Laporan praktikum biokimia

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Identifikasi Protein
Oleh :
Nama : M. Iqbal Baihaqi (10060313049)
Ulfa Siti M (10060313050)
Peri Supriatna (10060313051)
Chania H Anuzar (10060313053)
Shif/Kelompok : B
Asisten :
Tgl.Praktikum : Selasa, 3 Maret 2015
Tgl.Pengumpulan : Selasa, 10 Maret 2015


PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKAN DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG
2015




A. TUJUAN :
Dapat memahami metode identifikasi protein.

B. PRINSIP DASAR :
Uji protein dengan metode identifikasi protein secara kualitatif dapat menggunakan prinsip:
Uji Biuret: pembentukan senyawa kompleks koordinat yang berwarna yang dibentuk oleh Cu2+ dengan gugus –CO dan –NH pada ikatan peptida dalam larutan suasana basa.
Pengendapan dengan logam: pembentukan senyawa tak larut antara protein dan logam berat.
Pengendapan dengan garam: pembentukan senyawa tak larut antara protein dan ammonium sulfat
Pengendapan dengan alcohol: pembentukan senyawa tak larut antara protein dan alcohol
Uji koagulasi: perubahan bentuk yang ireversibel dari protein akibat dari pengaruh pemanasan.
Denaturasi protein: perubahan pada suatu protein akibat dari kondisi lingkungan yang sangat ekstrim.

C. TEORI DASAR
Protein
Kata protein sebenarnya berasal dari kata Yunani yang berarti pertama yang paling penting, asal dari kata protos. Protein terdiri dari bermacam-macam golongan makromolekul heterogen. Walaupun demikian semuanya merupakan turunan dari polipeptida dengan berat molekul yang tinggi, secara kimia dapat dibedakan antara protein sederhana yang terdiri dari polipeptida dengan berat molekkul yang tinggi. Secara kimia dapat dibedakan antara protein sederhana yang terdiri dari polipeptida dan protein kompleks yang mengandung zat-zat makanan tambahan seperti hern, karbohidrat, lipid atau asam nukleat. Untuk protein kompleks, bagian polipeptida dinamakan aproprotein dan keseluruhannya dinamakan haloprotein. Secara fungsional protein juga menunjukkan banyak perbedaan. Dalam sel mereka berfungsi sebagai enzim, bahan bangunan, pelumas dan molekul pengemban. Tapi sebenarnya protein merupakan polimer alam yang tersusun dari berbagai asam amino melalui ikatan peptida (Hart, 1987).
Protein adalah suatu senyawa organik yang mempunyai berat molekul besar antara ribuan hingga jutaan satuan(g/mol). Protein tersusun dari atom-atom C,H,O dan N ditambah beberapa unsur lainnya seperti P dan S. Atom-atom itu membentuk unit-unit asam amino. Urutan asam amino dalam protein maupun hubungan antara asam amino satu dengan yang lain, menentukan sifat biologis suatu protein. (Girinda, 1990).
Protein adalah sumber asam amino yang mengandung unsur C,H,O dan N yang tidak dimiliki oleh lemak dan karbohidrat. Molekul protein mengandung gula terpor belerang, dan ada jenis protein yang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga. (Winarnno, 1997).
Kunci ribuan protein yang berbeda strukturnya adalah gugus pada molekul unit pembangunan protein yang relatif sederhana dibangun dari rangkaian dasar yang sama, dari 20 asam amino mempunyai rantai samping yang khusus, yang berikatan kovalen dalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai samping yang khusus yang memberikan sifat kimia masing-masing individu, kelompok 20 unit pembangunan ini dapat dianggap sebagai abjad struktur protein. (Lehninger, 1996).

