MAPEO DE LAS REGIONES COMUNES DE DELECIÓN EN 5P15 EN CARCINOMA CERVICAL Y SU OCURRENCIA EN LESIONES PRECANCEROSAS

MAPEO DE LAS REGIONES COMUNES DE DELECIÓN EN 5P15 EN CARCINOMA CERVICAL Y SU OCURRENCIA EN LESIONES PRECANCEROSAS Hugo Arias Pulido 1,3,4 , Gopeshwar Narayan 1 , Hernán Vargas 3 Mahesh Mansukhani 1 , Vundavalli VVS Murty1,2

1. Departamento de Patología, Universidad de Columbia, New York, NY, USA, 2. Instituto de Genética del Cáncer, Universidad de Columbia, New York, NY, USA, 3. Laboratorio de Biología Molecular Tumoral, Instituto Nacional de Cancerología, Bogotá, Colombia. 4. Dep. de Genética Molecular y Microbiología, Escuela de Medicina, Albuquerque, NM, USA.

ABSTRACT

RESUMEN

Background: Previous studies have shown that the short arm of chromosome 5 (5p) exhibits frequent genetic changes in invasive cervical carcinoma (CC), and that these changes arise early during the carcinogenesis, in precancerous lesions. These data therefore suggest that loss of candidate tumor suppressor genes located on 5p is associated with the development of CC. However, the precise location of 5p deletions is not known.

Antecedentes: Estudios previos han mostrado que el brazo corto del cromosoma 5 (5p), exhibe cambios genéticos frecuentes en carcinoma cervical invasivo (CCI). Dichos cambios comienzan temprano durante la carcinogénesis, en lesiones precancerosas. Por lo tanto, estos datos sugieren la existencia de genes supresores de tumores (GST´s) en 5p la eliminación de los cuales contribuye al desarrollo del CCI. No obstante, la localización exacta de las deleciones de 5p es desconocida.

Results: We performed a detailed deletion mapping of 5p in 60 cases of invasive CC. We found that 60%of the tumors exhibit a 5p loss of heterozygosity (LOH). The patterns of LOH allowed us to identify two minimal regions of deletions, one at 5p15,3 spanning a 5.5 cM genetic distance and a second site of 7 cM at 5p15,2-15,3. In addition, we also identified 5p deletions in 16% lesions of highgrade cervical intraepithelial neoplasia (CIN). 5p LOH was found in 63% of HPV16 positive tumors, while only 33%tumors with other HPV-types had 5p LOH. The differences in frequency of 5p LOH between tumors harboring HPV16 in combination with other HPV types and tumors harboring HPV16 DNA alone were significantly higher, suggesting a synergistic effect of high-risk types in causing genomic instability. Conclusion: These findings implicate the presence of tumor suppressor gene(s)on 5p relevant to CC tumorigenesis.

Resultados: Se realizó un mapeo detallado de las deleciones en 5p en 60 casos de CCI. El 60% de los tumores exhiben una pérdida de heterocigocia (LOH) en 5p. El perfil de LOH nos permitió identificar dos regiones mínimas de deleciones: una en 5p15,3 con una distancia genética de unos 5,5 cM y la otra de 7 cM en 5p15,2 – 15,3. Además, también logramos identificar deleciones 5p en el 16% de las lesiones intraepiteliales de alto grado (LIE-AG). La pérdida de heterocigocia (LOH) en 5p fue encontrada en el 63% de los tumores positivos para VPH 16, mientras que solamente el 33% de los tumores con otros tipos de VPH presentaron LOH en 5p. La diferencia de frecuencia de LOH en 5p entre tumores que albergaban VPH 16 en combinación con otros tipos de VPH y los tumores que presentaban una infección única por VPH 16 es significativamente alta, sugiriendo un efecto sinérgico, entre los tipos de alto riesgo, en la inestabilidad génica.

Ésta es una traducción del artículo original que se encuentra disponible en: http://www.molecular-cancer.com/content/1/1/3 Published: 1 October 2002 on Molecular Cancer 2002,1:3 Recibido el 26 de septiembre de 2002 y aceptado para publicación el 2 de octubre de 2002. Correspondencia: Hugo Arias-Pulido, Hernán Vargas, Laboratorio de Biología Molecular Tumoral, Instituto Nacional de Cancerología, Calle 1 No 9-85, Bogotá-Colombia, Fax:57 1 334 13 60.

