Mecanismos de inmunidad en crustáceos

MECANISMOS DE INMUNIDAD EN CRUSTACEOS LORENA VÁZQUEZ1, CLAUDIA SIERRA1, SOLEDAD JUÁREZ1 CONCEPCIÓN AGUNDIS2, ARACELI ZAVALA2 y EDGAR ZENTENO3.

a inmunidad es un proceso de defensa que se manifiesta ante la presencia de moléculas extrañas genéticamente. Estudios realizados sobre la inmunidad en diversas especies de invertebrados y vertebrados, han sugerido que los mecanismos de defensa de los invertebrados podrían ser considerados los precursores de la inmunidad de los vertebrados; estos eventos requieren de una compleja participación de grupos celulares especializados y, factores humorales específicos que son generados contra un determinado antígeno como se muestra en los mamífe-

ros (Renwrantz, 1986). En los invertebrados, existen pocas evidencias que permitan identificar si alguno de estos factores son generados contra un antígeno en particular; sin embargo, se ha demostrado que algunos factores presentes en la hemolinfa o en diversos grupos celulares poseen una alta especificidad de reconocimiento, semejante a la demostrada por los anticuerpos (Aspán y Söderhäll, 1991; Vasta, 1992), por lo que se ha considerado que estos grupos celulares o moléculas antecesoras son los que dieron lugar, desde el punto de vista evolutivo, a una respuesta altamente específica.

Los crustáceos, entre otros invertebrados, representan un grupo con gran interés económico por su fácil adaptación a la acuacultura. Diversas especies de crustáceos son afectadas por patógenos (generalmente oportunistas) que llegan a mermar la producción. El estudio de la inmunidad en invertebrados se ha llevado a cabo con el interés de identificar los mecanismos de defensa y, rutas bioquímicas específicas que pueden desencadenarse ante la presencia de los diferentes patógenos que lo afectan, y así identificar cuales son los factores séricos y células que participan en la destrucción

PALABRAS CLAVE / Inmunidad en Crustáceos / Filogenia de la Respuesta Inmune / Crustáceos / Macrobrachium rosenbergii Vázquez, L. México, DF. Bióloga, UAEM. Dra. en Ciencias UNAM. Profesora-Investigadora Titular UAEMorelos. Profesora Adjunta Inmunología, Facultad de Medicina de la UNAM Línea de Investigación: Inmunología Comparada. Laboratorio de Lectinas, Centro de Investigaciones Químicas. Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Cuernavaca Morelos, México 62210. Sierra, C. Oaxaca, Oax. Bióloga UAEM. Especialidad M.E. Técnico Académico UAEMorelos. Línea de Investigación: Inmunología Comparada. Laboratorio de Lectinas, Centro de Investigaciones Químicas. Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Cuernavaca Morelos, México 62210. Juárez, S. Cuernavaca, Morelos. Ing. Químico. Universidad Autónoma del Edo. de Morelos. Actualmente estudiante de Maestría en Ciencias Químicas. Laboratorio de Lectinas, Centro de Investigaciones Químicas. Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Cuernavaca Morelos, México 62210. Agundis, C. Parras, Coahuila. QFB de la Universidad Autónoma de Nuevo León. Especialidad en Ingeniería Industrial. Profesor Titular de Inmunología. UNAMéxico (Depto. Bioquímica). Línea de Investigación: Inmunoquímica. 2 Laboratorio de Inmunología, Departamento de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNAM 04510. Zavala, A. Zacatlán, Puebla. QFB Univ Aut. Metropolitana. Técnico Académico, Dep. Bioquímica, UNAM. Línea de Investigación: Producción de Reactivos Biológicos. 2 Laboratorio de Inmunología, Departamento de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNAM 04510. Zenteno, E. Orizaba, Veracruz. Médico Cirujano UNAM. Dr. en Bioquímica Aplicada de la U. De Lille Francia. Profesor Titular de Inmunología y Bioquímica UNAMéxico. Línea de Investigación: Inmunología (Bioquímica de Glicoconjugados). 3 Departamento de Bioquímica. Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. Tlalpan. México D.F.10280 Correspondencia: Lorena Vázquez, Laboratorio de Lectinas. Centro de Investigaciones Químicas. Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Ave. Universidad 1001, Col. Chamilpa. 62210, Cuernavaca, Morelos. México.

