LA UTILIDAD DEL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS DE LA PLACA DENTAL EN LA INVESTIGACIÓN DE POBLACIONES ANTIGUAS: EL CASO DE DOS INDIVIDUOS DE FINALES DEL SIGLO XIX EN LA CIUDAD DE MÉXICO

ESCUELA NACIONAL DE ANTROPOLOGÍA E HISTORIA INAH

SEP

DIVISIÓN DE POSGRADOS POSGRADO EN ANTROPOLOGÍA FÍSICA

ENAH TÍTULO DE LA TESIS LA UTILIDAD DEL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS DE LA PLACA DENTAL EN LA INVESTIGACIÓN DE POBLACIONES ANTIGUAS: EL CASO DE DOS INDIVIDUOS DE FINALES DEL SIGLO XIX EN LA CIUDAD DE MÉXICO TESIS QUE COMO PARTE DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN ANTROPOLOGÍA FÍSICA P R E S E

N T A

JUAN JOEL HERNÁNDEZ OLVERA COMITÉ TUTORAL: DR. HÉCTOR MARTÍNEZ RAY DR. JAVIER ROLANDO AMBROSIO HERNÁNDEZ DRA. LOURDES MÁRQUEZ MORFÍN CIUDAD DE MÉXICO, MÉXICO

AGOSTO 2016

Agradecimientos Esta investigación se ha logrado gracias al apoyo del Posgrado en Antropología Física de la Escuela Nacional de Antropología e Historia y el Consejo Nacional para la Ciencia y Tecnología. Un especial agradecimiento al Dr. Héctor Martínez Ray, al Dr. Javier Rolando Ambrosio Hernández, la Dra. Lourdes Márquez Morfín, al laboratorio de Antropología Molecular e investigación del Microbioma (LMAMR) de la Universidad de Oklahoma), a la Dra. Christina Warinner por todo el apoyo durante todo el transcurso de este trabajo. Al mismo tiempo, Richard W. Hagan, Dr. Courtney Hoffman, Dr. Krithi Sankaranarayanan, Dr. Cecil M. Lewis Jr., Dr. Brian M. Kemp, al laboratorio de ADN antiguo de la Universidad del Estado de Washington, a la Bióloga Olivia Reynoso Ducoing y a la Dra. Ivet Gil Chavarria.

2

Índice Introducción

4

1. Diseño de investigación

6

1.1 1.2 1.2.1 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7

Planteamiento del problema Preguntas de investigación Preguntas específicas: Objetivo general Objetivos específicos Hipótesis Justificación Marco teórico

6 8 8 8 8 9 9 10

2. Conocer el presente para aproximarnos al pasado.

12

3. La utilidad de la proteómica en el estudio de restos antiguos

17

3.1 Los primeros años (1960-1980) 3.2 Los cimientos de una nueva disciplina (1990-2000) 3.3 La proteómica en el estudio de restos óseos antiguos 2010-2013 3.4 Nuevas tendencias en la investigación de restos antiguos a través de la metaproteómica 2014-

4. Características de la placa dental 4.1

Ecología Microbiana oral

17 19 23 27

30 31

5. Materiales y métodos

35

6. Resultados

39

6.1 Proteínas de la placa dental del entierro 16 6.1.2 Proteínas identificadas en placa dental del maxilar 6.1.3 Proteínas identificadas en placa dental de la mandíbula 6.1.3 Interpretación de los resultados 6.2 Proteínas de la placa dental del entierro 23 6.2.1 Proteínas identificadas en placa dental del maxilar 6.2.2 Interpretación de los resultados

39 40 41 47 53 53 55

7. Consideraciones Finales

59

Lista de figuras

63

Bibliografía

64

Anexo

80

3

Introducción Cada humano alrededor del mundo tiene una historia, ya sea familiar, laboral, o académica; y como especie también se ha ido registrando a nivel corporal o genético partes o fragmentos de esa historia evolutiva. La manera o las vías en que el investigador puede acercarse a conocer detalles de la alimentación, la salud o la presencia de una enfermedad, son vastas. En las últimas décadas, la incorporación de nuevas técnicas o instrumentos tecnológicos ha permitido ampliar el panorama a niveles microscópicos e inclusive moleculares. Este trabajo de investigación se dirige hacia ese sentido, es decir en el proceso de traer a la práctica de la antropología física la inclusión del análisis de proteínas de la placa dental. Este tipo de estudio ofrece un abanico de información sumamente importante para conocer la conformación del sarro, esto es, la comunidad microbiana oral, la alimentación y la respuesta del sistema inmune del hospedero contra posibles enfermedades. La preservación de biomoléculas dentro de la placa dental responde a ciertas características estructurales como la rápida mineralización intracelular y la diferencia en el tamaño de los cristales minerales, ofreciendo una clase de protección para la información biomolecular (ADN y proteínas). Esta investigación se basa en el análisis de proteínas de la placa dental de dos individuos que vivieron a finales del siglo XIX, cuyos restos óseos fueron recuperados en el proceso de rescate arqueológico de una parte del panteón del Hospital San Juan de Dios actualmente Museo Franz Meyer.

4

Los resultados de este estudio dan cuenta de elementos de la dieta de los individuos, de la presencia de colonizadores tempranos en la conformación del sarro, de la presencia de agentes patógenos y de componentes del sistema inmune que respondían a un proceso infeccioso de la vías respiratorias. En este orden de ideas, en el primer capítulo se expone el diseño de investigación, el cual tienen como objetivo principal descubrir qué tipo de proteínas se han preservado en la placa dental de los dos individuos, tratando de correlacionar la información proteica con su contexto histórico, social y cultural de finales siglo XIX en la Ciudad de México. En el capítulo II, se explica el argumento teórico del estudio del microbioma humano y la importancia de profundizar las comunidades microbianas del cuerpo, así como investigaciones que al día de hoy son de vanguardia y que permiten aproximarnos a lo que podría haber ocurrido en época antigua. En el tercer capítulo, se expone una recopilación de los trabajos más importantes realizados desde la mitad del siglo XX, con la finalidad de poner en contexto y dar sustento a la importancia de la proteómica en el estudio de restos antiguos. Para entender la importancia y la compleja constitución de la placa dental, en el cuarto capítulo se describen las características del sarro así como la conformación de la ecología microbiana oral. Tanto la descripción de los materiales como los métodos utilizados en esta investigación se desarrollan en el quinto capítulo; en el sexto capítulo, se muestran los resultados de las proteínas extraídas de los dos individuos que integran este trabajo de investigación para finalmente, en el último capítulo, presentar las consideraciones finales. 5

1.

Diseño de investigación 1.1 Planteamiento del problema

En las dos últimas décadas, la antropología física ha logrado un avance significativo por una parte, en el conocimiento de la historia evolutiva del humano (Noonan et al., 2006), y por otra, en las relaciones filogenéticas de las poblaciones pasadas y actuales (Raghavan et al., 2015). Asimismo, se ha comprobado el impacto que tienen los diversos procesos tafonómicos en la estructura ósea en muestras antiguas (Buckley y Wadsworth, 2014; Nielsen-Marsh y Hedges, 2000), y por otro lado, se ha ido incrementando el número de estudios en el campo de la paleopatología (Anastasiou y Mitchell, 2013; Boros-Major et al., 2011). En su conjunto, estas investigaciones permiten comprender como factores como el medio ambiente, la conformación social y cultural, o los cambios sustanciales en el modo de subsistencia, influyeron de manera directa en la salud; mientras que se abre una ventana

al

reconocimiento

de

los

procesos

co-evolutivos

entre

el

patógeno/hospedero y el desarrollo del sistema inmune (Zuckerman et al., 2011). Sin embargo, persiste una temática discutible en el campo de la paleopatología cuando se trata de reconstruir la salud de una población antigua dentro de un contexto evolutivo y cultural (Martin et al., 2013, pp. 1-3; Ortner, 2011). A la fecha, resulta complicado llevar a cabo un diagnóstico diferencial a nivel esquelético que permita reconocer de manera precisa un agente patógeno, puesto que hay padecimientos que se expresan de forma aguda causando la muerte en cortos periodos de tiempo (como en el caso de las epidemias), imposibilitando su

6

manifestación a nivel esquelético; o por el contrario, hay agentes patógenos que de manera similar, provocan reacciones en el tejido óseo.1 Un instrumento de conocimiento en el campo paleopatológico es el análisis de proteínas en la placa dental,2 es decir un biofilm mineralizado en la superficie del diente en el que ocurren una serie de interacciones en diferentes niveles (contacto físico, intercambio metabólico, señalizaciones y comunicaciones a nivel molecular e intercambio de material genético), (Kolenbrander et al., 2006; Metcalf et al., 2014; Warinner et al., 2015). Este depósito se va acumulando durante la vida de un individuo y depende de múltiples factores como la edad, el sexo, el grupo étnico, la dieta, la higiene oral, la localización en la cavidad oral, la respuesta del hospedero, el posible acceso a servicios de salud dental, múltiples enfermedades sistémicas o el tabaquismo, entre otros (Jepsen et al., 2011). El objetivo de esta investigación consiste en explorar la información proteica almacenada en la placa dental de dos individuos que vivieron al final del siglo

XIX,

de

manera que pueda ser utilizada como una herramienta diagnóstica de enfermedades; además para reconstruir la dieta, y por otro lado, averiguar la respuesta del individuo

1

La presencia de una enfermedad está directamente relacionada con alguna falla de la defensa del 1 hospedero contra el agente patógeno, con la alteración en el mecanismo de respuesta inmunitaria y con fallas hereditarias o defectos genéticos de las defensas inmunitarias que, por consiguiente, determinan su duración, propagación y atención (Murphy, 2009). 2

La preservación de las biomoléculas dentro de la placa dental puede atribuirse a: 1) la dificultad que sea consumido por otras bacterias ambientales y por lo tanto, no es fácil que sea colonizado; 2) el sarro comienza a mineralizarse o llevar un proceso de fosilización antes de que el organismo hospedero muera, es decir que se lleva a cabo una rápida mineralización intracelular; 3) hay una diferencia en cuanto a la composición mineral y el tamaño de los cristales, de tal manera que se convierte en un tipo de protección para las biomoléculas (ADN o proteínas); y 4) una vez mineralizado, el sarro adquiere una dureza y un grado de adhesividad que difícilmente puede caerse o removerse (Warinner et al., 2015).

7

ante episodios de estrés y todo esto como un aporte para el conocimiento de poblaciones antiguas. 1.2 Preguntas de investigación A través de este estudio, se pretende comprender: 1.

¿Qué tipo de información ofrece el análisis de proteínas de la placa dental para la interpretación dentro de un contexto histórico y sociocultural de los individuos estudiados?

1.2.1 Preguntas específicas: 1. Aunado al análisis proteico, ¿es posible reconocer algún tipo de enfermedad que pudiera haber afectado la salud de los individuos que integran esta investigación? 2. ¿Qué relación existe entre la información de las proteínas en la placa dental y el análisis osteológico de los individuos estudiados? 1.3

Objetivo general

Las proteínas conforman una fuente de información primaria de los factores que el humano enfrenta en situaciones de estrés, procesos infecciosos e inclusive, la composición de la dieta. Por lo tanto, el objetivo general de esta investigación es descubrir qué tipo de proteínas se han preservado en la placa dental de los dos individuos, tratando de correlacionar la información proteica de la placa dental con su contexto histórico, social y cultural de finales siglo XIX en la ciudad de México. 1.4

Objetivos específicos

1. Reconocer el tipo de enfermedades de los individuos que integran esta investigación.

8

2. Relacionar la información de las proteínas en la placa dental con la evidencia ósea de los individuos estudiados. 1.5

Hipótesis

El análisis de proteínas brinda información acerca de la composición bioquímica de la placa dental; ofrece también datos relacionados a la respuesta inmune del individuo (hospedero) y por otra parte, permite conocer la diversidad de la comunidad microbiana en la placa dental. 1.6

Justificación

El propósito general de esta tesis se basa en la incorporación de nuevas herramientas metodológicas para el estudio de restos humanos antiguos. De particular manera, el análisis de proteínas de la placa dental revela la conformación a nivel molecular de la placa dental; la identificación de los diversos microorganismos que forman parte de la comunidad microbiana; la información de la respuesta fisiológica del individuo ante eventos que influyen en su salud; así como datos sobre su constitución alimentaria. En este sentido, el análisis de proteínas de la placa dental puede ser aprovechado en el campo de la antropología física, la antropología médica, el campo biomédico y la mayoría de las ciencias biológicas. Cabe señalar que sea cualquiera de las disciplinas científicas antes mencionadas la que lleve a cabo este tipo de estudios, debe de partir desde una perspectiva global, multidisciplinaria y un enfoque biocultural que permita entender la multicausalidad de una enfermedad o los procesos microadaptativos derivados de la interacción con el ambiente, la alimentación o los aspectos socioculturales y genéticos.