Fungsi Protein
Sebagai Enzim
Hampir semua reaksi biologis dipercepat atau di bantu oleh suatu senyawa makromolekul spesifik yang disebut enzim, dari reaksi yang sangat sederhana seperti reaksi transportasi karbondioksida yang sangat rumit seperti replikasi kromosom. Protein besar peranannya terhadap perubahab-perubahan kimia dalam system biologis.
Alat Pengangkut dan Penyimpanan
Banyak molekul dengan MB kecil serta beberapa ion dapat diangkut atau dipindahkan oleh protein-protein tertentu. Misalnya hemoglobin mengangkut oksigen dalam eritrosit, sedangkan mioglobin mengangkut oksigen dalam otot.
Pengatur Pergerakan
Protein merupakan komponen utama daging, gerakan otot terjadi karena adanya dua molekul protein yang saling bergeseran.
Penunjang Mekanik
Kekuatan dan daya tahan robek kulit dan tulang disebebkan adanya kolagen, suatu protein berbentuk bulat panjang dan mudah membentuk serabut
Pertahanan Tubuh atau Imunisasi
Pertahanan tubuh biasanya dalam bentuk antibody, yaitu suatu protein khusus yang dapat mengenal dan menempel atau mengikat benda-benda asing yang masuk ke dalam tubuh seperti virus, bakteri, dan sel-sel asing lain.
Media Perambatan Impuls Saraf
Protein yang mempunyai fungsi ini biasanya berbentuk reseptor, misalnya rodopsin, suatu protein yang bertindak sebagai reseptor penerima warna atau cahaya pada sel-sel mata
Pengendalian Pertumbuhan
Protein ini bekerja sebagai reseptor (dalam bakteri) yang dapat mempengaruhi fungsi bagian-bagian DNA yang mengatur sifat dan karakter bahan. (Lehninger, 1996)

Sifat-Sifat Fisikokimia Protein

Sifat fisikokimia setiap protein tidak sama, tergantung pada jumlah dan jenis asam aminonnya
Berat molekul protein sangat besar
Ada protein yang larut dalam air, ada pula yang tidak larut dalam air, tetapi semua protein tidak larut dalam pelarut lemak
Bila dalam suatu larutan protein ditambahkan garam, daya larut protein akan berkurang, akibatnya protein akan terpisah sebagai endapan. Peristiwa pemisahan protein ini disebut salting out
Apabila protein dipanaskan atau ditambahkan alkohol maka protein akan menggumpal
Protein dapat bereaksi dengan asam dan basa



Struktur Protein
Struktur protein distabilkan oleh 2 macam ikatan yang kuat (peptida dan sulfida) dan dua macam ikatan yang lemah(hidrogen dan hidrofobik). Ikatan peptida adalah struktur primer protein yang berasal dari gabungan asam amino L-alfa oleh ikatan alfa-peptida. Bukti utama untuk ikatan peptida sebagai ikatan struktur primer dituliskan sebagai berikut:
a. Protease adalah enzim yang menghidrolisis protein, menghaslkan polipeptida sebagai produknya. Enzim ini juga menghidrolisis ikatan peptida protein.
b. Spektrum inframerah protein menunjukkan adanya banyak ikatan peptida
c. Dua protein, insulin dan ribonuklease telah disintesis hanya dengan menggabungkan asam-asam amino dengan ikatan peptida.
d. Protein mempunyai sedikit gugus karboksil dan gugus amina yang dapat dititrasi.
e. Protein dan polipeptida sintetik bereaksi dengan pereaksi biuret, membentuk warna merah lembayung. Reaksi ini spesifik untuk 2 ikatan peptida atau lebih.
f. Penyediaan difraksi sinar X pada tingkat kekuatan pisah 0,2mm telah menyajikan identifikasi ikatan peptida pada protein mioglobin dan hemoglobin. (Winarno, 1997)

Uji Biuret
Pada uji biuret, ketika beberapa tetes larutan CuSO4 yang sangat encer ditambahkan pada alkali kuat dari peptida atau proteindihasilkan warna ungu, adalah test yang umum untuk protein dan diberikan oleh peptida yang berisi dua atau lebih rantai peptida. Biuret dibentuk dengan pemanasan urea dan mempunyai struktur mirip dengan struktur peptida dari protein. (Routh, 1969)

Uji Pengendapan dengan Logam
Pada pH di atas titik isoelektrik protein bermuatan negative, sedangkan di bawah titik isoelektrik protein bermuatan positif. Olehkarena itu untuk mengendapkan protein dengan ion logam diperlukan pH larutan di atas titik isoelektrik, sedangkan untuk pengendapan protein dengan ion negative memerlukan pH larutan di bawah titik isoelektrik. Ion- ion positif yang dapat mengendapkan protein adalah Ag+, Ca2+, Zn2+, Hg2+,Pb2+,Cu2+,Fe2+. Sedangkan ion-ion negative yang dapat mengendapkan protein adalah ion salisilat, trikloroasetat, pikrat, tanat dan sulfosalisilat. (Riawan, 1990)

Uji Pengendapan dengan Garam
Pembentukan senyawa tak larut antara protein dengan ammonium sulfat. Apabila terdapat garam-garam anorganik dalam konsentrasi tinggi dalam larutan protein(albumin dan gelatin), maka kelarutan protein akan berkurang sehingga terjadi pengendapan protein. Teori menyebutkan bahwa sifat tersebut terjadi karena ion garam mampu mengikat air(terhidrasi) sehingga berkompetisi dengan molekul protein dalam mengikat air.

