Laporan Mikrobia Rumen Fapet UGM

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA TERNAK
ACARA II
MIKROBIA DALAM RUMEN




Disusun oleh :
Kelompok XVI
Raden Roro Asterzizia Amygdala PT/06423
Dheva Suprayoga PT/06442
Givari Cahya Oktovidhar PT/06536
Rahmat Noor Insan Hidayat PT/06563
Diska Ulfia Febrianawati PT/06588
Asisten : Era Rahmawati Agustiani




LABORATORIUM BIOKIMIA NUTRISI
BAGIAN NUTRISI DAN MAKANAN TERNAK
FAKULTAS PETERNAKAN
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2014


ACARA II
MIKROBIA DALAM RUMEN


Tujuan Praktikum
Tujuan dari praktikum mikrobia dalam rumen adalah untuk mengetahui kadar protein mikrobia, mengetahui aktivitas enzim CMC-ase dan kadar protein enzim serta mengetahui penentuan NH3 cairan rumen.


Tinjauan Pustaka
Rumen adalah kantung penampungan perrtama bahan pakan setelah dikunyah dan ditelen. Cairan rumen merupakan media yang sangat baik untuk pertumbuhan bakteri dan protozoa secara anaerobik. Salah satu bakteri yang penting di dalam rumen adalah bakteri selulolitik yang menyebabkan ternak ruminansia hidup dengan hijauan berkualitas rendah (Kamal, 1999).
Protein pakan yang tidak terdegradasi dalam rumen sangat diperlukan oleh ruminansia terutama yang berproduksi tinggi. Sistem evaluasi pakan ruminansia yang optimal selalu memperhitungkan kebutuhan mikroba rumen dan kebutuhan inangnya, sehingga Rumen Degradable Protein (RDP) dan UDP perlu diperhatikan dalam ransum (Widyobroto et al., 1995).
Pakan konsentrat yang mempunyai degradasi lambat cenderung memberikan pH cairan rumen lebih tinggi dibanding konsentrat dengan degradasi cepat. Degradasi protein berperan untuk menghasilkan VFA, methan, dan ammonia (Chiou et al., 1995).
Amonia adalah sumber nitrogen yang utama dan sangat penting untuk sintesis protein mikrobia rumen. Konsentrasi amonia di dlam rumen merupakan suatu besaran yang sangat penting untuk dikendalikan, karena sangat menentukan optimasi pertumbuhan biomassa mkrobia rumen. Sekitar 80% mikrobia rumen dapat menggunakan amonia sebagai sumber nitrogen untuk pertumbuhannya (Arora, 1995).
Mikroorganisme dalam rumen memecah karbohidrat kompleks seperti selulosa, hemiselulosa, dengan proses frementasi menjadi asam-asam lemak rantai pendek melalui aktivitas enzimnya. Hal yang sama, protein dalam pakan dipecah menjadi peptida, asam-asam amino, amonia, dan amine. Mikroorganisme menggunakan substansi ini kebutuhan perkembangan selnya sendiri. Protein pakan akan diubah menjadi protein bakterial dan protozoal sebelum benar-benar digunakan oleh sapi. Ini juga merupakan alasanbahwa urea (NPN) dapat dimanfaatkan sebagai sumber protein oleh ruminansia, yang pada ternak monogastrik tidak bermanfaat karena tidak mempunyai cukup banyak mikrobia yang mampu mensintesis protein (Prihadi, 1997).
Mikrobia selulolitik sesuai dengan namanya mampu memecah selulosa. Enzim selulase yang dihasilkan dapat memecah ikatan β-1,4-glikosidik pada selulosa. Hijauan yang mengandung selulosa dan hemiselulosa dicerna oleh enzim yang dihasilkan mikrobia dalam rumen sampai sebanyak 50% sampai 80% (Kamal, 1999).
Konsentrasi NH3 cairan rumen bervariasi tergantung pada tingkat degradasi protein pakan berkisar antara 3,3 sampai 8,78 mg/100 mL pada sapi yang diberi UDP rendah dan UDP tinggi (Widyobroto, 1999). Aras UDP dengan suplementasi lemak tidak berpengaruh pada produksi VFA cairan rumen (Rodriguez et al., 1997).
Sumber protein ternak ruminansia berasal dari protein pakan yang lolos dari degradasi mikrobia rumen. Protein yang terdapat pada ternak ruminansia adalah protein mikrobia dalam rumen dan sebagian kecil protein endogenous (Mc Donald et al., 1995).
 