9

1.7

Marco teórico

Los estudios paleopatológicos en bioarqueología reconocen la multicausalidad de los cambios biológicos, más específicamente en la relación dinámica entre el medio ambiente, la población, la organización social y cultural, así como otros fenómenos que inciden en la presencia de una enfermedad y por ende, en la salud del ser humano, es decir, un enfoque biocultural. Los esfuerzos de este planteamiento se abocan en evaluar los procesos microadaptativos en momentos de transición en la historia de la humanidad, ya sean cambios en el modo de subsistencia, la organización social o el contacto entre dos grupos biológica y culturalmente diferentes (Márquez, 2011; Márquez y Jaén, 1997). El proceso de interacción entre microorganismos y humanos inicia con el reconocimiento de una perspectiva multidimensional, donde el hospedero y los microbios se establecen como un superorganismo u holobionte, es decir, una entidad biológica y dinámica, integrada por el hospedero y su microbiota (Bordenstein y Theis, 2015; Moran y Sloan, 2015; Rosenberg y Zilber-Rosenberg, 2011). La evolución del holobionte puede suscitarse por cambios en el genoma del huésped y/o en cualquiera de los genomas bacterianos, del mismo modo puede estar influenciado por factores como la edad, el sexo, la alimentación, el ambiente, el acceso a los recursos o la presencia de alguna enfermedad (Warinner y Lewis, 2015; ZilberRosenberg y Rosenberg, 2008). Una parte fundamental para lograr los objetivos de este trabajo se basa en la teoría del Hologenoma, que postula como unidad de selección en un nivel evolutivo a

10

todos los organismos simbióticos3 (Salvucci, 2016); además sugiere que el holobionte4 con el hologenoma (la suma de la información genética del hospedero y su microbiota) actúan como un consorcio mediante tres mecanismos de variación,5 dicha teoría refiere que los diversos microorganismos simbióticos tienen un rol importante en la adaptación y coevolución del hombre (holobionte), (Fraune y Bosch, 2010). El tema de la coevolución en el campo de la teoría evolutiva no resulta desconocido, ya que el propio Charles Darwin consideraba que los organismos conformaban una compleja red de interacciones o una red enmarañada dependientes unos de otros que interactúan de acuerdo a la estructura de su comunidad. Para concluir este apartado, es importante mencionar que gracias al desarrollo de nuevas herramientas tecnológicas es posible entender y reevaluar la compleja red de interacciones entre la comunidades microbianas y el humano, de tal suerte que es posible ahora una nueva perspectiva de la diversidad biológica y cultural.

3

Parásitos, mutualistas, sinergistas, comensalistas.

4

El organismo y la microbiota.

5

1) Amplificación microbiana. Dado que el holobionte es una entidad dinámica, el número de microorganismos puede multiplicarse o disminuir dependiendo de las condiciones locales (dentro del holobionte) o externas (medio ambiente), el número de microbios particulares equivale a la amplificación de genes por lo que la cantidad de información genética puede manifestarse como una ventaja adaptativa; 2) Adquisición de nuevos simbiontes. La interacción con nuevos y millones de nuevos organismos es innegable, por lo que de manera aleatoria existe la posibilidad de que nuevos microorganismos se vayan alojando y creando nuevas redes de coacción; y 3) Transferencia horizontal de genes. En el cual nuevas características genéticas pueden ser transferidas a otros organismos y que no están necesariamente asociadas a la microbiota residente. Generalmente, organismos procariotes se constituyen de diversos mecanismos genéticos móviles que permiten la pérdida o la ganancia de regiones largas del genoma.

11

2.

Conocer el presente para aproximarnos al pasado .

Una de las tareas extenuantes y complicadas que han tenido las ciencias que tratan de desentrañar el origen de la vida, la evolución y la variabilidad, ha sido tratar de definir y distinguir los elementos biológicos, sociales y culturales que definen al Homo sapiens. Al respecto, James H. Mielke, Lyle W. Konigsberg y John H. Relethford, han enfatizado que los grupos humanos nos son morfológicamente homogéneos, por lo tanto, existe una dificultad intrínseca en determinar los límites discretos en la continua variación de caracteres, dado que hay diversas presiones evolutivas, además que persiste el cuestionamiento del número de indicadores biológicos que estimen la significancia biológica, sin dejar de lado que existe una gran diversidad genética sea dentro de grupos que entre divisiones geográficas mayores (Mielke et al., 2011). Si se examina el enfoque antropológico en torno a la evolución del ser humano y los rasgos específicos que lo definen, se deduce que la mayor parte de las hipótesis se han sustentado en la evaluación de aquellos cambios morfo-funcionales sustanciales y genéticos estructurales que se han venido dando a lo largo de la historia evolutiva del H. Sapiens (Lieberman, 2013). Sin embargo, hay un punto en parte olvidado, pero que en las últimas décadas ha tomado una posición importante en la biología gracias al desarrollo tecnológico, es decir el estudio de los microorganismos que cohabitan zonas específicas del cuerpo. Los humanos y la mayor parte de las especies comparten de manera dinámica, el mismo espacio con miles de pequeños microorganismos que se alojan

12

hasta el punto más recóndito del cuerpo, convirtiéndolo así en un observatorio microbiano (Relman, 2002). El número estimado de células que se encuentran en un individuo es aproximadamente de 3.72 x 1013 mientras que la cantidad de genes que cuenta esa misma persona se estima en alrededor de 20, 000 (Bianconi et al., 2013; Pertea y Salzberg, 2010). Si bien parecen cifras abrumadoras, el panorama se torna complicado y sorprendente ya que el 90% de las células y al menos 2 millones de genes son de origen microbiano (Ravel et al., 2014). Diversos estudios proponen que el H. sapiens ha coevolucionado con dichos microorganismos durante cientos o miles de años, teniendo un papel crucial en los roles evolutivos de la especie (Flintoft, 2013). Éstas interacciones se desarrollan antes del nacimiento, pues se ha descubierto que en la placenta humana, considerada por años totalmente estéril, están presentes diversos organismos comensales no patogénicos (Firmicutes, Tenericutes, Proteobacteria, Bacteroidetes y Fusobacteria), que van definiendo las funciones del tracto gastrointestinal (Aagaard et al., 2014). Igualmente, otro punto de contacto con los microorganismos durante el nacimiento se da mediante la vía de salida del infante, ya sea por la vagina, donde entran en contacto directo con la microbiota de la madre, es decir organismos microbianos que constituirán el microbioma; o por vía cesárea, donde no tienen ninguna aproximación, lo que puede provocar un gran riesgo para el desarrollo de diabetes tipo I, asma y obesidad (Dominguez-Bello et al., 2010). De suerte que conforme avanza el tiempo de vida de un organismo o un individuo, el cuerpo se va colonizando por una diversidad significativa de bacterias, 13

arquea, fungi y virus, los cuales conforman una comunidad denominada microbioma. Dichos microorganismos colaboran en las funciones vitales, como la digestión o el mantenimiento del sistema inmune, la producción de vitaminas, la digestión y la utilización de carbohidratos/lípidos, entre otros aspectos (Morgan et al., 2013; Salvucci, 2016). El término “microbioma” no cuenta con una sola definición, por un lado se refiere a la totalidad de microbios, su información genética y el medio en el cual actúan, constituidos en nichos ecológicos específicos o hábitats en el cuerpo humano; por el otro, a la totalidad del hábitat incluyendo los microorganismos (bacterias, arqueas, eucariotas y virus) y sus genomas (Marchesi y Ravel, 2015). Su composición está determinada por la carga genética, el sexo, la edad, la ubicación geográfica, el proceso de desarrollo y los factores ambientales. No obstante, una de las definiciones más aceptadas en la literatura lo describen como “la comunidad ecológica comensal, simbiótica y aquellos microorganismos patógenos o no patógenos que comparte el espacio corporal de un organismo o un individuo, dichos microorganismos generalmente fueron ignorados como determinantes de la salud y la enfermedad” (Lederberg y Mccray, 2001). En el año 2005 se lanzó el Proyecto del Microbioma Humano (Human Microbiome Project), cuyo objetivo era caracterizar el microbioma “normal” de individuos

hipotéticamente

“sanos”,

para

así

determinar

el

número

de

microorganismo, establecer su relación filogenética y reconocer la posible influencia de las comunidades microbianas en la salud. En dicho proyecto se desarrollaron 15 proyectos simultáneos alrededor del mundo, incluyendo muestras de piel, la cavidad oral, el tracto gastrointestinal, y la sangre. Un par de años después, en el 2007 se 14

trató de establecer el Consorcio Internacional del Microbioma Humano (International Human Microbiome Consortium) (Huttenhower et al., 2014; Peterson et al., 2009). Los esfuerzos realizados por estos grupos de investigadores permitieron reconocer cada vez más, que el microbioma humano conforma uno de los ecosistemas más complejos. Por consiguiente, los cambios o las modificaciones en la estructura y la interacción microbiota/hospedero, la modificación en la dieta del individuo, la edad y los diversos factores ambientales, afectan de manera significativa en la salud humana, provocando un estado de disbiosis, es decir, una condición en la cual la estructura de la población normal del microbioma se ve perturbada por alguna enfermedad o cierto tipo de medicamentos (Belizario y Napolitano, 2015); por ejemplo: enfermedades inflamatorias del intestino, enfermedades del hígado, obesidad y artritis reumatoide (Cho y Blaser, 2012). Igualmente

se

ha

reconocido

que

las

bacterias

están

clasificadas

filogenéticamente en cuatro filas o filum específicos: Firmicutes (integrados por bacterias anaeróbicas Gram-positivas que pertenecen a la clase Clostridia y aérobicas facultativas de la clase Bacilli), Bacteroidetes (conformadas por bacterias anaeróbicas Gram-negativas), Actinobacteria (que son Gram-positivas, no tienen forma de espora y tienen múltiples varillas de ramificación), y Proteobacteria (bacterias anaeróbicas facultativas, Gram-negativas y que habitan principalmente el tracto intestinal) (Yatsunenko et al., 2012). Sin duda, el microbioma intestinal es el ecosistema más abundante y con mayor grado de complejidad, ya que está colonizado por un número estimado de 100 trillones de microorganismos, distribuidos en dos filum principales: Bacteriodetes (Bacteroides y Provotella) y Firmicutes, y en un proporción menor Actinobacteria, 15

Fusobacteria y Verrucomicrobia. Por otra parte, el microbioma vaginal posee cerca de 200 filotipos, y el filum más predominante es Firmicutes, seguido de Bacteroidetes, Actinobacteria y Fusobacteria (Gajer et al., 2012). Mientras que el microbioma oral se conforma por bacterias, fungi, archaea, virus y protozoas, identificando más de 20 filos bacterianos. En el caso del microbioma de la piel, se ha documentado cerca 100 filotipos, donde el filo de Actinobacteria es el más cuantioso. Resumiendo, las investigaciones sobre los microorganismos que cohabitan el cuerpo humano han permitido asociar la composición de dichas comunidades con la presencia de enfermedades. Hoy en día sigue aumentando el número de publicaciones en distintas áreas. Para la antropología, el estudio del microbioma toma gran interés para entender la dinámica evolutiva de la especie humana en los diversos periodos de transición, como por ejemplo el cambio en el modo de subsistencia de la caza/recolección a la agricultura; o las posibles diferencias entre hombres y mujeres a lo largo del ciclo de vida e inclusive se puede tratar de entender como la constitución de las comunidades microbianas se ve influida por la cultura, los genes y el ambiente. Finalizando, los microbios son la forma de vida más abundante en el planeta, por consiguiente, conocer cómo se llevan a cabo las diversas interacciones entre el individuo y los diversos microorganismos en el presente, puede conducir al investigador hacia una mayor profundización de las poblaciones antiguas.

