Identificación y Cuantificación de Glicósidos Cianogenéticos de un extracto fluído de Laurel Cerezo

Universidad Católica Santa Maria
Facultad de Ciencias Farmaceúticas, Bioquímicas y Biotecnológicas
Arequipa
Identificación y Cuantificación de Glicósidos Cianogenéticos de un extracto fluído de Laurel Cerezo
Lenny Orana Sarmiento Sánchez
Resumen
Se realizaron pruebas para conocer las reacciones básicas, que nos permitieran identificar rápidamente glicósidos cianogenéticos a partir del extracto de la hoja de Laurel Cerezo (Prunus Laurocerasus) que contiene el prunasósido, prulaurasina, taninos, emulsina, y materias grasas. Las reacciones empleadas son las S.R. de Grignard, determinación de Azucares, e identificación de Taninos.

Summary
Tests were conducted to know the basic reactions that allow us to quickly identify cyanogenic glycosides starting in the leaf extract of cherry laurel (Prunus laurocerasus) containing the prunasósido, prulaurasina, tannins, emulsina, and fats. The reactions employed are S.R. Grignard determination of sugars, tannins and identification.
Introducción
Los Heterósidos Cianogenéticos o Glucósidos Cianogenéticos son una familia de compuestos que por hidrolisis producen un azucar y una cianohidrina, la cual resulta inestable y se descompone liberando acido Cianhidrico (HCN). La hidrolisis es llevada a cabo por unas enzimas, que en el vegetal se encuentran en compratimientos celulares distintos al del heterosido cianogenetico. Por aplastamiento, rotura, etc., se consigue que el heterosido cianogenetico contacte con las enzimas y se produce la hidrolisis y se libera el HCN. (*)
R1O-AzúcarR2CN AzúcarR1OHR2CN Nitriloliasa .O.R1CR2+HCN
La cianogénesis es la facultad que poseen ciertos organismos vivos –especialmente vegetales- de producir en determinadas ciscunstancias acido cianhidrico. Si se exceptuan los cianolípidos de las Sapindaceae, las sustancias cianógenas son siempre heterósidos de 2-hidroxinitrilos comunmente denominados heterósidos cianógenos (cianogenéticos´). La hidrolisis de estos heterósidos por glucosidasas endógenas y posteriormente por hidroxinitril-liasas, va precedida generalmente por la ruptura tisular inducida por un proceso físico –trituración, masticación, infestación fúngica, etc.- que pone en contacto los heterósidos vacuolares y los enzimas citoplasmáticos.
La capacidad de cianogenésis es frecuente en el reino vegetal en helechos, Gimnospermas y Angiospermas. Es especialmente marcada en algunas familias: Rosaceae, Fabaceae, Poaceae, Araceae, Euphorbiaceae, Passifloraceae, etc. Todos los organos de un vegetal pueden elbaorar estos compuestos. En ciertos casos, y esto se relaciona directamente con un papel de proteccion, la cianogenesis se asocia con un estadio vegetativo especial, por regla general con los organos jovenes, en fase de crecimiento activo. (*2)
Propiedades, detección, extracción
Los heterósidos se hidrolizan fácilmente, a pH cercanos a la neutralidad, por β-glucosidasas mas o menos específicas que liberan una osa y una cianhidrina. Esta última, inestable, produce HCN y un compuesto carbonilo, aldehído o cetónico; esta segunda reacción se cataliza por una hidroxinitrilliasa. En medio débilmente ácido y en caliente, los heterósidos de hidrolizan de la misma forma que por las glucosidasas y, a pH cercano a la neutralidad, la descomposición de la cianhidrina es espontánea y muy rápida. El comportamiento en medio básico es débil varía según la estructura: formación de HCN (como medio acido) o transformación del grupo nitrilo en acido carboxílico sin que el enlace glicosídico se hidrolice.
Debido a la gran fragilidad de los heterósidos cianógenos, su extracción y purificación son delicadas. Van precedidas de una inhibición enzimática (inmersión en aire líquido), y necesitan la utilización de alcoholes y recurrir a técnicas cromatográficas.
