IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIA PRESENTE EN SUELO DE PASTOREO EN LA GRANJA RIOFRÍO DEPARTAMENTO DE SANTANDER Freddy Fonseca García1. Natalia González Piñeres1 1. Universidad Industrial de Santander, Facultad de Ciencias, Escuela de Biología, Laboratorio de Microbiología, Grupo A2,
[email protected];
[email protected].
Resumen
Para el estudio se llevaron a cabo cuatro procedimientos principales: recolección, aislamiento, pruebas y análisis de resultados. Inicialmente se tomó una muestra de suelo de pastoreo, se rotuló y se llevó al laboratorio, donde se realizaron todos los procedimientos para obtener una bacteria aislada. Posteriormente se realizaron las pruebas morfológicas y bioquímicas propuestas. El análisis de los resultados obtenidos determinó que la bacteria obtenida se trata de un bacilo Gram positivo, formador de endosporas centrales perteneciente al género Bacillus sp.
Introducción
buen drenaje, de texturas franco arcillosa a arcillosa y con gran disponibilidad de
Como capa superficial de la corteza
nutrientes.
terrestre, el suelo está constituido por un conjunto complejo de elementos físicos,
Las propiedades biológicas del suelo son
químicos y biológicos en donde se
muy
desarrolla la vida. Esto, debido a que en
determinadas en primera instancia por la
él
y
microfauna, dentro de la cual se pueden
alimentan las plantas que son la base de
mencionar la poblaciones bacterianas,
la agricultura y la ganadería. Los suelos
las cuales mejoran las condiciones del
ideales para pastoreo se caracterizan por
suelo acelerando la descomposición y
ser moderadamente profundos y porque
mineralización de la materia orgánica.
su topografía se presenta en tierras con
Además,
pendientes inclinadas y complejas de
de antagonismo o sinergia, que permiten
moderada o baja fertilidad natural, de
un balance entre poblaciones dañinas y
mismo
se
anclan,
sostienen
importantes,
ya
que
están
entre ellas ocurren procesos
benéficas e igualmente la disminución de
Localización de la toma de muestra
los ataques a plantas. La bacteria
La muestra fue recolectada en la granja
identificada
Río
corresponde
al
género
Frío
Ltda,
localizada
Bacillus sp. y fue aislada de una muestra
geográficamente en las coordenadas 7°
de
3'
suelo
enriquecido
con
abono
16.02"
N, 73° 8'
42.07"O; que
orgánico, la cual fue recolectada en una
corresponden al Municipio de Girón
granja agropecuaria.
ubicado
en
el
departamento
de
Santander, Colombia. Se escogió una Objetivo:
Aislar,
caracterizar
y
zona dedicada a la ganadería moderada
determinar física y bioquímicamente una
en la que pastan entre 20-40 individuos
cepa bacteriana presente en el suelo de
vacunos. El suelo extraído presentaba
Pastoreo en la granja Riofrío.
una coloración oscura y una capa superficial de abono orgánico.
Materiales y métodos
Figura 1. Localización de la granja en la que se tomó la muestra de suelo. La flecha verde indica la zona de la que se recolectó dicha muestra. Fuente. Google Earth.
Figura 2. Fotografía de la zona en la que se recolectó la muestra de suelo. Fuente. Natalia González Piñeres. Parámetros de selección de la bacteria Análisis del laboratorio
aislada
La muestra colectada fue debidamente
Para seleccionar la bacteria de estudio,
rotulada y llevada al laboratorio 4 del
se tuvieron en cuenta diferentes patrones
edificio de Laboratorios Livianos de La
a nivel macroscópico y microscópico,
Universidad Industrial de Santander. Allí,
tales
fueron llevadas a cabo cada una de las
aisladas de similar morfología, el hábito
pruebas de
los
de crecimiento de la bacteria y el tamaño
procedimientos consignados en las guías
de las células. Siguiendo estos criterios,
de laboratorio de la escuela de Biología
se escogieron 4 colonias similares con
de la UIS (Carreño de Arango, 2005) y
formación de biofilm debido a que este
las técnicas sugeridas por los docentes
número
auxiliares.
evidenciaba una mayor capacidad de
identificación
según
como
y
el número de colonias
hábito
de
crecimiento
colonización y facilidad de cultivo. Por
otra
parte,
las
observaciones
seleccionó una colonia por caja y se
microscópicas permitieron apreciar una
realizaron
tres
tinciones
población de bacilos de gran tamaño, lo
siguiendo
el
protocolo
cual motivó la elección de dicha bacteria
(Koleman et al., 1988). Así se dispuso
con el fin de estudiarla e identificarla.