16

3.

La utilidad de la proteómica en el estudio de restos antiguos

El avance tecnológico en el campo de la biología molecular se ha incorporado a la antropología con el fin de analizar el componente genético y fenotípico de las poblaciones actuales y antiguas, además de explorar la presencia de ciertos agentes patógenos o inclusive, de comunidades microbianas que han co-evolucionado con el ser humano durante miles de años (Madhusoodanan, 2016; Tran et al., 2011; Weyrich et al., 2015). El fundamento de este tipo de trabajos se basa en la caracterización e identificación

sistemática

de

proteínas,

además

del

reconocimiento

de

intercomunicaciones y alteraciones con otras biomoléculas en los diversos procesos biológicos de un organismo. Por lo tanto, el estudio de la expresión del proteoma, referido como todo el complemento de proteínas expresadas por un genoma y presente en una célula, tejido, u organismo (Aebersold, 2003), contribuye en conocer los diversos factores que pudieron intervenir en la probable causa de muerte, en la determinación de un agente patógeno específico y en el entendimiento de los sistemas biológicos (Patterson y Aebersold, 2003; Tyers y Mann, 2003). 3.1

Los primeros años (1960-1980)

A mitad de la década de los cincuenta del siglo

XX,

se realizaron las primeras

investigaciones enfocadas a la extracción e identificación de aminoácidos en fósiles de trilobites del periodo ordovícico (360 millones de años) y de vértebra de Stegosaurus, trabajos que permitieron identificar alanina, ácido glutámico y valina (Abelson, 1954). Igualmente, se examinaron mediante cromatografía en dos dimensiones, 20 fósiles humanos y tres fósiles animales procedentes del área de 17

Kentucky, Nuevo México, Nueva York y California. Los fragmentos fueron datados entre 5300 años y 1175 antes del presente y se registraron evidencias de ácido aspártico, glicina y ácido glutámico. El cuestionamiento principal de la investigación se centró en reconocer qué tan viable es la preservación de aminoácidos recuperados en contextos arqueológicos (Ezra y Cook, 1957). Una década posterior se examinaron restos de especies animales (Equus sp., Equus occidentalis, canis dirus, bison antiqus) del Pleistoceno tardío, premolares de vaca y fragmentos de fémur de bisonte. Los resultados fueron alentadores ya que se logró encontrar hidroxiprolina, colágeno, glicina, alanina, prolina y glucosamina, aunque en proporciones bajas, principalmente en las muestras fósiles (Ho, 1965). Entre el final de la década de los 60 y los inicios de la siguiente, se dio un cambio significativo al incorporar técnicas inmunológicas en la distinción del material proteico en restos fósiles. Los investigadores que desarrollaron tal perspectiva mostraron la importancia de la preservación de macromoléculas en fósiles, dado que durante los procesos de mineralización de tejido óseo las biomoléculas se ven favorecidas, adquiriendo una capacidad de preservación diferencial dentro del componente mineral (De Jong et al., 1974; Sarich y Wilson, 1967). Los siguientes trabajos se enfocaron en caracterizar tanto colágeno, como proteínas no colágenas (PNC) en restos fósiles. La perspectiva de este tipo de investigaciones tenía como finalidad crear hipótesis en torno a la divergencia evolutiva de las especies a nivel biomolecular, colocando a la par los análisis de biología molecular con los criterios morfológicos. De acuerdo con lo anterior, se desarrollaron ensayos radio-inmunológicos en restos de momias egipcias con una 18

datación de hace 3000 años e inclusive fragmentos de hueso de Homo erectus (500,000 años de antigüedad) y Mamut (Mamuthus primigenius), (Lowenstein, 1980; Masters, 1987). Simultáneamente se incorporaron técnicas electroforéticas por medio de gel de acrilamida en ocho fragmentos de fémur de 200 a 1500 años de antigüedad, confirmando la presencia de colágeno y glicina (Gurtler et al., 1981). 3.2

Los cimientos de una nueva disciplina (1990-2000)

Durante la década de los 90, la mayor parte de los esfuerzos se volcaron en la detección de proteínas del componente sanguíneo en diversos materiales recuperados en contextos arqueológicos que puntualizaban la correlación de aspectos culturales con la información de la presencia de biomoléculas asociadas con la sangre, lo que podría indicar aspectos rituales o de dieta. Por otro lado, se vislumbró la posible utilidad de este tipo de estudios en campo forense. Tanto la cronología como la procedencia de las muestras fueron bastante heterogéneas: por ejemplo, se identificaron restos de proteína de albumina humana, fosfatasa alcalina e inmunoglobulina datadas de 2300 a 500 antes del presente; al mismo tiempo se llevaron a cabo pruebas experimentales en restos cremados, con el objetivo de reconocer la termo-estabilidad de las proteínas (Cattaneo et al., 1990, 1992a, 1992b, 1992c, 1995). Un

punto

interesante

que

fue

señalado

durante

el

desarrollo

de

investigaciones realizadas en dicha década, fue la exposición de la problemática de la diagénesis, del ambiente y de los diversos factores del contexto arqueológico que podían modificar la estructura de las proteínas, como el agua, el pH del suelo, así como la exposición térmica de manera directa o indirecta (Cattaneo et al., 1995). 19

Algunos investigadores hicieron énfasis en las proteínas por sus propiedades químicas, físicas y biológicas, que pueden estar sujetas a procesos de desnaturalización a causa del tiempo o factores diagenéticos; lo que podría modificar su estructura a simples péptidos, y entonces las pruebas de detección no serían las adecuadas para una identificación certera (Downs y Lowenstein, 1995). Cabe subrayar que cuanto dicho implicó un reto para los investigadores, de tal suerte que se lograron experimentos para la individualización de proteínas no colágenas (PNC) como la albumina, transferina y A2HS, aún cuando el colágeno constituye cerca del 90% del hueso. Por lo tanto, se adecuaron metodologías más efectivas para la purificación, separación e identificación de proteínas, además de la incorporación de técnicas electroforéticas y de inmunodifusión para confirmar la presencia de las biomoléculas (Grupe y Turban-Just, 1996). Cada vez más los estudios incluían dos o más herramientas tecnológicas (electroenfoque o isoelectroenfoque; ELISA, inmunodifusión radial, SDS-PAGE y evaluación

histológica)

para

la

extracción

e

identificación

de

proteínas;

especialmente las glicoproteínas (identificar albumina, 2-glycoproteina (AHSG) y 1antitripsina), las cuales penetran a la matriz del hueso uniéndose a la fase mineral. Los primeros resultados permitieron confirmar la presencia de 2-glycoproteina (AHSG) en restos humanos procedentes de la costa peruana de época prehispánica (Wiechmann et al., 1999). La inserción en el nuevo milenio de las investigaciones enfocadas a la extracción e identificación de proteínas en restos antiguos y fósiles conllevó la

20

implementación de nuevas técnicas analíticas, así como la incorporación de aparatos con un nivel de sensibilidad de biomoléculas más alto. Los trabajos que incluían ensayos inmunológicos para la identificación continuaron realizándose durante toda la década del 2000, de manera que la aplicación de pruebas paralelas de diagnóstico e identificación de biomoléculas como isoelectroenfoque, (IEF), Electroforesis por medio de gel de poliacrilameida (SDS PAGE), radioinmunoensayos, Western-Blot, fueron cada vez más comunes y los métodos de extracción fueron perfeccionándose. Tal esfuerzo redituó en la identificación de restos proteicos de 2-glycoproteina (AHSG) de restos esqueléticos peruanos del siglo II al XV antes del presente, y de inmunoglobulina (IgG) en restos de fósiles de équido datados en 1.6 millones de años y procedentes del sitio arqueológico de Atapuerca, en España (Brandt et al., 2000; Brandt et al., 2002; Torres, 2002). No obstante, el cambio más relevante en este campo fue la incorporación de métodos basados en la espectrometría de masas. Este tipo de análisis puede medir el total de la masa atómica de un elemento o componente por medio de la estimación del tiempo que le tome a una molécula dejar la búsqueda de ionización y alcanzar el detector dentro del componente, generando un espectro desde el fondo hasta la salida (Orsburn, 2010). La incorporación de nuevas estrategias de caracterización de proteínas de datación antigua usando la tecnología de fuente de ionización por medio de MALDIMS

o

MALDI-TOF-MS

(Matrix-assisted

laser

desorption/ionization

mass

spectrometry; Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass 21

spectrometry), confirmó la presencia de osteocalcina. El reconocimiento de la proteína no colágena almacenada en el tejido óseo se logró por medio del mapeo de masas de péptidos (peptide mass mapping) en muestras de bisonte y morsa, con datación entre los 10,000 y 50,000 años antes del presente (Ostrom et al., 2000). De manera semejante, se caracterizaron cinco secuencias de péptidos de colágeno extraídos de hueso de mamut con un rango de antigüedad que va de los 100,000 a los 300,000 años (Schweitzer et al., 2002); además de siete secuencias totales de péptidos asociados al colágeno en mayor abundancia de T. Rex, con una antigüedad de 68 millones de años y cuatro secuencias de proteínas de colágeno de mastodonte (de hace 160,000-600,000 años) (Asara et al., 2007). En este periodo, se reconoció que el colágeno muestra cierta resistencia a la degradación. Lo anterior hizo posible la diferenciación de especies a partir de secuencias de colágeno en 32 diferentes especies de mamíferos, ubicando 92 biomarcadores útiles para la identificación de especies a nivel de familia (Buckley et al., 2008; Buckley et al., 2009). Igualmente, la osteocalcina tiene propiedades de preservación semejantes al colágeno, por lo que tomó gran interés por el posible potencial en estudios filogenéticos. Dicha proteína no colágena se recuperó por medio de análisis de espectrometría de masas en las secuencias de proteínas de Neanderthal, con una fecha aproximada de 75,000, procedentes de Irak; además de restos de camélidos con una antigüedad estimada en 21,000 años (Humpula et al., 2007; Nielsen-Marsh et al., 2005).

