deduce por tanto que su densidad sea muy baja, oscilando normalmente entre 0.1 y 0.2 kg/dm3

-

Alta impermeabilidad: Las células del corcho son impermeables a los líquidos y a los gases gracias a la suberina. La impermeabilidad contribuye a hacer mayor la capacidad aislante del corcho, pues al aumentar la humedad en un material aumenta en este su conductibilidad y disminuye e incluso anula su poder de aislamiento y viceversa.

-

Elasticidad: En virtud de la flexibilidad de sus membranas celulares, el tejido suberoso posee una gran capacidad para soportar enormes presiones sin sufrir deformación permanente. Esta circunstancia es sumamente importante a la hora de su empleo como tapón de botella, pues le permite ajustarse indefinidamente como ningún otro material al cuello del recipiente.

-

Aislamiento térmico, acústico y vibratorio: Desde el punto de vista aislante, puede considerarse como polivalente, y en especial en la incomunicación acústica y térmica, se complementa en muchas ocasiones. Su coeficiente de conductividad térmica es de 0.035 Kcal. m/m 2 para una densidad de 110 Kg/m 3 lo que sitúa a la corteza suberosa entre aquellas sustancias más adecuadas para el aislamiento térmico.

-

Resistencia ígnea y estabilidad dimensional: El corcho es un material de difícil combustión o de combustión imposible con ciertos tratamientos. Al quemarse no desprende vapores tóxicos. Los plasmodesmos (puentes intercelulares) establecen entre las células la comunicación apropiada para que el aire pueda circular entre ellas, esto hace que los cambios de humedad y temperatura no creen problemas de presión en las lagunas celulares y por tanto de fractura o inestabilidad de los materiales. “El corcho es estable porque puede respirar”.

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-

Ligereza: se debe a que el 88 % de su volumen es aire, lo que se traduce en una densidad baja, comprendida entre el 0,12 – 0,24 Kg/litro.

-

Coeficiente de rozamiento elevado: la superficie del corcho queda tapizada por microventosas que le permiten una gran adherencia y dificultan su deslizamiento.

-

Poder de adsorción: gracias a su estructura porosa puede retener en su superficie moléculas ambientales.

4.8. Producción tapones de corcho Este proceso se divide en las siguientes fases: 1. Recogida del corcho -

Extracción del corcho del alcornoque

-

Apilado y reposo

2. Preparación del corcho -

Primer hervido

-

Reposo y secado

-

Clasificación

-

Segundo hervido

-

Reposo y secado en cámara

3. Fabricación -

Tapón natural

-

Tapón 3 piezas (1+1)

-

Tapón Aglomerado

4. Terminación del tapón -

Lavado

-

Marcado

-

Lubricado

-

Envasado

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A continuación se detallan estos procesos uno por uno.

4.8.1.- Recogida del corcho: Extracción del corcho del alcornoque La recogida de la cosecha se realiza cada 9 años en pleno periodo vegetativo del alcornoque, cuando el flujo de savia y la actividad de la capa suberofelodérmica permiten despegar la corteza sin dañar a ésta última. Durante la extracción se corta y se separa zona de la plancha de corcho más próxima al suelo ya que es aquí donde se pueden localizar colonias de microorganismos más fácilmente.

Ilustración 17 Extracción del corcho

Apilado y reposo Tras la saca, las planchas de corcho se apilan y se dejan reposar en el campo. Durante este periodo, el corcho sufre un primer proceso de lixiviación 5 , lavado y curado por el agua de la lluvia y el viento. El corcho separado del árbol se amontona sobre viguetas de cemento para evitar su contacto

5

Lavado de una sustancia pulverizada para extraer las partes solubles.

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directo con el suelo. Antes de pasar a la fase de preparación del corcho es necesario que transcurra un tiempo mínimo de nueve meses.

Ilustración 18 Apilado del corcho

4.8.2.- Preparación del corcho: Una vez recogido el corcho, se inicia una fase en la que son necesarias una serie de actuaciones con el fin de prepararlo para obtener de él un tapón de la máxima calidad. Primer hervido Una vez transcurrido el tiempo mínimo de reposo, las planchas se someten a un primer hervido, permaneciendo en la caldera durante 60 minutos aproximadamente. De este modo, se eliminan microorganismos y otros elementos extraños al corcho.

Ilustración 19 Corcho después del primer hervido

Reposo y secado Las planchas hervidas se apilan al aire libre, donde continua el lento proceso de lixiviación y curado. El corcho permanece así durante un periodo que oscila entre 3 a 6 meses. Para una mejor

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conservación de las planchas clasificadas, éstas son apiladas en un almacén sin paredes y con tejado para proteger las planchas de la lluvia y permitir la aireación. Clasificación El siguiente paso es la clasificación de las planchas según clases y calibres. Esta clasificación se hace atendiendo a los siguientes criterios: -

Eliminar defectos críticos relacionados directamente con la presencia de compuestos órgano clorados.

-

Clasificación de las planchas por calibres en función de su futura utilización: desde 6/8 hasta 18/24 líneas. Cada línea equivale a 2.25 mm. Los calibres más habituales para la fabricación de tapones son: por un lado, los calibres comprendidos entre 6/8 y 8/10 corresponden a las planchas de menor grosor que proceden de las zonas más altas del alcornoque se destinan a la fabricación de discos para tapones 1 + 1 o tres piezas o para la fabricación de tapones dos piezas y cuatro piezas. Los calibres entre 13/15 y 15/18 serán utilizados para la fabricación de tapones de vinos de crianza, reserva y gran reserva.

-

Clasificación de las planchas por calidad.

Segundo hervido Después del periodo de reposo, las planchas se someten a un segundo hervido de iguales características al primero. El segundo hervido proporciona al corcho un grado de humedad y una consistencia necesaria para facilitar el posterior perforado.

Ilustración 20 Segundo hervido del corcho

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Reposo y secado en cámara Una vez hervido el corcho se introduce en una cámara limpia, provista de lámparas de radiación ultravioleta para eliminar la contaminación ambiental y donde permanecerá hasta que adquiera las condiciones perfectas para el perforado.

Ilustración 21 Cámara de secado del corcho

4.8.3.- Fabricación del corcho: Tapón natural •

Perforado

Una vez las planchas están en óptimas condiciones para ser trabajadas, éstas se cortan transversalmente en tiras de 52 o 46 mm. de anchura, según la longitud del tapón que se vaya a fabricar. Posteriormente, se van pasando bien por una máquina perforadora automática dispuesta con un gubia 6 cilíndrica entre 22 y 27 mm. de diámetro, bien en perforadoras manuales.

Ilustración 22 Perforado del corcho

6

Instrumento de carpintería similar al formón, con corte curvado de media caña, delgado, para labrar superficies curvas.

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•

Desleñado

Proceso que se utiliza para retirar todos los tapones que se consideran inservibles por su calidad. El desleñado, se suele realizar manualmente por observación de los tapones a su paso por la cinta de desleñado. •

Secado

Para poder proceder al lijado del tapón, es necesario que éste posea una humedad comprendida entre el 4 % y el 8 % por lo que se introducen en un silo de secado por aire durante el tiempo necesario •

Lijado

Los tapones reciben dos tipos de lijado: uno de cuerpo, que reduce su diámetro al nominal deseado. Y otro de cabeza, quedando unas longitudes nominales de habitualmente 49, 44 o 38 mm. Este lijado proporciona al tapón una superficie lisa, así como una mayor adherencia a la pared de vidrio en la botella. •

Escogido electrónico

Tras el lijado se hace pasar la partida por unas máquinas escogedoras que al sumar la superficie total de poros clasifica el tapón dentro de cada una de las calidades de tapones establecidas y retira los defectos que pueda existir. •

Escogido manual

Una vez diferenciadas las calidades, los tapones pasan por una cinta de escogido manual, donde operarios cualificados retiran los tapones que no pertenecen a esa clase y que la cámara electrónica no ha podido diferenciar. Así mismo retiran aquellos defectos que puedan encontrarse todavía en la partida. Tapón tres piezas (1+1)

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Básicamente este tapón se encuentra formado por dos partes bien diferenciadas, por un lado un cuerpo de aglomerado y por otro dos arandelas 7 de corcho natural.

•

Cuerpo aglomerado

Esta parte del tapón tres piezas tiene un proceso de fabricación completamente diferente a los anteriores. Está compuesto por un lado de lo que se conoce como “grano”, se trata del molido de los refugos nobles de las planchas de corcho que se han perforado para la fabricación de los tapones naturales. Este proceso origina un conjunto de corcho triturado que se clasifica en función del tamaño de las partículas de corcho. A estas partículas de corcho se les adiciona un aglomerante y mediante un proceso de moldeo se forman unas barras de unos 26 mm. de diámetro y una longitud determinada. Después de que la temperatura y la humedad de las barras se encuentren en condiciones adecuadas se lleva a cabo el corte longitudinal de las mismas para obtener unos cilindros de unos 34,5 mm. de longitud y 26 mm. de diámetro. •

Arandelas de corcho natural

Para la obtención de las arandelas de corcho natural, se parte de las planchas de corcho de menor grosor, después de haber sido sometidas a los procesos previos de las Fases A y B del proceso de fabricación (Primer hervido, reposo y secado, segundo hervido, reposo y secado en cámara). Mediante procesos de corte se separa la espalda y la barriga de las planchas, resultando una o varias láminas de un espesor mínimo de 6 mm. A continuación, se lleva a cabo la perforación de la lámina para la obtención de las arandelas. Estas arandelas son secadas, lijadas y clasificadas en función de su calidad y futura utilización. •

Proceso de pegado

Para componer lo que será definitivamente el tapón tres piezas se utiliza un proceso de pegado en máquinas automáticas en el que se unen el cuerpo y las dos arandelas a los extremos con una pequeña cantidad de cola, ejerciendo la presión y la temperatura necesarias durante 15 minutos en el horno para una correcta adhesión de los mismos.