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de los patógenos, la regulación del mecanismo de defensa, y la reparación del daño, así mismo se pretende identificar cuales son los factores que son sintetizados de nuovo ante la presencia del patógeno. De esta forma se pretende por ejemplo, crear resistencia en los organismos susceptibles a determinados patógenos. Los decápodos poseen un sistema circulatorio abierto, mediante el cual son distribuidos nutrientes, oxígeno, hormonas y células que viajan a través de la hemolinfa. Los hemocitos (células circulantes) no son considerados equivalentes a los eritrocitos de los vertebrados, ya que estos no contienen el pigmento respiratorio (hemocianina), sin embargo pueden ser funcionalmente análogos a los leucocitos de los vertebrados dado que se encuentran involucrados principalmente en el reconocimiento y la eliminación del material extraño así, como en la coagulación de la hemolinfa (Martin y Hose, 1992, Vázquez et al.,1997a). Se han identificado lectinas en el suero y los hemocitos de diversas especies de decápodos que actúan como unidades de reconocimiento y, desencadenan diferentes mecanismos de defensa como son: la fagocitosis mediada por opzonización y la encapsulación. También se han identificado otras proteínas que actúan como moléculas que permiten el reconocimiento entre lo propio y extraño (particularmente en insectos) como el denominado factor kB-like, el cual es reconocido por receptores de membrana que tiene una secuencia homóloga al receptor de Interleucina 1 (lL-1). En el fluido celómico de invertebrados se ha reportado la presencia de proteínas que actúan como citocinas en una respuesta pre-inflamatoria y, en los equinodermos la IL-1 posee alguna homología con la IL-1 de mamíferos (Tabla I). En una respuesta de defensa en las especies primitivas de los vertebrados y artrópodos se han encontrado moléculas que han conservado su estructura y, son consideradas filogenéticamente ancestrales, tal como la α2-macroglobulina y la proteína C-reactiva (Marchalonis y Schluter, 1994). Mecanismos de Defensa El sistema de la profenoloxidasa (proPO). Los decápodos poseen diversos mecanismos de defensa y son dependientes de las características del agente patógeno, por lo que una vez reconocido el material extraño se desenca-

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TABLA I INTERLEUCINA 1 DE INVERTEBRADOS Peso Molecular

Punto Isoeléctrico

17.5 20-29 20 20

5.0/7.0 4.8/5.4/7.4 5.5/7.0 ND

(kDa) DEUTEROSTOMADOS MAMÍFEROS EQUINODERMOS TUNICADOS POLIQUETOS PROTOSTOMADOS CNIDARIOS (CELENTERADOS)

ACTIVIDAD NO REPORTADA

Beck, et al., 1989; Prendergast et al., 1983).

TABLA II TIPOS DE MECANISMOS DE DEFENSA EN LOS DECÁPODOS Mecanismos de inmunidad

Tipo de célula que participa

Patógeno que se elimina

ProPO*

Semigranulocitos, hemocitos con gránulos grandes y refráctiles

Bacterias y hongos

Fagocitosis

Hialinocitos semigranulocitos

Bacterias y microorganismos < de 10 µm.