Uji Pengendapan dengan Alkohol
Protein dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Pelarut organic dapat merubah atau mengurangi konstanta dielektrika dari air sehingga kelarutan protein berkurang, dan karena juga alkohol berkompetisi dengan protein terhadap air.

Uji Koagulasi
Protein dengan penambahan asam atau pemanasan akan terjadi koagulasi. Pada pH iso-elektrik ( pH pada larutan tertentu biasanya sekitar 4-4,5 dimana protein mempunyai muatan positiof dan muatan negative sama, sehingga saling menetralkan) kelarutan protein sangat menurun atau mengendap. Pada temperature diatas 60 kelrutan akan berkurang (koagulasi) karena pada temperature yang tinggi energy kinetic protein meningkat sehingga terjadi getaran yang cukup kuat untuk merusak ikatan atau struktur sekunder, tersier dan kuarterner koagulasi.

Uji Denaturasi Protein
Denaturasi protein adalah hilangnya sifat-sifat struktur lebih tinggi oleh terkacaunya ikatan hidrogen dan gaya-gaya sekunder lain yang memutuskan molekul protein. Akibat dari suatu denaturasi adalah hilangnya banyak sifat-sifat biologis suatu protein(Fessenden, 1989).
Salah satu penyebab denaturasi protein adalah perubahan temperatur, dan juga perubahan pH. Faktor-faktor lain yang dapat menyebabkan denaturasi adalah detergent, radiasi zat pengoksidasi atau pereduksi, dan perubahan jenis pelarut. Denaturasi dapat bersifat reversibel, jika suatu protein hanya dikenai kondisi denaturasi yang lembut seperti perubahan pH. Jika protein dikembangkan kelingkungan alamnya, hal ini untuk memperoleh kembali struktur lebih tingginya yang alamiah dalam suatu proses yang disebut denaturasi. Denaturasi umumnya sangat lambat atau tidak terjadi sama sekali(Fessenden, 1989). Denaturasi protein juga dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hydrogen, ikatan garam atau bila susuna ruang atau rantai polipeptida suatu molekul protein berubah. Dengan perkataan lain denaturasi adalah terjadi kerusakan struktur primer, sekunder, tersier dan struktur kuarterner, tetapi struktur primer (ikatan peptida) masih utuh.
Struktur protein dapat dilihat sebagai hirarki, yaitu berupa struktur primer (tingkat I), sekunder (tingklat II), tersier (tingkat III), dan kuarterner (tingkat IV).

Struktur primer protein 
Protein yang dibentuk dengan asama amino tergabung dalam ikatan polipeptida. Setiap asam amino terhubung dengan asam amino lainnya dalam ikatan peptida yang terbentuk karena adanya reaksi kondensasi gugus karboksil pada setiap masing-masing asam amino.
Struktur Asam amino primer
Pada ujung dari rangkaian polipeptida yang terbentuk mempunyai sifat kimia yang berbeda: satu ujung mempunyai gugus amino bebas (N atau amino, NH2-) disisi satunya, sedangkan mempunyai gugus karboksil bebas (ujung C atau karboksil, COOH-) pada ujung satunya. Oleh karena itu, arah polipeptida dan dituliskan baik N C (kiri ke kanan) maupun C N (kanan ke kiri).
Struktur Sekunder protein
Pada struktur sekunder, rangkaian polipeptida memiliki konformasi yang berbeda. Bersifat reguler dan memiliki pola lipatan berulang dari rangka protein. Dua tipe umum struktur protein sekunder yaitu α-heliks dan β-sheet. Keduanya terbentuk karena ikatan hidrogen yang terjadi antara asam amino yang berbeda pada polipeptida.
Struktur Tersier
Struktur polipeptida yang terjadi dari lipatan komponen struktur sekunder polipeptida yang membentuk konfigurasi tiga dimensi. Bermacam-macam gaya ikatan hidrogen antar asam amino yang terjadi pada rangkaian polipeptida inilah maka disebur struktur tersier. Disertai gaya hidrofobik rangkaian ini menempatkannya (asam amino gugus non-polar) dibagian dalam protein dengan tujuan melindunginya dari air. Selain ikatan hidrogen, terdapat juga ikatan kovalen yang disebut juga sebagai jembatan disulfide antara asam amino sistein di berbagai macam posisi pada rangkaian polipeptida.
Struktur Kuartener protein
Asosiasi yang terjadi antara dua atau lebih rangkaian polipeptida, dimana masing-masing terlipat menjadi struktur tersier, menjadi protein multisubunit. Tidak semua protein membentuk struktur kuaternair. Antara rangkian polipeptida yang berbeda struktur protein terikat dengan jembatan disulfide. Sedangkan pada protein yang terdiri dari asosiasi subunit yang lebih lemah akan dihubungkan dengan ikatan hidrogen dan efek hidrofobik. Protein ini dapat kembali pada komponen polipeptidanya, atau berubah komposisi subunitnya tergantung pada kebutuhan fungsinya. Singkatnya, struktur kuartener menggambarkan subunit-subunit yang berbeda dipak bersama-sama membentuk struktur protein. (Wibowo, luqman, 2009) 