22

En cada uno de los estudios se consideró la posibilidad que ofrece la extracción de osteocalcina y de colágeno en líneas de investigación del campo evolutivo, ya sea por medio de comparación bioquímica o filogenia molecular. En este

periodo

se

trató

de

comprender

los

cambios

diagenéticos

de

las

macromoléculas de contexto antiguo. A la par de los descubrimientos en las secuencia de péptidos, diversos autores explicaron que la tafonomía y la alteración de diversos agentes sedimentarios afectan de manera profunda la preservación de las proteínas (Jans et al., 2004; Nielsen-Marsh y Hedges, 2000; Smith et al., 2005). 3.3

La proteómica en el estudio de restos óseos antiguos 2010-2013

El universo del análisis de proteínas antiguas traspasó la frontera de la caracterización de biomoléculas a la búsqueda de biomarcadores proteicos para la identificación de enfermedades antiguas. Diversas investigaciones trataron de distinguir perfiles proteicos de agentes patógenos, que incidieron en la salud de las poblaciones durante momentos críticos en la historia de la humanidad, o que posiblemente afectaron a los individuos antes de su muerte (Boros-Major et al., 2011; Corthals et al., 2012; Mark et al., 2010; Minnikin et al., 2010). En este tenor, se encuentra la identificación de proteínas de Mycobacterium mediante espectrometría de masas (MALDI TOF / TOF MS) y huella peptídica de masas (PMF), en muestras óseas datadas entre 700 a 1600 antes del presente y recuperadas en sitios arqueológicos de Hungría. Se caracterizó adenilato quinasa, proteína regulador transcripcional de la familia LysR, helicasa putativa, el factor de iniciación de la traducción de proteínas IF-2, tres proteínas hipotéticas, catalasaperoxidasa-peroxinitrasa- TkatG, subunidad de flavoproteina fumarato reductasa 23

peptido sintetasa nrp, deshidrogenasa/reductasa y proteínas regulatorias (BorosMajor et al., 2011). Por otra parte, la caracterización de una momia inca con 500 años de antigüedad, reveló la presencia de proteínas involucradas en la respuesta inflamatoria y relacionadas con el sistema inmune. El perfil proteico corroboró la presencia de una infección respiratoria. Algunas proteínas consistentes con inflamación de los pulmones fueron: S100 A8/A9, apolipoproteina A1 y A2, proteina de unión a la vitamina D (VDB), inhibidor de proteasa de serina (SERPIN) transtiretina, albúmina, hemoglobina y serotransferina, además de proteínas asociadas a la respuesta inmune del hospedero en contra de una enfermedad infecciosa (catepsina G, α-1 antitripsina y neutrófilos defensina 1 y 3).6 El estudio permitió diagnosticar evidencia sólida de una infección activa justo antes del momento de la muerte de la momia (Corthals et al., 2012). Paralelamente, se desarrollaron pruebas inmunoquímicas para la detección e identificación de secuencias de péptidos de agentes patógenos en restos humanos y momificados

como:

Taenia

solium,

Plasmodium

falciparum,

Schistosoma

hematobium, Treponema pallidum, Tropheryma whipplei, Yersinia pestis, Rickettsia rickettsii, y Mycobacterium tuberculosis. Los investigadores que perfilaron la posibilidad de realizar diagnósticos de enfermedades en restos antiguos a partir del estudio de biomoléculas no nucleotídicas, concluyeron que las proteínas pueden 6

La función de la Catepsina G se ha relacionado con la patogénesis de enfermedades asociadas con la inflamación y la infiltración de neutrófilos de las vías respiratorias, tales como EPOC bacteriana (Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica). La α-1 antitripsina es un fuerte indicador de la infección por micobacterias y los neutrófilos defensina 1 y 3 se asocian específicamente con los macrófagos implicados en respuesta a la inflamación del tejido pulmonar.

24

preservarse más que el ADNa; hay menos susceptibilidad a la contaminación que en la PCR, dado que el análisis y el procesamiento no se basa en la amplificación; es posible caracterizar un amplio espectro de proteínas a partir de pequeñas muestras; y finalmente, los estudios de ADNa pueden confirmar la presencia de una enfermedad, aunque no hay certeza total si el padecimiento se manifestó, ya que el agente patógeno puede estar presente sin causar una infección aguda, por lo tanto, es necesario buscar las herramientas tecnológicas suficientes para confirmar su presencia (Corthals et al., 2012; Tran et al., 2011). El campo de la arqueozoología, en cambio, retomó la aplicación de la espectrometría de masas y su complemento con técnicas inmunológicas, que permitieron evaluar fragmentos óseos que, por su tratamiento y modificación cultural, perdieron su morfología original. Así que por medio de pruebas de ELISA, la cual responde a la reacción antígeno-anticuerpo, se identificaron materiales culturales pertenecientes a especies de vacas, cerdos y ovejas del neolítico de la Europa central. Un descubrimiento particular surgió a partir de la determinación del contenido de residuos de material orgánico insertos dentro de una vasija con antigüedad estimada de 4000 años. Mediante huella de masas peptídica por MALDI-TOF-MS y cromatografía líquida-ESI-LTQ-MS/MS, se corroboró la presencia de la secuencia de péptidos de -S1-caseina, una proteína contenida en la leche de bovino (Buckley et al., 2013; Pavelka et al., 2011). Es importante mencionar que gracias a los estudios de caracterización de colágeno y de otras proteínas no colágenas (NCP), como la albumina y la A2HSG (ésta última, con gran potencial para la inferencia filogenética), se pudo cuestionar 25

entorno al proceso de interacción del ser humano con los animales a lo largo de su historia evolutiva, además de entender los procesos de domesticación de las especies actuales (Buckley y Collins, 2011; van Doorn et al., 2012; Wadsworth y Buckley, 2014). Sin duda, las investigaciones que podrían considerarse como punto de partida de la paleoproteómica en restos antiguos, son las que analizaron los restos de mamut de hace 43,000 años y estudiaron el tejido momificado que vivió hace 5000 años. En el primer trabajo, se diferenciaron 126 proteínas a partir de dos muestras (2 mm de hueso) extraídas del fémur del mamut descubierto en Yakutia, Rusia (Cappellini et al., 2012). Del cuerpo momificado se logró la caracterización de 502 proteínas distintas de un cuerpo momificado de hace 5,300 años, de las cuales 41 asociadas al tejido nervioso y nueve específicas del cerebro. Asimismo, se encontraron 84 proteínas relacionas con la respuesta ante un evento de estrés, 39 ligadas con la respuesta a heridas y 15 asociadas a la reparación de heridas. El acceso al proteoma de un organismo o un tejido puede ofrecer información sobre la secuencia de aminoácidos o las tasas de sustitución, lo que puede contribuir a proponer inferencias filogenéticas por medio de la comparación bioquímica o la presencia de nuevos bio-marcadores de la fisiología del hueso y enfermedades, además de la interacción del conjunto de proteínas extraídas (Cappellini et al., 2012; Maixner et al., 2013).

26

3.4

Nuevas tendencias en la investigación de restos antiguos a través

de la metaproteómica 2014El arribo de métodos en espectrometría de masas más precisos, con un grado de sensibilidad mayor para la distinción de proteínas, así como la conformación de bases de datos para la comparación de secuencias de péptidos, han incrementado en los últimos años la posibilidad de reconocer y recuperar información a nivel molecular de muestras antiguas de distinta naturaleza y cronología (Schweitzer et al., 2014); además de caracterizar a gran escala todo el complemento de proteínas en un tiempo específico del organismo. Los estudios bajo la perspectiva de la meta-proteómica identifican tanto las proteínas del microbioma como del anfitrión/ambiente; posterior a la secuenciación, los análisis a través de bioinformática asignan las diversas proteínas a su origen biológico (Marchesi y Ravel, 2015). En relación a lo anterior, el objetivo principal de distintos investigadores ha sido el reconocimiento de los cambios estructurales que pueden darse en la proteínas

como

consecuencia

de

la

inestabilidad

de

las

condiciones

microambientales o macroambientales (modificaciones postraduccionales) a lo largo del tiempo, la contaminación por microorganismos o los cambios en la conformación mineral por causa de diagenéticos primarios (Buckley y Wadsworth, 2014; Mikšík et al., 2014). Las inferencias evolutivas y la distinción de especies a partir de la comparación de huellas de identificación proteica ha continuado (Cappellini et al., 2014), proponiendo al colágeno como una de las biomoléculas más estables por su 27

termo-estabilidad y las propiedades químicas resistentes a la mayoría de factores diagenéticos que podrían modificar su estructura (Buckley et al., 2014). Sin embargo, uno de los temas que ha recobrado una relevancia significativa es el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Algunos autores afirman que es totalmente viable encontrar biomarcadores que permitan corroborar la presencia de un agente patógeno en el tejido óseo, como el Mycobacterium tuberculosis o de proteínas asociadas como AG 85 (Schmidt-Schultz y Schultz, 2013, 2015). Por otra parte, hay quienes consideran que existe una pobre preservación del material inmunológico reactivo que permita corroborar la presencia de una enfermedad en restos óseos e inclusive dentina (Hendy et al., 2016; Kendall et al., 2016). Aunque el tema sigue en discusión, lo cierto es que persiste la posibilidad de llegar a un nivel de conocimiento de la salud de poblaciones antiguas mucho más certero. Un importante reservorio de información proteica es el cálculo dental o la placa dental. Las primeras investigaciones realizadas han permitido la identificación de 43 proteínas humanas, de las cuales 25 están involucradas en el sistema inmune innato; específicamente ocho de ellas presentan propiedades antimicrobianas. Asimismo, se han detectado péptidos de inmunoglobulina (IgA e IgG), así como enzimas de la saliva que sirven como medio para metabolizar nutrientes; de igual manera se caracterizaron proteínas con capacidad antiinflamatoria y de patógenos propios de la comunidad bacteriana de la cavidad oral como P. gingivalis, T. denticola, T. forsythia, es decir bacterias asociadas a enfermedad periodontal (Warinner et al., 2014b). En otro estudio llevado a cabo por el mismo grupo de colaboradores se identificó la

28

proteína -lactoglobulina, siendo la primera evidencia directa de consumo de leche en la edad de bronce (Warinner et al., 2014a). Consideremos ahora que el estudio de proteínas en restos antiguos lleva más de 60 años, por lo que no se habla de una herramienta nueva, sino que se han ido incorporando elementos tanto teóricos como metodológicos para conocer más acerca del pasado. Se debe agregar que todavía quedan muchos aspectos para profundizar sobre la preservación, la conformación y el tipo de información biomolecular en restos antiguos. Por lo tanto, en el siguiente capítulo se trata de exponer las características de la placa dental, espacio donde se va acumulando la información de gran parte de la vida de un individuo, así como de los microorganismos que en ella cohabitan.

29

4.

Características de la placa dental

La conformación de la placa dental se caracteriza por la presencia de componentes orgánicos, mayoritariamente proteínas, polisacáridos, leucocitos, carbohidratos y lípidos;7 mientras que la parte inorgánica se constituye principalmente por fosfato octacalcico,8 hidroxiapatita,9 whitlockita.10 La placa dental surge por la precipitación de sales minerales entre un periodo de tiempo de 1 a 14 días; aparece sobre todo en la adolescencia y puede aumentar progresivamente con la edad siendo variable de persona a persona. Su localización se encuentra directamente relacionada con proteínas salivares y se ha clasificado conforme a su ubicación en relación al diente en supragingival y subgingival, (Waldron, 2008, pp. 240-241). El cálculo o sarro supragingival (acumulación de placa dental en la superficie del diente y por encima de las encías) suele ser blanco o amarillento, de consistencia dura y fácilmente desprendible de la superficie dentaria. Éste puede localizarse en un solo diente, en un grupo de dientes o puede estar generalizado en toda la boca. En la mandíbula se encuentra principalmente en la superficie lingual de los dientes

7

De los cuales el 61.8% son lípidos neutros (incluyendo un alto contenido de ácidos grasos libres triglicéridos). Del total de lípidos, el 28% son glicolípidos; compuestos por un 17.2% de glicoesfingolípidos simples (lactosil y glucosilceramina esencialmente) y 18.8% de gliceroglucolípidos sulfatos. Mientras que los fosfolípidos constituyen el 10.2% de lípidos (34.2% de fosfatidiletanolamina, 25.5% de difosfatidiglicerol, 2.3%fosfatidilinositol y 1.7% de fosfatidilserina). 8

[Ca8(PO4)4(HPO4)25HO] (OCP).

9

[Ca10(PO4)6 (OH)2] (HAP).

10

[Ca10(HPO4)(PO4)6] (WHT).