Materi dan Metode


Materi
Alat. Alat yang digunakan dalam praktikum mikrobia dalam rumen antara lain adalah sentrifuge, safelock tube (ependorf), pipet ukur, pipet pump, kompor, spektrofotometer, waterbath, vortex, dan refrigerator.
Bahan. Bahan yang digunakan dalam praktikum mikrobia dalam rumen antara lain adalah cairan rumen, NaOH 1 N, larutan Lowry B, larutan Lowry A, sodium karbonat, sianida karbonat, potassium ferisianida, sodium tungstate, H2SO4 1 N, campuran phenol, hipoklorid, aquades, dan buffer pH 5,5.


Metode
Preparasi Sampel. Cairan rumen disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam ependorf. Supernatan tersebut disentrifugasi kembali pada 10.000 rpm selama 15 menit, sehingga mendapatkan endapan mikrobia. Supernatan (enzim) yang dihasilkan dipisahkan untuk penentuan aktivitas CMC-ase dan presipitat yang dihasilkan digunakan untuk penentuan kadar protein mikrobia.
Protein Mikrobia. Presipitat (endapan) hasil preparasi sampel ditambah 0,5 mL NaOH 1 N kemudian dididihkan pada suhu 90°C selama 10 menit dan selanjutnya digunakan sebagai sampel untuk penentuan protein mikrobia dengan metode Lowry. Dua buah tabung reaksi disiapkan. Tabung 1 diisi 0,5 mL sampel dan tabung 2 diisi 0,5 mL aquadest (sebagai blanko). Langkah selanjutnya yaitu masing-masing tabung ditambahkan 2,5 mL larutan Lowry B kemudian dihomogenkan dan dibiarkan selama 10 menit lalu ditambahkan 0,25 mL larutan Lowry A dan dihomogenkan serta dibiarkan selama 30 menit. Larutan pada kedua tabung reaksi tersebut dibaca pada panjang gelombang (λ) 750 nm dan kadar protein dihitung dengan persamaan:
Y = 0,0025X + 0,0146
Y = absorbansi produk, X = kadar protein (µ/mL)
Penentuan Aktivitas Enzim CMC-ase. Filtrat (supernatan) hasil preparasi sampel diinkubasi pada suhu 380C selama 45 menit, enzim dimasukkan setelah tabung diinkubasi selama 1 menit. Aktivitas enzim dihentikan dengan menambahkan campuran 1 mL larutan sianida karbonat, 0,2 mL sodium karbonat, dan 2 mL larutan 0,05% potassium ferrisianida (pH 10,6) pada semua tabung setelah diinkubasi. Isi tabung kemudian dihomogenkan dengan vorteks, lalu dipanaskan pada air mendidih selama 30 menit. Tabung didinginkan dan warna yang terjadi dibaca pada panjang gelombang (λ) 420 nm.
Rumus Perhitungan :
Abs produk = Abs (BL - ES) - (BL - E) - (BL - S)
Hasil perhitungan absorbansi produk digunakan untuk menghitung aktivitas CMC-ase berdasar persamaan regresi di bawah:
Y = 0,002034X + 0,01858
Dengan , Y = absorbansi produk
X = kadar gula mereduksi
Isi Tabung dalam Penentuan Aktivitas Enzim CMC-ase
Tabung
Enzim (mL)
Buffer pH 5,5
CMC 1%
H2O (mL)
Total
ES
0,1
0,4
1
0,3
1,8
E
0,1
0,4
-
1,3
1,8
S
-
0,4
1
0,4
1,8
BL
-
0,4
-
1,4
1,8
Penentuan NH3 Cairan Rumen. Larutan A sebanyak 0,1 mL ditambah 0,2 mL cairan rumen (blanko aquadest) dicampur 0,1 mL larutan B dingin, lalu dihomogenkan dan kemudian disentrifugasi pada 15.000 rpm selama 10 menit. Ditambahkan pada tabung yang lain 20 µL supernatan sampel ditambah 2,5 mL larutan C ditambah lagi 2,5 mL larutan D dan dicampur secepatnya. Larutan tersebut diinkubasi pada suhu 40°C selama 30 menit kemudian didinginkan pada suhu kamar dan dibaca pada spektofotometer dengan panjang gelombang (λ) 630 nm. Hasil absorbansi dimasukkan dalam persamaan:
Y = 0,0068X + 0,0278
Dengan, Y = absorbansi
X = kadar NH3 (mg/100 mL)