C. ALAT DAN BAHAN
UJI BURET
Alat : 1. Tabung reaksi Bahan : 1. Natrium hidroksida 2,5 N
2. pipet tetes 2. larutan protein (albumin)
3. gelas ukur 3. Larutan tembaga sulfat (CuSO4) 0,01 M



PENGENDAPAN DENGAN LOGAM
Alat : 1. Tabung reaksi Bahan : 1. larutan protein (albumin)
2. pipet tetes 2. Merkuri (III) klorida (HgCl2) 0,02 M
3. gelas ukur 3. Timbal asetat 0,2 M

PENGENDAPAN DENGAN GARAM
Alat : 1. Tabung reaksi Bahan : 1. Larutan protein (albumin)
2. pipet tetes 2. Larutan (NH4)2SO4
3. batang pengaduk 3. Reagen Millon
4. kertas saring 4. Reagen uji biuret



PENGENDAPAN DENGAN ALKOHOL
Alat : 1. Tabung reaksi Bahan : 1. Larutan albumin
2. pipet tetes 2. Buffer asetat 5 M
3. gelas ukur 3. Asam klorida 0,1 M
4. Natrium hidroksida 0,1 M
5. Etil alcohol 95 %

UJI KOAGULASI
Alat : 1. Tabung reaksi Bahan : 1. Asam asetat 1 M
2. pipet tetes 2. larutan protein
3. gelas ukur 3. Reagen millon
4. stopwatch 4. air
5. batang pengaduk

DENATURASI PROTEIN
Alat : 1. Tabung reaksi Bahan : 1. Larutan albumin
2. Pipet tetes 2. Buffer asetat pH 4,7 (1 M)
3. gelas ukur 3. HCl 0,1 M
4. stopwatch 4. NaOH 0,1 M
5. thermometer, pH meter

PROSEDUR KERJA

UJI BIURET

1,5 ml larutan protein dimasukkan ke dalam tabung reaksi

Ditambahkan 1ml natrium hidroksida 2.5 N, lalu diaduk

Ditambahkan satu tetes larutan tembaga sulfat 0.01 M, lalu diaduk

Jika tidak timbul warna, ditambahkan lagi setetes atau 2 tetes larutan tembaga sulfat




PENGENDAPAN DENGAN LOGAM

3ml larutan protein dimasukkan ke dalam tabung reaksi

Ditambahkan 5 tetes HgCl2 0.2 M

Percobaan diulangi dengan menggunakan Pb asetat 0.2 M

Pengendapan dengan Garam

5ml larutan protein dijenuhkan dengan ammonium sulfat ditambahkan sedikit garam.

Diaduk hingga melarut kemudian ditambahkan sedikit lagi ammonium sulfat lalu diaduk lagi.

Setelah larutan jenuh, lalu disaring.