Los heterósidos cianogenéticos se detectan fácilmente mediante papel impregnado en reactivos susceptibles de producir una reacción coloreada con el ácido cianhídrico que se libera cuando la materia vegetal se tritura (ácido pícrico/carbonato sódico, bencidina/acetato cúprico). El papel impregnado se coloca en el extremo de un tubo que contenga una pequeña cantidad de droga triturada. Un método clásico de valoración consiste en realiza un arrastre por vapor de agua de la droga suspendida en agua acidificada y posteriormente valorar, con la ayuda de nitrato de plata, el HCN en el destilado. Más cómodamente la cromatografía de gases de los derivados Trimetilsililados de los heterósidos, permite la identificación y determinación cuantitativa simultánea, aunque el contenido global sea bajo. (*2)
Toxicidad del HCN y de los vegetales cianógenos
Aunque el HCN es un veneno potente, no se debe olvidar que la absorción por vía oral de las drogas cianógenos no provoca necesariamente una intoxicación severa. En efecto, el margen de concentración peligrosa (0.5 – 3.5 mg/Kg) solo se puede alcanzar por la ingestión rápida de grandes cantidades de las partes de las plantas ricas en heterósidos cianógenos: en el caso de los frutos, su pulpa no contiene heterósidos, en el de las hojas –generalmente ricas en heterósidos- no suelen ser apetecibles (eje. Laurel Cerezo). Además es necesario que los heterósidos se hidrolicen en el tubo digestivo. Por otra parte se sabe que el organismo humano posee la capacidad de detoxificar con bastante rapidez los cianuros en tiocianatos por la actuación de una tiosulfatosulfurotransferasa (rodanasa); los tiocianatos así formados se eliminan por orina (30-60 mg/h). (*2)
El cianuro es fuertemente tóxico para los humanos. El cianuro de hidrógeno líquido o gaseoso y las sales alcalinas del cianuro pueden ingresar al cuerpo por inhalación, ingestión o absorción a través de los ojos y la piel. El nivel de absorción de la piel aumenta cuando ésta se encuentra cortada, deteriorada o húmeda. Las sales de cianuro se disuelven con facilidad y se absorben al entrar en contacto con las membranas mucosas. El grado de toxicidad del cianuro de hidrógeno (HCN) para los humanos depende del tipo de exposición. Como el cuerpo humano reacciona de formas diversas a una misma dosis, se considera que la toxicidad de una sustancia está expresada como la concentración o dosis que resulta letal para el 50% de los individuos expuestos. (LC50 o LD50). La concentración letal de cianuro de hidrógeno gaseoso (LC50) es de 100-300 partes por millón. La inhalación de esos niveles de cianuro causa la muerte en 10 a 60 minutos, teniendo en cuenta que cuanta más alta es la concentración más rápido se produce la muerte. La inhalación de 2.000 partes por millón de cianuro hidrogenado puede ser fatal en tan solo un minuto. El valor LD50 por ingestión del cianuro de hidrógeno es de 50-200 miligramos, o de 1-3 miligramos por kilo de peso. En contacto con la piel normal, el valor LD50 es de 100 miligramos por kilo de peso. Si bien el tiempo de exposición, la forma de exposición y la dosis pueden variar, la acción bioquímica del cianuro es la misma una vez que ingresa en el cuerpo. Una vez que se encuentra en el torrente sanguíneo, el cianuro forma un complejo estable de citocromo oxidasa, una enzima que promueve el traspaso de electrones a las mitocondrias de las células durante la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP). Si la citocromo oxidasa no funciona correctamente las células no consiguen aprovechar el oxígeno del torrente sanguíneo, lo que causa hipoxia citotóxica o asfixia celular. La falta de oxígeno provoca que el metabolismo cambie de aerobio a anaerobio, lo que conlleva a la acumulación de lactato en la sangre. El efecto conjunto de la hipoxia y la acidosis láctica provoca una depresión en el sistema nervioso central que puede causar paro respiratorio y resultar mortal. En concentraciones más altas, el envenenamiento por cianuro puede afectar otros órganos y sistemas del cuerpo, incluso el corazón. (*3)
Interés de las plantas cianógenos
Durante una veintena de años, se estableció una controversia sobre el amigdalosido y su hipotética actividad en pacientes cancerosos. A consecuencia de ello, ensayos rigurosos han demostrado sin ambigüedad que este tipo de producto (laetrile) se encuentra totalmente desprovisto de actividad, por lo que su utilización irracional y peligrosa. El Laurel-Cerezo es la única especie que conserva un uso farmacéutico.