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Arias H, Narayan G, Vargas H, Mansukhani N, Murty V

Conclusión: Los hallazgos demuestran la presencia de GST´s en la región 5p relevantes en la tumorigénesis del cáncer cervical. Palabras clave: Carcinoma cervical, neoplasia intraepitelial cervical (NIC), cromosoma 5p, pérdida de heterocigocia (LOH), mapeo de deleciones y virus del papiloma humano (VPH).

INTRODUCCIÓN Numerosos hallazgos clínicos implican a los tipos de VPH de alto riesgo como un factor etiológico critico en la tumorigénesis cervical.(1) Sin embargo, datos epidemiológicos y experimentales muestran que solamente una pequeña fracción de neoplasias intraepiteliales de cérvix (NIC) infectadas con VPH progresan a CCI.(2) Estos descubrimientos sugieren que las mutaciones somáticas juegan un papel crítico en la iniciación y la progresión del cáncer de cérvix. Se han identificado varios cambios genéticos que llevan al desarrollo del CCI. Sin embargo, el mecanismo preciso de cada una de estas alteraciones genéticas en la cascada de eventos del desarrollo del tumor cervical es desconocido. El desarrollo del cáncer cervical es precedido por distintos cambios morfológicos desde epitelio normal hasta carcinoma, pasando por lesiones intraepiteliales de bajo y alto grado. La base genética de esta progresión tampoco se conoce. Análisis citogenéticos y genético-moleculares han señalado al brazo corto del cromosoma 5 (5p) como la región cromosómica más frecuentemente afectada por duplicaciones y deleciones en una alta proporción de cáncer cervical.(3-6) Estos descubrimientos sugieren la presencia de oncogenes positivamente regulados y amplificados y genes supresores de tumores (GST) negativamente regulados y delecionados en este brazo cromosómico. La hibridización genómica comparativa (HGC), un método citogenético-molecular que identifica las ganancias y las pérdidas cromosómicas, al igual que los estudios de la pérdida de heterocigocia, han demostrado también la presencia de las deleciones recurrentes en las lesiones precancerosas de 5p.(7-10) Aunque estos estudios han identificado el 5p como una región comúnmente afectada, el sitio exacto de la deleción que alberga los GST es desconocido, debido a la falta de estudios de mapeo sistemático y detallado de la deleción.

Para una caracterización de la región 5p en cáncer cervical, se realizó un mapeo de alta resolución de la deleción y encontramos que un 60% de pacientes presentan LOH. Identificamos dos lugares de deleciones mínimas en 5p15,3 y 5p15,2-15,3, extendidos a 5,5 cM y 7 cM de distancia genética, respectivamente. También mostramos que las deleciones en la región 5p15 ocurren en un 16% en las lesiones de NIC de alto grado. Se identificaron dos lugares que pueden poseer genes candidatos a GST´s y confirmamos los reportes previos, en los cuales se mostró que las deleciones en 5p ocurren en pequeñas proporciones en las lesiones precancerosas.

MÉTODOS TUMORES

Y TEJIDO NORMAL

Se analizaron 60 biopsias de pacientes con diagnóstico confirmado de CCI primario, no tratadas previamente, con sus correspondientes muestras de sangre periférica, y 26 biopsias de NIC fijadas en formalina e incluidas en parafina. Los tejidos fueron obtenidos de pacientes del Instituto Nacional de Cancerología (Bogotá, Colombia). Se obtuvo consentimiento previo de los pacientes para la obtención de las muestras; el comite de ética institucional aprobó el protocolo de investigación. Los tumores invasivos fueron clínicamente clasificados de acuerdo con los parámetros de la FIGO en estado IB (5 tumores), IIB (14 tumores), IIIB (37 tumores) y IV (4 tumores). Histológicamente, 57 tumores fueron clasificados como carcinomas escamocelulares y 3 como adenocarcinomas. 25 de los NIC fueron clasificados como lesiones intraepiteliales de alto grado (LIE-AG) y uno como lesión intraepitelial de bajo grado (LIEBG). Se usaron ocho líneas celulares de cáncer cervical: SiHa, SW756, C-41, Caski, C-33A, HT-3, MS-751 y ME180, obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC-Manassas VA) y mantenidas en cultivo de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.