Uji kelarutan endapan didalam air

Endapan diuji lagi dengan Reagen Millon dan difiltrat dengan uji biuret

Pengendapan dengan Alkohol

Tiga tabung reaksi disiapkan untuk masing-masing reaksi

Tabung reaksi pertama diisi dengan 2,5 ml albumin ditambah 0,5 ml buffer asetat pH 4.7 (5M) dan 3 ml etil alkohol 95%

Tabung reaksi kedua diisi dengan 2,5 ml larutan albumin ditambah 0,5 ml HCl 0.1M dan 3 ml etil alkohol 95%

Tabung reaksi ketiga diisi dengan 2,5 ml larutan albumin ditambah dengan 0,5 ml NaOH 0.1 M dan 3 ml etil alkohol 95%.


Uji Koagulasi

2,5 ml larutan protein dimasukkan kedalam tabung reaksi

Ditambahkan 2 tetes asam asetat 1M

Tabung diletakkan dalam air mendidih selama 5menit

Endapan diambil dengan batang pengaduk

Uji kelarutan endapan dalam air

Endapan diuji pula dengan Reagen Millon

Denaturasi Protein

Siapkan tiga tabung reaksi

Tabung reaksi pertama diisi dengan 4,5 ml larutan albumin dan 1 ml HCl 0.1 M

Tabung reaksi kedua diisi dengan 4,5 ml larutan albumin dan 1ml NaOH 0.1 M

Tabung reaksi ketiga diisi dengan 4,5 ml larutan albumin dan buffer asetat pH 4.7 (1M)