7

Pieza en forma de disco perforado.

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•

Rectificado dimensional

Una vez estabilizado en humedad y temperatura, el tapón es rectificado dimensionalmente para conseguir las medidas finales en las que este tapón se comercializa, 44 mm. de longitud y 23,5 mm. de diámetro. La clasificación en calidades de este tipo de tapón está en función de las calidades visuales de las arandelas utilizadas para la fabricación del mismo y se realiza en cintas de escogido manual. Tapón aglomerado Estos tapones están formados por un cilindro de aglomerado de corcho natural y son fabricados completamente a partir de granulados de corcho procedentes de los materiales no utilizables de la producción de tapones naturales adheridos con un adhesivo. Los tapones aglomerados pueden ser fabricados con un molde individual o por extrusión: •

Moldeo individual: La mezcla de los granulados entra en un molde tubular y, posteriormente, es compactada con la ayuda de un pistón. Después se introducen los tubos rellenos en una estufa para permitir la reticulación de la cola. Tras esta operación, se desmoldan obteniendo el cuerpo de tapón listo para ser mecanizado.

•

Extrusión: Una mezcla de granulado, aglutinante y lubrificante, dispuesta en una tolva que alimenta a un cilindro sometido cíclicamente a la presión de un pistón. Por el extremo contrario del cilindro, vamos obteniendo una barra de aglomerado en forma continua (denominada comúnmente "morcilla" o "butifarra"), que será cortada y lista para mecanizar después de un periodo de estabilización.

Para la elaboración de tapones aglomerados una vez extrusionado o moldeado de forma individual se procede al pulido y esmerilado, posteriormente se realiza la clasificación visual, el marco y el tratamiento de superficie. Finalmente, el proceso termina co el embalaje y la distribución de los tapones. En cuanto a la producción de los tapones de tipo BMT, se efectúa el mismo proceso realizado para los tapones aglomerados pero el tamaño del granulado que se utiliza para la fabricación de los tapones BMT es mayor. Esta diferencia en el tamaño de los granulados afecta a la calidad del tapón, siendo el tapón BMT de una menor calidad que los tapones aglomerados. Las siglas BMT significan Biselado Marcado Tratado.

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4.8.4.- Terminación del tapón: Lavado Todos los tapones se someten a un proceso de lavado, para conseguir una desinfección completa y ausencia de carga microbiana en los mismos. Se realiza en un bombo de acero inoxidable cerrado con una válvula de descarga. Esta máquina utiliza un sistema por aspersión siendo prácticamente inapreciable los residuos de los productos del corcho y mediante el cual se consigue la desinfección por la eliminación de gérmenes, blanquea y elimina las partes leñosas del corcho, elimina el gusto a tapón y elimina de un modo casi total los taninos. Además, las características químicas y moleculares del tapón permanecen inalterables Estabilización Antes de proseguir con los tratamientos de terminado del tapones necesario que lo tapones tengan un tiempo de estabilización para que sus variables físicas (humedad, temperatura) se encuentren en los valores óptimos para que el tratamiento de lavado y los tratamientos de terminación posteriores pueden cumplir su función. Marcado Una vez los tapones han adquirido un valor de humedad óptimo, se procede a la impresión del logotipo que desea la bodega. Los tapones se hacen pasar por el sello de acero o aluminio que por calor o tinta respectivamente, deja impresa el logotipo en el desarrollo del tapón. En todos los casos, el marcado de las cabezas del tapón siempre se realiza a fuego. Igualado Los tapones se introducen en un bombo giratorio y mediante aspersión se le aplica una mezcla de polímeros naturales, con lo que se consigue una homogeneización de los tapones tratados. También se evita la aparición de gérmenes nocivos en los caldos vínicos, aumenta la resistencia a la capilaridad y mantiene intactas las características físicas y químicas del tapón por tratarse de un proceso físico y no químico. Lubricado En este proceso se utilizan dos productos, por un lado una emulsión acuosa de parafina y por otro elastómeros de silicona. De este modo se obtiene una película, que envuelve el tapón

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proporcionando un toque suave, brillante y altamente deslizante. Además evita el desprendimiento de polvo, de capilaridad y migración cuando el tapón está sometido al taponado. Envasado El envasado se realiza en bolsas a las que se realiza el vacío y posteriormente se introduce gas SO 2 como prevención de la posible aparición de microorganismos. La bolsa se cierra por termorresistencia. Asegurando siempre unas condiciones de almacenado de unos 20 ºC y una humedad ambiental del 75 %.

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5. METODOLOGÍA En este apartado, procederemos a explicar todo el proceso que hemos llevado a cabo para la realización del trabajo. 5.1. Metodología elaboración vino En este proceso de elaboración, el vino tinto se realiza a partir del mosto de uvas tintas que fermentan junto con las partes sólidas de la uva (hollejo y pepitas). Esta elaboración la llevaremos a cabo en las siguientes fases: Vendimia Hemos elaborado vino a partir de 57 kilogramos de uva de la variedad Cabernet-Sauvignon recogidos en la parcela de la bodega J. Martínez Verdú el día 20 de Octubre. La mitad de la muestra, 28.5 kilogramos, la congelamos para posteriormente elaborar vino con uva congelada.

Ilustración 23 Viñedo en el que se vendimiaron las uvas con las que se ha producido el vino (38º35’24,55’’N - 1º15’57,78’’O elev.800m)

Despalillado y adición de metabisulfito Los 28.5 kilogramos de uva restantes son introducidos en una máquina estrujadora-despalilladora para separar el racimo de la baya, la pasta resultante se introduce en un depósito de acero inoxidable. Posteriormente, se le añade metabisulfito de potasio para impedir la aparición o crecimiento de microorganismos que pueden estropear el vino y retrasar el comienzo de la fermentación. Tenemos que añadir 150 miligramos de metabisulfito por cada kilogramo de uva, es decir, 4.28 gramos y se va agregando por capas uniformes conforme vamos vertiendo la uva estrujada al depósito.

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Ilustración 24 Despalillado de la uva

A este mosto le analizamos: -pH: mediante un pH-metro -Acidez total: mediante una valoración ácido-base. -Densidad: mediante un mostímetro Para ello, seguimos los siguientes pasos: 1. Extraemos una pequeña cantidad de mosto, en un vaso de precipitados y medimos su densidad mediante un mostímetro calibrado en grados Baumé (ºBé.).

Ilustración 25 Medición de la densidad del mosto con un mostímetro

2. Para medir el pH utilizaremos un pH-metro. Introducimos una muestra de vino en un pequeño vaso y metemos unos imanes, junto con unos electrodos y anotamos su valor.

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Ilustración 26 Medición del pH del mosto con un pH-metro

3. Para determinar la acidez total de la muestra, extraemos 30 ml de mosto y le añadimos otros 30 ml de agua destilada. Esta muestra se coloca en un vaso de precipitados y lo colocamos debajo de una bureta que contiene sosa (NaOH) cuya concentración es 0.5M. Vertemos la sosa gota a gota hasta que el valor del pH de la muestra alcance el valor de 7. Una vez obtenida ese valor, observamos el volumen de sosa restante, entonces realizamos la diferencia y obtenemos el volumen de sosa que hemos utilizado para alcanzar ese pH. Seguidamente calculamos el valor de la acidez total en g/L Tartárico mediante las siguientes operaciones matemáticas:

Volumen mosto x Normalidad mosto= Volumen NaOH x Normalidad NaOH (Normalidad=Molaridad x número de equivalentes) Pie de cuba: adición de las levaduras Al día siguiente, realizamos el pie de cuba. Para ello seguiremos los siguientes pasos: -

Echamos agua (37 ml) y la calentamos hasta alcanzar 38 / 40 grados.

-

Cuando alcanza esa temperatura se añade las levaduras y se agita.

-

Se extrae mosto del depósito y se le mide la temperatura.

-

Añadimos a la mezcla de las levaduras y el agua 3,71 ml de mosto.

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-

Tras 30 minutos, se añaden otros 37 ml de mosto.

-

Esperamos otros 30 minutos y se mide la temperatura del pie de cuba. Si la diferencia de temperatura respecto al mosto del depósito inicial es menor de 10 grados, ésta se introduce automáticamente en el fondo del depósito a través de un tubo. En el caso de que la diferencia de temperatura fuera mayor de 10 grados, se deberían añadir otros 37 ml de mosto y esperar otros 30 minutos. En nuestro caso, la diferencia de temperatura obtenida fue menor de 10 grados por lo que la muestra fue introducida en la cuba sin necesidad de añadir otros 37 ml de mosto.

Fermentación alcohólica Tras la adición de las levaduras (Saccharomyces cerevisiae) comienza la fermentación alcohólica, mediante la cual todo el azúcar de las uvas se transformará en etanol (alcohol del vino). El control de la temperatura es muy importante para que se produzca este proceso, ya que las levaduras actúan en una franja comprendida entre los 12 ºC y los 32 ºC, por esta razón se realizaron mediciones de temperatura cada 8 horas aproximadamente. Además, es necesario hacer medidas de la densidad del mosto, ya que cuando ésta llegue al valor de 0º Bé (Grados Baumé) las levaduras habrán terminado su trabajo, finalizando así la fermentación alcohólica. Cada 8 horas se realizan las siguientes medidas: 1. Temperatura del sombrero: Introducimos el termómetro en el sombrero para comprobar que la temperatura a la que está ocurriendo el proceso es la correcta. Cuando la temperatura aumenta demasiado (más de 30 ºC) hay que refrigerar la cuba transportándola a otro lugar más fresco (por ejemplo, un frigorífico); si por el contrario la temperatura es demasiado baja (menos de 15 ºC) se coloca cerca de una estufa. 2. Temperatura del mosto: Extraemos una pequeña muestra de mosto (aproximadamente un vaso) y le introducimos el termómetro. Tras estas dos mediciones procedemos a eliminar el dióxido de carbono (CO2) del mosto agitando la muestra extraída para poder calcular la densidad de nuestro vino y el estado de la fermentación. Para que el gas carbónico disuelto no empuje el mostímetro hacia arriba modificando el valor real de la densidad de nuestro vino es necesario eliminar el CO2.

