Latin American Journal of Pharmacy (formerly Acta Farmacéutica Bonaerense)
Trabajos originales Recibido el 30 de septiembre de 2006 Aceptado el 5 de noviembre de 2006
Lat. Am. J. Pharm. 26 (2): 208-13 (2007)
Medicamentos Herbarios en el Centro-oeste Argentino. VII. Caracterización Farmacognóstica y Actividad Cardiotónica de Hypericum connatum (Clusiaceae) María del R. FUSCO 1; Angela SOSA 1; Marta E. PETENATTI 1, Américo JUÁREZ 2; Luis A. DEL VITTO 1 y Elisa M. PETENATTI *1 Área de Farmacognosia y Proyecto 22/Q-616, Dpto. de Farmacia, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Univ. Nac. San Luis. Ej. de los Andes 950. D5700HHW San Luis, Argentina. 2 Área de Farmacología, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Univ. Nac. San Luis. Chacabuco y Pedernera. 5700 San Luis, Argentina 1
RESUMEN. Hypericum connatum Lam. (Clusiaceae o Hypericaceae) es conocida en Cuyo con el nombre vernáculo de “cabotoril” o “cabo torí”, siendo ampliamente utilizada, en el centro-oeste de Argentina, como cardiotónico. Debido al incremento en el uso de esta entidad y a la escasa información existente sobre morfoanatomía, fitoquímica y cardioactividad, se llevó a cabo el presente estudio, que ha permitido validar el uso popular. Los análisis micrográficos diacríticos efectuados sobre las partes de la planta empleadas con fines terapéuticos han permitido caracterizar la droga, facilitando un efectivo control de calidad. SUMMARY. “Phytomedicines from Central-western Argentina, VII. Pharmacognostic Characterization and Cardiotonic Activity of Hypericum connatum (Clusiaceae)”. Hypericum connatum Lam. (Clusiaceae or Hypericaceae) is known under the vernacular names “cabotoril” or “cabo torí” in Cuyo where it is used in folk medicine. The objective of this study is to know about its morphoanatomics, phytochemistry and cardioactivity because the use of this drug has increased in central-western Argentina as cardiotonic. This work has validated its popular use. By the micrographic analysis carried out on the parts of the plant used for therapeutic purposes, the drug on the market has been characterized facilitating an effective quality control.
INTRODUCCIÓN Hypericum connatum Lam. es un sufrútice frecuente en Argentina y países limítrofes 1-4, empleado en medicina popular en el centrooeste de la Argentina con diversas aplicaciones terapéuticas, principalmente como cardiotónico, bajo los nombres vernáculos “cabo torí”, “cabotoril” o “cabotoryl” 5-17. Debido al incremento en el uso de H. connatum, a las escasas informaciones morfoanatómicas 15 , químicas y farmacológicas, y especialmente teniendo en cuenta que otra entidad cogenérica de morfología muy semejante (H. perforatum L.) es actualmente una especie ampliamente comercializada como antidepresivo, se decidió llevar a cabo el presente estudio, caracterizando morfoanatómicamente la droga y definiendo los parámetros micrográficos para facilitar un efectivo control de calidad; asimismo se ha realizado ensayos químicos (colorimétricos
orientativos y estructurales) con el fin de caracterizar los componentes mayoritarios, y estudios farmacológicos para corroborar el principal uso terapéutico popular de esta entidad. MATERIAL Y MÉTODOS Materiales Se trabajó con muestras en fresco y herborizadas, y material genuino (planta completa molida) procedente de comercios locales, cuya identidad botánica fue corroborada, correspondiendo en todos los casos a Hypericum connatum. Material de herbario. ARGENTINA, Prov. San Luis: Dpto. Junín: Rincón del Este, en cercanías de la propiedad de doña Damiana Vega, L.A. Del Vitto, E.M. Petenatti & M.E. Petenatti # 8797, 5.III.1998 (UNSL). Droga cruda. ARGENTINA, Prov. San Luis: Dpto. La Capital: San Luis, muestra adquirida en una herborístería local, año 1995 (UNSL-H 76 b); ídem, año
PALABRAS CLAVE: Cardiotónicos, Control de calidad, Clusiaceae, Estudio farmacognóstico, Estudio farmacológico, Hypericum connatum. KEY WORDS: Cardiotonics, Clusiaceae, Quality control, Hypericum connatum, Pharmacognostic study, Pharmacological study. *
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Autor a quien dirigir la correspondencia. E-mail:
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ISSN 0326-2383
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1997 (UNSL-H 697); ídem, año 1999 (UNSL-H 694, 695); ídem, año 2000 (UNSL-H 696).