LAUREL-CEREZO, prunus laurocerasus L., Rosaceae
Nombre Común o vulgar: Laurel Real, Lauroceraso, Lauro.
Origen: nativa del suroeste de Asia (norte de Persia) y sureste de Europa.
Hojas: oblongas, coriáceas relucientes de hasta 20cm, con dientes marginales espaciados, de color verdinegro por la haz y más pálidas por el envés.
Fruto: en drupa, de 1cm de diámetro, de color negro y sabor acerbo.
Se emplea en perfumería y en medicina casera en forma de agua destilada como antiespasmódico.
La hoja fresa de laurel-cerezo se emplea en la preparación del agua destilada de laurel-cerezo. Esta, titulada a 100mg/100g en HCN total, se emplea como aromatizante, antiespasmódica y estimulante respiratorio. (*4)
Esta especie originaria de Europa oriental es un arbusto siempre verde, con racimos de flores blancas y con pequeñas drupas ovoideas, rojas y posteriormente negras en la madurez; se utiliza con fines ornamentales, sobre todo para setos. Las hojas poseen un limbo entero, oval, acuminado, coriáceo, lustroso, adornado cerca de la unión del peciolo y sobre la cara inferior, por nectarios redondeados. Estrujados, desprenden un olor característico a almendras amargas. El contenido en PRUNASÓSIDO varia de 1.2 a 1.8 g por 100gr de hojas frescas.
El único empleo de la droga es la obtención de agua destilada de laurel-cerezo. Ajustada a 100(±5) mg de HCN total por 100gr, no debe contener más de 25mg por 100 de este mismo acido libre; el contenido mínimo en benzaldehído es de 300mg por 100gr.
material y métodos experimentales de determinación
Determinación Cualitativa
S.R. de Grignard
La reacción de Grignard detecta la presencia de ácido cianhídrico (HCN) al actuar este sobre una tira de papel absorbente impregnada con ácido pícrico y carbonato de sodio (picrato de sodio).








Los reactivos de Grignard son compuestos organometálicos de fórmula general R-Mg-X, donde R es un resto orgánico (alquílico o arílico) y X un halógeno. Los reactivos de Grignard son unos de los más importantes y versátiles en química orgánica debido a su rápida reacción con electrófilos, como por ejemplo el grupo carbonilo. Son importantes para la formación de enlaces de carbono-carbono, carbono-fósforo, carbono-estaño, carbono-silicio, carbono-boro y otros enlaces carbono-heteroátomo.1 2 Por el descubrimiento de estos reactivos y sus reacciones, Víctor Grignard recibió el premio Nobel de Química en 1912.
Identificación de Taninos
Los taninos están constituidos por un amplio grupo de compuestos hidrosolubles con estructura polifenólica, capaces de precipitar ciertas macromoléculas (proteínas, alcaloides, celulosa, gelatina). Esta capacidad para precipitarlas es la base de dos propiedades principales: su capacidad de curtir la piel y su poder astringente. Considerado como Tanino común se tiene la fórmula C14H14O11 , es aproximada porque son polímeros complejos.
Los taninos son glucósidos de polipéptidos solubles en agua presentes en muchas plantas, con un sabor agrio astringente, confiere sabor y olor indeseable a los alimentos. Afectan la utilización de las proteínas debido a que ligan a la lisina, haciéndola indisponible para animales monogástricos.
La prueba del cloruro férrico es utilizada para determinar la presencia o ausencia de fenoles en una muestra dada. Los enoles también dan resultados positivos. La prueba del bromo es muy útil para confirmar los resultados, aunque las técnicas espectroscópicas modernas (como la RMN y la espectroscopia IR) son muy superiores en determinar la identidad de la sustancia desconocida. La cantidad de fenoles totales puede ser determinada espectroscópicamente por la prueba de Folin-Ciocalteu.
Los taninos están constituidos por un amplio grupo de compuestos hidrosolubles con estructura polifenólica, capaces de precipitar ciertas macromoléculas (proteínas, alcaloides, celulosa, gelatina). Esta capacidad para precipitarlas es la base de dos propiedades principales: su capacidad de curtir la piel y su poder astringente.
Curtido de la piel: Los taninos se intercalan entre las fibras de colágeno, estableciendo uniones reversibles (interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno, etc.) e irreversibles (enlaces covalentes). Dichas fibras adquieren así una gran resistencia frente al agua y el calor y la piel se convierta en cuero. Forman sólidos amorfos Solubilidad: Son solubles en agua, forman soluciones coloidales y en disolventes orgánicos polares (acetona, alcohol, glicerina) pero son insolubles en disolventes orgánicos polares (éter etílico, cloroformo) Capacidad de precipitar:
Con agua de cal(solución de hidróxido cálcico)
Con agua de barita(solución de hidróxido barico)
Con wolframato o molibdato amónico
Con alcaloides, proteínas, celulosa y otras macromoléculas.
Capacidad de formar complejos: Son agentes quelantes con metales pesados como cobre, mercurio, plomo, etc. Propiedad de Redox: Se oxidan con facilidad, sobre todo en medio ácido y pueden actuar como reductores de ciertos compuestos (ácido fosfowolfrámico, ácido fosfomolibdénico, ferricianuro férrico). Estabilidad: Son moderadamente estables. Los taninos hidrolizables se hidrolizan fácilmente en medio ácido mientras que los taninos condensados son más resistentes a la hidrólisis. No obstante algunos de sus enlaces pueden romperse y polimerizan dando productos de intenso color rojo.
FUENTES NATURALES DE DÓNDE SE PUEDE OBTENER
Las plantas utilizadas para la extracción industrial de taninos son:
Los taninos gálicos se obtienen a partir de la corteza del castaño (Castanea sativa) y de las agallas de los robles (Quercus sp. pl), que se forman por la picadura en las yemas de la hembra de insecto Cynips gallae-tinctoriae, llegando a tener hasta un 70% de taninos. Los taninos condensados se obtienen de la madera de catecú (Acacia catechu) y de la corteza de algunas especies de eucalipto (Eucalyptus rostrata) entre otros. Los pseudotaninos son ácidos orgánicos derivados del ácido caféico que muestran una actividad farmacológica muy interesante. Destacan en este sentido las hojas de alcachofa (Cynara scolymus) que contienen cinarina y ácido clorogénico de acción colagogocolerética y hepatoreguladora y la sumidad del romero (Rosmarinus officinalis) con ácido rosmarínico, de acción semejante. Los alimentos en los que se encuentran estas sustancias presentan un sabor áspero y amargo. Están presentes en alimentos como el té, el café, las espinacas, las pasas negras y algunas frutas como la granada, la manzana. En la granada, la corteza y los tabiques internos son las partes del fruto con más cantidad de taninos. En el caqui, la presencia de taninos, abundantes en la pulpa, disminuye con la maduración. En la manzana, los taninos aparecen cuando se deja oscurecer la pulpa rallada de una manzana pelada. Son muy abundantes en el mundo vegetal, especialmente en algunas familias (Fagáceas, Rosáceas, Fabáceas, Mirtacéas, etc) y en diversos orgánicos: raíces rizomas (ruibarbo), cortezas (quina, roble), leño (catecú), hojas (hamamelis), frutos (cinorrodones).
ESTRUCTURA GENERAL
Considerado como Tanino común se tiene la fórmula C14H14O11, es aproximada porque son polímeros complejos.
ESTRUCTURAS CARACTERÍSTICAS DE CADA UNO DEL GRUPO DE COMPUESTOS
TANINOS CONDENSADOS: (catéquicos o proantocianidinas): son dímeros o polímeros flavánicos con uniones carbono-carbono entre las diferentes unidades de flavan-3-ol. S e forman por polimerización de las Catequinas y leucoantocianos. Además de encontrarse en Dicotiledóneasse producen también en helechos y Gimnospernas. Son muy resistentes a la hidrólisis ácida o enzimática (que rompe ciertos enlaces) y se convierten en antocianidinas, los cuales pueden polimerizar para formar los flobáfenos insolubles (color rojo intenso). Por destilación seca producen catecol (1,2-dihidroxibenceno). Por este motivo, reciben también el nombre de taninos catéquicos. Al tratar los taninos condensados con cloruro férrico (FeCl3) aparece una coloración verde.
TANINOS HIDROLIZABLES: Son éteres formados por una molécula de azúcar, generalmente la glucosa unida a un número variable de moléculas de ácidos fenólicos (ácido gálico o su dímero el ácido elágico). Los taninos hidrolizables son característicos de dicotiledóneas. Se hidrolizan tanto por hidrólisis ácida o básica como por hidrólisis enzimática. Por destilación seca producen pirogalol (1, 2,3trihidroxibenceno). Al tratar los taninos hidrolizables con cloruro férrico (FeCl3) aparece una coloración azul.
EXTRACCIÓN DE TANINOS
Por regla general, la extracción de los taninos se realiza con una mezcla de agua y acetona (no se aconseja utilizar metanol porque provoca la metanolisis de los dépsidos gálicos). Se obtiene un rendimiento óptimo con los tejidos frescos o conservados por congelación o liofilización pues, en las drogas desecadas, una parte de los taninos se encuentra irreversiblemente combinada con otros polímeros. Después de eliminar la acetona por destilación, de la disolución acuosa se separan con un disolvente como el diclorometano, pigmentos y lípidos. Una extracción de esta disolución acuosa con acetato de etilo permite separar los proantocianidoles dímeros y la mayor parte de los taninos gálicos. Los proantocianidoles polímeros y los taninos gálicos de masa molecular elevada permanecen en la fase acuosa. Para obtener moléculas puras es necesario utilizar técnicas cromatográficas apropiadas, generalmente una (o varias) cromatografía(s) de exclusión sobre gel, seguido(s) de cromatografía(s) en fase reversa, siempre en medio hidroalcohólico o hidroalcohol-acetónico.
APLICACIONES DE LOS TANINOS
EFECTOS ANTINUTRITIVOS
A pesar de todas sus propiedades, los taninos son considerados sustancias anti nutritivas. Esto se debe a que una concentración elevada puede provocar que la absorción de algunos nutrientes se vea disminuida. En el caso de las proteínas, los taninos se combinan con ellas y alteran su absorción. En cuanto al hierro, cuando los taninos están en elevadas concentraciones, forman con este mineral complejos insolubles en agua que no pueden ser absorbidos en el epitelio intestinal. Para contrarrestar esta situación, conviene saber las combinaciones dietéticas que favorecen la absorción de hierro vegetal, como acompañar los alimentos con otros ricos en vitamina C: zumo de naranja, kiwi, piña o ensalada de tomate






Identificación de Azucares
Es una solución que descubrió el alemán Hermann Von Fehling y se caracteriza fundamentalmente por su utilización como reactivo para la determinación de azúcares reductores es decir demostrar la presencia de glucosa o sus derivados como la sacarosa o la fructosa, también se lo conoce como licor de Fehling. Está formado por dos soluciones acuosas que son: sulfato de cobre cristalizado y sal seignette o tartrato mixto de potasio y sodio; es importante tener en cuenta que ambas se guardan separadas hasta el momento en el que vayan a ser utilizadas para de esa manera evitar la precipitación del hidróxido de cobre.
Su acción se fundamenta en el poder reductor del grupo carbonilo de los aldehídos el cual se oxida a ácido y se reduce la sal de cobre en medio alcalino a óxido de cobre, formando un precipitado de color rojo. El reactivo de Fehling se fundamenta principalmente, en su reacción, la oxidación de cobre, el poder reductor de los azúcares, sea este en monosacáridos, polisacáridos, aldehídos, y en ciertas cetonas.






Determinación Cuantitativa
Droga usada: Hojas frescas de laurel cerezo
Procedimiento: pesar 5gr de hojas de laurel cerezo, colocarlas en un Erlenmeyer de 50ml añadirle 25ml de agua caliente (50º)

Tapar herméticamente y someterlo a BM por 10 minutos. Destapar y rápidamente unirlo al dispositivo de destilación, con el extremo del refrigerante sumergido en un Erlenmeyer que contiene 20 ml de Na (OH) al 10% y 10ml de IK al 10%. Empezar la destilación con llama pequeña regulable a fin de recoger los 20ml de destilado en unos 20 minutos (marcar rápidamente el nivel). Terminada la destilación, el extremo del refrigerante lavarlo con agua destilada. Valorar con nitrato de plata 0.03N hasta aparición de ligera opalescencia. Cada ml de nitrato de plata equivale a 0.00162 g de HCN.