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3. Temperatura del mosto sin CO2: Colocamos el termómetro en el vaso y anotamos de la temperatura. 4. Densidad del vino: Para ello utilizamos un densímetro calibrado en Grados Baumé y en g/cm3. Introducimos dicho densímetro en una probeta y lo giramos suavemente, esperamos a que se estabilice y anotamos el valor de la densidad en las dos escalas. Con esta medición conocemos la situación de la fermentación, ya que cuando la densidad sea de 0 ºBé habrá terminado la fermentación. Tras estas pruebas pasamos a realizar un bazuqueo para mezclar el sombrero con el líquido en el interior de la cuba.

Ilustración 27 Bazuqueo

Prensado Cuando termina la fermentación alcohólica, prensamos nuestro vino con una prensa hidráulica. Para ello, se llena la cámara de su interior de agua para que vaya aumentado su volumen. Antes de que esta cámara se ponga en contacto con las paredes de la prensa, introducimos el contenido de nuestra cuba en ella de forma homogénea. Una vez introducida la muestra, colocamos la tapadera y los tornillos de la prensa. Tras esto, terminamos de llenar la cámara de agua, hasta que ésta alcance su presión máxima. Comienza así, a salir el vino, pero esta vez sin sólidos, y se va vertiendo sobre un recipiente. Cuando ya no queda más líquido en el interior de la prensa, introducimos el vino obtenido en una cuba para que comience la fermentación maloláctica.

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Dado que en ninguno de los dos casos obtuvimos mosto suficiente para llenar el depósito, quemamos una pastilla de azufre en su interior para que no quede oxígeno y pueda así llevarse a cabo correctamente la siguiente fermentación.

Ilustración 28 Prensa hidráulica

Fermentación maloláctica Tras esto, comienza la fermentación maloláctica basada en la transformación del ácido málico en ácido láctico por acción de bacterias lácticas. La temperatura ideal para la realización de este proceso se sitúa entre los 20 y 25 ºC. A los tres días del inicio de la fermentación maloláctica se realiza el primer trasiego que consiste en trasladar el líquido de un recipiente a otro, para así separar las lías gruesas. Al cabo de una semana se repite la misma operación, pero en esta última separaremos las lías finas.

Ilustración 29 Trasiego

Análisis Una vez terminada la fermentación maloláctica, realizamos una serie de análisis en el laboratorio para comprobar el estado de nuestro mosto. En estos análisis medimos el pH, la acidez total y el grado alcohólico, así como el sulfuroso total y libre.

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-pH: Para la medición del pH utilizamos el mismo método que empleamos anteriormente, al igual que para conocer el valor de la acidez total, también emplearemos el método utilizado anteriormente. - Grado alcohólico: El grado alcohólico lo obtendremos con un ebullómetro. Para ello, introducimos en primer lugar agua, para comprobar su punto de ebullición. Tras esto, desechamos este agua e introducimos una muestra de mosto en el ebullómetro, y observamos cual es su punto de ebullición. Con este valor, podemos conocer el grado de alcohol de nuestro mosto al relacionarlo mediante una regla graduada.

Ilustración 30 Ebullómetro

- Sulfuroso libre: Para ello, tomaremos una muestra de 25mL de vino en un vaso. A estos 25 ml de vino le añadimos 2 ml de ácido sulfúrico (H2SO4) al 25%, y pasados quince minutos añadimos una cucharilla de Yoduro potásico (KI); con esta mezcla, observamos que el vino cambia a un color brillante. El valor del sulfuroso libre de nuestro vino lo obtendremos gracias a un titrador de sulfuroso cuyo punto final de valoración será de 150 mV. - Sulfuroso total: Tomamos otros 25 ml de vino en un vaso, le añadimos 10 ml de sosa (NaOH) 4M y una cucharilla de Yoduro potásico (KI). Al igual que como ocurría en la medición del sulfuroso libre, el sulfuroso total también lo obtendremos gracias al titrador de sulfuroso. Álvaro Moreno García

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Ilustración 31 Titrador de sulfuroso

Cromatografía en capa fina Para asegurarnos de que nuestra fermentación maloláctica ha concluido, pasaremos a realizar una cromatografía para confirmar que todo el ácido málico se ha convertido en láctico. Para ello, seguimos los siguientes pasos: 1. Colocamos una gota de vino a 1 cm del borde del Papel Whatman nº 1. 2. Introducimos la tira de papel en un recipiente cromatográfico saturado de Butanol (C4H10O) que será lo que denominemos solvente; de manera que el borde inferior del papel apenas lo toque. 3. Dejamos que el solvente vaya ascendiendo por el papel, durante unas dos horas, hasta que se alcance una altura de 15 cm. 4. Tras esto, sacamos la tira de papel y la dejamos secar en un sitio aireado y en ausencia de vapores ácidos. 5. Una vez seca, se pulveriza sobre el papel una solución reveladora (Disolución acuosa de verde de bromotimol al 15%.), apareciendo entonces unas manchas amarillas sobre un fondo verde-azulado. Tras añadir esta solución, aparecerán tres manchas: la inferior correspondiente al ácido tartárico; en medio el ácido málico y en la parte superior del papel una mancha debida a los ácidos láctico y succínico. En nuestros experimentos, observamos que la marca correspondiente al ácido málico era muy pequeña, y la correspondiente al ácido láctico muy amplia, por lo que afirmamos que ha terminado nuestra fermentación maloláctica.

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Ilustración 32 Cromatografía en capa fina

Estabilización por frío y embotellado Cuando termina la fermentación maloláctica, realizamos la estabilización por frío, que consiste en introducir los depósitos en un refrigerador a una temperatura de – 6 ºC, para estabilizar así el vino. A la semana de introducir el vino en el congelador, pasamos a realizar un nuevo trasiego, y tras esto embotellamos nuestro vino con tapones de corcho mediante una embotelladora manual.

Ilustración 33 Embotelladora manual

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5.2. Metodología mediciones de los parámetros de los tapones de corcho He estudiado los siguientes parámetros de los tapones de corcho:

1.- Diámetro 2.- Longitud 3.- Ovalidad 4.- Densidad 5.- Cantidad de oxidantes 6.- Microbiología

A continuación, procederé a explicar el método de ensayo por el que hemos utilizado para calcular los parámetros citados anteriormente. También nombraré el material utilizado en cada método, el cálculo y expresión de los resultados.

Álvaro Moreno García

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5.2.1.- Método para el cálculo del diámetro de los tapones de corcho. Materiales: -

Tapones de corcho ( naturales, aglomerados, técnicos, BMT)

-

Calibre o pie de rey de precisión ± 0,05 mm.

Método: Para tapones naturales: Mediante el pie de rey se realizan dos mediciones en una de las caras del tapón, una en sentido paralelo a las venas de crecimiento y otra en sentido perpendicular. De esta forma, obtenemos dos medidas. Se anota la diferencia entre las dos medidas de cada una de las caras. Para tapones aglomerados: Se realiza el mismo sistema de medición que para los tapones naturales para vino tranquilo. Cálculo y expresión de los resultados: El valor del diámetro se calcula por la aplicación de la siguiente formula

Donde es el diámetro medio en mm

y

son los diámetros medidos en los sentidos paralelo y perpendicular a las líneas de

crecimiento en mm. El diámetro se expresa en milímetros redondeando a la décima de unidad más próxima. a.

b.

Ilustración 34 a) Medida del diámetro en sentido paralelo a las líneas de crecimiento (

)

b) Medida del diámetro en sentido perpendicular a las líneas de crecimiento (

Álvaro Moreno García

)

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5.2.2.- Método para el cálculo de la longitud de los tapones de corcho. Materiales: -

Tapones de corcho ( naturales, aglomerados, técnicos, BMT)

-

Calibre o pie de rey de precisión ± 0,05 mm.

Método: Mediante el pie de rey se mide la longitud o altura de los diferentes tipos de tapones de corchos, tomando una medida en el eje de simetría mediante el pie de rey. Expresión de los resultados: La longitud se expresa en milímetros redondeando a la décima de unidad más próxima.

Ilustración 35 Medida de la longitud de un tapón

5.2.3.- Método para el cálculo de la ovalación de los tapones de corcho. Materiales: -

Tapones de corcho ( naturales, aglomerados, técnicos, BMT)

-

Calibre o pie de rey de precisión ± 0,05 mm.

Método: Mediante el pie de rey se realizan dos mediciones del diámetro, una en sentido paralelo a las venas de crecimiento y otra en sentido perpendicular. Cálculo y expresión de los resultados: El valor de la ovalación se calcula por la aplicación de la siguiente formula

Donde es la ovulación en mm

Álvaro Moreno García

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y

son los diámetros en los sentidos paralelo y perpendicular a venas de crecimiento en mm

La ovulación se expresa por el valor absoluto en milímetros, redondeando a la décima de unidad más próxima.

5.2.4.- Método para el cálculo de la densidad de los tapones de corcho. Materiales: -

Tapones de corcho ( naturales, aglomerados, técnicos, BMT)

-

Balanza de precisión 0,1 g

-

Calibre o pie de rey de precisión ± 0,05 mm.

Método: Se pesa cada tapón con la balanza definida anteriormente, anotando su masa en gramos redondeado a 0,01 g , se mide el diámetro y la longitud tomando una medida en el eje de simetría mediante el pie de rey. Cálculo y expresión de los resultados: El valor de la densidad se calcula por la aplicación de la siguiente formula

Donde es la densidad en Kg/ m 3 es la masa en gramos redondeada a 0,01 gr. es el diámetro medio calculado y expresado en mm. es la longitud en milímetros redondeada a 0,1 mm. El valor de la densidad se expresa en Kg/ m 3 , redondeando a la unidad más próxima.