30

anteriores y en menor proporción en los molares; mientras que en el maxilar, el cálculo supragingival se localiza en la superficie bucal de los primeros molares. Por otro lado, en el cálculo subgingival (es decir, por debajo de la región cervical del diente), se concentra mayoritariamente en la superficie lingual (principalmente en los primeros molares inferiores), más que en la bucal (donde los incisivos centrales, laterales y primeros molares superiores presentan mayores concentraciones). Cuando la placa dental se ha calcificado, se puede formar una estructura a manera de puente entre dientes adyacentes o cubrir sus superficies oclusales, sin antagonistas funcionales (Hillson, 2005; Hillson, 2007; Jin y Yip, 2002). 4.1 Ecología Microbiana11 oral La microbiota oral se considera la segunda comunidad12 microbiana más importante en el ser humano, sólo por detrás del intestino. Aparentemente la cavidad oral13

podría

representar

un

ecosistema14

pequeño;

sin

embargo

los

microorganismos que viven, crecen y se reproducen en este hábitat tienen características estructurales, biológicas y químicas propias, además de funciones e

11

La ecología microbiana trata de comprender las múltiples interrelaciones entre los microorganismos y su entorno, intentando identificar los aspectos funcionales, así como los cambios en el número de microorganismos en un hábitat especifico. 12

Se ha definido como una “comunidad” al conjunto de especies que cohabitan e interactúan entre si de manera dinámica en un ambiente especifico. 13

La cavidad oral incluye distintos habitas como: los dientes, el surco gingival, la encía, la lengua, las mejillas, el labio, el paladar duro y el paladar blando, las amígdalas, la faringe, el esófago, el tubo de Eustaquio, el oído medio, la tráquea, los pulmones, los pasajes nasales y los senos paranasales. 14

El ecosistema representa el conjunto de organismos y elementos orgánicos e inorgánicos en un entorno especifico. Es importante mencionar que cada ecosistema es particular, es decir, con organismos específicos que en su totalidad constituyen una comunidad.

31

interrelaciones entre los microorganismos, el medio ambiente y el hospedero. Se han identificado alrededor de 280 bacterias bajo cultivos controlados, aunque otros métodos han permitido registrar entre 500 y 700 especies. Estudios recientes han distinguido seis phylum principales: Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, Spirochaetes y Fusobacteria y, en menor proporción, Euryarchaeota, Chlamydia, Chloroflexi, SR1, Synergistetes, Tenericutes y TM7 (Dewhirst, 2010). La sucesión de microorganismos de la microbiota oral se transforma en diferentes espacios a lo largo del tiempo o ante la presencia de una enfermedad, ya sea de manera autogénica (donde hay una sustitución de especies con capacidades adaptativas favorables a su hábitat) o alogénica (sucede cuando existe un remplazo de una comunidad por otra, debido a factores no microbianos como los cambios en las propiedades químico-físicas de la región del hospedero). De cualquier manera, los organismos que integran la comunidad es dinámica y heterogénea de individuo a individuo (Socransky y Haffajee, 2005). De manera general, la colonización de microorganismos bacterianos inicia con el reconocimiento de los receptores de las películas salivales por las bacterias colonizadores iniciales en la superficie del diente, y la agregación conjunta (coagregación) entre los colonizadores iniciales, las fusobacterias y los colonizadores tardíos. Los

principales

colonizadores

iniciales

son:

Streptococcus

gordonii,

Streptococcus mitis, Streptococcus oralis y Streptococcus sanguinis, los cuales se

32

unen con los receptores salivales complementarios15 en el revestimiento de película adquirida en la superficie del diente. En un segundo momento, los colonizadores tardíos se fijan a las bacterias referidas anteriormente. La unión secuencial de bacterias es el resultado de un puente de atracción respecto a las propiedades de co-adhesión16 (adherencia de las células microbianas para inmovilizar bacterias) o co-agregación17 (unión de bacterias en suspensión) con su célula afín. Cada cepa bacteriana muestra propiedades de co-agregación con otras cepas de diferente género, esto quiere decir que existen asociaciones intra-específicas e interespecíficas entre las cepas bacterianas que se almacenan en la placa dental (Kolenbrander et al., 2010; Rickard et al., 2003). La colonización de bacterias en la superficie del diente depende de tres aspectos esenciales: el lugar de colonización (superficie), la composición de fluidos biológicos (saliva, líquido del surco gingival) y la comunidad de microrganismos. Existen otros factores de influencia para que se lleve a cabo la colonización de la microbiota, como la capacidad de asimilación de nutrientes en el ecosistema, la capacidad de adaptación ante agentes no microbianos (pH, niveles de oxígeno, temperatura, entre otros) y en particular, la relación intrínseca entre el hospedero y los microorganismos. La patogenicidad de los organismos está relacionada con el 15

Mucinas sialiladas (proteína rica en prolina), α-amilasa, aglutinina salival y fragmentos de células bacterianas. 16

Se refiere a la capacidad de adhesión de los microorganismos planctónicos a una célula microbiana genéticamente distinta, la cual se inmoviliza sobre una superficie. 17

Sucede en la unión de dos microorganismos genéticamente distintos en suspensión en fase fluida; se lleva a cabo por medio de interacciones específicas entre los componentes de las superficies celulares.

33

nivel de virulencia (capacidad de un organismo para causar una enfermedad o intervenir en funciones metabólicas o fisiológicas), los factores ambientales, los componentes físico-químicos de la bacteria, y los mecanismos de defensa del sistema inmune del hospedero (Dumitrescu, 2010, p. 40) (ver figura 1).

Figura 1. Composición de la placa dental.

34

5.

Materiales y métodos

Los individuos que integran esta investigación fueron recuperados en el marco de un proyecto de salvamento arqueológico, en el que actualmente se ubica el Museo Franz Meyer de la Ciudad de México. La historia del Hospital San Juan de Dios remonta al año de 1538, cuando el Dr. Pedro López lo nombró “Hospital Real de la Epifanía”. Este centro hospitalario tuvo múltiples usos, desde centro de enseñanza hasta centro de atención exclusivamente de mujeres públicas. Desde finales del siglo XIX hasta 1960 se le llamó “Hospital Morelos” y dio atención de particular manera, a mujeres con enfermedades venéreas (gonorrea y sífilis), (Muriel, 1956). Si bien la cronología no se conoce con exactitud, investigaciones previas ubican el lugar de inhumación de los restos en la parte tardía del cementerio del hospital (Márquez y Meza, 2015).

El diseño metodológico fue planteado de manera que cada variable nos permita reconstruir fragmentos de la historia de vida de los individuos analizados; para la determinación del sexo se utilizó el método basado en las características morfológicas del pubis (Klales et al., 2012; Phenice, 1969) y el cráneo (Walker, 2008). Mientras que la estimación de la edad se realizó mediante la aplicación del método que evalúa las características de la carilla auricular (Buckberry y Chamberlain, 2002), la sínfisis púbica (Brooks y Suchey, 1990); la estatura se calculó por medio de las ecuaciones de regresión para huesos largos (Angel y Cisneros, 2004).

La evaluación tanto del sexo como la edad permite establecer en primera instancia el perfil biológico y en segundo término, da una idea de la vulnerabilidad o 35

susceptibilidad a una enfermedad acuerdo a la edad y el sexo, ya sea por la distinción social, el acceso diferencial a los recursos o la capacidad adaptativa del individuo a su contexto sociocultural.

Para la toma de muestra de placa dental se siguieron las recomendaciones propuestas por la Dra. Christina Warinner (2014), tratando de recuperar la cantidad máxima de sarro adherido a la superficie de los dientes, reuniendo la muestra total de la mandíbula y del maxilar por separado, esto puede ayudar a caracterizar la información de la microbiota tanto superior como inferior o las demás proteínas almacenadas dentro de la placa dental. Seguidamente, retomó el protocolo de extracción asistido por medio de filtro (Amicon YM-10, 4mL)18, este método permite obtener proteínas digeridas libres de minerales de hidroxiapatita, componentes celulares, ácidos nucleicos y posibles contaminantes del suelo, adicionalmente se puede aplicar a muestras cuyo contenido de detergentes o la presencia de contaminantes exógenos es alto, al mismo tiempo que la concentración de biomoléculas es significativa; las proteínas pueden analizarse por medio de gel uni o bidimensional o por medio de espectrometría de masas (Cappellini, 2014; Warinner et al., 2014c; Wisniewski et al., 2009).

A continuación se presenta los datos generales del perfil biológico de los individuos analizados, así como la representación ósea y la ubicación de patologías, lesiones o marcas de estrés musculo-esquelético.

18

Ver anexo para más detalles del protocolo. 36

-

Individuo 1 (Entierro 16)

Corresponde a un individuo de sexo masculino, con un rango de edad estimado de 37.8  13.08 años y una estatura que oscila entre 1.57 a 1.61 m.

Figura 2. Representación gráfica de los elementos óseos que integran el entierro 16.

-

Individuo 2 (Entierro 23A)

37

Se trata de un individuo masculino, con un rango de edad estimado de 37.8 13.08 y una estatura estimada en 1.56 m.

Figura 3. Representación gráfica de los elementos óseos que integran el entierro 23.

38

6.

Resultados

Se lograron extraer e identificar 12 proteínas de la placa dental de Entierro 16; mientras que del Entierro 23A se identificaron cinco proteínas. Cabe mencionar que se identificaron proteínas con una estructura similar, como el cluster de colágeno, por lo tanto, fue seleccionada la proteína que tenía mayor porcentaje de cobertura. Para asentar la confiabilidad de éstas se confirmó el número de acceso arrojado por el estudio de espectrometría de masas en el sitio web BLAST 19 (Basic Local Aligment Search Tool) y UNIPROT20 (Universal Protein Resource). 6.1 Proteínas de la placa dental del entierro 16 De las muestras de placa dental se lograron extraer e identificar 12 proteínas, de las cuales dos provienen de las muestras de sarro de los órganos dentales del maxilar; mientas que las 10 restantes fueron recuperadas de la placa dental de los dientes inferiores. A continuación se muestra la clasificación de las proteínas identificadas, el número de acceso para su evaluación en base de datos (BLAST, Uniprot), el peso molecular, el porcentaje de cobertura y la taxonomía.

19

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

20

http://www.uniprot.org/

39

6.1.2 Proteínas identificadas en placa dental del maxilar 1. Proteína identificada: Cluster of Collagen alpha-2(I) chain OS=Homo sapiens GN=COL1A2 PE=1 SV=7 (P08123); Número de Acceso: P08123 [6]; Peso molecular: 129 kDa; porcentaje de cobertura: 100%; Taxonomía: Homo sapiens.

Procedencia o Función de la proteína: El colágeno tipo I se constituye por dos cadenas: alfa1 y una cadena alfa 2. Los colágenos son una familia de proteínas que están involucradas en la mayor parte de tejidos del cuerpo (cartílago, huesos, tendones, piel y la parte blanca del ojo); además de estar implicadas en funcionas muy importantes, como el desarrollo del tejido óseo, el desarrollo de los vasos sanguíneos, la coagulación, la organización de la matriz

extracelular,

la

organización

de

las

fibras

de

colágeno,

la

odontogénesis, el proceso catabólico del colágeno, la migración de leucocitos, la morfogénesis de la piel, la regulación de la presión sanguínea, la regulación del sistema inmune, entre otras. El colágeno tipo I es la forma más abundante de colágeno en el cuerpo humano. Las mutaciones en este gen se asocian con: osteogénesis imperfecta I-IV, síndrome de Ehlers-Danlos tipo VII B, recesiva de Ehlers-Danlos tipo clásico, osteoporosis idiopática, el síndrome de Marfan y atípico (de Wet et al., 1987; Monroe et al., 2015; Takagi et al., 2015).

2. Proteína identificada: Collagen alpha-2(I) chain (Fragments) OS=Cyclopes didactylus GN=COL1A2 PE=1 SV=1; Número de Acceso: C0HJP2; Peso molecular: 75 kDa; % de cobertura: 24%; Taxonomía: Cyclopes didactylus.