Ketiga tabung tersebut dimasukkan dalam air mendidih selama 15 menit

Kemudian didinginkan pada temperatur kamar

Dicatat tabung mana yang menunjukan adanya endapan

Pada tabung 1 dan 2 ditambahkan 10ml buffer asetat pH 4.7

DATA PENGAMATAN

PEMBAHASAN
1. UJI BIURET
Larutan yang digunakan pada reaksi uji protein, terutama pada uji biuret adalah albumin dan gelatin. Albumin didapat dari larutan putih telur, telur sebagai sumber protein mempunyai banyak keunggulan antara lain, kandungan asam amino paling lengkap dibandingkan bahan makanan lain seperti ikan, daging, ayam, tahu, tempe, dll. Nilai gizi telur sangat lengkap, yeitu merupakan sumber protein yang baik, kadarnya sekitar 14%, sehingga dari tiap butir telur akan diperoleh sekitar 8 gram protein. Kandungan asam amino proteinnya sangat lengkap. Telur kaya fosfor dan besi, tetapi kandungan kalsiumnya rendah. Selain itu telur juga mengandung vitamin B kompleks, serta vitamin dan D.
Pada percobaan biuret ini yaitu yang pertama larutan protein (albumin) ditambahkan larutan natrium hidroksida 2,5 N yang kemudian diaduk. Pada albumin terdapat endapan putih di dalam larutan, yang mulanya albumin berwarna putih kental. Penambahan larutan natrium hidroksida pada larutan protein tersebut yaitu sebagai katalis yang berfungsi untuk menghancurkan atau memecahkan protein. Kemudian ditambahkan juga dengan larutan tembaga sulfat pada larutan protein tersebut (albumin). Terjadi perubahan warna pada larutan albumin setelah ditambahkan tembaga sulfat dan dikocok yaitu warna larutan menjadi berwarna ungu dan warna ungu tetap tidak hilang walaupun ditambahkan larutan tembaga sulfat setetes demi tetes dan kemudian di kocok, serta masih terdapat endapan putih, yang mulanya larutan tersebut berwarna putih terdapat endapan. Untuk membuktikan adanya peptida pada protein (albumin), yaitu dengan penambahan larutan tembaga sulfat pada larutan albumin, larutan tembaga sulfat yang bersifat basa bereaksi dengan polipeptida, sedangkan polipeptida merupakan penyususn protein. Yang menandakan positif adanya protein yaitu terdapat ikatan peptida lebih banyak, dapat dibuktikan saat penambahan larutan tembaga sulfat setetes demi tetes dan dikocok larutan tetap berwarna ungu, hal ini menandakan bahwa ikatan peptidanya kuat, karena apabila ikatan peptinya lemah, saat larutan protein ditambahkan tembaga sulfat yaitu warna ungunya akan memudar saat dikocok.
Reaksi uji biuret ini memberikan hasil yang positif akibat pembentukan senya kompleks Cu 2+ gugus CO dan NH dari suatu rantai peptida dalam suasana basa. Dipeptida dari asam-asam amino histidin, serin, dan treonin tidak memberikan reaksi untuk uji biuret. Pada percoban larutan sampel yang memberikan hasil uji positif adalah albumin.
2. PENGENDAPAN DENGAN LOGAM
Pada percobaan pengendapan dengan logam, 2 tabung yang berisi larutan albumin, pada tabung pertama ditambahkan HgCl2 dan tabung kedua ditambahkan PbSO4, penambahan larutan HgCl2 dan PbSO4 pada larutan albumin secara bersamaan, supaya dapat dibandingkan larutan mana yang lebih cepat bereaksi, dan yang lebih bereaksi adalah larutan albumin yang ditambahkan HgCl2. warna albumin yang ditambahkan HgCl2 yaitu putih, sedangkan pada albumin yang ditambahkan PbSO4 berwarna putih keruh. Warna semula laruta albumin yaitu putih kental.
Dari percobaan diatas, masing-masing larutan protein (albumin) yang ditambahkan HgCl2 lebih cepat bereaksi dibandingkan PbSO4. Larutan protein yang ditambahkan HgCl2 lebih cepat bereaksi karena apabila protein direaksikan dengan logam akan terjadi ikatan lebih kuat dan itu yang menyebabkan terjadi reaksi lebih cepat, sehingga akan mempengaruhi logam berat terhadap larutan protein. Dan hal ini juga terjadi karena tetapan disosiasi HgCl2 lebih besar daripada PbSO4. Pada saat ditambahkan ke dalam larutan protein, HgCl2 akan terionisasi dan lebih banyak dalam bentuk Hg2+sehingga protein lebih cepat bereaksi dengan Hg2+ tersebut dan menghasilkan endapan atau gumpalan dalam jumlah yang lebih banyak ketimbang pengendapan oleh logam PbSO4 yang memiliki tetapan disosiasi lebih kecil dari Hg.
Ikatan yang amat kuat dari reaksi protein yang ditambahkan dengan HgCl2 akan memutuskan ikatan jembatan garam, sehingga akan terjadi denaturasi, secara bersama gugus –COOH dan gugus –NH2 yang terdapat pada protein dapat bereaksi dengan ion logam berat dan dapat membentuk senyawa kelat. Ion-ion yang dapat membentuk endapan logam dengan protein antara lain adalah Ag, Ca, Zn, Hg, Fe, Cu, Co, Mn, dan Pb. Selain gugus –COOH dan gugus –NH2, gugus –R pada molekul asam amino tertentu dapat pula mengadakan reaksi dengan ion atau senyawa lain. Gugus –SH pada molekul akan bereaksi dengan dengan ion Hg. Jumlah endapan yang dihasilkan dipengaruhi oleh kereaktifan logam berat yang ditambahkan. Logam Hg lebih reaktif daripada logam Pb karena merupakan logam transisi pada sistem periodik.
3. PENGENDAPAN DENGAN GARAM
Yang dilakukan pada percobaan ini adalah protein (albumin) dijenuhkan dengan amonium sulfat. Dengan cara ditambahkan amonium sulfat, ditambahkan amonium sulfat dan juga diaduk lagi sehingga tertinggal sedikit garam.
Pada larutan protein tersebut (albumin) terdapat endapan putih dilapisan bawah, endapan putih itu adalah endapan garam yang tidak larut akibat ditambahkan dengan ammonium sulfat, peristiwa pemisahan protein ini disebut salting out. Hal ini terjadi karena ammonium sulfat memiliki tingkat kelarutan yang lebih tinggi daripada protein. Sehingga pada saat penambahan ammonium sulfat, ammounium sulfat akan melarut dalam air/pelarutnya dan mendesak protein keluar, kembali dalam bentuk solidnya sehingga terbentuklah protein yang terendapkan. Dan endapan putih tersebut juga di saring menggunakan kertas saring, kemudian hasil saring dari protein tersebut (albumin) dilarutkan menggunakan air, dilarutkan menggunakan reagen Millon, dan difiltrat juga dengan uji biuret. Pada endapan garam yang dilarutkan dengan air yaitu semua endapan larut, karena sifat garam yang hidrofobik, jadi saat garam dilarutkan pada air, garam akan menyerap air sehingga garam mudah larut dalam air. Bila garam netral yang ditambahkan berkonsentrasi tinggi, maka protein akan mengendap. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk mengdehidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air.Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang.
Pada hasil endapan albumin yang ditambahkan amonium sulfat dilarutkan dengan reagen millon yaitu endapan tidak larut pada reagen millon dan endapannya berwarna orange, padahal mulanya endapan tersebut berwarna putih. Prinsip reagen millon itu sendiri pembentukan garam merkuri dari tirosin yang tertitrasi. Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai molekul fenol pada gugus R-nya, yang akan membentuk garam merkuri dengan pereaksi millon. Dari hasil percobaan, diketahui bahwa protein albumin mengandung Tirosin sebagai salah asam amino penyusunnya. Tirosin memiliki molekul fenol pada gugus R-nya.
Selain dilarutkan dalam air dan reagen millon, hasil endapan protein yang ditambahkan dengan amonium sulfat juga di filtrat dengan ditambahkan NaOH, dan kemudian juga ditambahkan dengan CuSO4. Pada endapan albumin yang difiltrat dan ditambahkan NaOH, yaitu menjadi larutan jernih dan setelah ditambah CuSO4 larutan berubah menjadi berwarna biru. Warna biru inilah yang menjunjukan bahwa masih ada ikatan peptida dalam larutan, ini berarti juga masih ada protein dalam larutan yang belum terendapkan sempurna dengan penambahan garam amonium sulfat tersebut.