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5.2.5.- Método para el cálculo de la cantidad de oxidantes en los tapones de corcho. Este ensayo permite controlar la ausencia de residuos de productos de lavabo de carácter oxidante que provienen del lavado de los tapones (peróxido). Materiales y reactivos: -

Tapones de corcho ( naturales, aglomerados, técnicos, BMT)

-

Frasco de vidrio de 100 ml con cierre hermético

-

Buretas y pipetas clase A

-

Solución acuosa de KI (ioduro de potasio) 20 gr/l. debe estar recién preparada para evitar falsos positivos ya que el KI se oxida a I molecular I2 con mucha facilidad

-

Solución acuosa de almidón al 3%

-

Solución de ácido acético al 50%

-

Solución de patrón tiosulfato sódico 0.02N.

Método: Se introduce el tapón a ensayar en el frasco y se añade: 50ml de la solución acuosa de KI, 5 ml de la solución de ácido acético al 50 %, 5 ml de la solución acuosa de almidón al 3% y 40 ml de agua destilada. El tapón se mantiene sumergido y en agitación durante una hora, al cabo de la cual se extrae. Expresión de los resultados: Si la solución se mantiene incolora, se manifiesta la ausencia de residuos de peróxidos en el tapón.

Ilustración 36 Cálculo de la cantidad de oxidantes en los tapones de corcho

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5.2.6.- Método para el aislamiento de hongos presentes en tapones de corcho y vino. Este ensayo permite establecer el recuento de hongos filamentosos y levaduras presentes en los diferentes tipos de tapones de corcho y vino analizados. Material: -

Tapones de corcho (naturales, aglomerados, 1+1, BMT)

-

Solución salina estéril al 0,9 %

-

Agua destilada

-

Frascos de vidrio de 500 ml

-

Placas de Petri

-

Medio de cultivo: Agar glucosado de Sabouraud adicionado de 30 ppm de clorhidrato de tetraciclina

-

Bomba de vacío (filtro de porcelana unido a una jeringa)

-

Filtros estériles Whatman GR 113

-

Estufa para incubación

Procedimiento: - Se prepara la solución salina al 0,9 % en un matraz de 1 litro. - Se pone a la mezcla durante unos 25 – 30 minutos. Para preparar los 30 ppm de clorhidrato de tetraciclina que posteriormente serán añadidos al medio de cultivo utilizaremos el antibiótico amoxicilina.

Ilustración 37 Antibiótico amoxicilina

- Se tritura la amoxicilina con un mortero y con guantes para no afectar a su estado de esterilización. Se utilizan 3 comprimidos de 1 gramo cada uno, obteniendo 3 gramos de antibiótico. A partir de estos 3 gramos obtenemos las 30 ppm necesarias para el medio de cultivo mediante una serie de diluciones:

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1º Se introducen los 3 gramos en 100 ml de agua. La concentración de esta solución es del 3 %. 2º Se extraen 10 ml de la solución anterior y se le añaden 90 ml de agua. La concentración de esta solución es del 0,3 %. 3º Se extraen 10 ml de la solución anterior y se le añaden 90 ml de agua. La concentración de esta solución es del 0,03 %. 4º Se extraen 10 ml de la solución anterior y se le añaden 90 ml de agua. La concentración de esta solución es del 0,003 %. De este modo, obtenemos las 30 ppm de clorhidrato de tetraciclina que necesitamos añadir al medio de cultivo. -

Tras esto, se pesan 65 gramos de Agar Sabouraud. Estos 65 gramos se echan en un matraz vacío de 1 litro. A continuación, se vierten 900 mililitros de agua destilada y después se rellenará con los 100 mililitros de agua destilada que contiene los 30 ppm de clorhidrato de tetraciclina.

Antes de verter los 100 mililitros del agua destilada con el clorhidrato de tetraciclina, se esteriliza los 900 mililitros de agua destilada con Agar en la olla express a 121 ºC.

Ilustración 38 Esterilización del Agar Sabouraud en la olla express

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Estudio de la microbiología del vino y los tapones de corcho Estudio Microbiología tapones de corcho y vino.

-

Seguidamente, se acondiciona la solución a 42 – 44 ºC y se procede a añadir los 100 mililitros de agua destilada con clorhidrato de tetraciclina. Una vez realizado esto, se vierte el litro que contiene el Agar y el antibiótico cerca de una llama proporcionada por un mechero bunsen para evitar la contaminación de los medios de cultivo, ya que alrededor de 15 cm de la llama se considera un medio estéril, en las placas Petri, éstas se van apilando bocabajo para evitar la condensación del vapor de agua que se forma en la tapadera que podría precipitar y estropear la muestra. a.

b.

Ilustración 39 a) Acondicionamiento de la solución b) Apilación de las placas Petri con el medio de cultivo

Necesitaremos 13 litros de solución salina estéril al 0,9 % puesto que utilizaremos 0,5 litros por cada 2 tapones puros del mismo tipo y 0,5 litros por cada tapón que ya ha estado en contacto con el vino. Utilizaremos 16 tapones puros y 16 tapones que han sido utilizados para embotellar el vino. - Cuando los frascos de solución salina han alcanzado la temperatura ambiente, se introducen los tapones y se agitan manualmente durante 20 minutos. a.

b.

Ilustración 40 a) Tapón entero en la solución salina b) Tapón triturado en la solución salina

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Los medios de cultivo se realizarán a partir de tapones de corcho triturados y enteros. Antes de ser filtrados, los tapones triturados se pasarán por un colador y un filtro de tela para evitar que se amontone todo el corcho sobre el papel de filtro. -

Tras esto, se filtra el contenido de cada frasco a través de un filtro estéril de Whatman GR 113. Una vez filtrado el contenido, se deposita el filtro en una placa de Petri que contiene el medio de Agar Sabouraud. a.

b.

Ilustración 41 a) Filtro de porcelana unido a una jeringa mediante el cual se realizó la filtración de las soluciones salinas y el vino b) Papel de filtro a través del cual se filtra el contenido de las soluciones salinas y el vino

- Estas placas de Petri se introducen en una estufa para la incubación a 22 ºC durante 3 días.

Ilustración 42 Estufa para la incubación

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55

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-

Tras este tiempo se procede a la identificación de hongos filamentosos y levaduras que se han desarrollado sobre los filtros incubados.

Ilustración 43 Microorganismos desarrollados sobre un filtro incubado

Para la elaboración de los medios de cultivo de las levaduras se realiza el mismo proceso realizado para crear los medios de cultivo de hongos filamentosos, pero se prepararon 40 gramos de medio Agar Sabouraud al que se le añadió 1 gramo de amoxicilina. Posteriormente, se diluye 1 gramo de

Saccharomyces cerevisiae en diferentes volúmenes de

solución salina estéril al 0,9 % (200 ml, 400 ml y 600 ml). Después, se realiza el cultivo con una asa de cultivo mediante la técnica de sembrado césped.

Álvaro Moreno García

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6. RESULTADOS 6.1.- Resultados elaboración vino En este apartado vamos a exponer los resultados que hemos obtenido en los análisis iniciales, seguimiento de la fermentación alcohólica, los análisis realizados después de la fermentación alcohólica y los análisis efectuados tras el embotellamiento del vino realizado con uva normal y del realizado con uva congelada. Vino realizado con uva no congelada Tras el despalillado de las uvas y la adición de metabisulfito, pasamos a analizar estos parámetros iniciales: -pH → 3,35 -Densidad → 12,5º Bé = 1095 g/L -Acidez total → 6,15 g/L de tartárico Para obtener el valor de la acidez total aplicamos la fórmula anterior: Volumen mosto x Normalidad mosto= Volumen NaOH x Normalidad NaOH 30 x N. Vino = 4,9 x 0,5 N. vino= 0,082N g/L tartárico = N x

=0,082x

= 6,15 g/L

Mediante el seguimiento de la fermentación alcohólica obtenemos la siguiente tabla

Álvaro Moreno García

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O

Día

Hora

Tª Sombrero

Tª Mosto

Tª Medida

Bé

Densidad

1º

10:00

16 O C

16,7 O C

20,5 O C

13,8

1105

1º

13:00

16O C

17 O C

20 O C

13,8

1105

1º

20:00

16 O C

18 O C

19 O C

15,8

1122

2º

13:16

22 O C

21,5 O C

22,5 O C

13,8

1106

2º

18:30

23 O C

21,6 O C

22 O C

13,7

1105

2º

21:55

23,6 O C

22 O C

22,6 O C

13,6

1104

3º

10:40*

27,7 O C

22,2 O C

22,2 O C

13,4

1102

3º

17:45

23 O C

21,5 O C

23 O C

12,2

1092

3º

21:10

24 O C

22,8 O C

22,2 O C

10,6

1080

4º

6:00*

30 O C

25,2 O C

21 O C

7,2

1052

4º

19:00

19 O C

18,3 O C

21 O C

4,8

1034

4º

23:50

21 O C

20,2 O C

20,7 O C

3,8

1027

5º

6:50

23,5 O C

21,5 O C

21,2 O C

3,2

1022

5º

15:30

25 O C

23,2 O C

23 O C

2,4

1016

5º

22:00

25,3 O C

23,2 O C

23 O C

0,3

1002

6º

6:30

25 O C

23 O C

22,4 O C

0,0

998

Tabla 4 Seguimiento fermentación alcohólica vino elaborado a partir de uvas normales

En esta tabla podemos observar las tres mediciones que realizamos por día durante las seis jornadas que duró esta fermentación. Las mediciones marcadas por un asterisco (*) hacen referencia a que hubo que refrigerar el depósito, ya que aumentó demasiado la temperatura del sombrero y como hemos explicado anteriormente, es muy importante el control de la temperatura para que se produzca correctamente la fermentación, ya que se debe mantener entre 12 ºC y 32 ºC.