MICRODISECCIÓN, OBTENCIÓN DE ADN, ARN Y ANÁLISIS DE LOH El ADN de alto peso molecular de los tumores congelados, la correspondiente sangre periférica y las líneas celulares fueron aislados como ya se ha descrito.(25) Las células tumorales procedentes de

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tejidos con NIC embebidas en parafina fueron aisladas por microdisección con láser (Arcturus, Mountain View, CA). Después de la tinción con verde de metilo se realizo la extracción de ADN como ya se ha descrito.(26) El ARN total fue aislado de los cultivos celulares semiconfluentes utilizando TRIzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se usó un panel de 20 marcadores (18 di y 2 tetra-nucleótidos) de secuencias repetitivas de blancos polimórficos (STRP) los cuales fueron escogidos basándonos en su localización en 5p y en su heterocigocidad (Figura 1) (Gene-map99) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genemap). Posteriormente se realizó una PCR estándar que contenía un primer sentido marcado en su extremo terminal con Fósforo 32 gamma-(32P)ATP. Los análisis de los productos de la PCR se realizaron en geles de secuenciación de poliacrilamida denaturante; la valoración de LOH en autorradiogramas se realizó tal como se ha descrito. (25,26) Todos los autorradiogramas fueron analizados visualmente por tres observadores. La reducción de la intensidad de la señal en un 50% o más de un alelo en el ADN tumoral, comparada con la intensidad del alelo normal, se considera como LOH. La definición de la región mínima de la delusión se realizó tal como se describió anteriormente.(25) El análisis de LOH fue realizado por lo menos dos veces en todos los tumores con los respectivos marcadores que definen las deleciones mínimas.

ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA El ARN total aislado de las líneas celulares fue retrotrascrito utilizando primers al azar y el kit prostar primera cadena RT-PCR (Stratagene, La Jolla,CA). El análisis semicuantitativo de la expresión génica se realizó por 26 a 28 ciclos de una multiplex RT-PCR con a-actina como control y primers específicos para cada gen, extendidos a por lo menos 2 exones. Los primers utilizados y sus posiciones en el ADN complementario (ADNc) son: PDCD F 5’ –GCTTTCCGTGGAACGTTTTC- 3’ (108 – 127 Pb). PDCD R 5’ –TCTTATCGATCATCCCGGAG- 3’ (349 – 368 Pb). TERT F 5’ –GCGTTTGGTGGATGATTTCT-3’ (2647 – 2666 Pb). TERT R 5’ –CAGGGCCTCGTCTTCTACAG-3’ (2778 – 2797 Pb) TRIP 13 F 5’ –CAGCAGCACTGCAAAGAAAG –3’ (132 – 151 Pb). TRIP 13 R 5’ –TGTGAAGTGCAACAGTGCAT-3’ (321 – 340Pb). POLS F 5’ –CCCTTGTCCTGAAGAAGCAG-3’ (43 – 62 Pb). POLS R 5’ –AGGACTTTGATGGAACACGG-3’ ( 263 – 282 Pb).

Los productos finales de PCR fueron corridos en geles de agarosa al 1,5%, visualizados con tinción de bromuro de etidio y cuantificados utilizando un kit de Kodak Digital Image Analisis System (Kodak, New Haven, CT).

RESULTADOS IDENTIFICACIÓN DE DOS REGIONES DE DELECIONES MÍNIMAS EN 5P15,2-P15,3

DETECCIÓN DE TIPOS DE VPH Los primers consenso de L1 de VPH PGMY09/ 11 y el sistema de hibridización de línea reversa fueron usados para detectar 38 tipos de VPH (27, 28). Se emplearon controles negativos para eliminar el riesgo de una contaminación potencial. Ensayos individuales de sensibilidad fueron analizados a través del uso de diluciones seriadas de la línea celular SiHa, en diluciones de 104, 103, 102, 101 y 100 en copias de VPH-16.