Encapsulación

Semigranulocitos Hemocitos con gránulos

Bacterias y levaduras Organismos > 10 µm grandes y refráctiles (ej. nemátodos)

* Sistema de la profenoloxidasa.

denan diversos procesos como la activación del sistema de la profenoloxidasa, la fagocitosis y la encapsulación (Tabla II). En la inmunidad humoral de los crustáceos, la actividad del sistema de la proPO posee una función similar al sistema del complemento, ya que al ser activado, se manifiestan una serie de reacciones enzimáticas en cascada. En los crustáceos este sistema enzimático se encuentra como un precursor inactivo (proenzima) en la hemolinfa o en los hemocitos (Johansson y Söderhäll, 1989). La proPO, convierte a la tirosina en DOPA y a la DOPA en DOPA-quinona, siendo este último el precursor de la melanina. La melanina es un pigmento pardo-negro al cual, se le adjudican diversas propiedades biológicas tal como la inhibición de la actividad de enzimas bacterianas y fúngicas (Smith y Söderhäll,1983). La degranulación (exocitosis) de los hemocitos, es un

evento importante para ciertos mecanismos de defensa sobre todo, porque es un sistema que provoca también la activación del sistema de la profenoloxidasa (proPO) (Söderhäll y Smith, 1986). Estudios sobre la actividad del sistema de la proPO, en el acocil Pacifastacus leniusculus y en el cangrejo Carcinus maenas, han demostrado que este sistema se relaciona de manera específica con la exocitosis de hemocitos que poseen gránulos. La activación de este sistema es inducido por la presencia de lipopolisacáridos (LPS) o el ß-1,3glucano (carbohidratos de la pared celular de bacterias Gram negativas y hongos) (Johansson y Söderhäll, 1989). En el cangrejo Astacus leptodactylus, se ha demostrado que la laminarina y los LPS inducen la degranulación de células con gránulos pequeños (Söderhäll, 1982). La vía de activación del sistema de la proPO es compleja; sin embargo, se sabe que comprende

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una serie de reacciones enzimáticas en cascada en la que participa por lo menos una serina-proteasa (Figura 1), liberando así ciertos factores asociados como: el Factor de Adhesión, el cual recubre a los microorganismos invasores adhiriendose de manera inespecífica a superficies como por ejemplo de hifas fungales. Este factor puede llegar a provocar la amplificación del sistema de la profenoloxidasa mediante la degranulación de células con gránulos grandes y pequeños y éste a su vez es regulada por proteínas plasmáticas como la α2-macroglobulina. La proteína de adhesión aislada del acocil de agua dulce Pacifastacus leniusculus, tiene un peso aproximado de 76 kDa y un punto isoeléctrico de 7.2. En células adheridas in vitro, el factor de adhesión puede tener la propiedad de estimular una respuesta multicelular como la encapsulación restringiendo así la actividad del patógeno; también es responsable para la estimulación de la fagocitósis en el caso de las células hialinas de Carcinus maenas (Johansson y Söderhäll, 1989; Thornqvist, et al., 1994). Proteínas con actividad antimicrobiana. La presencia de proteínas con actividad antimicrobiana, ha sido identificada en los gránulos de diversos grupos circulantes en los crustáceos, como en Tachypelus tridentatus, en donde al inducir la liberación del material presente en los gránulos, por componentes bacterianos como el lipopolisacárido se ha recuperado una proteína con actividad bactericida, esta proteína tiene capacidad de reconocer específicamente residuos de N-acetil-D-galactosamina en la pared bacteriana (Kawabata et al., 1996). Fagocitosis La fagocitosis es un proceso realizado por células especializadas, que tienen la propiedad de reconocer e ingerir las partículas extrañas como bacterias, esporas o células envejecidas del propio organismo. Este elemento de inmunidad también se ha conservado en la escala evolutiva de los animales lo cual, sugiere que este mecanismo es precursor de la inmunidad innata de los vertebrados. En la mayoría de las especies de crustáceos se conoce que los fagocitos pueden encontrarse libres en el hemocele o en el exterior de arteriolas especios del hepatopáncreas y/o en las branquias (McCumber et al., 1979; Factor y Beeckman, 1990). Los ensayos experimentales de McKay y Jenkin (1970) al inocular partículas de carbón coloidal al hemocele del cangrejo de agua dulce Parachaeraps bicarinatus y del cangrejo Carcinus