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Con estos datos obtenemos las siguientes gráficas: -Temperatura del sombrero:

Gráfico 1 Evolución de la temperatura del sombrero durante la fermentación alcohólica del vino normal

-Densidad medida en grados Baumé:

Gráfico 2 Evolución de la densidad medida en grados Baumé durante la fermentación alcohólica del vino normal

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Tras la fermentación alcohólica y el consiguiente prensado de la muestra, comienza la fermentación maloláctica y en los análisis que realizamos obtenemos los siguientes resultados: -pH → 3,3 -Acidez total → 6,75 g/L tartárico Volumen mosto x Normalidad mosto= Volumen NaOH x Normalidad NaOH 10 x N. Vino = 1,8 x 0,5 N. vino= 0,09N g/L tartárico = N x

=0,09x

= 6,75 g/L

-Grado alcohol → 14% Vol. (Punto de ebullición del vino: 88,7 ºC = 14% Vol.) -Sulfuroso libre → 72 mg/L -Sulfuroso total → 165 mg/L

Tras el embotellado, realizamos los últimos análisis de este vino, y obtuvimos los siguientes datos: - Grado alcohol→ 16% Vol. - Acidez total→ 6,85 g/L tartárico - pH → 3,22 - Sulfuroso libre → 15 mg/L - Sulfuroso total→ 68 mg/L - Acidez volátil→ 0,33 g/L acético - Azúcar reductor→ 1,5 g/L

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Vino elaborado con uvas congeladas En los primeros análisis obtuvimos los siguientes resultados: - pH →3,35 - Densidad→12,5º Bé = 1095 g/L - Acidez total → 6,45 g/L de tartárico Obtenemos este valor aplicando la fórmula anterior: Volumen mosto x Normalidad mosto= Volumen NaOH x Normalidad NaOH 30 x N. Vino = 4,9 x 0,5 N. vino= 0,086N g/L tartárico = N x

=0,086x

= 6,45 g/L

En la siguiente tabla podemos observar las tres mediciones que realizamos por día durante las siete jornadas que duró esta fermentación. A lo largo de este proceso, tuvimos que elevar la temperatura del ambiente para que la temperatura del vino no fuera muy baja, para ello colocamos una estufa al lado del depósito.

Álvaro Moreno García

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Día

Hora

Tª Sombrero

1º

10:00

7

1º

13:00

7,3 O C

1º

21:45

2º

O

C

Tª Mosto O

O

Densidad 1095

10,5 O C

12,5 O C

12,6

1095

9OC

12 O C

13 O C

12,6

1095

10:30

11 O C

11 O C

12,5 O C

12,6

1095

2º

17:15

11 O C

12 O C

13,5 O C

12,5

1094

2º

21:00

12 O C

13,5 O C

14,7 O C

12,5

1094

3º

9:00

13 O C

12,5 O C

14 O C

12,4

1093,5

3º

15:30

13,5 O C

14,5 O C

16 O C

12,3

1093

3º

21:00

14 O C

15 O C

15,2 O C

12,2

1092,5

4º

9:00

15 O C

14,5 O C

16 O C

12,2

1092,5

4º

15:30

15,6

12,1

1092

4º

21:15

16,5 O C

15,1 O C

17 O C

12

1091

5º

9:00

19,2 O C

16 O C

17 O C

11,4

1086

5º

17:00

22 O C

18,5 O C

19,5 O C

9,6

1070

5º

23:00

24,5 O C

20 O C

21 O C

7,4

1054

6º

7:30

25 O C

20 O C

20,6 O C

5,2

1037

6º

15:30

24 O C

20 O C

20,2 O C

3,4

1023

6º

23:00

23 O C

20 O C

20,6 O C

2,0

1013

7º

7:30

22 O C

19 O C

19 O C

0,9

1006

7º

16:30

20,5 O C

19 O C

19,2 O C

0,2

1001

7º

21:30

19,5 O C

17,8 O C

18 O C

0,0

999

14,7

O

C

12,3

Bé

12,6

C

C

O

C

O

10 ,2

Tª Medida

16,6

O

C

Tabla 5 Seguimiento de la fermentación alcohólica en el vino realizado a partir de uvas congeladas

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62

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Con los datos de la tabla anterior obtenemos las siguientes gráficas: - Temperatura del sombrero:

Gráfico 3 Evolución de la temperatura del sombrero durante la fermentación alcohólica del vino congelado

- Densidad medida en grados Baumé:

Gráfico 4 Evolución de la densidad medida en grados Baumé durante la fermentación alcohólica del vino congelado

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Tras la fermentación alcohólica y el consiguiente prensado de la muestra, comienza la fermentación maloláctica y en los análisis que realizamos obtenemos los siguientes resultados: -pH → 3,4 -Acidez total → 5,6 g/L tartárico Volumen mosto x Normalidad mosto= Volumen NaOH x Normalidad NaOH 10 x N. Vino = 1,5 x 0,5 N. vino= 0,075N g/L tartárico = N x

=0,075x

= 5,6 g/L

-Grado alcohol → 12,6% Vol. (Punto de ebullición del vino: 89,8 ºC = 12,6% Vol.) -Sulfuroso libre → 0 mg/L -Sulfuroso total → 10 mg/L Tras el embotellado, realizamos los últimos análisis de este vino, y obtuvimos los siguientes datos: - Grado alcohol → 13% Vol. - Acidez total → 5,41 g/L tartárico - pH → 3,22 - Sulfuroso libre → 1 mg/L - Sulfuroso total → 5 mg/L - Acidez volátil → 0,31 g/L acético - Azúcar reductor → 1,1 g/L

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64

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6.2. Resultados parámetros tapones de corcho

Tapones puros (no utilizados para embotellar):

- Tapones BMT

Nº Muestra

Masa

Diámetro

Longitud

Densidad

Ovalidad

(gr)

(mm)

(mm)

(Kg/ m 3 )

(mm)

1

4,5

20

35

409

0

2

4,5

20

35

409

0

3

4,7

20,18

35

420

0,3

Media

4,56667

20,06

35

412,6667

0,033

Tabla 6 Parámetros físicos de los tapones puros BMT

- Tapones aglomerados

Masa

Diámetro

Longitud

Densidad

Ovalidad

(gr)

(mm)

(mm)

(Kg/ m 3 )

(mm)

1

5,6

21

35

462

0

2

5,9

21

34,9

488

0

Nº Muestra

Álvaro Moreno García

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3

5,8

20,95

34,9

482

0,1

Media

5,76667

20,98333

34,9333

477,33333

0,033

Tabla 7 Parámetros físicos de los tapones puros aglomerados

- Tapones 1+1

Nº Muestra

Masa

Diámetro

Longitud

Densidad

Ovalidad

(gr)

(mm)

(mm)

(Kg/ m 3 )

(mm)

1

5,2

20,3

41,2

389

0,3

2

4,9

20,1

41,1

368

0,2

3

5,6

20,3

41,2

420

0

Media

5,23333

20,23333

41,16667

392,33333

0,166

Tabla 8 Parámetros físicos de los tapones puros 1 + 1

-

Tapones naturales

Nº Muestra

Masa

Diámetro

Longitud

Densidad

Ovalidad

(gr)

(mm)

(mm)

(Kg/ m 3 )

(mm)

1

2,9

20,5

42

209

0

2

3,8

20,5

41

281

0,2

3

3,9

20,55

41,2

285

0,1

Media

3,53333

20,51667

41,4

258,33333

0,1

Tabla 9 Parámetros físicos de los tapones puros naturales

Tapones que han embotellado vino:

- Vino elaborado con uva congelada

Tipo tapón

Masa

Diámetro

Longitud

Densidad

Ovalidad

(gr)

(mm)

(mm)

(kg/m3)

(mm)

1+1

5,8

18,5

46

469,07

0

BMT

4,8

17,95

37

512,65

0,1

Natural

3,8

16,95

43

391,64

0,1

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66

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Aglomerado

7,4

18

38

765,27

0

Tabla 10 Parámetros físicos de los diferentes tipos de tapones que han embotellado vino congelado

- Vino elaborado con uva normal

Tipo tapón

Masa

Diámetro

Longitud

Densidad

Ovalidad

(gr)

(mm)

(mm)

(kg/m3)

(mm)

1+1

6

18

43

548,34

0

BMT

5,2

17,5

37

584,3

0,2

Natural

3,6

18

44

321,53

0

Aglomerado

6

17,8

38

634,5

0,2

Tabla 11 Parámetros físicos de los diferentes tipos de tapones que han embotellado vino normal

Cantidad de oxidantes En cuanto a la cantidad de oxidantes en los tapones de corcho, se manifiesta la ausencia de éstos en los diferentes tipos de tapones analizados, debido a que la solución se mantuvo incolora.

Ilustración 44 Cálculo de la cantidad de oxidantes de los tapones de corcho

En la siguiente tabla, se muestra la no presencia de oxidantes en los diferentes tipos de tapones de corcho analizados.