4. PENGENDAPAN DENGAN ALKOHOL
3 tabung reaksi yang masing-masing diisi dengan larutan albumin, pada tabung pertama yang berisi larutan albumin ditambahkan dengan Buffer aetat pH 4,7 (5 M), setelah ditambahkan Buffer asetat pH 4,7 (5 M) pada larutan albumin tidak reaksi apa-apa pada larutan, yaitu larutan tetap berwarna putih keruh. Kemudian pada larutan tersebut ditambahkan juga larutan etil alkohol 95 %, dan reaksi yang didapat pada larutan tersebut adalah terdapat 3 lapisan pada larutan yaitu pada lapisan atas berwarna jernih, lapisan tengah berwarna putih keruh, dan lapisan bawah berwarna keruh. Pada pH buffer asetat 4,7 dan pH albumin 4,5-4,8 hal inilah yang membuat ikatannya lebih cepat, sehingga akan membentuk endapan lebih banyak.
Pada tabung yang kedua berisi larutan albumin ditambahkan dengan HCl 0,1 M, reaksi yang di dapat setelah penambahan HCl pada larutan albumin yaitu warnanya tetap putih keruh. Kemudian pada larutan tersebut juga ditambahkan larutan etil alcohol 95 %, reaksi yang didapat pada larutan tersebut adalah warna larutan putih keruh dan terdapat 2 cincin putih ditenggah-tengah larutan, cincin pertama agak lebih tipis sedangkan cincin kedua agak lebih putih keruh.
Pada tabung yang ketiga berisi larutan albumin ditambahkan dengan NaOH 0,1 M, reaksi yang didapat setelah penambahan NaOH pada larutan albumin yaitu larutan tetap berwarna putih keruh. Kemudian pada larutan tersebut ditambahkan larutan etil alcohol 95 %, reaksi yang didapat pada larutan tersebut adalah terdapat 2 lapisan pada larutan, lapisan atas berwarna jernih dan lapisan bawah agak keruh. Terdapat endapan pada larutan albumin karena terjadi denaturasi.
Tujuan reaksi pengendapan dengan alkohol pada reaksi diatas yaitu untuk mengetahui pengaruh alkohol terhadap larutan protein. Dan berfungsi juga untuk menurunkan konstanta dielektrik pada larutan sehingga gaya tarik-menarik antar molekul jadi semakin kuat. Kemudian alkohol akan mengkondisikan gugus positif pada asam amino untuk bereaksi dengan gugus negatif yang ada dalam larutan, sehingga pada suasana tertentu mampu membentuk endapan. Albumin yang ditambah larutan penyangga (buffer) pH 4,7 paling banyak menghasilkan endapan, hal ini terjadi karena pH tersebut merupakan titik isoelektrik protein sehingga endapan yang terbentuk merupakan jumlah yang paling maksimal. Albumin yang ditambahkan HCl juga menghasilkan endapan, namun dengan kuantitas yang lebih sedikit, ini terjadi karena gugus positif pada protein berikatan dengan gugus Cl- dan gugus negatif yang ada pada larutan sehingga terbentuk endapan pada suasana asam. Sebaliknya, protein tidak terendapkan oleh alkohol pada suasana basa karena pH nya terlampau jauh dari titik isoelektrik protein. Protein juga disebut ampoter karena pada ujung rantai protein terdapat gugus asam amino dan karboksilat, sehingga mudah larut tetapi susah larut dalam lemak.
5. UJI KOAGULASI
Larutan protein (albumin) didalam tabung reaksi, kemudian ditamahkan 2 tetes asam asetat 1 M dan dipanaskan selama 5 menit, terjadi reaksi pada larutan albumin yang ditambahkan asam asetat yaitu seluruh larutan setelah dipanaskan menjadi endapan putih susu. Kemudian endapan tersebut ada yang ditambahkan dengan air ada juga yang ditambahkan dengan reagen millón tapi tidak terjadi perubahan apapun. Ini terjadi akibat kesalahan praktikan saat praktikum. Seharusnya ketika endapan ditambahkan reagen Millon menghasilkan warna kecoklatan yang menunjukan reaksi +. Endapan putih susu yang dihasilkan terjadi karena perubahan struktur tersier ataupun kwartener, sehingga protein tersebut mengendap. Begitu juga dengan uji kelarutan oleh air yang tetap tidak larut. Hal tersebut dikarenakan perubahan struktur tesier albumin ini tidak dapat diubah kembali ke bentuk semula.