40

Procedencia o Función de la proteína: La secuencia de esta proteína colágena se encuentra correlacionada con una especie de oso hormiguero que habita actualmente la zona de Centroamérica y Sudamérica. Pertenece al superorden Xenarthra y se encuentra emparentado filogenéticamente con los armadillos y perezosos de dos dedos (Chacón et al., 2013; Hayssen et al., 2012).

6.1.3 Proteínas identificadas en placa dental de la mandíbula 1. Proteína identificada: Cluster of Collagen alpha-1(I) chain (Fragments) OS=Tapirus terrestris GN=COL1A1 PE=1 SV=1 (C0HJN7); Número de Acceso: C0HJN7 [6]: Peso molecular: 86 kDa; porcentaje de cobertura: 100 %; Taxonomía: Tapirus terrestres.

Procedencia o Función de la proteína: Esta proteína tiene las propiedades físico-químicas propias del colágeno; sin embargo, la secuencia proteica está vinculada con los datos de la especie animal Tapirus terrestres. Este mamífero perisodáctilo incluye nueve géneros ahora extintos, mientras que actualmente se extiende desde Centroamérica hasta Brasil. Esta proteína ha sido reportada previamente en estudios de corte evolutivo y filogenético del sur de América (Welker et al., 2015).

2. Proteína

identificada:

Collagen

alpha-2(I)

chain

OS=Homo

sapiens

GN=COL1A2 PE=1 SV=7; Número de Acceso: P08123: Peso molecular: 129 kDa; porcentaje de cobertura: 96%; Taxonomía: Homo sapiens.

41

Procedencia o Función de la proteína: El colágeno tipo I está constituido por dos cadenas: alfa1 y una cadena alfa 2. Los colágenos son una familia de proteínas que refuerzan y apoyan muchos tejidos del cuerpo, incluyendo el cartílago, los huesos, los tendones, la piel y la parte blanca del ojo. Este tipo de proteínas están involucradas en funcionas muy importantes en el ser humano como el desarrollo del tejido óseo, el desarrollo de los vasos sanguíneos, la coagulación, la organización de la matriz extracelular, la organización de las fibras de colágeno, la odontogénesis, el proceso catabólico del colágeno, la migración de leucocitos, la morfogénesis de la piel, la regulación de la presión sanguínea, la regulación del sistema inmune, entre otras. El colágeno tipo I es la forma más abundante de colágeno en el cuerpo humano. Las mutaciones en este gen se encuentran asociadas con: osteogénesis imperfecta I-IV, síndrome de Ehlers-Danlos tipo VII B, recesiva de Ehlers-Danlos tipo clásico, osteoporosis idiopática, el síndrome de Marfan y atípico (de Wet et al., 1987; Monroe et al., 2015; Takagi et al., 2015).

3. Proteína identificada: Cluster of Keratin, type I cytoskeletal 9 OS=Homo sapiens GN=KRT9 PE=1 SV=3 (sp|P35527|K1C9_HUMAN): Número de Acceso: sp|P35527|K1C9_HUMAN [3]:; Peso molecular: 62 kDa; porcentaje de cobertura: 88%; Taxonomía: Homo sapiens.

Procedencia o Función de la proteína: Esta proteína puede tener una función importante en el programa morfo-genético de tejido de la mano o en la región plantar; al mismo tiempo juega un papel esencial en el montaje de los

42

filamentos de queratina, en el desarrollo de la epidermis y la piel, así como en la espermatogénesis (Kobayashi et al., 1996; Langbein et al., 1993).

4. Proteína identificada: Cluster of Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase OS=Streptococcus

pyogenes

serotype

M1

GN=gap

PE=3

SV=2

(sp|P0C0G7|G3P_STRP1); Número de Acceso: sp|P0C0G7|G3P_STRP1 [18]:; Peso molecular: 36 kDa; porcentaje de cobertura: 100%; Taxonomía: Streptococcus pyogenes serotype M1. Procedencia o Función de la proteína: Esta proteína se asocia con la bacteria Gram-positiva Streptococcus pyogenes, la cual se vincula con la presencia de faringitis estreptocócica, fiebre escarlata y fiebre reumática (Madigan, 2009, p. 781). 5. Proteína identificada: Collagen alpha-2(I) chain (Fragments) OS=Cyclopes didactylus GN=COL1A2 PE=1 SV=1; Número de Acceso: C0HJP2; Peso molecular: 75 kDa; porcentaje de cobertura: 24%; Taxonomía: Cyclopes didactylus.

Procedencia o Función de la proteína: La secuencia de esta proteína colágena se encuentra correlacionada con una especie de oso hormiguero que habita actualmente la zona de Centroamérica y Sudamérica, pertenece en el superorden Xenarthra y se encuentra emparentado filogenéticamente con los armadillos y perezosos de dos dedos (Chacón et al., 2013; Hayssen et al., 2012).

43

6. Proteína identificada: Cluster of Neutrophil defensin 1 OS=Homo sapiens GN=DEFA1 PE=1 SV=1 (sp|P59665|DEF1_HUMAN); Número de Acceso: sp|P59665|DEF1_HUMAN [6]; Peso molecular: 10 kDa; porcentaje de cobertura: 99%; Taxonomía: Homo sapiens. Procedencia o Función de la proteína: Las defensinas son una familia de péptidos que constituyen la primera línea de respuesta inmune contra diversos patógenos, inactivando varias clases de exotoxinas bacterianas. La proteína defensina 1 está codificada por el gen DEFA1 y presenta propiedades antivirales, fungicidas antibacterianas, específicamente contra bacterias Gramnegativas y Gram-positivas (Ericksen et al., 2005). Este tipo de proteína ha sido reportada previamente en muestras antiguas, sugiriendo que el individuo portador enfrentaba una enfermedad infecciosa respiratoria (Corthals et al., 2012). 7. Proteína identificada: ABC transporter related protein Actinomyces oris K20 763 0 99.99; Número de Acceso: anae_c_1_13111; Peso molecular: ¿?; porcentaje de cobertura: 100%; Taxonomía: Actinomyces. Procedencia o Función de la proteína: No se encontró información de la proteína, sin embargo la bacteria Actinomyces forma parte de la comunidad bacteriana de la cavidad oral (Kolenbrander et al., 2010; Kolenbrander et al., 2006; Rickard et al., 2003). 8. Proteína identificada: phosphoglycerate mutase 1 family protein Actinomyces sp. oralstaxon 171 str. F0337 529 0 94.18; Número de Acceso:

44

anae_c_1_9170; Peso molecular: ¿?; porcentaje de cobertura: 100%; Taxonomía: Actinomyces. Procedencia o Función de la proteína: No se encontró información específica de la proteína, sin embargo la bacteria Actinomyces forma parte de la comunidad bacteriana de la cavidad oral (Kolenbrander et al., 2010; Kolenbrander et al., 2006; Rickard et al., 2003). 9. Proteína identificada: unnamed protein product Mesorhizobium loti 3640 0 99.99; Número de Acceso: mlot_c_1_43559 (+16); Peso molecular: ¿?; porcentaje de cobertura: 100%; Taxonomía: Mesorhizobium. Procedencia o Función de la proteína: La proteína está relacionada con bacterias fijadoras de nitrógeno Gram-negativas, las cuales viven en el suelo. Son capaces de establecer una simbiosis con las plantas huéspedes de los géneros, además de conducir a la formación de nódulos en las raíces (Kaneko et al., 2000). 10. Proteína identificada: Cluster of Enolase OS=Frankia sp. (strain CcI3) GN=eno PE=3 SV=1 (sp|Q2J619|ENO_FRASC); Número de acceso: sp|Q2J619|ENO_FRASC [27]; Peso molecular: 45 kDa; Porcentaje de cobertura: 100%; Taxonomía: Frankia sp. CcI3. Procedencia o Función de la proteína: Esta proteína se asocia a la bacteria Frankia, quien establece un estado de simbiosis (simbiosis Actnorrizica) en las raíces de 25 géneros de plantas distribuidos en 8 familias, en su conjunto son llamadas plantas actinorrízicas (PA). El hábitat de este tipo de arbustos perennes es muy diverso, pero tienen la particularidad de sobrevivir en

45

condiciones extremas y a una profundidad somera (Guerrero y Valdés, 2008; Huss-Danell, 1997).

46

6.1.3 Interpretación de los resultados

El conjunto de proteínas ofrece datos relevantes en varios niveles de información, que pueden agruparse de la siguiente manera:

a) Proteínas estructurales. El colágeno tipo I alpha-2, se identificó tanto en la placa dental del maxilar como en la mandíbula, podría ser consecuencia del proceso de la toma de muestra, ya que durante el raspado para obtener la muestra de sarro posiblemente se tomó un poco de la estructura alveolar.

Por otra parte, se identificó una proteína de keratina que puede relacionarse con un proceso de contaminación, en la manipulación previa a la toma de muestra.

b) Proteínas de respuesta inmune. La proteína neutrófilo defensina I indica que el individuo momentos o años anteriores a su deceso, sufría de algún tipo de enfermedad infecciosa respiratoria. Es probable que la infección respiratoria afectara al individuo durante un periodo de tiempo prolongado, a tal grado que perjudicó la región adyacente de la cavidad nasal (derecha e izquierda) y el crecimiento de tejido óseo indiferenciado por debajo de la espina nasal anterior, muy cercano a la sutura intermaxilar. Esto nos permite suponer que el individuo podría estar bajo un proceso infeccioso de las vías respiratorias donde la bacteria Streptococcus pyogenes podría estar involucrada (ver fig. 4 y 5).

47

Figura 4. Vista lateral de región facial. Las líneas discontinuas indican el área de inflamación del tejido óseo en región adyacente de la cavidad nasal y crecimiento no diferenciado de hueso en la parte cercana a la sutura intermaxilar del lado derecho.

Figura 5. Vista a detalle del proceso infeccioso cercano a la espina nasal del lado derecho. c) Proteínas asociadas a la dieta. La identificación de proteínas de colágeno tipo I alpha 1 y 2, indican el consumo de algún tipo de alimento relacionado con la especie Cyclopes didactilus y Tapirus terrestres. Si bien ambas

48

especies actualmente se encuentran en Centroamérica y América del Sur, es posible establecer que durante la etapa adulta y en el proceso de acumulación de sarro, el individuo consumía este tipo de carne relacionada con estas especies. Este par proteínas evidencia los elementos que integraban la dieta del individuo, ya que la proporción de este tipo de alimento cárnico explica la acumulación de placa dental sub y supragingival de manera significativa (ver figs. 6 y 7)

Figura 6. Vista lingual de órganos dentales con presencia significativa de placa dental supragingival.

49

Figuras 7. Vista vestibular de órganos dentales con presencia significativa de placa dental supragingival. d) Proteínas asociadas a microorganismos. Dentro de este grupo de proteínas podemos establecer dos puntos de partida: las proteínas de organismos comensales o no patogénicos que convivían con el individuo en el hábitat de la cavidad oral (como las bacterias Actynomices), y aquellas que podían tener una carga patogénica (como Streptococcus pyogenes, que se relaciona con problemas de faringitis o con algún cuadro febril de origen infeccioso). En el caso de las baterías asociadas con Actinomyces y consideradas como comensales, es decir que podrían ser parte de la comunidad microbiana normal de un individuo, se asocian a otro tipo de bacterias colonizadoras tardías,

causantes

de

enfermedad

periodontal.

Seguramente

dichos

microorganismos formaban parte de la placa dental; sin embargo, debido a su preservación no se lograron identificar. De cualquier manera, la enfermedad periodontal es evidente en este individuo, la retracción del límite del alveolo va 50

más allá de los 3 mm, lo que revela que padecía este tipo de afección (ver fig. 8 y 9).

