Laporan Praktikum Genetika dan Biologi Molekuler \"Elektroforesis DNA (SDS-PAGE)\"

LAPORAN LENGKAP PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER (ELEKTROFORESIS DNA (SDS-PAGE))

Disusun oleh:

NAMA

:

LASINRANG ADITIA

NIM

:

60300112034

KELAS

:

BIOLOGI A

KELOMPOK

:

V (Lima)

LABORATORIUM BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR 2014

@Copyright Lasinrang Aditia

LEMBAR PENGESAHAN Laporan lengkap praktikum Genetika dan Biologi Molekuler dengan judul “Elektroforesis DNA (SDS-PAGE)” yang disusun oleh:

Nama

: Lasinrang Aditia

Nim

: 60300112034

Kelas

: Biologi A

Kelmpok

: V (lima)

Telah diperiksa oleh Kordinator Asisten / Asisten dan dinyatakan diterima.

Samata-Gowa,

Desember 2014

Kordinator Asisten

Asisten

(Muhammad Alamsyah)

(Risnawati)

60300110

60300111059

Mengetahui, Dosen Penanggung Jawab

(Isna Rasdiana Aziz, S.Si, M.Sc.)

@Copyright Lasinrang Aditia

A. Tujuan Praktikum Adapun tujuan dilakukannya praktikum ini adalah untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi, dan purifikasi dari molekul DNA atau RNA dengan elektroforesis SDS-PAGE. B. Dasar Teori Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan

atau

autoradiografi,

ataupun

dilakukan

kuantifikasi

dengan

densitometer (Magdeldin, 2012). Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ke tidak homogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan (Martin, 1996).

@Copyright Lasinrang Aditia

Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fase diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Kemampuan perpindahan pergerakan muatan molekul tersebut menuju ke arah kutub yang berlawanan merupakan suatu parameter kecepatan dalam proses elektroforesis yang dinyatakan sebagai mobilitas elektroforetik (Lisdiyanti, 1997). Teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan dan elektroforesis daerah. Pada teknik elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, dan kertas sellulose poliasetat (David, 2009). C. Waktu dan Tempat Adapun waktu dan tempat dilaksanakannya praktikum ini adalah sebagai berikut: Hari/tanggal

: Senin/15 Desember 2014

Waktu

: 08.00-10.00 WITA

Tempat

: Laboratorium Genetika dan Molekuler Lantai II Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar Samata-Gowa

@Copyright Lasinrang Aditia

D. Alat dan Bahan a. Alat Adapun alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu beaker glass (10, 250, 500, dan 1000 ml), sarung tangan, spatula, batang pengaduk, gelas ukur, erlenmeyer, aluminium foil, pipet ukur, pipet, timbangan digital, mikropipet, sentrifuge, refrigator, pH meter, eppendorf, masker, power supply, plakon, perangkat elektroforesis SDS-PAGE dan kamera digital. b. Bahan Adapun bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu ekstrak antigen OMP, amonium persulfat (APS), akrilamid, aquadest steril, bis-akrilamid, SDS, Tris base, TEMED, glysin, b-mercapetanol, metanol, NaCl, asam asetat glasial, bromofenol biru, gliserol, coomassie briliant blue R-250 (CBB R250), marker protein, dan Tris-HCL. E. Cara Kerja Adapun cara kerja pada percobaan ini yaitu: 1. Persiapan Gel Membersihkan plat kaca dengan aquadest dan etanol (70%)

Menyusun lempeng kaca serta spacer dan menutup celah diantaranya menggunakan agar 2% secukupnya

Menyiapkan gel poliakkrilimide-SDS 10%

Menuang campuran gel pemisah ke dalam ruang antara lempeng kaca dan meneteskan isobutanol dan biarkan selama 30 menit dan menyiapkan gel penumpuk

@Copyright Lasinrang Aditia

Setelah gel pemisah berpolimerisasi, menuangkan campuran gel penumpuk di atasnya dan menyiapkan sisir plastik (pembentuk sumur sampel)

Setelah gel penumpuk berpolimerisasi, lepaskan sisir dari bagian atas dan klem serta spacer bagian bawah

Letakkan lempeng kaca yang berisi gel secara vertikal pada alat elektroforesis dan klem. Isi tempat dapar dengan dapar elektroda. Singkirkan gelembung udara pada bagian bawah gel 2. Persiapan sampel-sampel protein Memakai sarung tangan dan teknik-teknik keselamatan laboratorium

Menyiapkan 3 tabung mikrosentrifus dan menandainya, menambanhkan 450 ml buffer sampel dan 250 ml b-merkaptoetanol ke setiap tabung tersebut. Transfer 50 ml sampel protein ke masingmasing tabung

Menvortex pelan-pelan supaya endapannya dicampur rata dengan buffer

Memasukkan semua tab ung ke dalam waterbath selama 5 menit setelah itu mensentrifuse semua tabung selama 3 menit dengan kecepatan 14.000 rpm

@Copyright Lasinrang Aditia

3. Loading and Running the Gel Memasukkan 10 ml sampel protein ke dalam sumur

Hubungkan alat elektroforesis dengan power supply. Jalankan elektroforesis selama 4 jam

4. Pewarnaan Gel Setelah waktu untuk menjalankan pemisahan protein selesai, matikan power supply dan melepaskan kabel dari elektroforesis

Mengangkat spacer pada kedua sisi lempeng kaca, kemudian pisahkan lempeng kaca dari gel

Memindahkan ke tempat pencui dan mengganti larutan pencuci beberapa kali hingga warna latar memudar dan pita-pita protein terlihat jelas dan terakhir menfoto hasil gel F. Hasil Pengamatan Adapun hasil yang diperoleh dari pengamatan yaitu sebagai berikut ini: No

1.