Hasil dan Pembahasan


Preparasi Sampel. Cairan rumen pada uji ini disentrifuge dengan kecepatan 3.000 rpm selama 15 menit. Hal ini bertujuan untuk mengendapkan partikel pakan. Supernatan disentrifuge kembali dengan kecepatan 10.000 rpm untuk mendapatkan endapan mikrobia. Hasil dari preparasi sampel ini adalah cairan rumen yang telah terbentuk menjadi dua lapisan, yaitu enzim rumen (supernatan) dan endapan partikel pakan rumen. Enzim (supernatan) digunakan untuk penentuan protein enzim dan endapan partikel pakan digunakan untuk penentuan protein mikrobia. Cairan rumen bervariasi tergantung pada tingkat degradasi protein pakan berkisar antara 3,3 sampai 8,78 mg/100 mL pada sapi perah (Widyobroto et al., 1999).
Proses fermentasi di dalam rumen dapat berlangsung dengan bantuan bakteri dalam lingkungan yang sesuai, namun kondisi rumen banyak dipengaruhi oleh keberadaan pakan yang dikonsumsi. Beberapa faktor yang mempengaruhi populasi mikrobia di cairan rumen antara lain jenis pakan, interaksi antara bakteri dengan protozoa, spesies ternak, letak geografis daerah, iklim dan faktor lainnya. Di samping makanan, faktor lain yang mempengaruhi populasi mikrobia rumen yaitu keasaman rumen, frekuensi pemberian pakan, kelaparan dan pengenceran rumen.
Protein Mikrobia. Endapan hasil sentrifuge ditambah 1 mL NaOH 1 N bertujuan untuk melisiskan dinding sel, kemudian dididihkan pada suhu 90oC selama 10 menit. Pendidihan tersebut berfungsi untuk menyempurnakan lisis oleh penambahan NaOH. Tabung reaksi yang diisi 0,5 mL sampel (blangko aquades) ditambah 2,5 mL larutan Lowry B (CuSO4, Na2CO3, dan Na Kaltartat) setelah divortex dan dibiarkan 10 menit akan timbul warna biru stabil. Hal ini terjadi karena adanya ikatan antara Cu dari CuSO4 dengan peptida. Penambahan larutan Lowry A (Folin dan Aquadest) akan memberikan warna kompleks yaitu protein yang bereaksi dengan folin – clocalteau (Wahyuningtyas et al., 2013). Warna tersebut dibentuk karena reaksi antara super alkali dengan protein seperti pada reaksi biuret dengan terjadinya reduksi fosfomolibdat oleh tirosin dan triptofan yang ada dalam triptofan. Larutan divortex dan dibiarkan 30 menit kemudian dibaca pada panjang gelombang 750 nm didapatkan absorbansi sebesar 0,675 A dan kadar protein mikrobia sebesar 264,16 µ/mL. Literatur menjelaskan bahwa konsentrasi amonia yang optimum untuk pakan setelah didegradasi di dalam rumen adalah sebesar 3,57 mM (Lynd et al., 2002). Hasil yang didapat, konsentrasi amonia tidak normal dan tidak sesuai dengan literatur. Hal ini disebabkan oleh salah satu faktor yaitu menurunnya protealisis dan kurangnya deaminasi oksidatif dari protein pakan (Widyobroto et al., 2007).