Figura 8 y 9. Vista bucal y vestibular de órganos dentales inferiores con presencia de placa dental y resorción alveolar significativa. Por último, la proteína asociada a Mezorhizobium, que se atribuye principalmente a contaminación por el lugar de inhumación final de restos, y la proteína asociada a la bacteria Frankia (microorganismo simbiótico con diversos arbustos perennes) hacen suponer que tal vez el individuo realizaba 51

algún tipo de actividad relacionada con las raíces o posiblemente, alguna variedad de estos arbustos haya constituido parte de su dieta.

52

6.2

Proteínas de la placa dental del entierro 23

De las muestras de placa dental se lograron extraer e identificar cinco proteínas, pertenecientes a los órganos dentales inferiores. Como en la descripción de proteínas del entierro 16, se expone la clasificación de las proteínas identificadas, el número de acceso para su evaluación en base de datos (BLAST, Uniprot), el peso molecular, el porcentaje de cobertura y la taxonomía. 6.2.1 Proteínas identificadas en placa dental del maxilar Se identificaron un total de cinco proteínas de la placa dental de los dientes inferiores. Se describe por lo tanto, cada una de ellas y la procedencia o función en la que colaboran. 1. Proteína identificada: Albumina sérica OS=Homo sapiens GN=ALB PE=1 SV=2; Número de acceso: sp|P02768|ALBU_HUMAN; Peso molecular: 69 kDa; Porcentaje de cobertura: 0% ; Taxonomía: Homo sapiens. Procedencia o función de la proteína: La albúmina sérica se considera como la principal proteína del plasma sanguíneo. Tiene una buena capacidad de unión con el agua, Ca2 +, Na +, K +, los ácidos grasos, las hormonas y la bilirrubina. Su función principal es la regulación de la presión osmótica coloidal de la sangre, además de ser un importante transportador de zinc en el plasma (Lu et al., 2008). 2. Proteína identificada: Malate dehydrogenase OS=Nocardioides sp. (strain BAA-499

/

JS614)

GN=mdh

sp|A1SMP3|MDH_NOCSJ;

Peso

PE=3

SV=1;

molecular:

34

Número kDa;

de

acceso:

Porcentaje

de

cobertura: 66%; Taxonomía: Nocardioides. 53

Procedencia o función de la proteína: La proteína malato deshidrogenasa cataliza la oxidación reversible de malato a oxalacetato; está asociada a la bacteria Nocardioides sp. (BAA-499 Strain / JS614), es decir una bacteria Gram-positivas aeróbica filogenéticamente asociadas a Actinobacteria. Ésta crece rápidamente y de manera eficiente en medios que contienen cloruro de vinilo (VC) y etano (ETH). Generalmente se acumula y persiste en aguas subterráneas como resultado de cloración reductiva (Coleman et al., 2011). 3. Proteína identificada: 50S ribosomal protein L5 OS=Streptococcus sanguinis (strain

SK36)

GN=rplE

sp|A3CK75|RL5_STRSV;

PE=3

Peso

SV=1;

molecular:

Número 20

kDa;

de

acceso:

Porcentaje

de

cobertura: 31%; Taxonomía: Streptococcus sanguinis. Procedencia o función de la proteína: Es una de las proteínas que unen y promueven la unión de la ARN 5S en la subunidad ribosómica grande, donde forma parte de la protuberancia central. En los ribosomas 70S pone en contacto a la proteína S13 con la subunidad 30S (puente B1b). Esta proteína se relaciona con la bacteria oral Streptococcus sanguinis. Se ha asociado la presencia de S.sanguinis en cavidad bucal a sujetos libres de caries (Caufield et al., 2000). 4. Proteína

identificada:

OS=Bacillus

cereus

Glyceraldehyde-3-phosphate

GN=gap1

PE=1

SV=3;

dehydrogenase

Número

de

1

acceso:

sp|Q4MQ58|G3P1_BACCE; Peso molecular: 36 kDa; Porcentaje de cobertura: 50%; Taxonomía: Bacillus cereus. Procedencia o función de la proteína: La función molecular de esta proteína comprende la interacción selectiva y de forma no covalente con nicotinamida 54

adenina dinucleótido, o sea una coenzima implicada en muchas reacciones biosintéticas y redox, mientras que se ha asociado a procesos biológicos en la reacciones y vías químicas de la glucosa. Esta proteína está asociada a la bacteria Bacillus cereus, la cual pertenece al género Bacillus. Algunos estudios han demostrado que este microorganismo produce al menos siete tipo de toxinas, debido al consumo de arroz, verduras crudas o carne. Se trata de alimentos contaminados, que provocan directamente el vómito, dolor abdominal, diarrea acuosa, tenesmo rectal, náuseas, algunas complicaciones derivadas de la infección por B. cereus pueden incluir gangrena, meningitis séptica, abscesos pulmonares, endocarditis e infecciones sistémicas graves (Tajkarimi et al., 2010). 5. Proteína identificada: Cluster of Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase OS=Streptococcus

pyogenes

serotype

M1

GN=gap

PE=3

SV=2

(sp|P0C0G7|G3P_STRP1); Número de acceso: sp|P0C0G7|G3P_STRP1 [18]; Peso molecular: 36 kDa; Porcentaje de cobertura: 92%; Taxonomía: Streptococcus pyogenes serotype M1. Procedencia o Función de la proteína: Esta proteína está vinculada con la bacteria Gram positiva Streptococcus pyogenes, que a su vez se encuentra en casos de faringitis estreptocócica, fiebre escarlata y fiebre reumática (Madigan, 2009, p. 781). 6.2.2 Interpretación de los resultados Las proteínas identificadas de las muestras de placa dental acumulada en los órganos dentales de la mandíbula, permiten agrupar la información en dos niveles de información, en proteínas estructurales y proteínas asociadas a microorganismos. 55

-

Proteínas estructurales. Se logró identificar albúmina sérica considerada como la principal proteína del plasma sanguíneo y regula la presión osmótica coloidal de la sangre, además de transportar zinc a plasma.

-

Proteínas asociadas a microorganismos. En primera lugar, es preciso señalar que la bacteria Streptococcus sanguinis pertenece al grupo de microorganismos comensales que se adhieren a la película en la superficie del esmalte. Este colonizador inicial permite la coagregación con otras bacterias para la conformación de la microbiota oral y puede estar involucrado en conjunto con otras bacterias de la enfermedad periodontal, considerando que el nivel de retracción del alveolo va de los 3 a los 6 mm, se puede afirmar que el individuo sufría de inflamación de las encías y ligeros sangrados, lo que indicaría la presencia de albumina sérica (ver figs10 y 11).

Figura 10 . Vista general de la region palatina, señalando la placa dental calcificada en primer molar izquierdo

56

Figura 11. Presencia de sarro en superficie lingual y se señal el nivel de exposicion de la raiz por causa de la retraccion alveolar.

Por otro lado, se identificó una proteína vinculada con la bacteria Nocardioides sp, la presencia de esta bacteria podría deberse a un tipo de contaminación del suelo ya que no tiene una relación directa con la microbiota oral. Finalmente, la proteína asociada a la bacteria Bacillus cereus está relacionada con la ingesta de alimentos contaminados, y provoca en el individuo vómito, dolor abdominal, diarrea acuosa, tenesmo rectal y nauseas. Este tipo de intoxicación pondría en riesgo la capacidad metabólica de los nutrientes, por lo que se vería comprometido a obtener ese tipo de vitaminas y minerales de otro parte. La presencia de estrías longitudinales a lo largo de la diáfisis de ambos fémures, puede estar asociada con este tipo de intoxicación por alimentos echados a perder (ver figs. 12 y 13).

57

Figura 12 y 13. Vista anterior de fémur izquierdo y derecho, en rojo y con líneas discontinuas se señala la presencia de periostosis a lo largo de la diáfisis de ambos huesos; a la derecha, detalle de las estrías longitudinales en fémur derecho.

58

7. Consideraciones Finales El tema central de la investigación radica en tratar de reconocer la utilidad del análisis de proteínas de la placa dental para el estudio de sociedades antiguas. De acuerdo con los resultados obtenidos en este primer trabajo, la información se puede agrupar en cuatro niveles: medio ambiente, dieta, proteínas del humano (hospedero) y aspectos socio-culturales (ver fig. 14). Dichos elementos están fuertemente correlacionados, caracterizan al individuo y posiblemente, al resto de la población.

Figura 14. Tipo de información obtenida a partir del análisis de proteínas de la placa dental. Los cuatro niveles dan la pauta para poder sustentar la hipótesis de la investigación, la cual establece que es posible mediante el análisis de proteínas, 59

conocer la composición bioquímica de la placa dental, así como la respuesta del sistema inmune del individuo (hospedero) e inclusive conocer la diversidad microbiana oral. Ante el cuestionamiento de que si ¿es posible reconocer algún tipo de enfermedad que pudiera haber afectado la salud de los individuos que integran esta investigación? Podemos afirmar que los resultados dan cuenta de que ambos individuos podrían haber sufrido de una infección de las vías respiratorias, hecho que correspondería a lo propuesto por Márquez y Meza en 2015, quienes mencionan que los padecimientos más comunes en el Hospital San Juan de Dios eran las infecciones gastrointestinales y respiratorias (Márquez y Meza, 2015). De igual manera concordaría con la aparición de brotes de influenza a inicios del siglo XX que podrían haber surgido a finales del siglo XIX (Cano Sánchez, 2013). A lo anterior, podemos sumar la presencia de bacterias asociadas a la ingesta de alimentos echados a perder coloca la situación precaria y el acceso diferencial a los recursos en los diferentes sectores de la población; además de evidenciar que la inclusión de nuevos alimentos y diferentes modos de preparación posiblemente causaba de manera inmediata problemas de infección estomacal. Los resultados favorecen entonces cuestionamientos más que respuestas claras: por ejemplo, si los enfermos recibían comida podrida, y en este caso, de dónde provenía la comida; o cuáles eran los métodos de cocción y almacenamiento. Por lo tanto, es posible que las reacciones periósticas a lo largo de las diáfisis de los huesos largos estén relacionadas con los vómitos o las infecciones estomacales que provocaría la comida echada a perder.

60

Igualmente, se identificaron proteínas asociadas a dos especies de mamíferos, Cyclopes didactilus y Tapirus terrestres. Aunque ambos habitan actualmente regiones de Centroamérica y Sudamérica, pudieron haber formado parte de la alimentación al final del siglo XIX. Es particular la presencia de proteínas asociadas a Cyclopes didactilus, si bien se trata de un oso hormiguero pertenece al superorden de Xenarthra donde se encuentran los armadillos, por lo que podría tratarse de este animal. Asimismo, la identificación de proteínas asociadas a la comunidad microbiana oral permite explorar la presencia de bacterias no patógenas y profundizar en torno de la capacidad adaptativa no sólo de los microorganismos comensales, sino también del sistema inmune del humano. Se ha demostrado que grupos geográfica y biológicamente distintos, la composición del microbioma oral es diferente debido a la alimentación y los factores socioculturales de cada población. La llegada de los grupos europeos y africanos en el siglo XVI constituye uno de los eventos que más impacto tuvo en la historia de la humanidad. Los cambios socioculturales y biológicos afectaron principalmente a la población nativa, sea por los conflictos bélicos durante el proceso de conquista, que por el sometimiento religioso que implicó la evangelización, y el deficiente sistema hidráulico que propiciaba la concentración de materia tóxica de la ciudad. Los individuos que sobrevivieron al exterminio de los colonizadores europeos no lograron desarrollar un complejo inmunológico adecuado, dejando escapar ciertos agentes patógenos de la vigilancia inmunológica.