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Presencia de

Tapones

Tapones

Tapones

Tapones

oxidantes

Aglomerados

Naturales

1+1

BMT

X

X

X

X

Sí No

Tabla 12 Presencia de oxidantes en los diferentes tipos de tapones puros de corcho natural

En los siguientes gráficos, se pueden observar las diferencias de las características físicas entre los distintos tipos de tapones puros de corcho analizados. Masa 7 5,77

6

4,57

5 masa (gr)

5,23 aglomerado 3,53

4

BMT 1+1

3

natural

2 1 0 Gráfico 5 Masa promedia de los distintos tipos de tapones de corcho puros

Densidad

densidad (Kg/m3)

600 477,33

500

412,67

400

392,33

aglomerado 258,33

300 200

BMT 1+1 natural

100 0

Gráfico 6 Densidad promedia de los distintos tipos de tapones de corcho puros

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68

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Longitud 41,17

42

41,4

longitud (mm)

40 aglomerado

38 36

34,93

BMT

35

1+1

34

natural

32 30

Gráfico 7 Longitud promedia de los distintos tipos de tapones de corcho puros

diámetro (mm)

Diámetro 21,2 21 20,8 20,6 20,4 20,2 20 19,8 19,6 19,4

20,98 20,52 20,23 20,06

aglomerado BMT 1+1 natural

Gráfico 8 Diámetro promedia de los distintos tipos de tapones de corcho puros

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6.3. Resultados identificación microorganismos En los tapones de corcho puros (no han sido utilizados para embotellar) hemos conseguido identificar los siguientes hongos filamentosos:

1. Alternaria alternata Hongo filamentoso con conidióforos simples, tabicados, en cuyo extremo se forman unos conidios muriformes, de color pardo, con septos transversales y verticales de disposición irregular. En las colonias de crecimiento rápido (tres días), al principio son de color gris, después el centro se oscurece en tonos negros. a.

b.

Ilustración 45 a) Alternaria alternata en medio Agar Sabouraud (Colonia verde oscura) b) Alternaria alternata microscópicamente 400X

2. Aspergillus niger Hongo filamentoso con cabezas conidiales biseriadas y radiales; estipes de paredes gruesas, lisos, hialinos, amarillentos o de color marrón pálido cerca de la vesícula. La vesícula es casi esférica. Posee conidios globosos de color marrón, normalmente muy rugosos con crestas irregulares y protuberancias. Sus colonias son de color negro o marrón muy oscuro, reverso incoloro a amarillo.

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70

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a.

b.

c.

Ilustración 46 a) Aspergillus niger en medio Agar Sabouraud b) Conidio de Aspergillus niger microscópicamente 400X c) Vesícula Aspergillus niger 1000X

3. Aspergillus fumigatus Hongo filamentoso con cabezas conidiales uniseriadas y predominante columnares; estipes hialinos y lisos; vesícula piriforme o en forma de cuchara. Conidios globosos o ovoides, lisos o ligeramente rugosos. Sus colonias son de color verde azulado; micelio blanco; textura aterciopelada plana.

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71

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a.

b.

Ilustración 47 a) Aspergillus fumigatus en medio Agar Sabouraud (colonia azulada) b) Aspergillus fumigatus microscópicamente 400X

4. Trichoderma viride Hongo filamentoso cuyas colonias son de color verde olivo brillante de aspecto rugoso.

Ilustración 48 Trichoderma viride en medio Agar Sabouraud (Colonia verde)

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72

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5. Aureobasidium pullulans Hongo dimorfo que presenta micelio pigmentado con hifas de las que nacen de forma sésil numerosos conidios hialinos y piriformes, los cuales, una vez libres, forman por gemación otros más pequeños. En cultivo se muestra en una gran variedad de colores y formas. A 25 ºC se desarrolla como colonias blancas o cremosas.

Ilustración 49 Aureobasidium pullulans en medio Agar Sabouraud (colonia blanca)

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73

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En cuanto a especies de levaduras y bacterias hemos conseguido identificar las siguientes:

1. Saccharomyces cerevisiae También conocida como la levadura de cerveza ,es un hongo unicelular, un tipo de levadura utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación. Este proceso se lleva a cabo cuando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azúcares. Se reproducen de forma asexual por gemación. a.

b.

Ilustración 50 a) Saccharomyces cerevisiae en medio Agar Sabouraud b) Saccharomyces cerevisiae visto microscópicamente

2. Candida albicans Candida albicans es un hongo diploide asexual, saprófito de la familia de los Sacaromicetos. Candida Albicans está presente en todos nosotros. Se encuentra en las membranas superficiales y en las mucosas. Este hongo suelta toxinas en el torrente sanguíneo que tiene un efecto devastador en el sistema nervioso y el sistema inmune.

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74

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a.

b.

Ilustración 51 a) Candida albicans en medio Agar Sabouraud b) Candida albicans visto microscópicamente

3. Bacillus cereus Bacillus cereus es una especie de bacteria que causan envenenamiento por consumo. Produce dos tipos de enterotoxinas: toxinas termoestables y termolabiles lo que permite el crecimiento a temperaturas extremas y las variaciones de la mismas sin ocasionar desnaturalización de la bacteria.

Ilustración 52 Bacillus cereus en medio Agar Sabouraud

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75

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En la siguiente lista se especifica en que tipo de tapón de corcho aparece cada una de las especies de hongos filamentosos identificadas: -

Aspergillus niger → Aparece en tapones triturados de tipo aglomerado, BMT y natural.

-

Alternaria alternata → Aparece en tapones enteros de tipo BMT

-

Trichoderma viride → Aparece en tapones triturados de tipo BMT

-

Aspergillus fumigatus → Aparece en todos los tipos de tapones analizados, tanto en tapones enteros como en tapones triturados.

-

Aureobasidium pullulans → Aparece en tapones triturados de tipo BMT.

En la siguiente lista se especifica en que tipo de tapón de corcho aparece cada una de las especies identificadas de levaduras y bacterias en vinos: -

Saccharomyces cerevisiae → Aparece tanto en tapones de corcho puro (50%) como en el vino producido con uva congelada (100%) y en el vino realizado con uva normal. (58,82%)

-

Candida albicans → Aparece en tapones de corcho puro (33,33%) y en el vino realizado con uva normal. (17,65%)

-

Bacillus cereus (Bacterias) → Únicamente aparece en el vino elaborado a partir de uva normal (11,76%).

En la siguiente tabla se puede observar las especies de hongos filamentosos, levaduras y bacterias aisladas a partir de tapones puros de corcho naturales, del vino realizado con uva normal y con uva congelada:

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76

Estudio de la microbiología del vino y los tapones de corcho Estudio Microbiología tapones de corcho y vino.

Tapones que no han embotellado vino Microorganismo

Vino producido con:

Tapón

Tapón

Tapón

Tapón

Uva no

Uva

natural

aglomerado

BMT

1 +1

congelada

congelada

Aspergillus niger

X(t)

X(t)

2X(t)

Alterinaria

X(t)

X(e)-X(t)

X(1)

X(1)

2X(t)

10 X

21 X

2X(e)

alternata 2X(t)

Trichoderma viride X(e)

Aspergillus

X(t)

X(t)-X(e)

fumigatus X(t)

Aureobasidium pullulans Saccharomyces

2X(e)-2X(t)

2X(e)-3X(t)

2X(e)

2X(e) 3X(t)

cerevisiae Candida albicans

3X 2X

Bacillus cereus

Tabla 13 Número de muestras en las aparecen cada especie de microorganismo

X hace referencia a la aparición de ese microorganismo en ese tipo de tapón o vino (t) hace referencia a que el microorganismo aparecen en un tapón triturado (e) hace referencia a que el microorganismo aparecen en un tapón entero (1) hace referencia a que el vino estaba embotellado por un tapón del tipo 1+1 En los tapones de tipo BMT aparecen todas las especies de hongos filamentosos identificados en tapones puros. El tipo de tapón en el que menos especies de hongos filamentosos son los tapones de tipo 1 + 1. En cuanto a las especies de hongos filamentosos identificados predominan Aspergillus fumigatus y Aspergillus niger.

En los siguientes gráficos se puede observar el porcentaje de las colonias aisladas de cada tipo de hongos filamentoso identificado en cada tipo de tapón de corcho analizado.

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Estudio de la microbiología del vino y los tapones de corcho Estudio Microbiología tapones de corcho y vino. Aspergillus niger 0%

25% Tapón natural Tapón aglomerado Tapón BMT

50%

Tapón 1 +1 25%

Gráfico 9 Porcentaje de colonias de Aspergillus niger en cada tipo de tapón de corcho puro Aspergillus fumigatus

13% 13% Tapón natural Tapón aglomerado Tapón BMT

49%

Tapón 1 +1 25%

Gráfico 10 Porcentaje de colonias de Aspergillus fumigatus en cada tipo de tapón de corcho puro Alternaria alternata 0% 33%

Tapón natural Tapón aglomerado Tapón BMT

67%

0%

Tapón 1 +1

Gráfico 11 Porcentaje de colonias de Alternaria alternata en cada tipo de tapón de corcho puro Trichoderma viride 0 0 0

Tapón natural Tapón aglomerado Tapón BMT Tapón 1 +1

100%

Gráfico 12 Porcentaje de colonias de Trichoderma viride en cada tipo de tapón de corcho puro

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78

Estudio de la microbiología del vino y los tapones de corcho Estudio Microbiología tapones de corcho y vino. Aureobasidium pullulans 0 0 0

Tapón natural Tapón aglomerado Tapón BMT Tapón 1 +1

100%

Gráfico 13 Porcentaje de colonias de Aureobasidium pullulans en cada tipo de tapón de corcho puro

En el vino producido con uva normal aparecen 2 especies de levaduras: Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans predominando la primera, mientras que en el vino realizado con uva congelada solo aparece Saccharomyces cerevisiae. Esta especie de levadura también aparece en los tapones de corcho puros. En el vino producido con uva normal aparece una especie de bacterias: Bacillus cereus, mientras que en el vino realizado con uva congelada no aparece ninguna especie de bacterias. En los siguientes gráficos se puede observar el porcentaje de las colonias aisladas de cada tipo de levaduras y bacterias identificados en cada tipo de tapón de corcho analizado y tipo de vino.

Saccharomyces cerevisiae

26% Tapones puros Vino normal Vino congelado

50% 24%

Gráfico 14 Porcentaje de colonias de Saccharomyces cerevisiae en cada tipo de tapón de corcho puro

Candida albicans

30% Tapones puros Vino normal 70%

Gráfico 15 Porcentaje de colonias de Candida albicans en cada tipo de tapón de corcho puro

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6.4. Resultados crecimiento de las levaduras En las siguientes fotos se puede contemplar el crecimiento de las levaduras Saccharomyces cerevisiae en el medio de cultivo Agar Sabouraud. En la columna de la izquierda se puede observar los cultivos realizados a partir de levaduras refrigeradas en el frigorífico, diluidas en un volumen de 400 ml y 600 ml respectivamente. En la columna de la derecha se puede observar los cultivos realizados a partir de levaduras congeladas, diluidas en un volumen de 400 ml y 600 ml respectivamente. a.

b.

c.

d.