Penentuan Aktivitas Enzim CMC-ase. Prinsip kerja aktivitas enzim CMC-ase bahwa aktivitas enzim ditentukan dengan menghitung gula reduksi yang dibebaskan dari reaksi hidrolisis substrat selulosa oleh enzim CMC-ase (Murray et al., 2003). Potassium ferrisianida ditambahkan berfungsi sebagai oksidator untuk mereduksi gula pereduksi. Isi tabung dididihkan selama 30 menit dengan suhu 100oC berfungsi untuk mematikan aktivitas enzim, kemudian dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm didapatkan absorbansi sebesar - 0,128 A dan kadar gula mereduksi sebesar - 72,065 mg/mL. Hasil yang didapatkan negatif karena banyak faktor yang mempengaruhi, salah satunya faktor kelebihan volume masing-masing larutan yang akan dicampurkan untuk diuji. Berdasarkan literatur, kisaran kadar gula reduksi yang dihasilkan oleh aktivitas CMC-ase sebesar 215,3 (Bradford, 1997).
Hasil yang didapat dalam praktikum tidak sesuai dengan literatur. Faktor utama yang mempengaruhi reaksi adalah waktu pemanasan dan kekuatan reagen (Bradford, 1997). Gula pereduksi dalam suasana alkali akan mereduksi asam 3,5 dinitrosalisilat membentuk senyawa yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 sampai 550 nm. Aktivitas enzim yang dihasilkan berada pada kisaran 0,3464 sampai 1,0313 IU/mL, aktivitas terbesar diperoleh pada perlakuan suhu 35oC, pH 6, dan waktu inkubasi 8 hari yaitu sebesar 1,0313 IU/mL (Sarma, 2005).
Penentuan NH3 Cairan Rumen. Prinsip kerja dalam percobaan ini bahwa metode penentuan ammonia didasarkan pada reaksi indophenol yang dikatalisis dan menghasilkan senyawa biru yang stabil. Reaksi indophenol adalah reaksi antara ammonia dengan sodium phenat (Murray et al., 2003). Hal ini terjadi karena adanya reaksi indophenol dimana NH3 berikatan dengan phenol, kemudian dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 630 didapatkan nilai absorbansi sebesar 0,35 dan kadar NH3 sebesar 0,4738 mg/mL.
Berdasarkan literatur, maksimum laju sintesis protein mikrobia akan tercapai jika konsentrasi NH3 berkisar antara 3,0 sampai 8,0 mg/100 mL cairan rumen (Hristov et al., 2004). Hasil yang didapat tidak sesuai dengan literatur. Hal ini disebabkan oleh faktor ketidaksinkronan antara ketersediaan energi dan protein dalam pakan untuk mikrobia rumen (Widyobroto et al., 2007). Konsentrasi amonia di dalam rumen ikut menentukan efisiensi sintesa protein mikroba yang pada gilirannya akan mempengaruhi hasil fermentasi bahan organik pakan. Hasil fermentasi tersebut dapat dilihat sebagai konsentrasi Volatile Fatty Acid (VFA) di dalam cairan rumen. Konsentrasi tersebut antara lain ditentukan antara lain oleh tingkat protein pakan yang dikonsumsi, derajad degradabilitasnya, lamanya makanan berada di dalam rumen dan pH (Rodriguez et al., 1997). Hubungan antara protein mikrobia, aktivitas CMC-ase dan NH3 cairan rumen yaitu efisiensi pertumbuhan dan produksi protein mikrobia dapat ditingkatkan dengan adanya keseimbangan antara energi dan N yang tersedia dalam pakan. Perbaikan sinkronisasi energi dan protein yang dibebaskan dalam rumen dapat meningkatkan sintesis protein mikrobia. Faktor-faktor yang mempengaruhi protein mikrobia, aktivitas enzim CMC-ase, penentuan NH3 cairan rumen yaitu pH, tingkat keasaman media, dan lama waktu inkubasi. Pakan yang mempunyai degradasi protein yang tinggi memberikan konsentrasi NH3 yang tinggi dan sebaliknya (Widyobroto et al., 2001).





























