INFLUÊNCIA DE GENÓTIPOS DO GENE DA LEPTINA SOBRE CARACTERÍSTICAS PRODUTIVAS EM SUÍNOS1

41ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Zootecnia 19 de Julho a 22 de Julho de 2004 - Campo Grande, MS

INFLUÊNCIA DE GENÓTIPOS DO GENE DA LEPTINA SOBRE CARACTERÍSTICAS PRODUTIVAS EM SUÍNOS1 AUTORES JANE DE OLIVEIRA PEIXOTO2, SIMONE ELIZA FACIONI GUIMARAES3,4, PAULO SÁVIO LOPES3,4, MARIA AMÉLIA MENCK SOARES5, ALDRIN VIEIRA PIRES6, DANIELLE ASSIS DE FARIA2, DAIANNY SILVEIRA BARBOSA7, PRISCILA VENDRAMINI SILVA7, DEBORA MARTINS PAIXÃO7 1

Financiamento: CAPES, CNPq, FAPEMIG Estudante de mestrado, UFV, Viçosa, MG 3 Professor do Departamento de Zootecnia - UFV, Viçosa, MG 4 Professor bolsista do CNPq 5 Professor da UNIOEST, Cascavel, PR 6 Professor da FAESA, Vitória, ES 7 Estudante de graduação, UFV, Viçosa, MG 2

RESUMO O objetivo deste estudo foi investigar a associação entre polimorfismos no gene da leptina com características de performance, carcaça e qualidade de carne em suínos produzidos por um cruzamento divergente entre matrizes comerciais e machos da raça nativa Piau. Um sítio polimórfico para “Fok I” foi observado na posição 3.266, no segundo “intron” do gene da leptina. Genótipos foram identificados pela técnica de PCR-RFLP em 367 animais. As análises foram feitas usando o programa PROC GLM do SAS. Os genótipos do gene da leptina para “Fok I” foram associados com IDABATE - idade ao abate; PVIVO - peso ao abate; UC – espessura de toucinho após a última costela na linha dorso-lombar; P2 – espessura de toucinho medida após a última costela, a 6,5 cm da linha dorso-lombar; UL – espessura de toucinho entre a última e a penúltima vértebra lombar, na linha dorso-lombar; PCOSTELA – peso de costela; PCOPA - peso da copa; e PBACON – peso do bacon.

PALAVRAS-CHAVE Cruzamento Divergente, ‘’Fok’’ I, PCR-RFLP

TITLE INFLUENCE OF LEPTIN GENOTYPES ON PRODUCTION TRAITS IN SWINE1

ABSTRACT The objective of the present study was to investigate the association of polymorphisms in the porcine Leptin gene with performance, carcass and meat quality traits in pigs produced by initial mating of Brazilian commercial sows and native boars. A polymorphic site of ‘’Fok’’ I was observed at position 3.266, in the second ‘’intron’’ of Leptin gene. Genotypes were identified by PCR – RFLP technique in 367 animals. In testing the significance of allele substitution, data analysis was performed using PROC GLM of statistical package SAS. It was found that the Leptin genotypes for ‘’Fok‘’ I were associated with: IDABATE – slaughter age; PVIVO – slaughter weight; UC – backfat thickness after last rib; P2 – backfat thickness after last rib, at 6.5 cm from the midline; UL – backfat thickness between last and last but one lombar vertebrae; PCOSTELA – spareribs weight; PCOPA – boston shoulder weight; and PBACON – bacon weight.

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KEYWORDS Divergent crossbreeding , ‘’Fok” I, PCR-RFLP

INTRODUÇÃO A Leptina é um hormônio produzido pelo gene obeso (OB). Estudos em roedores, humanos e animais domésticos têm mostrado que este hormônio apresenta grande efeito sobre o metabolismo energético, atuando como modulador do consumo alimentar e das funções reprodutivas. A expressão e a secreção da Leptina estão fortemente relacionadas com a quantidade de tecido adiposo (Housenecht et al., 1998). A Leptina age no hipotálamo para controlar, além da ingestão de alimentos, a termogênese e a ação da insulina, por regulação da expressão e secreção de múltiplos neurotransmissores, neuropeptídeos e hormônios hipotalâmicos, incluindo o neuropeptídeo-Y (NPY), hormônio de liberação do hormônio do crescimento (GHRH), somatostatina (SS). Além disso, a Leptina modula a expressão do hormônio luteinizante (LH), do hormônio de crescimento (GH), da prolactina (PRL) e do hormônio estimulador da tireóide (TSH) (Barb et al., 1998). Como os hormônios regulam o metabolismo e conseqüentemente a performance animal, polimorfismos nos genes que os codificam têm potencial para serem usados como marcadores para características de interesse econômico, visando ao aumento do ganho genético nos programas de melhoramento. O objetivo deste estudo foi associar os genótipos do gene da Leptina para a enzima ‘’Fok’’ I com características de desempenho, carcaça e qualidade de carne, medidas em uma população F2 obtida por cruzamento divergente entre suínos naturalizados e comerciais.

MATERIAL E MÉTODOS Na construção da população de estudo foi utilizado o delineamento F2. Foram utilizados como parentais dois machos da raça nativa brasileira Piau e 18 matrizes cruzadas (Landrace x Large White x Pietran). Na geração F1 foram selecionados 54 fêmeas e 11 machos e do acasalamento destes animais F1 nasceram cerca de 800 animais F2. Na geração F2 foram avaliadas características de desempenho, de carcaça e de qualidade de carne. Algumas das características avaliadas foram: pesos (PNAS, P21, P42, P77, P105), consumo de ração (CONSRAC), ganho de peso diário (GPD), conversão alimentar (CA), idade ao abate (IDABATE); peso vivo anterior ao abate (PVIVO), medidas de espessura de toucinho (UC, UL, L, P2, ETO), peso de cortes (PBACON, PCOSTELA), medidas de pH (pH45, pH 24), gordura intramuscular (GI), perda de água (PG, PC e PT), maciez objetiva (FC) e medidas de coloração. As análises genotípicas foram conduzidas no Laboratório de Biotecnologia Animal do Departamento de Zootecnia da UFV (LABTEC). O par de “primers’’ (Direto: 5’ TGTGAGAAACAGACAGTCGTGG; Reverso: 5’ TGAGGATCTGTTGGTAGATCGC) foi desenhado a partir da seqüência do gene da Leptina publicada por Bidwell et al, (1997) em suínos (‘’GenBank’’ acesso número U66254) e amplifica uma região de 423 nucleotídeos. As reações de amplificação foram realizadas usando sistemas

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construídos para um volume final de 20 microlitros, contendo 1 U de Taq polimerase; 0,2 mM de cada dNTP; 0,2mM primers, 20mM Tris-HCl pH 8.3; 2,0 mM de MgCl2; 50 mM KCl e 25 ng de DNA genômico. Os resultados das amplificações foram avaliados em eletroforese em gel de poliacrilamida a 8% com posterior coloração com nitrato de prata. O polimorfismo analisado neste trabalho foi detectado por SOARES (2001) na posição 3.266 do gene, onde ocorreu uma troca de T→G que incluiu um sítio de restrição para endonuclease Fok I. As análises de restrição por PCR – RFLP foram processadas em um volume final de 15 microlitros (10 microlitros do produto da amplificação, 0, 5 microlitros (5 U) da enzima ‘’Fok’’ I, 1, 5 microlitros de tampão; 0,15 microlitros de BSA; 2,85 microlitros de água). As reações de restrição ocorreram a 37°C durante 2 horas. As análises estatísticas para associação dos genótipos com as características avaliadas foram feitas utilizando-se o PROC GLM do SAS. No modelo foram considerados como efeitos fixos genótipo, sexo e época de nascimento e o efeito de pai foi considerado como aleatório. Para características de carcaça, a característica peso da carcaça foi utilizada como covariável. Para as características de desempenho, foi utilizada a característica peso aos 77 dias como covariável e para as características de qualidade de carne, como covariável foi usada a característica idade ao abate.

RESULTADOS E DISCUSSÃO O polimorfismo para enzima de restrição ‘’Fok’’ I foi detectado na posição 3.266 pb no segundo ‘’intron’’ do gene da Leptina (BIDWELL et al, 1997), onde ocorreu a troca de um T por um G. A digestão do produto de PCR revelou três genótipos: para o genótipo TT os tamanhos dos fragmentos foram de 337, 73 e 13 pb, já o genótipo GG apresentou fragmentos com os tamanhos de 185, 152, 73 e 13pb. O genótipo heterozigoto TG apresentou fragmentos de 337, 185, 152, 73 e 13bp. Foram genotipados 367 animais da geração F2. Verificou-se que 235 animais possuíam o genótipo TT, 105 eram heterozigotos TG e 27 eram homozigotos para mutação GG. O genótipo GG não foi considerado nas análises estatísticas devido a sua baixa freqüência. Efeitos significativos dos genótipos da ‘’Fok’’ I foram observados para as seguintes características: idade ao abate (IDABATE), peso vivo (PVIVO), espessura de toucinho após a última costela, na linha dorso-lombar (UC), espessura de toucinho medida imediatamente após a última costela, a 6,5 cm da linha dorso-lombar (P2), espessura de toucinho entre a última e a penúltima vértebra lombar, na linha dorso-lombar (UL), peso de costela (PCOSTELA), peso de copa (PCOPA), e peso de bacon (PBACON). O nível de significância para a associação e as médias para cada genótipo estão mostrados na Tabela 1. O polimorfismo estudado não está localizado dentro da região que é expressa do gene, portanto, não está afetando a estrutura protéica do hormônio Leptina. Contudo, é possível que esta mutação tenha efeitos biológicos específicos, que possam influenciar a

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estabilidade ou a eficiência de transporte do transcrito deste gene e desta forma afetar a variação nas características fenotípicas. Uma outra hipótese que explique a associação do polimorfismo da ‘’Fok’’ I com as características estudadas seria a existência de desequilíbrio de ligação entre este polimorfismo e outro sítio polimórfico que seria o verdadeiro sítio responsável pela variação nas características estudadas. O polimorfismo da ‘’Fok’’ I na posição 3266 ainda não foi descrito em outros trabalhos. Porém, o polimorfismo da enzima ‘’Hinf ‘’ I neste mesmo gene já foi estudado em suínos (Jiang & Gibson, 1999 e Kennes et al., 2001) e se encontra no ‘’exon’’ três, na posição 3.469, e de acordo com estes autores, o polimorfismo está associado com a deposição de gordura e o consumo alimentar. Pela proximidade de ambas as substituições nucleotídicas, (203pb), o sítio 3266 pode ser considerado como marcador para a alteração exônica 3.469. Esta hipótese está sendo analisada.

CONCLUSÕES Os genótipos da Leptina para o polimorfismo da enzima ‘’Fok’’ I apresentaram associação positiva com características produtivas. Porém, esta associação foi detectada numa população experimental sendo necessária sua confirmação com novos estudos envolvendo populações comercias.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. BARB, C. R., G. J. HAUSMAN, K. L. HOUSECKNECHT. D.D. Biology of Leptin in the pig. “Domestic Animal Endocrinology”, v. 21: 297 – 317, 2001. 2. BIDWELL, C.A., CORNELIUS, S.G, WILLIS, G.M, SPURLOCK, M. Cloning and expression of the porcine obese gene. “Animal Biotechnology”, v 8, n 2, p.191 – 206, 1997. 3. HAUSEKNEC , K. L., BAILE, C. A., MATTERI, R. L. et al., The biology of leptin: a review. “Journal of Animal Science”., v. 76: 1405 – 1420, 1998 4. JIANG, Z.H, GIBSON, J.P. Genetic polymorphism in the Leptin gene and their association with fatness in four pig breeds. “Mammalian Genome”, v. 10, p.191 – 193, 1999. 5. KENNES, Y.M., MURPHY, B.D., POTHIER, F., PALIN, M.F. Characterization of swine Leptin (LEP) polymorphisms and their association with production traits. “Animal genetics” v.32, p. 215 – 218, 2001. 6. SOARES, M. A. M. Estudo do gene da obesidade e de seu receptor em suínos. Viçosa: Universidade Federal de Viçosa, 2001. 108 pgs. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento) – Universidade Federal de Viçosa, 2001.

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Tabela 1 – Características de desempenho e de carcaça (número de observações, médias e desviospadrão) estatisticamente associadas aos genótipos TT e TG do gene da Leptina Genótipo TT Genótipo TG Característica n Média dp n Média dp IDABATE (dias)* 182 149,39 9,76 85 146,35 9,17 PVIVO (kg)* 144 64,55 5,59 80 63,32 4,13 PCOSTELA (kg)* 184 1,53 0,25 85 1.52 0,23 PCOPA (kg)* 181 1,72 0,29 85 1,62 0,25 PBACON (kg)** 182 2,69 0,46 84 2,66 0,37 UC(mm)** 184 19,61 4,69 86 19,95 4,80 UL(mm)* 183 28,00 5,99 86 28,37 5,83 P2(mm)* 184 16,65 3,80 86 16,90 3,85 n = número de observações em cada característica, de cada genótipo. dp = desvio-padrão. * Diferenças significativas (P