Resultados y discusiones
Discusión de resultados
El resultado de la práctica es óptimo, conocemos que la experiencia con el reactivo de Fehling se fundamenta en el poder reductor del grupo carbonilo en las aldosas, pues tienen la estructura química abierta necesaria para actuar como agentes reductores, y en algunas cetosas (generalmente positiva en fructosa), lo que se evidencia con la formación de un precipitado rojo ladrillo (óxido cuproso).
Vemos que la coloración que toman los precipitados depende de la cantidad de reactivo que se use y por tanto dan un aspecto de buena o baja concentración, según las imágenes, por lo que hablamos de una cantidad muy buena de azúcar.
Discutiendo los resultados positivos, que se dio en la glucosa, maltosa, lactosa este reactivo, reacciona principalmente con los aldehídos porque tienen un grupo carbonilo más expuesto, que le da el carácter reductor, y existe la presencia del precipitado rojo ladrillo (óxido cuproso).
Interesante es discutir el resultado de la fructosa, cuya estructura es una cetosa característica alfa-hidroxi-cetónicos, que al reaccionar con Fehling da un resultado positivo.
Por otro lado, y refiriéndonos a la imagen de la sacarosa (que no nos dio coloración), esto se da porque es un azúcar constituida por una molécula de glucosa y de fructosa, tiene un enlace entre el primer carbono de la glucosa y el segundo carbono de la fructosa, y no queda grupos reductores disponibles. Al no ser reductor, la prueba de Fehling es negativa, y por lo que se intuye, no posee el grupo carbonilo apto y libre, necesario como para reaccionar con el reactivo Fehling, y a ebullición, no se observó ningún cambio.

conclusiones
La prueba de Fehling nos permite identificar cual es un azúcar reductor.
La mayoría de los monosacáridos y algunos disacáridos poseen poder reductor.
Un azúcar es reductor por la formación de un precipitado de color rojo ladrillo (óxido cuproso) y la decoloración de la solución.
Podemos concluir que las muestras de glucosa, fructosa, maltosa y galactosa son azúcares reductores, ya que se formó un precipitado de color rojo ladrillo (óxido cuproso).
En cambio la sacarosa es un azúcar no reductor, debido a que no se formó un precipitado de color rojo ladrillo. 

Anexos
S.R. de Grignard

Identificación de Azucares y Taninos






Bibliografía
(*) KUKLINSKI Claudia, Farmacognosia
(*2) BRUNETON Jean, Farmacognosia 2da Edición
(*3) CAEM
(*4) REACCIÓN DE FEHLING http://blog.uchceu.es/eponimos-cientificos/reactivo-de-fehling/20140507
http://blog.universidadnacionaldecolombia/Heterosidos_Cianogenos/Fehlingh
Claudia KuKlinski, Farmacognosia, Ediciones OMEGA S.A., 2000, cap. 14 págs. 106-109, cáp. 15 págs. 112-116
Jean Bruneton, Farmacognosia, Fitoquímica plantas medicinales, 2ed, Editorial ACRIBIA S.A. ZARAGOZA, España 2001, págs... 305-341, 365-400
Métodos de Investigación Fitoquímica, Dr. Xorge Alejandro Domínguez, EDITORIAL LIMUSA S.A. Arcos de Belén número 75 México1, D.F. 1973 cap. 6, págs. 81-88
http://farmacia.udea.edu.co/~ff/flavonoides2001.pdf, Fecha: 4-10-2015, Hora: 16:00PM
http://es.wikipedia.org/wiki/Flavonoide#Estructura_qu.C3.ADmica Fecha: 410-2015, Hora: 16:00PM
http://www.botanical-online.com/medicinalesflavonoides.htm Fecha: 4-102015, Hora: 16:00PM
http://www.hierbitas.com/principiosactivos/Taninos.htm Fecha: 4-10-2015, Hora: 16:00PM