6. DENATURASI PROTEIN
Disiapkan 3 tabung rekasi yang berisi larutan albumin masing-masing sebanyak 4,5 ml, pada tabung pertama yang berisi larutan albumin ditambahkan dengan HCl 0,1 M sebanyak 0,5 ml, setelah ditambahkan HCl 0,1 M pada larutan albumin, yaitu larutan tetap berwarna putih keruh. Kemudian larutan tersebut dipanaskan selama 15 menit, setelah dipanaskan terjadi endapan putih, cairan putih diatasnya sedikit. Protein akan terdenaturasi atau mengendap bila berada pada titik isolistriknya, yaitu pH dimana jumlah muatan positif sama dengan jumlah muatan negatifnya.
Pada tabung yang kedua berisi larutan albumin ditambahkan dengan NaOH 0,1 M 0,5 ml, reaksi yang di dapat setelah penambahan NaOH pada larutan albumin yaitu warnanya tetap putih keruh. Kemudian larutan tersebut dipanaskan selama 15 menit, setelah dipanaskan terjadi reaksi yaitu endapan putih, cairan putih diatasnya sedikit.. Setelah larutan tersebut didinginkan lalu ditambahkan dengan Buffer asetat pH 4,7 (5 M) 5 ml dan tidak ada perubahan yang terjadi. Seharusnya protein yang dilarutkan dalam HCl maupun NaOH, keduanya tidak menunjukkan adanya pengendapan ini akibat dari kesalahan praktikan mungkin pada saat praktikum memakai pipet tetes yang tidak dicuci pada saat mengambil antara zat 1 dengan yang lainnya sehingga tercampur. Namun setelah ditambahkan buffer asetat dengan volume berlebih, protein pun mengendap hal ini menunjukkan bahwa protein albumin mengendap pada titik isolistriknya, yaitu sekitar pH 4,7. Setelah pemanasan ketiga tabung tidak terjadi perubahan apapun. Seharusnya menghasilkan endapan yang lebih banyak dengan tingkat pengendapan sama seperti di atas, hal tersebut dikarenakan panas dapat mengacaukan ikatan hydrogen ddan interaksi hidrofobik non polar, hal ini terjadi karena suhu tinggi yang dapat meningkatkan energy kinetic dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat, sehingga mengkacaukan ikatan protein tersebut.




DAFTAR PUSTAKA
Girindra, A. 1986. Biokimia I. Gramedia, Jakarta.
Hart,H, 1987, KIMIA ORGANIK, alih bahasa: Sumanir Ahmadi, Erlangga, Jakarta
Lehninger, A. 1988. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan Maggy Thenawidjaya. Erlangga, Jakarta
Ridwan, S. 1990. Kimia Organik edisi I. Binarupa Aksara: Jakarta
Routh, J.I, 1969, ESSENTIAL of GENERAL ORGANIC and BIOCHEMISTRY, W.B.Sounders Company, Philadelphia
Wibowo, luqman. 2009. Deskripsi dan macam-macam tingkatan struktur protein. Bandung
Winarno, F.G, 1997, KIMIA PANGAN dan GIZI, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta