Introducción a la identificación de algunos Fungi y Algae mediante caracteres morfológicos e Identificación molecular de Procariotas y Algae utilizando el Ribosomal Database Proyect, Barcode Of Life, Algae DataBase y National Center For Biotecnology Information

Informe N°2 Introducción a la identificación de algunos Fungi y Algae mediante caracteres morfológicos e Identificación molecular de Procariotas y Algae utilizando el Ribosomal Database Proyect, Barcode Of Life, Algae DataBase y National Center For Biotecnology Information Andrei Gonzales Iturri Resumen Los

caracteres

morfológicos

y fisiológicos

son

expresiones

fenotípicas

importantes para la identificación de caracteres distintivos entre los grupos y para los mismos individuos. Las secuencias del gen 16S rRNA son la forma más conocida y utilizada para la identificación de Bacterias y Archae siendo un Cronómetro Molecular que nos permite trabajar en la Sistemática. Se Utilizó el Ribosomal Data Proyect, Barcode Of Life, Algae Database y National Center For Biotecnology Information para poder identificar y obtener información sobre tres secuencias de bacterias a nivel de Género: Helicobacter sp., Clostridium sp. y Mycobacterium sp. con un nivel de similitud de 98,0%, 96,6% y 96,9% respectivamente y una especie de Algae Characiosiphon rivularis con un nivel de similitud de 100%, todos con orígenes desconocidos. Se sugiere utilizar la identificación morfológica para organismos macroscópicos y la identificación molecular para organismos microscópicos. Posiblemente en un futuro se pueda definir la especie en bacterias gracias a las similitudes entre las secuencias de genes del 16S rRNA y de ésta forma se tendrá mayor claridad en la filogenia;dichas herramientas online citados anteriormente suelen ser muy útiles para llevar a cabo la identificación, sin embargo deberían gestionar el ingreso de información en cuanto a las secuencias para evitar datos irreales en la base de datos, se concluye que el uso de 16S rRNA para análisis filogenéticos son los confiables hasta donde se reportaron, con comienzos a dejar en el pasado a la clasificación por pruebas bioquímicas. Palabras Clave: Databases, Secuencias, Datos moleculares, especie bacteriana. Introducción Los ácidos nucleicos y las proteínas, macromoléculas comunes a todos los seres vivos, cambian con el tiempo. Por ello, pueden considerarse como cronómetros moleculares o documentos de la historia evolutiva (Rodicio y Mendoza, 2004).

El uso de la secuencia de gen del 16S rRNA para estudiar la filogenia y taxonomía de bacterias ha sido utilizado más comúnmente por varias razones. Por su presencia en casi todas las bacterias y archae, a menudo existente como una familia multigénica, u operones. La función del 16S rRNA no ha cambiado en el tiempo lo que sugiere que los cambios de secuencia aleatoria son una medida más precisa de tiempo (evolución). El tamaño del 16S rRNA (1.500 bp) es suficientemente grande para los propósitos de informática y minimiza las fluctuaciones estadísticas. La conservación en estructura secundaria puede servirde ayuda en las comparaciones, aportando una basepara el alineamiento preciso.Uno de los usos potenciales más atractivos de 16S rRNA es que las secuencias de genes mediante la informática nos facilita la identificación de género y especie para datos que no han encajado en los perfiles bioquímicos reconocidos, para las cepas que generan sólo una "baja probabilidad" o identificación "aceptable", de acuerdo a los sistemas comerciales, o los taxones que rara vez se asocian con las enfermedades de infección humana (Janda y Abbott 2007 y Rodicio y Mendoza 2004). Los ARNr 16S pueden caracterizarse en términos de secuencia parcial, marcado in vivo, y purificado, se trata con la enzima ribonucleasa T1. Los fragmentos generados se separan,

determinándose

posteriormente la secuencia de todos aquellos que incluyan al menos seis nucleótidos (amplificación del gen),determinación de la secuencia de nucleótidos del amplicón y las secuencias de la colección de fragmentos correspondientes a diferentes bacterias se alinean y comparan, utilizando programas informáticos,para calcular finalmente los coeficientes de asociación.En estas circunstancias, la identificación molecular basada en el análisis del ARNr 16S (o del gen que lo codifica) se justifica al representar una ventaja tanto en tiempo como en precisión, llegando incluso a competir de manera favorable con otras técnicas rápidas y eficaces, como las inmunológicas(Rodicio y Mendoza, 2004). Enalgas se inicia cuando la enzima Ribulosa 1-5 bifosfatocarboxilasaoxigenasa (RuBPC) realiza la carboxilación del CO2siguiendo una serie de procesos hasta llegar a sintetizar carbohidratos. Siendo RuBPC la base molecular para poder identificar algas. El objetivo del presente trabajo es identificar molecularmente secuencias en distintas herramientas online a través de la web. Específicamente se desea Identificar 3 secuencias de bacterias y una de Algae. Por último ver las ventajas y desventajas que nos brindan dichos databases.

Métodos Para la identificación de algunos hongos y algas se consiguieron muestras del Jardín Botánico La PazBolivia; para las algas se recoló agua de la laguna y algunas charcas, para algunas muestras de hongos se los localizó en lugares húmedos cerca de la base de árboles y cerca a algunas paredes. Con ayuda del microscópio se tomaron parte de las muestras para observar el tipo de vida que llevan estos organismos, ya sea de vida libre, colonial, pseudofilamentosa, filamentosa, pseudotejido o tejido. Para la identificación de las bacterias, primero se obtuvo las secuencias de los tres organismos, en este caso de bacterias desconocidas que son la serie user_24 del comprimido descargado en

https://sites.google.com/site/biologiabot142/. Una vez obtenidas las secuencias se accede a la página http://rdp.cme.msu.edu. Que es RibosomalDatabase Project (RDP) una herramienta online que nos ayudará a identificar las secuencias para mostrarnos la clasificación en la que se encontrarían los organismos. Una vez que ingresamos a la página web ingresamos a Classifier, en dicha sección se encuentra un cuadro donde colocaremos la secuencia que deseamos analizar ya sea subiéndolo en un archivo de block notes, wordpad o Word, o simplemente copiando ahí la secuencia manualmente; donde dice Choose a gene: colocar 16S rRNA training set 9, por último colocar “submit”. Luego, se copiará la clasificación que nos dará desde posibles opciones de Dominio a Especie. Volvemos a la página principal y entramos a Sequence Match nuevamente pegamos la secuencia pero antes colocar de esta forma las distintas opciones: Strain: Both; Source: Isolates; Size: >1200; Quality: Good; Taxonomy: Nomenclatural; KNN matches: 5 Por último colocar “submit”; ahora seleccionamos “viewselectablematches”, de ésta forma nos citará 5 posibles opciones con sus respectivos porcentajes de semejanza a nuestra secuencia, luego tomamos en cuenta esas 5 opciones para reportar, si cambiamos el KNN matches a 1, nos mostrará sólo la opción que más se asemeja a nuestra secuencia; reportar. Finalmente volvemos la página principal e ingresamos a HierarchyBrowsere, con el cual identificaremos a las cianobacterias y las familias existentes, para luego con esta información conseguir artículos sobre el género encontrado y así poder citarlas. Esta información puede ser encontrada con el NCBI (NationalCenter ForBiotecnologyInformation), en la página: http://www.ncbi.nlm.nih.gov, ingresando el nombre del organismo identificado, presione“search”,explore los resultados y cite los artículos. Para la identificación del alga obtenemos las secuencias pero esta vez basadas en el gen de la Ribulosabifosfatocarboxilasa, así ingresamos a la página del Barcodeof Life Data System, en la página: http://www.boldsystems.org/index.php/Login/page e ingresamos a la herramienta superior “Identification” para poder identificar nuestra secuencia; Nos aparece una nueva ventana con tres pestañas justo debajo de “IdentificationRequest”, escogemos la prestaña que dice “PlantIdentification”, debido a que los otros son para animales y hongos; colocamos la secuencia en el cuadro y apretamos “submit”.Así obtenemos los resultados de clasificación de nuestra secuencia; observamos dos gráficos que utilizaremos para reportar uno a la izquierda que dice “Score Summary” y el otro que dice “E-valueSummary”; Más abajo se encuentra una tabla con todas las especies que más se asemejan a nuestra secuencia por orden de similitud; identificamos el que más se asemeje al nuestro y lo reportamos junto a los otros cuatro que le seguían. Queremos identificar la especie, entonces ingresamos al NCBI mencionado anteriormente; una vez que ingresamos podemos ver a la izquierda unas opciones en columna, seleccionamos “DNA & RNA”, aparecerá una nueva ventana llamada Databases, bajamos un poco y seleccionamos “GenBank”, en una

pestaña en la parte superior izquierda dice GenBank, le hacemos click y seleccionamos “Blast”, abajo donde dice Basic Blast seleccionamos la opción “nucleotideblast”, nos aparece una nueva ventana donde colocaremos la secuencia en el cuadro debajo de donde dice FASTA sequence, luego donde dice Database nos aseguramos de que diga “Others”, luego, presionar “Blast”. Primero se observará una Gráfica, más abajo se encuentra una tabla con todas las especies que se asemejan a nuestra secuencia; podemos ver la similitud en la columna de “Querycover”. Luego para ver la distancia entre los organismos más cercanos se abrirá dos nuevas ventanas ingresando a “Distant tree results” y “Taxonomy report” que se encuentran en la parte superior de esa página, la primera nos lleva a una nueva venta donde nos muestra un Cladograma derelaciones filogenéticas de nuestro organismo y la segunda es para poder buscar más información acerca del data de taxonomía. Resultados

Utilizando el libro de los editores Wehr y Sheath (2003) se utilizaron claves para poder identificar las algas en el grupo grande al que pertenecen. Se lograron encontrar diatomeas de vida libre, algas verdes cocoideas y diatomeas coloniales, filamentos de Spyrogira sp. y Ulothrix, sp., pseudotejido en algunas clorófitas y tejido de chara. En muestras fijas de laboratorio se logró ver pseudofilamentos que eran conformadas por diatomeas marinas, también se logró ver la disposición de diferentes tejidos en hongos, y formas coloniales de volvox, en general para ser observados de mejor forma éstas muestras estaban teñidas con distintas tinciones de colores celeste, rojo, azul, fucsia, magenta, naranja oscuro. Clasificación de Bacterias Para la Clasificación de bacterias se usó el “classifier” de Wang et al. (2007): Classifier:

RDP NaiveBayesianrRNAClassifierVersion 2.6, Sep 2013

TaxonomicalHierarchy:

RDP 16S rRNA training set 9

Query File:

classifier_seq_upload3436004268925576147.FASTA

QuerySubmit Date:

SatApr 19 10:32:21 EDT 2014

Classifier Para la Primera Bacteria del set 24 de secuencias: » » Domain Bacteria (1) » » » phylum "Proteobacteria" (1)

» » » » class Epsilonproteobacteria (1) » » » » » order Campylobacterales (1) » » » » » » family Helicobacteraceae (1) » » » » » » » genus Helicobacter (1) Desde un 80% de confianza se tienen estos resultados. Sequence Match Para el Sequence Match y Hierarchy Browser se utilizó el RDP de Cole et al.(2014): S000375740

0.980 1415 Helicobacter sp. 'B52D Seymour'; B52D Seymour; CCUG

S000427361

0.904 1361 Helicobactersuncus; Kaz-2; AB00614829261; M88144

S000436861

0.905 1333 Helicobacter sp.; B8A Seymour; M88146

S000651603

0.950 1407 Helicobacteranseris (T); MIT 04-9362; DQ415545

S000651604

0.906 1410 Helicobacter brantae (T); MIT 04-9366; DQ415546

Con un nivel de confianza de 95% estos son los 5 candidatos que se asemejan más a la secuencias siendo la Helicobactersp. Con un 98% de semejanza, la siguiente sería Helicobacteranseriscon un 95% de certeza. El Helicobacter pylori es una de las especies más conocidas del género, siendo una bacteria Gramnegativa patógena colonizadores del epitelio del estómago humano y otras especies, es ureasa, catalasa, con oxidasa positiva, forma espiral con 3 a 5 flagelos en la parte polar que son usados para su desplazamiento; la mayoría de las cepas de H. pylori expresan factores de virulencia que han evolucionado para infectar la célula huésped por distintas vías de señalización, por lo menos la mitad de la población del mundo se encuentra infectada por H. pylori con o sin síntomas, parecen ser persistentes en el hospedador durante años,los efectos de las infecciones por el género Helicobacter no se limitan al sistema gastrointestinal y pueden afectar a la reproducción, el desarrollo de cánceres en órganos gastrointestinales y órganos remotos, tales como el de mama, las respuestas a las vacunas, alta resistencia a antibióticos y otras áreas de investigación. Actualmente la ciencia están buscando formas de poder erradicar el género Helicobacter como agentes patógenos del ser humano, de ésta forma genera una alarma a nivel mundial (Kusterset al.2006; Chichlowski 2009 y Wroblewskiet al. 2010). Classifier Para la Segunda Bacteria del set 24 de secuencias:

» » domain Bacteria (1) » » » phylum Firmicutes (1) » » » » class Clostridia (1) » » » » » order Clostridiales (1) » » » » » » family Ruminococcaceae (1) » » » » » » » genus Clostridium IV (1) Desde un 80% de confianza se tienen estos resultados. Sequence Match S000060294

0.837 1384 unidentified bacterium ZF3; AJ404681

S000127873

0.737 1202 Clostridiumsporosphaeroides (T); DSM 1294; X66002

S000416648

0.966 1398 bacterium Irt-JG1-53; AJ295664

S000436479

0.746 1264 Clostridiumsporosphaeroides; M59116

S002441763

0.811 1336 Clostridium sp. BS-1; FJ805840

Con un nivel de confianza de 95% estos son los 5 candidatos que se asemejan más a la secuencias siendo la Clostridiumsp. (bacterium) con un 96,6 % de semejanza, la siguiente sería una bacteria indefinida con un 83,7 % de certeza. Los primeros registros del género Clostridium (bacilos anaerobios)fueron atribuidos a generación de la diarrea en humanos, el espectro de infección en pacientes susceptibles en tratamiento con antibióticos está aumentando en frecuencia y gravedad; sin embargo, existen muchos métodos de tratamiento que están emergiendo, incluyendo la terapia fidaxomicina, el tratamiento con anticuerpos monoclonales, y el trasplante de la microbiota fecal, que han demostrado ser prometedores para el tratamiento de la infección por C. difficile, las enfermedades más comunes del género Clostridiumson el botulismo, tétanos,enteritis necrótica infecciones de heridas, edemas enfisematosos o gangrena caseosa, entre otros.(Harvey et al. 2002; Rohlke y Stollman 2012 y Khanna y Pardi 2012) Classifier Para la Tercera Bacteria del set 24 de secuencias: » » domain Bacteria (1) » » » phylum "Actinobacteria" (1) » » » » class Actinobacteria (1) » » » » » subclass Actinobacteridae (1) » » » » » » order Actinomycetales (1)

» » » » » » » suborder Corynebacterineae (1) » » » » » » » » family Mycobacteriaceae (1) » » » » » » » » » genus Mycobacterium (1) Desde un 80% de confianza se tienen estos resultados. Sequence Match S000000246

0.961 1342 Mycobacterium sp.; IWGMT 90160; X88911

S000461440

0.956 1416 Mycobacteriumnebraskense (T); UNMC-MY1349; AY368456

S001575461

0.961 1403 Mycobacteriumnebraskense; ATCC BAA-837; GQ153277

S001875273

0.969 1379 Mycobacterium sp. 20612A; GU358074

S003257784

0.959 1320 Mycobacterium sp. 18-20.9 AW; HE575968

Con un nivel de confianza de 95% estos son los 5 candidatos que se asemejan más a la secuencias siendo

el

Mycobacteriumsp.

Con

un

96,9

%

de

semejanza,

la

siguiente

sería

una

Mycobacteriumnebraskense con un 96,1 % de certeza. El género Mycobacterium enfermedades conocidas como tuberculosis, lepra, infecciones cutáneas por micobacterias no tuberculosas tienen una incidencia cada vez mayor. En pacientes inmunocompetentes, por lo general siguen un traumatismo local.No presentan una pared celular conocida entre las Gram, pueden sobrevivir a largas exposiciones a ácidos (pH 1), bases (pH 7), ráfagas oxidativas, detergentes, siendo altamente resistentes a los antibióticos, los tratamientos que se usan actualmente no son muy efectivos por lo que se están realizando muchas pruebas para ver los valores de resistencia extrema que sobrellevan, sin embargo se lograron algunas alternativas para curar las lesiones con una combinación de claritromicina, ciprofloxacina y doxiciclina; y para el caso de la tuberculosis se usan Isoniacida, Rifampicina, Pirazinamida, Etambutol y Estreptomicina entre otros. (Vandalet al. 2009;Wongkitisophonet al. 2011;Cheunget al. 2012). Ver en anexos las especies de cada grupo sacado en Hierarchy Browser Clasificación del Algae » » domain Eukarya (1) » » » phylum "Chlorophyta " (1) » » » » class Chlorophyceae (1) » » » » » order Chlamydomonadales(1) » » » » » » family Characiosiphonaceae (1)

» » » » » » » Genus Characiosiphon (1) » » » » » » » » SpeciesC. Rivularis (1) Así con un E-value de 0 y un 100% de similitud a la secuencia predeterminada en el NCBI en “NucleotideBlast”del autor Verghese, et al. (2006). Characiosiphonrivularis strain UTEX LB 1763 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast GenBank: EF113419.1

Fig. 1 Muestra la Similitud en Porcentaje (%) que tiene la secuencia del alga a uno que ya está determinado en el Database del Barcode of Life.

Fig. 2 Muestra el E-Value que comparte con la relación de la similitud entre las secuencias Tabla 1. Muestra las especies con mayor similitud a la secuencia del alga analizado en el Data base del Barcode of Life. Phylum

Class

Order

Family

Genus

Species

Similarity

Chlorophyta

Chlorophyceae

Chlamydomonadales

Characiosiphonaceae

Characiosiphon

Rivularis

100

Chlorophyta

Chlorophyceae

Chlamydomonadales

Characiosiphonaceae

Characiochloris

Sasae

96,63

Chlorophyta

Chlorophyceae

Chlamydomonadales

Characiosiphonaceae

Lobocharacium

coloradoense

95,62

Chlorophyta

Chlorophyceae

Chlamydomonadales

Characiosiphonaceae

Characiochloris

Acuminata

93,87

Chlorophyta

Chlorophyceae

Volvocales

Chlamydomonadaceae

Chlamydomonas

Reinhardtii

91,29

Fig. 3 Muestra la completa similitud de la secuencia que se desconocía con la almacenada en la base de datos de Barcode of Life

Fig 4. Muestra un pequeño Cladograma que muestra la relación filogenética de la secuencia analizada con en el NCBI mostrando la especie Characiosiphonrivularis.

Con respecto a Characiosiphonrivularis es la única especie descrita hasta el momento del género,tiene una estructura coanocitica con forma de un saco, posee un a vacuola central larga y una capa periférica delgada de citoplasma, posee una pared de talo fibrilar compuesta de celulosa, es una especie colonizadora de ambientes fríos donde fue descrita en 1936 por Iyengar, recolectada en el suelo de los Himalayas (India) y en la China en 1975, siendo una especie de agua dulce, también se encontraron algunos ejemplares en la Antártida el 2008, se ha encontrado muy poca información sobre dicha especie en cuanto a sus aportes a la medicina o ecología en condiciones naturales, lo que se sabe en general es su morfología y secuencias de DNA (Iyengar 1936; Stewart 1978; Payne y Stewart 1988; Weber et al. 2009; Iyer 2012 y Guiry M. y Guiry G. 2014). Discusiones Para la identificación de organismos con la ayuda de caracteres morfológicos se debe eventualmente se utilizar y ver la tinción gram, morfología celular, motilidad, tolerancia al oxígeno, morfología en su tipo de vida (colonial, en tejidos, etc.), en algunos casos una tipificación bioquímica, perfiles de proteínas celulares, etc. en cambio a través de la identificación molecular tenemos la hibridación de DNA, 16s rRNA, utilización del PCR, análisis del citocromo, etc. La identificación morfológica es una forma directa y en gran parte la primera opción que uno utiliza para poder determinar que individuo es, sin embargo tiene sus complicaciones, por ejemplo uno debe comenzar a memorizar partes generales y específicas de cada grupo, por otra parte también es importante saber la fisiología de los mismos para los análisis bioquímicos que se aplican debido a que algunas de esas características no se ven a simple vista como su expresión fenotípica y mediante tinciones facilitamos la observación, aún así existen ocasiones en la que individuos de dos grupos distintos tienen una morfología y fisiología tan parecida que es prácticamente muy complejo la identificación aunque se utilice tinción o algunas prácticas bioquímicas, es ahí donde la identificación por análisis molecular entra perfectamente a salvar la situación; no existe una expresión que diga cuál tipo de identificación sea la mejor pero lo que se debe tomar en cuenta es que ambos tienen una gran importancia e incluso mucha complementariedad, en todo caso la identificación morfológica es más accesible para muchos por cuestiones monetarias con respecto el material, sin embargo algunos caracteres de ciertos grupos sólo se los puede ver a través de microscopia electrónica que lleva a costos elevados al igual que tener los instrumentos para la identificación molecular, pero aquellos que lo tienen es una buena inversión para el uso de un gran grupo de investigadores. Rodicio y Mendoza (2004) definen la especie bacteriana en taxonomía como: el conjunto de cepas que comparten una similitud del 70% o más, en experimentos de reasociación ADN-ADN, con una típica identidad del 97% o más entre sus genes ARNr 16S. (Rodicio y Mendoza, 2004), pero se recomienda usar una identificación polifásica (criterios fenotípicos y datos de secuencia).Desafortunadamente, no existe una definición universal para la identificación de especies a través de la secuencia de genes del

16S rRNA, los autores varían ampliamente sus criterios de forma aceptable para el establecimiento de una "especie" secuenciada (Janda y Abbott, 2007).

Una pregunta concierne en cuan eficaz es nuestra rutina de identificación de especies comunes usando métodos convencionales o sistemas comerciales. A pesar de que estas identificaciones se consideran eficaces, se sabe que existen más precisos y convenientes mecanismos para estas identificaciones en bases molecular que necesitan ser realizadas y publicadas (Janda y Abbott, 2007). Muchos investigadores encontraron un problema en la resolución de la identificación al nivel de géneroespecie en la secuencia del gen 16S rRNA. En otras instancias, la distancia entre las similitudes dentro la cepa(Janda y Abbott, 2007), por ejemplo se tiene una similitud de 99,5%, no justifica en muchas circunstancias esa pequeña diferencia al 0,5% para poder tomar el valor inferior más cercano como el definitivo para la identificación, es más esto es exactamente lo que muchos hicieron científicos hicieron. Es por eso que las especies que se trataban de identificar en el caso de las bacterias los porcentajes de similitud eran altas pero no determinantes; se optó identificarlas hasta el género. La utilidad de la 16S rRNA secuencias de genes como una herramienta en la identificación microbiana depende de dos elementos clave, la deposición de las secuencias completas de nucleótidos inequívocas en bases de datos públicas o privadas y la aplicación de la "etiqueta" correcta a cada secuencia. Hace años, la calidad general de las secuencias de nucleótidos depositados en bases de datos públicas es cuestionable, ya que muchas deposiciones eran de mala calidad (Janda y Abbott, 2007). El problema de que sea abierto a todo público sin un mecanismo de control del ingreso de la información es que cualquier persona podría ingresar secuencias falsas e inventadas, y que se graben en la base de datos, esto generaría clasificaciones o situaciones de comparación irreales, sin embargo deberían buscar una forma de gestionar el ingreso de la información. Se desconoce el origen de las secuencias obtenidas por lo cual puede que haya varios factores que afecten los resultados, sin embargo, cabe la posibilidad de que hayan sido obtenidas con condiciones bien controladas por el nivel de similitud que presentaron. La baja información del Algae identificada posiblemente se deba al escaso muestreo, baja investigación y localización de la misma geográficamente. De ésta forma si el 16S rRNA cumpliría la función de “Cronómetro Molecular” debería cumplir las siguientes condiciones: Debe tener una distribución universal. No debe estar sujeto a transmisión horizontal. Ha de poseer una constancia funcional, de modo que la presión selectiva que actúe sobre lamolécula sea mínima. La longitud de la secuencia debe ser suficiente para que las estimaciones de semejanza tenganvalidez estadística.

La tasa de cambio, al menos en una parte de la molécula, debe ser lo suficientemente bajacomo para permitir la detección de las relaciones evolutivas lejanas. Desde el punto de vista metodológico interesa que no sea excesivamente larga para poderaplicar técnicas de secuenciación.

Conclusiones Por cuestiones de logística y accesibilidad económica, se llega a la conclusión que es mejor utilizar la identificación morfológica (a no ser que se quiera obtener el código genético) cuando los individuos que se desean identificar tienen una tamaño macroscópico que se puedan ver detalladamente en el esteromicroscopio y en el microscópio ciertos grupos de fácil identificación hasta los 100X; cuando se aplique inmersión en organismos microscópicos es preferible hacer la identificación molecular y/o utilizar la microscopía electrónica. Para la definición de especie en organismos procariotas, posiblemente dentro de unos años con una mayor cantidad de secuencias que sean almacenadas en los databases si es que no se cambia el uso de 16S rRNA posiblemente se puedan tener mayor claridad en cuanto a similitudes dentro de la cepa y la magnitud con la que el mismo 16S rRNA cambia. Se lograron identificar cuatro secuencias, tres sólo a nivel de Género en las Bacterias Helicobacterm sp., Clostridium sp. y Mycobacterium sp.Por dos razones: Se desconoce el origen y el proceso de obtención de las secuencias, en segunda instancia los porcentajes de similitud eran mayor al 0,01 por razones explicadas en discusiones se descarta la posibilidad de que sean una de las especies que tenían en los databases. La Algae identificada fue identificada exitosamente con un 100% de similitud siendo Characiosiphon rivularis la especie; sin embargo, al parecer la secuencia que se tuvo tiene que haber sido predeterminada como para que pudiera haber coincidido al 100%. En cuanto al uso de las secuencias genéticas de 16S rRNA para poder usar en la sistemática, cumplen las condiciones de “Cronómetro Molecular” siendo el más confiable que se ha reportado y de ésta forma posiblemente en un futuro sea más accesible económicamente desplazando las clasificaciones por medios bioquímicos. A pesar del problema con la información libre explicada en discusiones el Uso del RDP, BOLD, Algae Database y el NCBI mostraron ser herramientas muy útiles para la identificación y como buscadores de especies, siendo así muy utilizados a nivel mundial. Bibliografía Chichlowski, M. y Hale, L.P. 2009.Effects of Helicobacter Infection on Research: TheCase for Eradication of Helicobacter from RodentResearch Colonies. Comparative Medicine. 59 (1): 10-17. Cheung, J.P.Y., Fung, B. Yuk Ip, W., y Chow, S. 2012. Mycobacterium marinuminfection of the hand y wrist. Journal of Orthopaedic Surgery. 20 (2):214-18.

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thallus

wall

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ANEXOS Hierarchy Browser S000363188 Helicobacter

S000574753 Helicobacter

S000428426 Helicobacter

acinonychis (T); Eaton 90-119-3; cholecystus (T); ATCC 700242; mesocricetorum; M88148

AY686606

MU97-5506;

AF072334

S000651603 Helicobacter anseris S000334505 Helicobacter cinaedi S000334502 Helicobacter (T); MIT 04-9362; DQ415545

(T); CCUG 18818; M88150

S000012544 Helicobacter

S000891774 Helicobacter

muridarum (T); ST1; ATCC 49282; M80205

apodemus;

YMRC

000215; cynogastricus

AF284754

(T);

JKM4; S000363169 Helicobacter mustelae

DQ004689

(T);

ATCC

43772;

M35048 S000390922 Helicobacter

aurati S000650986 Helicobacter

(T); MIT 97-5075c; AF297868

equorum (T); EqF1; DQ307735

S000926238 Helicobacter

S000262259 Helicobacter

baculiformis (T); M50; EF070342

INTO; AY366428

S000390967 Helicobacter pametensis;

felis;

ATCC51478;

AF302105 S000003255 Helicobacter

S000363265 Helicobacter bilis (T); S000360594 Helicobacter Hb1; MIT 93-1909; U18766

ganmani; ES-5; AY561831

S000145295 Helicobacter

S000007612 Helicobacter

winghamensis;

97-1611;

AF363062 S000363187 Helicobacter

bizzozeronii (T); CCUG 35045; heilmannii type 1; L10079

pametensis (T); B9A Seymour;

Y09404

M88147

S000089425 Helicobacter S000651604 Helicobacter brantae hepaticus; AJ007931

S000005255 Helicobacter

(T); MIT 04-9366; DQ415546 S000460552 Helicobacter

macacae;

callitrichis; R-204; AY192526

AF333338

S000390281 Helicobacter

S001152554 Helicobacter

pylori;

ATCC49396; AF363064

S000391771 Helicobacter MIT

NLEP

99-5501;

S000017564 Helicobacter rappini; W.Tee-Yu; AF286053

canadensis (T); 16143; AF262037 magdeburgensis;

S000472685 Helicobacter HM007;

pullorum; 98/191; AJ876511

EF990624 S000388691 Helicobacter

canis;

S000995267 Helicobacter S000391774 Helicobacter

MIT 98-152; AF177475

marmotae S000390782 Helicobacter cetorum AF292378

(T);

MIT

99-5656;

AF333341

(T);

MIT

(T); HS1; EF204589

98-6070; S000145632 Helicobacter salomonis; 4; Y09405

suis

S000427360 Helicobacter suncus; S000391424 Helicobacter

S000438897 Helicobacter

Kaz-1; AB006147 S000995267

tursiopsae; P13; AF317325

rodentium

S000389475 Helicobacter

S000387334 Helicobacter

(T);

MIT

95-1707;

U96296 trogontum;

ATCC49310; typhlonius

AF225548

AF127912

(T);

MIT

97-6810;

Alrededor de 39 especies del Género Helicobactersp. Hierarchy Browser S001243254 Clostridium cellulosi; D3; FJ465164 S000004442 Clostridium leptum (T); DSM 753T; AJ305238 S000014612 Clostridium methylpentosum (T); DSM 5476; Y18181 S000127873 Clostridium sporosphaeroides (T); DSM 1294; X66002 S000008119 Clostridium viride (T); T2-7 (DSM 6836); X81125 Como 5 especies en el Género ClostridiumIV al parecer no se encuentran bien definidos ni clasificados el PhylumFirmicutes en el RDP. Hierarchy Browser S000128241 Mycobacter S000001615 Mycobacter S000002735 Mycobacter S000016429 Mycobacter ium abscessus; ITG 98- ium 1292; AJ419970

anthracenicum; ium austroafricanum (T); ium botniense (T); E347;

Y15709

ATCC 33464; X93182

AJ012756

S000429476 Mycobacter S000129242 Mycobacter S000004552 Mycobacter S000127410 Mycobacter ium acapulcensis; ATCC ium aichiense (T); ATCC ium 14473; AF480575

27280; X55598

avium;

Myc373; ium

AF410479

bovis;

vallee;

X55589

S000429506 Mycobacter S000126794 Mycobacter S000460393 Mycobacter S000429475 Mycobacter ium africanum (T); ATCC ium 25420; AF480605

asiaticum;

ATCC ium

25276; X55604

boenickei

W5998;

ATCC

(T); ium branderi (T); ATCC 49935; 51789; AF480574

AY012573 S000002541 Mycobacter S000128054 Mycobacter ium

agri

(T);

44515T; AJ429045

S000460397 Mycobacter

DSM ium aurum (T); ATCC S000006333 Mycobacter ium 23366; X55595

brisbanense

ium bohemicum; E743; W6743; AJ277284

ATCC

AY012577

(T);

49938;

S000429477 Mycobacter S000485192 Mycobacter S000126966 Mycobacter S000014279 Mycobacter ium brumae (T); ATCC ium 51384; AF480576

cosmeticum

(T); ium

LTA-388; AY449728

fortuitum;

MB935; ium

AJ416915X52932

haemophilum;

X88923

S000386806 Mycobacter S000001327 Mycobacter S000002446 Mycobacter S000437741 Mycobacter ium buckleii; AF000225

ium duvalii (T); ATCC ium

frederiksbergense ium

(T);

43910; U94745 S000014993 Mycobacter

DSM

AJ276274 ium

diernhoferi;

ium

19340; X55593 celatum;

S000388579 Mycobacter

ATCC S000001608 Mycobacter ium heckeshornense (T);

S000128238 Mycobacter ium

fortuitum;

ium

doricum

13295; S000127631 Mycobacter

(T);

DSM

S000004347 Mycobacter

FI- S000006337 Mycobacter ium heidelbergense (T);

44339; ium

AF264700

fuerthensis; 2554/91; AJ000684

AF316618

ium chelonae; MB300;

S000130952 Mycobacter S000002743 Mycobacter S000128633 Mycobacter ium hiberniae (T); ATCC

AJ416939

ium S000127411 Mycobacter

elephantis

(T); ium gadium (T); ATCC 9874; X67096

AJ010747

27726; X55594

ium chitae (T); ATCC

S000000628 Mycobacter S000429478 Mycobacter S000022165 Mycobacter ium

19627; X55603

ium S000128055 Mycobacter

engbaekii;

hodleri (T); DSM

ATCC ium gastri; ATCC 15754.; 44183; X93184

27353; AF480577

X52919

ium chubuense; ATCC

S000104183 Mycobacter S000429501 Mycobacter S000013455 Mycobacter ium holsaticum (T); 1406;

27278; X55596

ium S000001338 Mycobacter ium

ATCC S369; AF174290

6841.; X52933

MB72; S000390342 Mycobacter

AJ416914

(T);

44346; U49401

ium caprae (T); gM-1; S000131074 Mycobacter caprine; AJ131120

hassiacum

fallax

(T);

ATCC ium

35219; AF480600

genavense

X60070

chlorophenolicum;

NCIMB 12325T; X81926

(T); AJ310467 S000441319 Mycobacter

S000131073 Mycobacter S000008902 Mycobacter ium

houstonense

(T);

ium farcinogenes; DSM ium gilvum (T); ATCC ATCC 49403; AY457067 S000013726 Mycobacter

43294; X55592

43909; X81996 S000001705 Mycobacter

ium confluentis; X63608

S000432487 Mycobacter S000088561 Mycobacter ium immunogenum; MN S000000626 Mycobacter ium

conspicuum

(T);

ium

frederiksbergense; ium goodii (T); M069; 3744; AJ011771

VM0503; AF544628

Y12872 S000004763 Mycobacter

X88922

S000008158 Mycobacter S000013097 Mycobacter ium S000133995 Mycobacter ium cookii (T); ATCC 49103 X53896

(T)

=

NZ2.;

ium

flavescens

ATCC 14474.;

intermedium

(T); ium gordonae (T); ATCC X67847 14470.; X52923

(T);

S000002089 Mycobacter S000003529 Mycobacter S000010044 Mycobacter S000429488 Mycobacter ium interjectum; MB739; ium mageritense; 1336; ium nonchromogenicum ium AJ272088

(T);

AJ011335

ATCC

petroleophilum;

19530.; ATCC 21497; AF480587

X52928 S000007790 Mycobacter S000435090 Mycobacter

S000429504 Mycobacter

ium intracellulare; ATCC ium manitobense; NRCM S000390385 Mycobacter ium 15985.; X52927

ium

01-154; AY082001

phlei

(T);

ATCC

neoaurum; 11758; AF480603

AF268445 S000006255 Mycobacter S000002102 Mycobacter ium

isoniacini;

INA-I; ium marinum; AF251565 S000131075 Mycobacter ium S000001005 Mycobacter

S000012377 Mycobacter ium kansasii;

malmoense

(T);

27023; X55597

(T);

DSM ATCC 29571.; X52930

S000417544 Mycobacter S000433334 Mycobacter ium porcinum; W6236; ium palustre (T); E846; AY012581

43224; X15916 S000429485 Mycobacter

AJ308603

S000126793 Mycobacter ium microti (T); ATCC ium

pinnipedii

ium obuense (T); ATCC AF502574

X80768

ium

S000395520 Mycobacter

komossense

(T); 19422; AF480584

S000429490 Mycobacter S000015728 Mycobacter ium poriferae (T); ATCC ium paraffinicum; ATCC 35087; AF480589

ATCC 33013; X55591 S000391703 Mycobacter

12670; X88925

S000387866 Mycobacter ium montefiorense (T); ium kubicae (T); CDC ATCC 941078; AF133902

S000416815 Mycobacter

BAA-256; S000015367 Mycobacter ium psychrotolerans (T); ium

AF330038

parafortuitum

(T); type

DSM 43528; X93183

strain:

WA101;

AJ534886

S000324288 Mycobacter S000002172 Mycobacter ium

kuopiense;

type ium

strain: E716; AJ748837

moriokaense

(T); S000418699 Mycobacter S000004105 Mycobacter

DSM 44221T; AJ429044 ium (T);

S000429483 Mycobacter S000429486 Mycobacter ium

lacticola;

ATCC ium

parascrofulaceum ium pulveris (T); DSM ATCC

BAA-614; 44222T; AJ429046

AY337273

mucogenicum;

S000007340 Mycobacter

ATCC 49649; AF480585 S000366306 Mycobacter ium ratisbonense; SD4;

9626; AF480582

ium parmense (T); MUP AJ271863 S000429484 Mycobacter S000261607 Mycobacter ium

lentiflavum

(T); ium

neglectum;

ATCC 51985; AF480583 strain:

BN

AJ580802

S000468031 Mycobacter ium liflandii; AY845224

S000015160 Mycobacter

3150; S000008897 Mycobacter ium rhodesiae (T); DSM

S000022471 Mycobacter ium leprae; X53999

1182; AF466821

type

ium peregrinum; ATCC 44223T; AJ429047 strain

S000441320 Mycobacter

of

unknown

provenance; X52921

S000250696 Mycobacter

ium neworleansense (T);

ium sacrum; BN 3151;

ATCC 49404; AY457068

AY235429

S000356593 Mycobacter S000011976 Mycobacter S000127593 Mycobacter S000428212 Mycobacter ium (T);

saskatchewanense ium simiae (T); ATCC ium thermoresistibile (T); ium NRCM

ATCC

00-250; 25275.; X52931

ATCC 19527; X55602

tusciae

(T);

FI-

25796; AF058299

BAA-544;

AY208856

S000009661 Mycobacter S000143815 Mycobacter S000008908 Mycobacter ium smegmatis; ATCC ium tilburgii; AJ580826

ium ulcerans; X58954

S000324287 Mycobacter 14468.; X52922 S000437884 Mycobacter S000128243 Mycobacter

ium savoniae; type strain: E533; AJ748836

S000131254 Mycobacter ium triplex (T); 90-1019; ium ium

sphagni;

ATCC U57632

vaccae;

ATCC

15483; X55601

S000006636 Mycobacter 33026; X55590 S000003946 Mycobacter S000334571 Mycobacter

ium scrofulaceum; ATCC 19981.; X52924

S000428897 Mycobacter ium ium

triviale;

ATCC ium vanbaalenii (T); type

sydneyiensis; 23292; X88924

strain:DSM 7251=PYR-1;

S000429497 Mycobacter AF101243

X84977 S000429491 Mycobacter

ium senegalense; ATCC 35796; AF480596

S000010837 Mycobacter ium tokaiense (T); ATCC S000009668 Mycobacter ium szulgai (T); ATCC 27282; AF480590

ium

S000015082 Mycobacter 25799.; X52926

ATCC

700009; Y12871 S000002374 Mycobacter

ium septicum; HXN500; AJ457055

wolinskyi;

S000003137 Mycobacter ium ium

terrae;

ATCC NCTC

tuberculosis 7416

S000013211 Mycobacter 15755.; X52925

phage

ium shimoidei (T); ATCC

Tb1; X58890

27962; AJ005005 Más de 121 Especies del Género Mycobacteriumsp.

lambda

(T); S000021374 Mycobacter

H37Rv; ium

xenopi;

EMBL- 19250.; X52929

ATCC