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Tirosina

DOPA HO

CO 2 NH2

TH Tiase

DA CO 2H

HO AADC

NH2 HO

O

CO 2 H NH2

O

NH2

HO

Cisteina HO

CO 2H NH2

HO S

Dopaquinona

CH2 CH2 CHCO 2H NH2

Figura 1. Mecanismo propuesto de formación de melanina en la hemolinfa de crustáceos. TH: Tirosina hidroxilasa, AAD descarboxilasa de aminoácidos aromáticos, Tias: Tirosinasa (Tomado de Carlberg, 1992).

maenas, han permitido demostrar que lo fagocitos son las células principales que participan en la eliminación de las partículas circulantes en el hemocele. El tipo de hemocito que realiza tal actividad, varía entre las diferentes especies de decápodos e incluso su reconocimiento hacia las diferentes especies de bacterianas como por ejemplo: los fagocitos del acocil P. bicarinatus y Chelax destructor, reconocen particularmente a las bacterias Gram negativas como Pseudomonas y E. coli (Tyson y Jenkin, 1974), en cambio los fagocitos de la langosta americana Homarus americanus solo fagocitan eficazmente a las bacterias Gram negativas y no a las Gram positivas, las cuales al no ser eliminadas llegan a multiplicarse en el interior del organismo (McCumber et al., 1979); en el caso de los fagocitos del cangrejo azul Calinectes sapidus, eliminan tanto a las bacterias Gram negativas como a las Gram positivas (Cassels et al., 1986). Por otra parte, en ensayos de fagocitosis in vitro, se ha logrado evaluar también, la participación de ciertos factores séricos asociados a la membrana celular que favorecen a la fagocitosis. En experimentos realizados en el acocil P. bicarinatus, se ha identificado que los fagocitos poseen en la membrana factores de reconocimiento dirigidos hacia lipopolisacáridos del antígeno somático O de Salmonella abortus (Tyson y Jenkin, 1974). Los hemocitos circulantes del langostino de agua dulce M. rosenbergii poseen un doble mecanismo de reconocimiento del material extraño, uno de ellos está determinado por una lectina que presenta la misma especificidad de la lectina sérica que le permite reconocer carbohidratos acetilados y posee otro mecanismo, menos eficaz que el primero pero

que no posee especificidad alguna, que le permite sin embargo fagocitar agentes patógenos (Vázquez et al., 1997a). Experimentos realizados en el cangrejo Astacus astacus, han demostrado que las bacterias de Moraxella sp. tratadas previamente con lamiranina (ß1,3-glucano, aislada de la pared celular de hongos) son fagocitadas mas fácilmente que las bacterias que son tratadas con otro tipo de polímero de carbohidratos (celulosa o quitina) (Söderhäll et al., 1984). Por otra parte, experimentos realizados con larvas del camarón tigre Penaeus monodon, han demostrado que las larvas al ser alimentadas con dietas que contienen bacterias inactivadas de Vibrio sp., poseen una mayor resistencia a la infección bacteriana que el grupo control que no fue alimentado previamente con la bacteria (Bechteler y Holler, 1995). Encapsulación La encapsulación, es un tipo de respuesta multicelular para eliminar a las partículas extrañas que no pueden ser fagocitadas o destruídas por los mecanismos humorales. Se considera que este proceso da muerte a los patógenos o por lo menos restringe su movimiento y crecimiento en la cavidad del hemocele. Ensayos in vitro, sobre la respuesta de encapsulación en el acocil Astacus leptodactylus, se ha identificado la agrupación de hemocitos semigranulares y la presencia de factores adhesivos alrededor de partículas mayores de 10 µm de diámetro (helmintos y esporas fúngicas) (Persson y Söderhäll, 1987). Una reacción similar a la encapsulación, se ha observado también cuando se presenta un daño en la cutícula, en este caso, la encapsulación

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participa como una barrera de protección, que previene la entrada de patógenos al músculo o al hemocele. Se ha considerado que una cápsula típica consiste de 5 a 30 capas compactas de hemocitos, sin espacios intercelulares; el aspecto morfológico de la cápsula en las diferentes especies de decápodos puede presentar una ligera variación en la extensión de las células, la necrosis celular, la presencia o ausencia de melanina y la cantidad de material extracelular. Entre los mecanismos de regulación del crecimiento de la cápsula, se ha identificado a una descarboxilasa la cual, decrece gradualmente en concentración hacia la periferia de la cápsula. Mediante análisis histoquímicos, se ha demostrado que los hemocitos que participan en la encapsulación, presentan mucopolisacáridos ácidos o neutros y glicoproteínas (Ratner and Vinson, 1983). Teóricamente, la muerte celular de los organismos encapsulados va a estar dada por la disminución de la concentración de oxígeno y la participación de hidrolasas o por la acción tóxica de quinonas (Persson y Söderhäll, 1987; Durliat, 1985). El reconocimiento específico de lo extraño en decápodos. Un aspecto fundamental en el desarrollo de la inmunidad en los invertebrados es la habilidad de cada especie para distinguir entre lo propio y lo extraño. Desde los organismos unicelulares, se han descrito moléculas con una función de reconocimiento. Estas proteínas, que han sido consideradas como un precursor funcional de los anticuerpos, son un grupo de proteínas denominadas genéricamente lectinas (del latin legere: buscar o escoger). Las lectinas tienen la propiedad de reconocer de manera específica a los carbohidratos de superficie de membranas o de pared bacteriana y, por lo tanto llegan a inducir aglutinación de estas células o bien, desencadenar diversos eventos celulares como la fagocitosis, actuando como opsonina (Bayne, 1990). La presencia de lectinas en el suero de los crustáceos decápodos ha sido identificada en prácticamente todos los crustáceos, sin embargo lectinas con características estructurales y especificidad idéntica a las lectinas séricas han sido identificadas en la membrana de los hemocitos, así como en gránulos citoplásmaticos, sugiriendo que las lectinas son sintetizadas por los hemocitos y posteriormente liberadas al hemocele. De esta manera las lectinas que permanecen en la superficie de membrana participan en el reconocimiento hacia lo extraño (Mullainadhan y Renwrantz, 1986; Vázquez et

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TABLA III ESPECIFICIDAD DE LAS LECTINAS DE DECÁPODOS POR CARBOHIDRATOS. _______________________________________________________________________ - Macrobrachium rosenbergii

9-O-acetil siálico*

+

9.8

Vázquez et al.,1993

- Cancer antennarius

9-O/4-O-acetil siálico* +

37

Ravindranath et al.,1985

- Penaeus californiensis

GlcNAc/GalNAc

ND 35

Vargas-Albores et al., 1993.

- Homarus americanus

Acido siálico*

+

Hall y Rowlands, 1974

70

- Callinectes danae

Acido siálico*

+

ND Brown et al., 1968

- C. sapidus

Acido siálico*

+

100 Cassels et al., 1986.

- Liocarcinus depurator

9-O-acetil siálico

+

38

Fragkiadakis y Stratakis 1997

_______________________________________________________________________ GlcNAc=N-acetil-D-glucosamina; GalNAc=N-acetil-D-galactosamina; *el Acido siálico= ácido N-acetil-neuramínico; ND= no determinado.

al., 1997b), como mediador de la cooperación celular o incluso en el transporte de carbohidratos. Ensayos in vitro, han permitido identificar que la especificidad de las lectinas de los decápodos hacia carbohidratos está dirigida principalmente hacia carbohidratos N-acetilados como ácido N-acetil-neuramínico (ácido siálico), N-acetil-D-glucosamina y N-acetilD-galactosamina, además la mayoría de las lectinas reportadas en este grupo son dependientes de iones calcio y/o magnesio (Tabla III); de manera interesante las lectinas identificadas en el langostino Macrobrachium rosenbergii, en Cancer antennarius y en Liocarcinus depurator poseen especificidad por residuos de ácido siálico substituídos por grupos Oacetilados (Ravindranath et al., 1985; Vázquez et al., 1993 y 1994; Fragkiadakis y Stratakis, 1997). Hasta el momento no se ha logrado identificar ninguna relación estructural de las lectinas con los anticuerpos ya que las lectinas están conformadas por un número diverso de unidades protéicas y cuyo peso molecular también varía entre cada especie (Tabla III); sin embargo, como se indica las lectinas de un grupo animal en particular, parecen haber conservado básicamente la capacidad de reconocer e interactuar con estructuras de carbohidrato muy semejantes. Estos datos sugieren que en este grupo la especificidad ha sido conservada evolutivamente, sin embargo otros grupos de invertebrados como los moluscos no poseen esta característica ya que en este grupo se han identificado lectinas con especificidad por un amplio espectro de carbohidratos (Renwrantz,1986; Vasta, 1992; Arreguin-Espinoza et al., 1997). El reconocimiento específico de estructuras carbohidrato, permite que diversas bacterias que poseen estos determinantes en la pared o la cápsula, sean identificadas y aglutinadas; la lec-

tina del langostino M. rosenbergii reconoce a los grupos O-acetilados de los carbohidratos de Aeromona y Bacilus cereus (Vázquez et al, 1994 y 1996) y por su parte la lectina de Carcinoscorpius rotunda cauda identifica a los lipopolisacáridos de Escherichia coli, lo que permite que las lectinas aglutinen estas bacterias (Dorai et al., 1982). Perspectivas Los invertebrados carecen de una respuesta inmune humoral basada en anticuerpos y, de una respuesta celular basada en células especializadas como los linfocitos por lo que aparentemente, carecen de una especificidad y memoria inmunológica. En los decápodos y en otros artrópodos, la presencia del caparazón o exoesqueleto representa la barrera externa de protección ante la constante amenaza de patógenos, pero su inmunidad está basada en hemocitos con capacidad de reconocer material extraño por medio de lectinas para fagocitarlo o encapsularlo; a pesar de que la respuesta celular en estos organismos es bastante limitado, ya que en los crustáceos se han logrado definir solo tres tipos de grupos celulares diferentes morfológica y funcionalmente (Vázquez et al., 1997b). Los niveles de respuesta varían entre las diferentes especies de crustáceos, por ejemplo: Penaeus setiferus, P. vannamei y P. chinensis, son susceptibles al Síndrome de Taura, no así P. aztacus y P. duodarum (Overstreet et al., 1997), por lo cual se considera que ciertos factores fisiológicos contribuyen de manera importante en la inmunidad de estas especies tales como: el estado de desarrollo, etapa cercana a la ecdisis, su adaptación al medio acuático en el que se desarrolla (salino, esterosalino o dulceacuícola) y, a las condiciones de estrés que sufren los or-

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ganismos al ser cultivados de manera extensiva. Es de gran interés, el identificar la estructura y la secuencia de los factores séricos, así como el realizar estudios sobre la biología molecular de estas proteínas, con la finalidad de determinar la organización y restricción genética en la síntesis de estas proteínas, así como el inducir la regulación de los mecanismos de inmunidad a las especies susceptibles a enfermedades que llegan a causar merma en la producción, y determinar su relación filogenética en la escala evolutiva. AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Ref: 26068-N) y la Universidad Nacional Autónoma de México, Programa PAPIIT, México.

REFERENCIAS

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NOV - DEC 1998, VOL. 23 Nº 6