Ilustración 53 Cultivo de Saccharomyces cerevisiae refrigeradas y congeladas

F hace referencia a que las levaduras han sido refrigeradas en el frigorífico C hace referencia a que las levaduras han sido congeladas 400 y 600 ml se refiere al volumen de dilución con el que se realizaron los medios de cultivo

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Mediante el análisis y la comparación de estas fotos, podemos afirmar que las levaduras crecen en la misma cantidad tras ser congeladas ya que en los medios de cultivo las superficies de crecimiento son muy similares. A modo de curiosidad, podemos destacar esta fotografía en la que se observa muy bien el proceso de gemación de las levaduras, algo que se ve manera teórica, pero rara vez de forma práctica. La gemación es un tipo de reproducción asexual a través del cual un organismo crea copias genéticamente similares a sí mismo. Consiste en la división del citoplasma y el núcleo, el núcleo resultante se desplaza hacia la membrana, formando una especie de yema que se rodea de citoplasma, formándose así dos células de diferente tamaño. a.

b.

Ilustración 54 a) Fotografía microscópica de Saccharomyces cerevisiae en la que se observa el proceso de gemación b) Proceso de la gemación visto de forma teórica

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81

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7. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

7.1. Discusión de los resultados de la elaboración del vino Análisis iniciales: Vino elaborado con uva no congelada - pH →3,35 - Densidad→12,5º Bé = 1095 g/L - Acidez total → 6,15 g/L de tartárico Vino elaborado con uva congelada - pH →3,35 - Densidad→12,5º Bé = 1095 g/L - Acidez total → 6,45 g/L de tartárico

En los análisis iniciales de ambos vinos, comprobamos que las diferencias entre ellos son mínimas, ya que el pH y la densidad son iguales, mientras que la acidez total sufre un pequeño cambio. Por tanto, podemos afirmar que las diferencias entre los dos vinos al comienzo de la elaboración son prácticamente nulas.

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Fermentación alcohólica Durante este proceso la principal diferencia reside en la duración del mismo: la fermentación alcohólica de las uvas normales dura seis días, mientras que en las congeladas la duración es de siete días. Esto se debe principalmente a las diferentes temperaturas a las que ocurren cada una. Este hecho lo podemos observar en la siguiente gráfica de la temperatura del sombrero:

Gráfico 16 Comparación de la temperatura del sombrero durante la fermentación alcohólica entre los vinos realizados a partir de uva normal y a partir de uva congelada

En este gráfico se puede observar la evolución de la temperatura del sombrero durante la fermentación alcohólica. Observamos que las uvas congeladas fermentan a una menor temperatura, y por tanto dura más tiempo la fermentación, a diferencia del otro tipo de uva que fermenta a una temperatura mayor y más rápidamente.

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Esta gráfica representa la temperatura del mosto durante la fermentación. Es prácticamente idéntica a la de la temperatura del sombrero, por lo que llegamos a las mismas conclusiones que en la anterior gráfica.

Gráfico 17 Comparación de la temperatura del mosto durante la fermentación alcohólica entre los vinos realizados a partir de uva normal y a partir de uva congelada

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Debido a las diferentes temperaturas a las que ocurre el proceso en los dos tipos de vino, observamos la siguiente tabla de densidad respecto al tiempo:

Gráfico 18 Comparación de la evolución de la densidad medida en grados baulé durante la fermentación alcohólica entre los vinos realizados a partir de uva normal y a partir de uva congelada

En esta gráfica observamos la variación de la densidad (medida en Grados Baumé) respecto al tiempo, a lo largo de la fermentación alcohólica. Mediante el análisis de esta gráfica, podemos identificar las cuatro fases en la que se divide este proceso: 1. Fase de demora: Se corresponde con los primeros días, en los cuales las levaduras se van aclimatando al medio. En el vino de las uvas normales llega hasta el segundo día aproximadamente, mientras que en el otro vino se demora hasta el cuarto día. Esta diferencia reside principalmente a que la temperatura a la que ocurre el proceso en las uvas congeladas es mucho menor, y por tanto, las levaduras necesitan un mayor tiempo para alcanzar la temperatura necesaria para activarse. 2. Crecimiento exponencial: Esta es la etapa en la que la densidad desciende rápidamente. En el primer tipo de vino (uva normal) abarca unas dos jornadas y media (entre los días 2 y 4), mientras que en la uva congelada no podemos observar claramente esta etapa, ya que en este caso la fermentación se hizo controlando más la temperatura, principalmente porque fue en invierno y hacía más frío, de modo que la temperatura no subió tan bruscamente como en la normal, y tal vez por eso no se aprecie muy claramente la fase exponencial.

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85

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3. Fase estacionaria: Es la fase en la que la que disminuye la concentración de azúcares a una velocidad constante. En las uvas normales podríamos afirmar que ocurre entre los días 4 y mitad del 5, mientras que en las uvas congeladas ocurre desde el día 5 al comienzo del 7. 5. Fase declinante: Es la última de las etapas de este proceso, en la cual la densidad va disminuyendo a muy baja velocidad hasta alcanzar el valor de 00 Bé. En el primer tipo de vino (uva normal) abarca de mitad del día 5 a comienzos del 6, mientras que en el segundo tipo de vino (uva congelada) transcurre a lo largo del día 7. Análisis realizados durante la fermentación maloláctica: En los análisis que realizamos durante la fermentación maloláctica para comprobar el estado de nuestros vinos, obtuvimos los siguientes resultados: Parámetro pH Acidez total (g/L tartárico) Grado de alcohol (% Vol.) Sulfuroso libre (mg/L) Sulfuroso total (mg/L)

Uva normal 3,3 6,75 14 72 165

Uva congelada 3,4 5,6 12,6 0 10

Tabla 14 Comparación de los resultados de los análisis realizados durante la fermentación maloláctica

En estos análisis comenzamos a observar algunas diferencias entre nuestros dos vinos. El pH se mantiene en un valor parecido, siempre ácido. La acidez total es mayor en el vino elaborado con uva normal. Tal vez pueda deberse a que parte del tartárico forme tartratos con dichos compuestos, sobre todo con el potasio, y que al congelar precipitaran, aunque no estamos totalmente seguros de ello. Con la medida del grado alcohólico comenzamos a demostrar una de nuestras hipótesis iniciales, según la cual el vino elaborado con uva congelada tiene un menor grado alcohólico, así el grado alcohólico del primer vino es de 14o, mientras que el segundo es de 12,6o. La cantidad de sulfuroso es muy diferente entre los dos vinos, pero al ser datos ilógicos, debido a que son cantidades muy altas en el vino realizado con uva normal y muy bajas en el elaborado con uva congelada, pensamos que esto se debe a que esparcimos el metabisulfito de forma incorrecta. También cabe la hipótesis de que la uva congelada absorbiera más cantidad de sulfuroso que la normal, aunque nos falta realizar más pruebas para demostrarlo.

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86

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Este valor puede provocar la llamada refermentación en nuestros vinos, y con ella la presencia de precipitados sólidos en el fondo de la botella. Esto puede deberse a que no terminamos la fermentación maloláctica, debido a que decidimos cortarla por falta de tiempo. A pesar de todo esto, en el caso de que se produzca esta refermentación no afectaría a la calidad de nuestros vinos, puesto que estos precipitados no influyen en la calidad del vino; es más, esta fermentación tiene muy pocos años de antigüedad. Cuanto mayor es la cantidad de sulfuroso, las posibilidades de que se produzca es menor, y por tanto es más probable que ocurra en el vino elaborado a partir de uva congelada.

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87

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7.2. Discusión de los resultados de las mediciones de los parámetros físicos de tapones. En cuanto a los resultados sobre características físicas de los tapones tales como longitud, diámetro y ovalidad no han sido revelantes, ya que su variación entre diferentes tipos de tapones y entre los que han embotellado vino normal y vino congelado es mínima. Por otro lado, resulta interesante analizar la variación de la densidad entre los tapones puros y los tapones que han embotellado vino. En la siguiente tabla se puede observar como la densidad de los tapones puros aumenta tras haber embotellado vino. Densidad Tapones

Vino

Vino

Tipo tapón

puros

normal

congelado

1+1

392,33

548,34

469,07

BMT

412,67

584,3

512,65

Natural

258,33

321,53

391,64

634,5

765,27

Aglomerado 477,33

Tabla 15 Comparación de la densidad entre los tapones puros y los tapones que han embotellado vino

El mayor aumento de densidad aparece en los tapones aglomerados que han embotellado vino congelado. Esto puede ser debido a que el vino congelado contiene más compuestos libres que el vino normal y a la especial composición de los tapones aglomerados que favorece su aumento de la densidad. Están hechos con serrines de “desperdicios” de tapones naturales, estos “desperdicios” se obtienen del corcho que no es taponable por ser muy delgado y el corcho que ha sobrado una vez se ha obtenido el tapón natural. Por tanto, la densidad aumenta al aumentar la porosidad.