Métodos Morfoanatómicos Los materiales frescos fueron fijados y conservados en formalina aceto-alcohólica. Las muestras genuinas provenientes del comercio local fueron previamente hidratadas con agua caliente y detergente 18 y posteriormente tratadas de manera similar a las colectadas en fresco. Una serie de preparados semipermanentes de ambos grupos de muestras fue obtenida por corte a mano alzada, coloración con verde iodocarmín alumbre y montaje en gelatina glicerinada, mientras otra serie de preparados permanentes fue confeccionada mediante deshidratación en una serie creciente de etanol, infiltración e inclusión en parafina, corte con micrótomo de deslizamiento, desparafinado, coloración con safranina-fast green y montaje en DPX. Para efectuar los recuentos de micrografía cuantitativa, el material fue diafanizado según la técnica de Dizeo 19, midiendo los siguientes parámetros: número de estomas (NE) 20 en ambas epidermis y la relación estomática entre las caras adaxial y abaxial (Rest), índice de estomas (IE) 21,22, relación de empalizada (Remp) 23, número de islotes (NI) 24 y número de terminales de nerviación (NTN) 25. El NE fue medido con objetivo de 40x, mientras que para los otros parámetros se empleó uno de 20x. Los diseños y las fotomicrografías fueron obtenidos en un microscopio Leitz-DMRB provisto de dispositivo de dibujo y cámara fotográfica. Ensayos químicos y análisis espectral IR El material fresco fue secado a 55 °C en estufa, mientras que la droga cruda fue tratada directamente. Parte de las mismas fueron pulverizadas y extraídas con metanol durante 5 h utilizando un Soxhlet. Sobre el filtrado se llevaron a cabo diferentes reacciones químicas de caracterización con el objeto de detectar los principales grupos fitoquímicos presentes. Los glicósidos cardiotónicos fueron caracterizados por la aplicación de las siguientes reacciones: Liebermann-Burchard para el esteroide, Keller-Kiliani para los desoxiazúcares y Kedde para la lactona α−β-insaturada. La presencia de heterósidos saponínicos fue comprobada mediante la producción de espuma persistente por agitamiento; los heterósidos antraquinónicos mediante la reacción de Bornträger, con hidrólisis previa; los heterósidos flavonoides por el método de Shinoda, los taninos
con cloruro férrico, los lípidos por su reacción frente a vapores de iodo, los alcaloides a través de las reacciones de Draggendorf y de Bertrand, y los glúcidos mediante las reacciones de Molisch, de Tollens y de Fehling. Teniendo en cuenta los usos etnofarmacológicos regionales de esta especie, se hizo hincapié en la búsqueda de heterósidos cardiotónicos. Para ello, se procedió a la extracción con agua a 60 °C durante 45 min, seguida de centrifugación y extracción del sobrenadante con acetato de etilo por tres veces consecutivas, efectuando sobre la fase orgánica las reacciones características para glicósidos cardiotónicos. Los espectros IR fueron registrados directamente de los extractos metanólicos obtenidos y corroborados con la literatura específica 26. Estudios de bioactividad Para detectar la actividad cardiotónica se preparó una infusión al 10% de droga cruda y una fracción polar (eluidas de la columna con acetato de etilo puro) conteniendo una mezcla de glicósidos cardiotónicos, ensayándolas a ambas sobre ratas de la cepa Wistar de ambos sexos, de 250 g, y sobre sapos (Bufo arenarum) adultos de 120 g. En cada caso los animales fueron separados en dos lotes (n = 3), administrándoseles al primero de ellos la infusión, y al segundo la fracción polar. Se realizaron electrocardiogramas (ECG) utilizando un registrador biológico de 5 canales Gilson Biophysical & Industrial Recorder 5/6 H. Las ratas fueron anestesiadas con solución de uretano al 25% (0,6 ml/ 100 g de animal: 0,3 ml por vía intraperitoneal y 0,3 ml por vía subcutánea); se realizaron los ECG basales y a los 30-45 minutos fueron administrados 0,2 ml de la infusión al 10% y 0,2 ml de la fracción polar. Los sapos fueron desmedulados y se perfundió la vena abdominal con solución fisiológica; el ECG fue realizado inmediatamente después de la administración endovenosa de 0,1 ml de la infusión y 0,1 ml de la fracción polar 27. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estudios botánicos Hypericum connatum Lam., Encycl. mét. 4: 168, 1797 (Fam. Clusiaceae, Subfam. Hypericoideae, Tribu Hypericeae). Sinónimos: H. connatum Lam. var. fiebrigii Briq.; H. cyathifolium Larrañaga. Es conocido vulgarmente en la región como “cabo torí” o “cabotoril” 11, y en otras regiones argentinas se conoce la planta o se la comercializa también con un sinnúmero de nom-
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bres, entre ellos: “ca’ avó torí macho”, “ca’ avo torî”, “ca’ avó torí”, “caá-botering”, “caá-vorotí”, “caá-votireg”, “cabotoryl”, “corazoncillo”, “hipérico”, “manbí”, “mbaracayá”, “oreja de gato”, “sombrerito”, “toro ca’ á”, “yerba alegre”, “yerba de la soledad”, “yerba del toro” y “yerba meona” 5-17. Hábitat y distribución Es una planta austroamericana, frecuente en países limítrofes (sur del Brasil, Bolivia y Paraguay hasta Uruguay) y en el norte y centro de la Argentina, extendiéndose a las Sierras de Córdoba, San Luis y Buenos Aires 2-4. En nuestro país crece a niveles hipsométricos de entre 0-2.000 m, en situación de umbría y en pastizales serranos 2,10. Usos populares El decoctado y la infusión (o infuso) de las partes aéreas de esta especie son recomendados, en uso interno, para problemas cardíacos que se manifiestan con dolores, opresión y palpitaciones, y para afecciones respiratorias, mientras que la decocción es empleada para la desintoxicación etílica 8. Las hojas machacadas o pulverizadas, en uso externo, son aplicadas en el tratamiento de contusiones y dolores articulares 7 y como astringentes y vulnerarias 9. En Misiones la planta es empleada en el tratamiento de cardiopatías 28, mientras que en el noroeste de Corrientes es empleada en asociación con
Melissa officinalis “contra ataques y dolores del corazón” 8, siendo considerada medicinal en el Norte del país 29. Morfología vegetativa Sufrútice de 20-90 cm alt., erguido, subleñoso y ramoso en la base, con tallos glabros, provistos de hojas hasta la inflorescencia (Fig. 1A). Hojas coriáceas, opuestas, anchamente ovadas a semicirculares, de ápice obtuso, connatas por su base (de allí su epíteto específico), enteras, glabras, generalmente pequeñas (1,5-3 x 3-4 cm) y provistas de puntuaciones oscuras en el hipofilo (que anatómicamente corresponden a las estructuras secretoras descriptas más adelante). Morfología floral Flores numerosas, brevemente pediceladas, dispuestas en cimas paucifloras terminales, más o menos dicotómicas (Fig. 1 B); pentámeras, perfectas (Fig. 1 B), con pedicelos glabros. Sépalos ovado-lanceolados, acuminados, con puntuaciones en el dorso, de unos 5 mm long. Pétalos amarillos a amarillo-anaranjados, obovados, bilobulados en el ápice, de hasta 7-8 mm largo. Androceo formado por numerosos estambres, libres o unidos en su base en 3-8 grupos (poliadelfos). Ovario 5-carpelar, unilocular, con 5 placentas parietales, multiovulado. Estilos 5 (excepcionalmente 4), terminando en estigmas capitados. Fruto cápsula ovoidea, de aprox. 5-7 mm, algo rostrada, con estilos persistentes (Fig. 1 C),
Figura 1. Hypericum connatum (Del Vitto & al. # 8797). A, ejemplar de herbario; B, flor en disección; C, fruto en sección longitudinal; D, transcorte por nomófilo mostrando el haz vascular medial; E-F, transcorte por hemilámina mostrando una estructura secretora (s) y haces vasculares laterales; G, epidermis del hipofilo de nomófilo. La escala vale: 50 mm para A; 0,2 µm B-C; 50 µm para D-F y 25 µm para G.