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El análisis de LOH en 60 tumores con CCI, en el cual se utilizaron 20 marcadores para 5p, mostró deleciones en 36 de 60 tumores (60%) en por lo menos un marcador (Tabla 1). De los 36 tumores con LOH, 17 (47,2 %) presentaron LOH en todos los marcadores informativos, sugiriendo una monosomía génica en 5p (Figura 1). El perfil de LOH en los 19 tumores restantes que exhibieron perdidas en regiones de 5p fue utilizado para mapear las regiones comunes de pérdida (Figura 1). Esto permitió identificar dos deleciones mínimas en 5p15,3 y 5p15,2-15,3 (Figura 1 y 2). Todos los tumores que definieron las deleciones mínimas presentaron más del 60% de reducción en la intensidad de los alelos perdidos.

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Tabla 1. Frecuencia de LOH de 5p en cáncer cervical invasivo (CCI) Banda Cromosómica

Locus

Posición en el Mapa Genico (En cM)

No. Estudiado/ informativo

LOH (%)

5p15.3

D5S392 D5S678 D5S417 D5S405 D5S2088 D5S406 GATA82H02

0.0 0.0 5.5 8.2 8.2 10.7 11.0

60/39 59/27 59/28 58/29 59/48 60/39 60/42

21 (53.8) 11 (40.7) 15 (53.6) 11 (37.9) 20 (41.7) 17 (43.6) 21 (50.0)

5p15.2

D5S1455 D5S2054 D5S635 D5S676 D5S1957 D5S208 D5S630

13.0 13.2 13.8 15.6 17.7 18.0 18.6

60/38 60/37 60/40 57/29 59/42 60/40 60/46

20 (52.6) 17 (45.9) 18 (45.0) 11 (37.9) 17 (40.5) 13 (32.5) 17 (37.0)

5p14

D5S432 D5S117 D5S416 D5S486

21.4 22.0 27.9 31.0

58/42 58/37 59/46 57/40

16 (38.1) 13 (35.1) 18 (39.1) 13 (32.5)

5p13.2

D5S419

39.5

60/48

18 (37.5)

5p11-12

D5S426

51.6

60/41

13 (31.7)

Figura 1. Identificación de regiones mínimas delecionadas analizadas por mapeo de alta resolución de LOH en 5p en muestras de pacientes con cáncer cervical Invasivo . En la parte superior se muestra un idiograma de bandas G del cromosoma 5.Una línea horizontal gruesa debajo del idiograma representa, la región cromosómica correspondiente a 5p. Pequeñas líneas verticales muestran los marcadores STRP; en la línea gruesa horizontal se aprecian las distancias geneticas correspondientes al mapa. El Porcentaje de LOH se muestra en las cajas Horizontales debajo de cada marcador de STRP. Los patrones de LOH son mostrados debajo. Una línea horizontal representa cada tumor; la región del marcador con LOH esta representada por líneas sombreadas suaves y las líneas sombreadas oscuras muestran la retención de la Heterocigocidad . los números de tumores están mostrados en el carril vertical izquierdo. Los rectángulos oscuros gruesos en la parte inferior indican regiones de mínima deleción.

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Figura 2. En el tumor ( T-6) al lado izquierdo se observa la LOH en la región 5p15.3 y en el tumor(T-59) al lado derecho la LOH en la región 5p15.3-15.2. En la parte superior de cada grafica esta la secuencia repetitiva de blanco polimórfico usado (STRP). N= Normal; T= Tumor; y el (*) indicando la LOH; determinada por la reducción de la intensidad en mas de un 50% del alelo tumoral al ser comparado con el alelo normal (LOH)