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88

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No hemos podido argumentar por qué unos tipos de tapones aumentan más su volumen en vino producido con uva no congelada y otros tipos en vino elaborado con uva congelada. Densidad 765,27

800 634,5 584,3 700 548,34 512,65 477,33 469,07 600 391,64 412,67 500 392,33 321,53 Densidad (Kg/m3) 400 258,33 300 200 100 0 1+1 BMT Natural Aglomerado

Tapones puros Vino normal Vino congelado

Tipos de tapones

Gráfico 19 Comparación del aumento de la densidad experimentada en los tapones puros tras embotellar vino

7.3. Discusión de los resultados del aislamiento de hongos filamentosos, levaduras y bacterias en tapones y en vino. La diversidad de especies de hongos filamentosos, levaduras y bacterias aisladas de las muestras de tapones de corcho coincide con la microbiota descrita previamente para este substrato por otros autores. La mayoría de autores que han realizado diferentes estudios microbiológicos sobre el corcho no especifican en que fase del proceso de fabricación han identificado los hongos que describen. Nosotros, durante esta investigación, hemos identificado los hongos en tapones de corcho que se encontraban preparados para embotellar botellas de vino tranquilo. En los 4 tipos de tapones de corcho se han identificado las siguientes especies de hongos filamentosos: 1) Aspergillus fumigatus, se ha aislado en el 18 % de las muestras de tapones analizados, aparece tanto en medios cultivados a partir de tapones enteros como en los cultivados a partir de tapones triturados. Es la única especie de hongo filomentosos que aparece en los cuatro tipos de tapones analizados. No es productor de ninguna de las micotoxinas legisladas. 2) Aspergillus niger, se ha encontrado en un 12 % de las muestras de tapones analizados, el 100 % de las muestras en las que aparece provienen de un medio cultivado a partir de tapones de corcho triturados. Es productor de micotoxinas como la ocratoxina A.

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3) Trichoderma viride, se ha aislado en el 6 % de las muestras de tapones analizados, el 100 % de las muestras en las que aparece provienen de un medio cultivado a partir de tapones de corcho triturados de tipo BMT. Esta especie de hongo filamentoso no es mencionada como productora de alguna de las micotoxinas legisladas. 4) Alternaria alternata, se ha encontrado en un 9 % de las muestras de tapones analizados, el 66’6 % en tapones de tipo BMT y el 33’33 % en tapones de tipo natural. Aparece tanto en medios de cultivo realizados a partir de tapones triturados y enteros. No es productor de ninguna de las micotoxinas legisladas. 5) Aureosbadium pullulans, se ha detectado en un 3 % de las muestras de tapones analizados, el 100 % de las muestras en las que aparece provienen de un medio de cultivo realizado a partir de tapones de corcho triturados de tipo BMT. No produce ninguna de las micotoxinas legisladas. Mediante los resultados obtenidos, podemos afirmar que en cada tipo de tapón de corcho natural crecen diferentes especies de hongos filamentosos. Por ejemplo, en los tapones de BMT crecen hongos filamentosos de las especies Trichoderma viride y Aureobasidium pullulans que no crecen en ningún otro tipo tapón de corcho analizado. También podemos confirmar que la presencia en el vino de las diferentes especies de hongos filamentosos identificadas no afectaría a las condiciones de calidad del vino, exceptuando a Aspergillus niger que produce ocratoxina A, puesto que las demás especies identificadas no producen micotoxinas legisladas por lo que en teoría no deberían afectar a la calidad del vino. Además, podemos afirmar que no se ha producido ninguna contaminación en los tapones de corcho analizados en este proyecto de investigación puesto que los géneros y especies de hongos filamentosos, levaduras y bacterias aislados

de las muestras de los tapones de corcho analizados coinciden con la

microbiota descrita previamente para este substrato por otros autores.

De un total de 34 colonias de hongos filamentosos identificados, 21 de ellas aparecen en medios de cultivo realizados a partir de tapones triturados y 13 aparecen en medios de cultivo realizados a partir de tapones enteros. Con estos resultados, podemos afirmar que los tapones de corcho triturados representan un substrato más favorable para la identificación de microorganismos que los tapones de corcho enteros.

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Esta afirmación se puede comprobar en el tipo de tapón BMT, en el que aparece mayor diversidad de microorganismos. Este tipo de tapón está compuesto por granulado de corcho, o sea, proviene de la trituración del corcho clasificado como no apto para el embotellamiento.

Gráfico 20 Porcentaje de colonias de hongos filamentos aisladas a partir de tapones triturados y enteros

Con los resultados obtenidos, no se puede demostrar el paso de microorganismos desde el tapón de corcho al vino. Esto es debido a que la diversidad de microorganismos presente en los tapones puros no aparece en los medios de cultivo realizados a partir de tapones que han embotellado vino, ni en los medios de cultivo realizados a partir del vino producido con uva congelada ni en los realizados a partir del otro tipo de vino. Con estos datos podríamos afirmar que no ocurre ese paso de microorganismos, pero esto no significa que no se pueda producir el paso de compuestos volátiles producidos por ellos. En el caso de que se produzca el paso de microorganismos desde el tapón al vino éstos no sobreviven debido a que las condiciones de vida del vino no son favorables para la vida y crecimiento de los hongos filamentosos identificados. Una de estas condiciones es el pH siendo el pH del vino mucho más ácido (3,35/3,4) que el del medio en el que se han cultivado los hongos filamentosos (5,6). Para comprobar si ocurre el paso de compuestos volátiles desde el tapón al vino se debería realizar un análisis de las toxinas presentes en el vino. En cuanto a las especies de levaduras y bacterias aisladas a partir de tapones de corcho y vino. En el vino producido con uva normal aparecen dos especies de levaduras: Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans predominando la primera, mientras que en el vino realizado con uva congelada solo aparece Saccharomyces cerevisiae. Esta especie de levaduras también se encuentra en los tapones de corcho puros. La no aparición de Candida albicans en el vino congelado puede deberse su menor termorresistencia

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respecto a Saccharomyces cerevisiae. En el vino producido con uva normal aparece una especie de bacterias: Bacillus cereus, mientras que en el vino realizado con uva congelada no aparece ningún tipo de bacteria. El 100 % de las muestras en las que aparece Bacillus cereus provienen de medios cultivados a partir de la filtración de vino producido con uva normal embotellado con tapones de corcho de tipo natural.

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8. CONCLUSIONES 1.- Los características del tapón no afectan a la calidad del vino, debido al corto tiempo de maduración de nuestro vino (vino joven). La utilización de un tipo de tapón u otro para embotellar una botella de vino tiene sentido según su tiempo de vida establecido, donde se puede generar una mayor o menor microoxigenación del vino. La microoxigenación está directamente relacionada con la formación de nuevos pigmentos, los cuales estabilizan el color de los vinos 2.- Las condiciones de vida impuestas por las levaduras en el vino son muy agresivas para permitir la existencia de los demás microorganismos procedentes de los tapones. Una de las principales condiciones es la excesiva acidez generada en el vino con respecto a las condiciones del medio en el que crecen los microorganismos identificados en los tapones. 3.- En el vino realizado con uva normal aparecen más especies de microorganismos que en el realizado con uva congelada. Tienen en común entre ellas la predominancia de Saccharomyces cerevisiae. Esto se debe a que tras adicionar el metabisulfito de sodio se elimina la mayoría de microorganismos del vino. Por tanto, al echar las levaduras al mosto, son ellas las que van a crecer en mayor cantidad predominando en este medio y regulando en su provecho las condiciones del caldo, las cuales no son óptimas para el resto de microorganismos. 4.- El crecimiento de las levaduras no desciende después de haber sido congeladas. La diferencia entre levaduras en el vino elaborado con uva congelada y el vino elaborado con uva normal reside en la cantidad de levaduras que se encuentran en cada medio, esta diferencia determinará las características del vino tales como azúcar. 5.- Los tapones de corcho triturados representan un sustrato más favorable para la identificación de hongos filamentosos que los tapones de corcho enteros. 6.- La presencia de hongos filamentosos en un medio conlleva una menor concentración de levaduras en ese medio debido a las condiciones biológicas perjudiciales para las levaduras impuestas por los hongos. 7.- El vino producido con uva congelada posee más compuestos libres que el vino elaborado con uva normal esto puede ser debido a que cuando la uva es congelada absorbe compuestos que están a su alrededor, de forma que al ser prensada va a liberar más compuestos que el vino producido con uva normal. Esto se puede observar en los papeles de filtro que han filtrado vino producido con uva congelada. Éstos se tiñen de un tono más oscuro que los que han filtrado vino realizado con uva normal. Álvaro Moreno García

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8.- En los últimos análisis realizados tras el embotellado de nuestros dos tipos de vinos, observamos claramente las diferencias que exponíamos al principio: - El pH se mantiene muy parecido a lo largo de todo el proceso y no cambia considerablemente entre estos dos vinos. - En cuanto a la acidez total observamos que es diferente, al igual que en los análisis intermedios. Con estos datos podemos corroborar lo dicho anteriormente, y suponer que esto es debido a que una porción del tartárico acabe formando tartratos, que en la uva congelada desaparecerán. - Apreciamos que el grado de alcohol es menor en el vino elaborado a partir de la uva congelada, lo que puede otorgar la característica de ese sabor más dulce que posee este vino respecto al elaborado a partir de uva normal. 9.- La uva congelada produce menos vino que la uva no congelada, es decir, su rendimiento. Con esta conclusión, podemos afirmar que no es rentable realizar vino a partir de uva congelada.

9. BIBLIOGRAFIA •

http://es.scribd.com/doc/8614571/Manual-de-Medios-de-Cultivo

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http://es.paperblog.com/aureobasidium-pullulans-en-csi-las-vegas-341470/

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http://www.monografias.com/trabajos27/hongos/hongos.shtml#resum

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http://www.semicro.es/info/revista_hist/3_2.pdf#page=51

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Tesis doctoral “Hongos y micotoxinas en tapones de corcho. Propuesta de límites micólogicos aceptables” de Margarita Pi i Contallé

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Tesis doctoral “Evaluación microbiológica de tapones de corcho para vinos” de Sara Centeno Briceño

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ACE revista de enología

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Revista 19 líneas

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www.diccionariodelvino.com

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www.wikipedia.org

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http://www.crisoninstruments.com/index2.php?module=1&idParam=18&idFam=66& idSubFam=105&lang=es

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