Gambar

Keterangan

Mengencerkan buffer dengan konsentrasi tertentu.

@Copyright Lasinrang Aditia

2.

Menambahkan agarosa.

3.

Malarutkan agarosa.

4.

Mendinginkan larutan.

5.

Mempersiapkan cetakan gel agarosa.

6.

Menuang larutan ke dalam cetakan.

7.

Melepaskan gel agarosa yang telah memadat dari cetakan.

@Copyright Lasinrang Aditia

8.

9.

10.

11.

Menyiapkan alat elektroforesis.

Memasukkan sampel ke dalam sumur gel agarosa.

Memasang tutup pengaman.

Menghubungkan alat elektroforesis ke Power supply dan menjalankannya.

Melepaskan semua kabel dari alat 12.

elektroforesis dan membuka penutup pengaman.

Memasukkan gel hasil elektroforesis 13.

ke dalam suatu wadah yang berisi larutan buffer.

@Copyright Lasinrang Aditia

14.

Menambahkan Ethidium Bromida (EtBr) ke dalam wadah tersebut.

Menggoyangkan wadah hingga 15.

seluruh EtBr tercampur dengan larutan.

16.

17.

Mendiamkan selama 5-10 menit.

Menyiapkan sinar UVTransilluminator.

Mengangkat gel ke atas UV18.

Transilluminator. Meletakkan dengan hati-hati, jangan sampai terbentuk gelembung udara.

@Copyright Lasinrang Aditia

Meletakkan kamera di atas hood. Memotret fragmen DNA hasil

19.

elektroforesis tanpa menggunakan flash pada kamera.

20

Hasil dari pewarnaan gel.

G. Pembahasan Elektroforesis merupakan metode analisis fisika berdasarkan kecepatan migrasi partikel bermuatan yang terlarut atau terdispersi, dalam larutan elektrolit dibawah medan listrik. Prinsip pemisahan dengan elektroforesis gel adalah pemisahan suatu molekul organik dari campurannya melalui suatu gel dalam suatu medan listrik. Pemisahan terjadi tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan atau melihat kemurnian DNA atau protein yang tidak bisa diperoleh dengan metode lain seperti gradient sentrifugasi. Media yang banyak dipakai dalam proses pemisahan ini adalah agarose atau akrilamid. Agarose digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang lebih besar karena memiliki ukuran partikel yang lebih besar. Sehingga daya pisah dari agarose (resolusi) lebih kasar (lebih lemah) dibandingkan akrilamid. Akrilamid memiliki ukuran partikel yang lebih halus sehingga daya pemisahannya lebih baik. Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan Teknik ini merupakan teknik yang sederhana, cepat, dan dapat memisahkan

@Copyright Lasinrang Aditia

molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradient. Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Agarosa yang disaring dari ganggang laut merupakan polimer dengan dasar struktur D-alaktosa dan 3,6 –anhidro L-galaktosa. DNA dari 200 basa sampai 50 kilo basa dapat dipisahkan dengan gel agarosa dengan berbagai konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap. Gel yang biasa digunakan agarosa. Gel agarosa dapat melakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga nanti di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Gel agarosa dibuat dengan melelehkan agarosa dengan buffer dan kemudian dituangkan pada cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarosa membentuk matriks dengan kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnet diberikan antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral, bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi ini ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa dan besaran tegangan yang digunakan. Molekul DNA untai ganda linear, yang diletakkan pada salah satu ujung gel, bergerak melalui matriks gel pada kecepatan yang berbanding terbalik terhadap log jumlah asam basa. Molekul yang lebih besar bergerak lebih lama karena terjadi gesekan lebih besar. Hal ini disebabkan DNA harus melewati pori-pori gel sehingga kurang efisien lajunya dari pada molekul yang lebih kecil. Fragmen DNA linear dengan panjang tertentu bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda pada gel yang mengandung konsentrasi agarosa berbeda. Cara yang paling mudah untuk

@Copyright Lasinrang Aditia

mendeteksi adanya DNA dengan menggunakan etidium bromide, suatu senyawa berfluoresensi yang biasanya digunakan untuk mendeteksi DNA pada gel agarosa atau poliakrilamid. Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR,memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran,lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan,antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang dikloning dalam rekombinan plasmid DNA. H. Kesimpulan Adapun kesimpulan pada percobaan ini bahwa elektroforesis merupakan metode analisis fisika berdasarkan kecepatan migrasi partikel bermuatan yang terlarut atau terdispersi, dalam larutan elektrolit dibawah medan listrik. Prinsip pemisahan dengan elektroforesis gel adalah pemisahan suatu molekul organik dari campurannya melalui suatu gel dalam suatu medan listrik. Pemisahan terjadi tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.

@Copyright Lasinrang Aditia

DAFTAR PUSTAKA David G. Watson. 2009. Analisis Farmasi. Jakarta : EGC Lisdiyanti. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Bogor: Warta Biotek, 1997. Magdeldin, Sameh. Gel Electrophoresis-Principles and Basics. Rijeka: InTech Publisher, 2012. Martin, R. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Oxford: Bros Scientific Publishers Ltd., 1996.

@Copyright Lasinrang Aditia