La deleción distal 5p15,3 se extiende a la región telomérica alrededor de los marcadores D5S392, D5S678 y D5S417. Sin embargo, dos tumores (T-13 y T-49) mostraron deleciones del marcador terminal D5S392 sólo a 0 cM de distancia genética, el cual es el marcador más distal en 5p. Consideramos que el límite de la deleción está definido por el marcador proximal D5S417 en los tumores T-6 y T-105 (Figuras 1 y 2). La segunda región proximal de la deleción abarcaba 6 marcadores (D5S406, GATA82H02, D5S1455, D5S2054, D5S635 y D5S676) y fue detectada en 28 tumores. El límite de la deleción fue definido próximamente por los tumores T-59 y T-66, mientras que el límite distal fue identificado por los tumores T-59 y T-114 (Figuras 1 y 2). Todos los tumores que presentan deleciones en 5p se ubican dentro de las dos regiones definidas por las deleciones, mientras que sólo 25 tumores exhibieron deleciones en ambas regiones. Así, este análisis identifica dos sitios discretos y cercanos de deleciones mínimas en 5p15,3 y 5p15,2-15,3, los cuales fueron restringidos a 5,5 cM y 7 cM de distancia genética, respectivamente.

ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE LOS GENES CANDIDATOS A SUPRESORES DE TUMOR EN LÍNEAS CELULARES DE CÁNCER CERVICAL

En un esfuerzo por identificar los genes inactivados en las deleciones recurrentes de 5p en cáncer cervical, identificamos genes candidatos a GST´s. Tres genes fueron identificados en la deleción terminal 5p15,3. Éstos incluyen PDCD6, una proteína que

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juega un papel en la apoptosis inducida por el receptor de las células T, FAS- y glucocorticoides;(11) TERT, un gen que codifica un componente de transcriptasa reversa de la telomerasa, la derregulación del cual promueve la inestabilidad cromosomal;(12) y TRIP13, una proteína que interactúa con el receptor hormonal de tiroides, el cual se une con la proteína VPH 16 E1.(13) Hemos identificado, en la región proximal de la deleción mínima, un gen POL que codifica una ADN-polimerasa sigma y juega un papel en la replicación del ADN y en la cohesión de la cromátida hermana.(14) Desarrollamos un análisis de RT-PCR semicuantitativo de todos los cuatro genes (PDCD6, TERT, TRIP3 y POLS) en ocho líneas celulares de cáncer cervical y no encontramos evidencia de carencia o disminución de la regulación en la expresión al compararla con la expresión en cérvix normal.

DELECIONES VPH

EN

5P

EN RELACIÓN

CON

Las deleciones 5p no muestran ninguna diferencia significativa con la edad al diagnóstico y el estado del tumor (datos no mostrados). En 58 de los 60 (96,7%) tumores estudiados fueron positivos para VPH. Los dos tumores restantes fueron VPH negativos. El VPH 16, solo o en combinación con otros tipos de VPH, fue encontrado en 46 tumores, mientras que 12 tumores tuvieron otras clases de VPH, incluyendo VPH 18. Se detectó LOH en 5p en 29 de 46 (63%) tumores positivos para VPH 16, mientras que solamente 4 de 12 (33%) tumores con otros tipos de VPH tuvieron LOH 5p. Los dos tumores que no poseían infección con VPH también tenían

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LOH en 5p. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (X2 = 4,93; P = 0,10). Sin embargo, cuando el análisis fue restringido a VPH 16, se encontró que los pacientes que poseían VPH 16 como infección única, presentaron LOH en 20 de 36 (55,6%) tumores, mientras que los pacientes infectados con VPH 16 en combinación con otros tipos de VPH exhibieron LOH 9 de 10 (90%). Esta diferencia fue significativa (X2 = 8,75; P = 0,05).

embargo, la localización de regiones exactas de LOH es desconocida, por la falta de un mapeo sistemático y de alta resolución de la deleción en la región 5p en cáncer cervical. Hemos identificado previamente que los marcadores de mapeo para las regiones 5p15 son frecuentemente delecionados.(4,7) En este estudio se realizó un mapeo de alta densidad para caracterizar las pérdidas en 5p en CCI. Encontramos una alta frecuencia de LOH e identificamos dos regiones mínimas de deleciones en 5p15,3 y 5p15,2 – 15,3.