Kesimpulan


Berdasarkan hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa kadar mikrobia dalam rumen sebesar 264,16 µ/mL, kadar gula mereduksi sebesar – 72,065 mg/mL, dan kadar NH3 dalam rumen sebesar 0,4738 mg/mL. Faktor-faktor yang mempengaruhi sintesis protein mikrobia adalah ketersediaan prekursor dalam konsentrasi yang cukup dalam rumen, kelarutan dan tingkat degradasi protein pakan sebagai sumber N, ketersediaan energi total hasil fermentasi dalam rumen untuk menunjang pertumbuhan mikro organisme secara maksimal, kecepatan absorbsi amonia dan asam amino, tingkat konsumsi pakan, laju aliran partikel dalam rumen.
















Daftar Pustaka
Arora, S. P. 1995. Pencernaan Mikrobia pada Ruminansia. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
Bradford, M. M. 1997. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein untilizing the principal of protein-dye binding . Anal Biochem.
Chiou-Shyang-Peter Wen; Kuen-Jaw Chen; Kwen-Sheng-Kuo; Jenn Chung Hsu; Bi Yu. 1995. Studies on the application of an undergradable system to high yielding dairy cattle in Taiwan. Anim.
Hristov, A.N., R. P. Etter, J. K. Ropp, and K. L. Grandeen. 2004. Effect of dietary crude protein level and degradability on ruminal fermentation and nitrogen utilization in lactating dairy cows. J. Anim Sci
Kamal, M. 1999. Nutrisi Ternak I. Laboratorium Makanan Ternak Jurusan Nutrisi dan Makanan Ternak. Fakultas Peternakan. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Lynd, L.R., Weimer P.J., Van Zyl W.H., and Pretorius IS. 2002. Microbial cellulose utilization:Fundamentals and biotechnology. Microbiol. Mol.Biol. Rev
Mc Donald, P.,R.A. Edwards and J.F.D. Greenhalg, C.A. Morgan. 1995. Animal Nutrition 5th ed. Longman. Singapore Publishers, Singapore.
Murray, Robert, K. Darylk, Granner, Peter, A. mayos, Victor, W. Rodwell. 2003. Biokimia Harper. EGC, Jakarta.
Prihadi, Sugeng. 1997. Dasar Ilmu Ternak Perah. Fakultas Peternakan Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Rodriguez, L. A., C. C. Stallings, J. H. Herbein, dan M. L. Mc Gilliard. 1997. Variation in milk and plasma urea nitrogen in Holstein and Jersey cows in response to degradable dietary protein and added fat. J. Dairy Science.
Sarma. 2005. Identifikasi Enzim Pencernaan pada Rumen Domba. Institut Pertanian Bogor. Bogor
Wahyuningtyas P, Bambang D.A, Wahyunanto A.N. 2013. Studi pembuatan enzim selulase dari mikrofungi Trichoderma reesei dengan substrat jerami padi sebagai katalis hidrolisis enzimatik pada produksi bioetenal. Journal Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Brawijaya. Malang
Widyobroto B. P., M. Soejono, H. Hartadi, D.A. Kusumaningrum. 2001. Pengaruh tingkat undegraded protein terhadap produksi dan kualitas susu sapi perah. Buletin Peternakan UGM. Edisi Tambahan. Desember 2001
Widyobroto, B. P., SPS. Budhi, A. Agus. 2007. Effect of undegraded protein and energy level on rumen fermentation parameters and microbial protein synthesis in cattle. Fakultas Peternakan Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Widyobroto B.P., SPS. Budhi, A. Agus and B. Santosa. 1995. Effect of undegraded protein level on nutrient digestibility and microbial protein synthesis of dairy cows.









Lampiran

Protein Mikrobia
Diketahui: Y : 0,675 A

Ditanyakan : kadar protein (X)
Jawab:
Y = 0,025 X + 0,0146
X = Y – 0,0146
0,025
X = 0,675 – 0,0146
0,025
X = 264,16 mg/mL

Penentuan Aktivitas Enzim CMC-ase
Diketahui:
Absorbansi blangko : 0,501 A
Absorbansi ES : 0,188 A
Absorbansi E : 0,359 A
Absorbansi S : 0,202 A
Absorbansi produk = (0,501-0,188) – (0,501-0,359) – (0,501-0,202)
Y = 0,313 – 0,142 – 0,299
= - 0,128 A
Ditanyakan : kadar protein (X)
Jawab:
Y = 0,002034 X + 0,01858
X = - 0, 128 – 0,01858
0,02034
X = - 0, 14658
0,02034
X = - 72,065 mg/mL
Penentuan NH3 Cairan Rumen
Diketahui: Absorbansi produk : 0,35 A
Absorbansi blanko : 0,037 A
Ditanyakan : kadar protein (X)
Jawab:
Y = 0,0068 X + 0,0278
X = 0,35 – 0,0278
0,0068
X = 0, 3222
0,0068
X = 0,4738 mg/mL