61

Igualmente, el cambio climático y las sequias favorecieron el surgimiento de nuevas patologías, como los brotes epidémicos de tifo, cólera, influenza, paludismo, tuberculosis, sífilis y otras enfermedades como el cocoliztli o matlazahuatl. Por consiguiente, los mecanismos microadaptativos se revelaron insuficientes. Los dos individuos incluidos en la investigación vivieron en un periodo sumamente agresivo, en el que la vulnerabilidad a contraer una enfermedad era muy alta. El siglo XIX no fue un periodo de tranquilidad o estabilidad económica y política, en efecto los rezagos de la guerra independiente de 1821, los conflictos bélicos prerevolucionarios, así como los brotes epidémicos de tifo y cólera impactaron en la población más vulnerable. A pesar de una perspectiva de vida desfavorable, los individuos logran llegar a la etapa adulta, lo que indica una capacidad adaptativa para enfrentar la mayor parte de las fatalidades. Para concluir, los datos obtenidos para esta investigación destacan por ser los primeros en el estudio de proteínas en México. Este trabajo inicial es un paso preliminar para la incorporación de nuevas metodologías que colaboren en el campo de la bioarqueología, evolución, ontogenia y otras subdisciplinas antropológicas. La diversidad de información que puede recuperarse de la placa dental, abre la ventana a nuevas posibilidades de estudio e incluso se puede impulsar al desarrollo de una línea de investigación que retome la interacción entre los microbios y el humano, conocer más acerca de los modos y estilos de vida, las condiciones de salud y el diagnóstico diferencial, no sólo en épocas antiguas sino en modernas, puesto que los estudios sobre de qué nos enfermamos, qué comemos o cómo nos adaptamos a nuestro entorno en la actualidad, nos ayudaría a descifrar parte del pasado. 62

Lista de figuras Figura 1. Composición de la placa dental.

Figura 2. Representación gráfica de los elementos óseos que integran el entierro 16.

Figura 3. Representación gráfica de los elementos óseos que integran el entierro 23. Figura 4. Vista lateral de región facial. Las líneas discontinuas indican el área de inflamación del tejido óseo en región adyacente de la cavidad nasal y crecimiento no diferenciado de hueso en la parte cercana a la sutura intermaxilar del lado derecho. Figura 5. Vista a detalle del proceso infeccioso cercano a la espina nasal del lado derecho. Figura 6. Vista lingual de órganos dentales con presencia significativa de placa dental supragingival. Figuras 7. Vista vestibular de órganos dentales con presencia significativa de placa dental supragingival. Figura 8 y 9. Vista bucal y vestibular de órganos dentales inferiores con presencia de placa dental y resorción alveolar significativa. Figura 10 . Vista general de la region palatina, señalando la placa dental calcificada en primer molar izquierdo Figura 11. Presencia de sarro en superficie lingual y se señal el nivel de exposicion de la raiz por causa de la retraccion alveolar. Figura 12 y 13. Vista anterior de fémur izquierdo y derecho, en rojo y con líneas discontinuas se señala la presencia de periostosis a lo largo de la diáfisis de ambos huesos; a la derecha, detalle del estrías longitudinales en fémur derecho. Figura 14. Tipo de información obtenida a partir del análisis de proteínas de la placa dental.

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Anexo (Protocolo de extracción de proteína mediante el método FASP modificado por la Dra. Christina Warinner) A. TOMA DE MUESTRA (DÍA 1) 1. Si las muestras están intactas (no molidas) envolver las muestras en hojas de aluminio (al menos 4 capas de aluminio) a. Mortero. Preparar el mortero con una capa de parafilm y dos capas de aluminio, envolver la mano del mortero con una hoja de aluminio. Colocar la muestra dentro del mortero y aplastar con la mano del mortero. Continuar hasta que la muestra se ha pulverizado. Pesar y colocar en un tubo. b. Opción con martillo. Preparar una superficie dura con una capa de parafilm y colocar dos hojas de aluminio en la superficie. Cubrir la cabeza del martillo con hojas de aluminio. Colocar la muestra preparada en la superficie y golpear con el martillo hasta que se encuentre pulverizada. Pesar y colocar en tubo. c. Opción con cureta de dentista. Cubrir una rejilla con hojas de aluminio donde se pueda colocar el tubo eppendorf, colocar en la parte externa del tubo dos hojas de aluminio en forma de cono e insertar el tubo dentro del cono. Iniciar con el raspado del cálculo cuidando que la muestra no pueda saltar. Pesar y colocar en el tubo. Si las muestras tienen una granulación aceptable, si éstos no exceden a tres milímetros, puede ser considerado como aceptable. Si no tienen que ser procesados o disminuir su tamaño por la elección de mortero o martillo. 2. Peso target por muestra para el análisis: 30-70mg. Pesos de la muestra. Este procedimiento se lleva a cabo en una cuarto específico para la extracción de ADNa. Pesar cada muestra y separar las sub-muestras. B. DESCALCIFICACIÓN (DÍA 1) 1. Para aproximadamente 30-70 mg de la muestra añadir 1mL 0.5M EDTA. Cerrar las tapas herméticamente (utilizar tubos de bloqueo seguro si es posible), envolver las muestras con aluminio y colocar en posición horizontal con cinta en el

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rotador, con ajuste de nivel bajo durante la noche (12-24 hrs) a temperatura ambiente. Notas: 1 mL 0.5M EDTA es añadido en cada muestra y mezclada en vórtex por algunos segundos, de acuerdo a la coloración de las muestras y el contenido de las partículas minerales es posible centrifugar, todo esto a temperatura ambiente. Si las muestras presentaban una coloración café o marrón se puede hacer una serie de lavados con 200 microlitros de EDTA, hasta que el producto sea más homogéneo, puede realizarse hasta cuatro serie de lavados. Las muestras se quedan en rotatorio hasta por tres días aprox. Los sobrenadantes y las muestras se almacenan. 2. Centrifugar a máxima velocidad (13-14krpm) en una centrifuga de mesa por 10 minutos. 3. Transferir el sobrenadante en un tubo Falcon de 15mL. Añadir 9 mL de UA 8M para hacer un total de 10 mL. 4. Resuspender el pellet en 1 mL (el protocolo dice 300 μl) de solución de lisis. Mezclarlo en el Vortex. Nota: El sobrenadante y el pellet son preparados de manera independiente y posteriormente sus fracciones son combinadas en el paso C-3 para el análisis subsecuente. C. EXTRACCIÓN Y DIGESTIÓN (DÍA 2) 1. Tratamiento del sobrenadante (para todos los tejidos). a. Transferir el sobrenadante/solución UA en incrementos de 4mL a la unidad de filtración Amicon YM-10. Centrifugar entre 15-20 minutos una velocidad máxima (4000 rpm) hasta que toda la solución atravesó completamente. b. Después de que todo el sobrenadante ha pasado a través del Amicon, añadir 4mL de UA a la unidad de filtración y centrifugar de nuevo. Descartar el sobranadante. Colocar a un lado la unidad de filtrado para usarlo en el paso C-3 a.

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Inicialmente, debe transferirse de la solución del sobrenadante/UA 4 mL a la unidad de filtrado Amicon YM-10, y centrifugado alrededor de 15 a 20 minutos a máxima velocidad (4000 rpm) hasta que la solución ha pasado a través del filtro. Esto puede llevarse a cabo en incrementos de 4 mL hasta terminar la solución del tubo. 2. Homogeneización del pellet y resuspensión a. Para muestras de hueso y dentina: i. Colocar los pellets de hueso/dentina resuspendida en thermoblock a 80°C y agitar por 2 horas hasta gelatinizar. ii. Centrifugar los pellets a máxima velocidad (13-14 krpm entre 10 y 20 minutos, retirar y almacenar a +4°C hasta que sea requerido. NO DESECHAR EL SOBRENADANTE b. Para muestras de cálculo: i. Homogeneizar los pellets de cálculo con una microaplastador, puede ser operado manualmente o mediante un dremel eléctrico a baja velocidad ii. Mezclar el pellet resuspendido en el vortex iii. Colocar los pellets resuspendidos en thermoblock a 95°C y agitar entre 5 y 10 minutos iv. Centrifugar los pellets a máxima velocidad (13-14krpm) entre 10-20 minutos. Separar y almacenar a +4°C hasta que sean requeridos. NO DESECHAR EL SOBRENADANTE. Los pellets fueron colocados en thermoblock a 95-100°C alrededor de 15 minutos y luego pasaron a la centrifuga por 10 min x 4000 rpm 3. Digestión de proteína (para todas las muestras) a. Añadir 2mL de solución de UA a las unidades de filtración del paso C1-b. b. Transferir el sobrenadante de los pellets de la muestra del paso Transfer C-2aii/biv a la solución UA en la unidad de filtración. Cerrar y mezclar en el vórtex. Colocar la 82

unidad de filtración en la centrifuga y mezclar a máxima velocidad (4000 rpm) entre 15 y 20 minutos. Desechar el flujo continuo. c. Añadir 2mL of UA a la unidad de filtrado y centrifugar a máxima velocidad (4000 rpm) por 15 min. d. Descartar el líquido remanente del tubo de recolección e. Añadir 500 μl de CAA, mezclarlo en el vórtex. Colocar los tubos en un racks y cubrirlos con aluminio para protegerlos de la luz, se deben dejar incubando en oscuridad total sin movimiento durante 20 minutos f. Centrifugar las unidades de filtrado a máxima velocidad (4,000 rpm) 10 min. Desechar el sobrante. g. Añadir 1mL de UA a la unidad de filtro, mezclarlo en el vórtex y centrifugarlo a máxima velocidad (4,000 rpm) por 15 min. Desechar el sobrante. Repetir este paso. h. Añadir 1mL de ABC a la unidad de filtrado y mezclarlo en el vórtex, centrifugarlo a máxima velocidad (4,000 rpm) por 10 min. Desechar el sobrante. Repetir este paso. i. Añadir 100ul de ABC, mezclarlo en el vórtex. Tomar una alícuota de un 1uL para la cuantificación de proteína en Qubit. Nota: El límite para la detección de proteína en Qubit es 1μg/mL, de tal manera que se necesitan de al menos 200ng para que la proteína sea detectable. j. Añadir 200 μl de ABC. Checar el pH (7.5-8.0). Si el pH es incorrecto, ajustar con HCl o hidróxido de amonio. k. Añadir 4uL de solución de tripsina (0.5ug/μl), mezclarlo en el vórtex. l. Envolver las unidades de filtrado con parafilm; envolver la parte superior como la inferior, mezclarlo en el vórtex. m. Incubar las unidades de filtrado a 37°C toda la noche (el parafilm es para prevenir la evaporación). D. ELUCIÓN DE PÉPTIDO (DÍA 3) 1. Adicional a la digestión de tripsina

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a. Por la mañana, remover el parafilm y añadir 2μL (1μg) de la solución de tripsina a los filtros. Cubrir la tapa de nuevo con parafilm nuevo y continuar con la incubación por 6 horas. 2. Recuperación de péptidos a. Remover el parafilm Transferir las unidades de filtro a un nuevo tubo de recolección (tubos de 15 mL ordinarios). b. Centrifugar las unidades de filtrado a máxima velocidad (4,000 rpm) por 10 min. NO DESECHAR EL LÍQUIDO. AHÍ ESTAN LOS PÉPTIDOS. c. Opcional. Tomar una alícuota de 1μL para la cuantificación en Qubit. Nota: La concentración de péptidos puede caer a los límites detectables. d. Añadir 500 μl de ABCal filtro mezclarlo en el vórtex y centrifugar las unidades de filtrado a máxima velocidad (4,000 rpm) por 10 min. e. Transferir todo el líquido que pasó el filtro (approx 800μL) a un tubo eppendorf de 1.5mL. Nota: el filtro podría tener una fuerte coloración. f. Acidificar el líquido resultante con TFA (CF3COOH) para una concentración final 0.2-0.8% y un pH < 2. Dejar a un lado para el paso E-7. Para hacer lo siguiente añadir 30 μL de solución TFA (10% TFA). El ácido TFA es sumamente tóxico y debe ser tratado en una campana de extracción adecuada. Checar el pH usando tiras de pH. Si el pH es >2, ajustar con TFA adicional hasta que sea