LAS

La deleción mínima de 5p15 se expande de 0 a 5,5 cM de distancia genética. En concordancia con estos patrones, los marcadores D5S392 y D5S417 exhibieron la más altas frecuencias (53,8% y 53,6%, respectivamente) de LOH entre todos los lociprobados. El tamaño genómico del intervalo de la deleción 5p15,3 es aproximadamente de 3,2 Mb. Una búsqueda en la base de datos ha identificado tres genes candidatos: PDCD6, TERT y TRIP13, con una función insinuada de genes supresores de tumor. El gen de la muerte celular programada, PCDC6 es un miembro de la familia de las proteínas de unión intracelular de Ca+2 y una parte de la maquinaria apoptótica controlada por los receptores de células T (TCR), Fas y señales glucocorticoides.(11,17) TERT codifica una transcriptasa reversa requerida para la replicación de los extremos del cromosoma y desempeña un rol en la elongación de la telomerasa. Aunque la expresión de la telomerasa es un distintivo del cáncer, el ratón que muestra la ausencia del componente de ARN de la telomerasa (mTERC) muestra un progresivo encogimiento del telómero e inestabilidad cromosómica, asociada con los tumores epiteliales.(12) De modo compatible con el papel establecido de esta enzima en la inmortalización celular y la patogénesis del cáncer(18), nosotros no encontramos expresión en cérvix normal, mientras que se presentó abundantemente en todas las ocho líneas celulares estudiadas (Figura 3). Recientemente se ha mostrado que la amplificación y la sobreexpresión del hTERT es común en cáncer cervical.(19) TRIP13, la proteína 13 que interactúa con receptores de tiroides, es un factor de trascripción que regula la expresión de una variedad específica de genes blanco, incluyendo el de la proteína E1 del VPH16.(13) De forma similar al TERT, TRIP13 también muestra una muy baja expresión en cérvix normal y niveles muy elevados de expresión en líneas celulares de cáncer cervical (Figura 3). La presencia de estos genes en el intervalo 5p15,3 sugiere que pueden ser genes supresores de tumor blanco de estas deleciones en

LESIONES

5P

OCURREN

CON BAJA FRECUENCIA EN LESIONES PRECANCEROSAS

Para entender el papel de las deleciones en 5p en la progresión del cáncer cervical, evaluamos LOH en 26 especímenes microdisectados (25 LIE-AG y uno de bajo grado), utilizando cuatro marcadores (Tabla 2). 4 de los 25 tumores informativos tuvieron LOH en uno o más marcadores. Un NIC de bajo grado no presentó LOH. Así, las deleciones en 5p identificadas en las lesiones LIE-AG sugieren que estas alteraciones genéticas ocurren previamente al desarrollo del cáncer invasivo.

Tabla 2. LOH en 5p en lesiones Cervicales precancerosas. Locus

No. de CINs Estudiados

No. Informativos

LOH (%)

D5S2088 GATA82H02 D5S1455 D5S635

25 24 18 23

22 17 9 17

1 (4.5%) 3 (17.6%) 1 (11.1%) 2 (11.8%)

DISCUSIÓN Estudios genéticos extensos han documentado alteraciones frecuentes que afectan varias regiones cromosómicas en cáncer cervical. Análisis de LOH y HGC (hibridización genomica comparativa) han demostrado, consistentemente, pérdidas frecuentes de material genómico en un número de regiones cromosómicas, sugiriendo la presencia de genes supresores de tumor en estos lugares.(4,6,15,16) De éstas, las deleciones del cromosoma 5p han sido reportadas como muy frecuentes en cáncer cervical invasivo.(5-7) Sin