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dehiscente por cinco valvas. Semillas numerosas, oblongas a semilunares. Anatomía foliar En transcorte, la hoja presenta una gruesa cutícula, característica de plantas xerófilas, con escasos tricomas eglandulosos, unicelulares y estomas de tipo anisocítico (o crucífero) que se hallan sólo en el hipofilo (Fig. 1 D, G); mesofilo con estructura dorsiventral, con un único estrato en empalizada integrado por células de gran tamaño y varios estratos de parénquima esponjoso con células laxamente dispuestas (Fig. 1 E-F); inmersos en el mesofilo se hallan abundantes canales secretores esquizogénicos (Fig. 1 E, s), los que de acuerdo con Metcalfe & Chalk 30 presentan una antocianidina (pelargonidina). El haz vascular central se halla protegido por colénquima angular y, al igual que los laterales, tiene estructura colateral, presentándose cavidades secretoras inmersas en el floema (Fig. 1 D). Esta descripción coincide, en términos generales, con la efectuada por O’Donell & Rodríguez 15. Anatomía caulinar Tallo primario con corteza delgada, parenquimatosa, escaso tejido mecánico y canales secretores. Haz vascular casi continuo, interrumpido sólo por delgados radios medulares; su estructura es colateral y presenta cavidades secretoras floemáticas. Médula amplia, con células tánicas que dan reacción positiva al tratamiento con tricloruro férrico. Parámetros micrográficos Número de estomas.mm–2 de la epidermis inferior = 10,25 ± 1,61; número de estomas.mm-2 de la epidermis superior = 0; índice de estomas de la epidermis inferior = 26,48 ± 3,39; índice de empalizada = 9,2 ± 0,75; número de terminales de nerviación.mm–2 = 3 ± 0,98; y número de islotes.mm–2 = 3,80 ± 0,92. Análisis de material comercial Fueron analizadas 20 muestras de herboristería de la región centro-oeste de la Argentina, consistentes en sumidades estériles y floríferas groseramente molturadas, por lo cual sus caracteres morfológicos e histológicos fueron fácilmente distinguibles. Todas ellas correspondieron a Hypericum connatum y registraron en general un alto grado de pureza. Ensayo químico y análisis espectroscópico IR El estudio preliminar de las muestras recolectadas y/o adquiridas dio resultados positivos para taninos, flavonoides, saponinas, antraquino-
nas, alcaloides y heterósidos cardiotónicos; estos últimos corresponderían a cardenólidos en virtud del resultado de reacciones características, lo que daría sustento al amplio uso popular como cardiotónico. Los espectros IR registrados directamente de los extractos muestran señales características (Fig. 2): una a 1732 cm–1 (correspondiente al carbonilo) y otra a 1265 cm–1 (que corresponde a la banda del C-O), típicas de δ-lactonas α,β-insaturadas, demostrando en todos los casos la presencia de un núcleo cardenólido. Las lactonas señaladas pueden ser diferenciadas de las de mayor insaturación α, β, γ, δ– dado que el carbonilo presenta doble vibración a 1732 cm–1 y a 1715 cm–1, además de la próxima a 1270 cm–1 del C-O que se conserva. Se continúan realizando los estudios necesarios para aislar y cuantificar los principios cardiotónicos presentes por diversos métodos espectroscópicos (C13RMN, H1RMN, EM).
Figura. 2. Espectro IR del extracto metabólico de Hypericum connatum.
Estudios de bioactividad Los ECG de los animales tratados con la infusión al 10 % muestran un aumento en el complejo QRS respecto al registro basal, debido a un incremento en el sistema de conducción cardíaca (Figs. 3 y 5). En los animales que recibieron la fracción polar se verificó un efecto similar al observado con la infusión, aunque de menor magnitud (Fig. 4). La existencia de glicósidos cardiotónicos justificaría estos efectos sobre la actividad cardíaca en los animales utilizados en este experimento. Es probable que en la infusión otros metabolitos contribuyan a la sinergia del efecto. Esta experiencia ha permitido validar el uso popular de H. connatum como cardiotónico, mediante los correspondientes estudios farmacológicos. 211
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Agradecimientos. Los autores agradecen el apoyo financiero recibido a través de subsidios de la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de San Luis (Proyecto 22/Q-616). Nota. El presente trabajo forma parte de una tesis doctoral en Farmacia, en curso en la Universidad Nacional de San Luis e integra una serie de estudios cuyas primeras contribuciones han sido publicadas en Acta Farm. Bonaerense 17: 197-212 (1998); 19: 99-103 (2000); 23 : 442-7 y 484-91 (2004) y 24 : 190-196 (2005). Figura 3. Registro electrocardiográfico en rata someti-
das a una inyección de una infusión de H. connatum al 10% en agua.
Figura 4. Registro electrocardiográfico en rata someti-
da a una inyección de la fracción polar de H. connatum.
Figura 5. Registro electrocardiográfico en sapo some-
tido a una inyección de una infusión de H. connatum al 10% en agua.
CONCLUSIONES Los estudios morfoanatómicos y la determinación de los parámetros micrográficos permiten realizar un efectivo control de calidad de la entidad analizada, que es expendida en simples y mezclas en el comercio regional. De los análisis farmacobotánicos realizados se desprende que la droga comercializada en el mercado regional sólo es expendida bajo los nombres de “Cabotorí” o “Cabotoril” correspondiendo en todos los casos a Hypericum connatum, con un alto grado de pureza. Los resultados químicos aunados a los estudios de bioactividad permiten corroborar los datos etnofarmacológicos sobre el uso como cardiotónico que se atribuye a esta especie en Argentina.
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