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cáncer cervical. Sin embargo, el análisis de la expresión de estos genes no brindó evidencia de la derregulación en líneas celulares de cáncer cervical. El segundo sitio de deleción mínima en 5p15,215,3 entre 10,7 y 17,7 cM de distancia genética, se expande aproximadamente 2,5 Mb de la región genómica. Una búsqueda en la base de datos identificó, en la región deleccionada, al gen POLS, una proteína con función relacionada con la topoisomerasa, que codifica la polimerasa sigma (ADN dirigida). El gen de levadura homólogo TRF-4 juega un papel crítico en la segregación del cromosoma, por la coordinación entre la replicación del ADN y la cohesión de la cromátide hermana.(14) Análisis de la expresión de este gen en las líneas celulares de cáncer cervical no mostraron evidencia de regulación baja. Aunque los genes analizados no mostraron una expresión derregulada, aún queda por ver si alguno de estos genes u otros mapeados en las regiones mínimas de pérdida son blancos de mutaciones en cáncer cervical. Sin embargo, el presente estudio identificó dos sitios discretos de deleciones en 5p15,3 y 5p15,2-15,3 que contienen GST putativos de gran importancia en el desarrollo de cáncer cervical, y provee las bases para su identificación. Las deleciones 5p también han sido reportadas en lesiones precursoras de LEI con frecuencias entre 14,7% y 42%.(7-10) Hemos mostrado previamente en poblaciones geográficamente diferentes que el 21% de LEI tenían deleciones en 5p. Basados en los estudios de seguimiento, hemos sugerido que las deleciones genéticas 5p pueden identificar lesiones de alto riesgo para la progresión a cáncer invasivo.(7) En un estudio más reciente se mostró también que las deleciones 5p fueron significativamente más frecuentes en las displasias recurrentes, comparadas con las displasias no recurrentes (9). Estos datos sugieren además que las alteraciones genéticas en 5p ocurren tempranamente en la carcinogénesis cervical y deben ser críticas para el desarrollo de cáncer invasivo. Dándoles soporte a los estudios previos, el estudio presentado muestra la presencia de LOH en 5p15 en un 16% de LEI-AG (Tabla 2). El papel de los mecanismos envueltos en la inestabilidad genómica inducida por VPH de alto riesgo ha sido de considerable especulación (revisado en 20). La expresión de los genes E6 y E7 de los VPH de alto riesgo puede independientemente inmortalizar varios tipos de células humanas in vitro. El gen E6 interactúa con la p53 y una proteína

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apoptótica BAK, seguido de su degradación, lo cual resulta en inestabilidad cromosomal y resistencia a la apoptosis.(21,22) La proteína E7 interactúa con pRb conduciendo a su degradación.(23) Se ha mostrado que las proteínas p53 y pRb, juegan múltiples funciones en el crecimiento celular y en la integridad genómica. Existen reportes contradictorios sobre las deleciones 5p con relación a la infección por VPH.(5,24) Ku y colaboradores mostraron que las deleciones 5p ocurren en una proporción significativamente alta en cáncer cervical positivo para VPH 16, comparado con los tipos de bajo riesgo.(5) Contradictoriamente, otro estudio ha mostrado que deleciones 5p son independientes de la infección con VPH 16 y VPH 18.(24) En el presente estudio no encontramos ninguna diferencia significativa en LOH de 5p en pacientes que poseían VPH 16 en combinación con otros tipos. Sin embargo, encontramos que los pacientes positivos para VPH 16 y otros tipos de VPH mostraron un incremento significativo en la pérdida en 5p, comparados con los pacientes que tenían infección única por VPH 16. Por lo tanto, estos datos sugieren que múltiples infecciones con VPH de alto riesgo pueden tener efecto sinergético, causando inestabilidad genómica. Actualmente no está claro el rol del tipo de VPH de alto riesgo causante de inestabilidad genómica en 5p. Estudios posteriores serán necesarios para resolver esta pregunta.

CONCLUSIONES En resumen, el presente estudio confirmó nuestras observaciones anteriores, donde se mostró que la pérdida genética en 5p es una característica común del cáncer cervical. Aquí identificamos dos regiones comunes de pérdida que presentan genes candidatos a genes supresores de tumores en este brazo cromosómico y se mostró que la infección múltiple por VPH de alto riesgo puede producir instabilidad genética en 5p. Además, mostramos que las deleciones genéticas en 5p ocurren durante el desarrollo temprano del cáncer cervical, en lesiones LIE de alto grado. Nuestra identificación de las deleciones mínimas en 5p y LOH en lesiones intraepiteliales escamosas tiene varias implicaciones potenciales. Primero, puede facilitar la identificación de los genes diana de importancia en la tumorigénesis cervical. Segundo, puede brindar marcadores genéticos críticos para la identificación de neoplasias intra-epiteliales cervicales de alto riesgo para la progresión.

Arias H, Narayan G, Vargas H, Mansukhani N, Murty V

REFERENCIAS

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