cada
colonia
sobre
de
Gram
propuesto
una
lámina
portaobjeto con una gota de solución Determinación de las Características:
salina
al
0,85%
y
se
adicionaron
morfológicas, fisiológicas y
consecutivamente los reactivos: Cristal
bioquímicas de la bacteria aislada
Violeta (Oxoid) durante 1 minuto; Lugol (Iodo) (Oxoid) durante 1 minuto; Alcohol-
Inicialmente,
se
realizaron
cuatro
Acetona 3:1 de Gram (Oxoid) durante 5
diluciones de la muestra, empleando
segundos;
100µL de la muestra y 900µL de buffer
0.25 g Safranina, 10cc de Alcohol al 95%
fosfato para mantener el PH estable y
y 100cc de agua durante 30 segundos.
evitar la proteólisis. Más adelante, las
Cada placa se dejó secar y se observó al
diluciones 2,3 y 4 fueron seleccionadas
microscopio.
para ser sembradas en cajas de Petri por
descripción de las células observadas en
estriación en el medio de cultivo agar
cada placa y se seleccionó una de ellas
nutritivo (AN) (Merck) preparado con
para
0,5% de peptona, 0,3% de extracto de
aislando una colonia en agar sólido y otra
carne y 0,15% de agar. Las cajas de
en medio líquido, el cual se selló con
Petri sembradas fueron incubadas a
parafilm.
37°C durante 24 horas. Pasado este
incubados a 37°C durante 24 horas y
tiempo, se revisó el crecimiento de
posteriormente refrigerados a 4°C.
la
y Safranina preparada con
Luego,
se
realizó
la
resiembra. Ésta se realizó
Estos
aislados
fueron
colonias en el medio. Una vez hecha esta revisión los cultivos fueron llevados
Para la caracterización e identificación
a refrigeración a 4°C para reducir su tasa
fisiológica y bioquímica de la bacteria
de crecimiento y metabolismo.
aislada se realizaron
las pruebas de:
Catalasa (Peróxido de Hidrógeno al 3%); Los cultivos fueron revisados 120 horas
oxidasa
después en el laboratorio y se realizó la
fenilendiamina);
caracterización
(agua estéril sobre placa portaobjeto);
morfológica
de
las
(Tiras
oxidasa
prueba
de
p-
motilidad
formación
cajas
Schaeffer-Fulton, verde de Malaquita);
Petri.
Posteriormente,
se
Endosporas
con
colonias presentes en cada una de las de
de
de
(Método
licuación de gelatina (Medio gelatina: 10g
Indol (agar SIM, reactivo de Kovacs)
peptona de carne, 10g de extracto de
(Merck).
carne, 5g Cloruro de sodio 10g Gelatina y 15g Agar-agar. Sulfato de Amonio 6M);
Para analizar la respuesta a antibióticos,
hidrólisis de almidón; Fermentación de
se empleó una colonia en medio líquido y
Lactosa (Agar MacconKey: Lactosa 10g,
se sembró en 2 cajas de Petri con medio
peptona de Caseína 3g, sales biliares
agar nutritivo (AN); se sembró en cada
1.5g, peptona de Gelatina 17g, rojo
una de ellas y se colocaron discos de
neutro 0.03g, cloruro de sodio 5g, violeta
antibióticos (Cloranfenicol, tetraciclina,
Cristal 0.001g, Agar 13.5g, pH final: 7.1 ±
fentamicina) y antisépticos (Peróxido de
0.2); Fermentación de sacarosa (Caldo
Hidrógeno 3%, Acohol Isopropílico 70% e
de sacarosa) (Merck) (Lab-Lemco poder
Hipoclorito de Sodio al 5%). Finalmente,
3g, peptona 5g, sacarosa 5g, rojo de
se observaron las respuestas a estos
Fenol 0.018g, pH final: 6.9 ± 0.2) ;
compuestos
Fermentación Glucosa - Vía Butanodiol
correspondientes resultados.
y
se
anotaron
los
Voges Proskauer (MR-VP) (Oxoid ltda) Resultados
(Extracto de carne 7g, D-Glucosa 5g, buffer fosfato 5g, pH final: 6.9 ± 0.2) ; Fermentación Glucosa – Ácido Mixta
Hecha la resiembra como se mencionó
(Rojo de Metilo); Producción H2S (Agar
en la metodología se obtuvieron colonias
SIM) (Merck) (Peptona de caseina 20g,
pequeñas de forma circular o irregular,
peptona de carne 6.6g, citrato de amonio
color crema, con apariencia de bordes
hierro 0.2g, tiosulfato sodio 0.2g, Agar
entrecerrada,
3g, pH final: 7.3 ± 0.2); Citrato (Sulfato
ondulada; las elevaciones de las colonias
Magnesio 0.2g, amonio di-Hidrógeno,
suelen
fosfato 1g, di-Potasio Hidrógeno, Fosfato
umbonadas; superficie opaca con anillos
1g, sodio Citrato tri-basico 2g, cloruro de
concéntricos, de consistencia seca y
sodio 5g, azul bromotimol 0.08g, agar-
ligosas. (Figura No. 2)
Agar 13g, PH final: 6.6 ± 0.2) (Merck);
ser
lobulada,
enteras,
digitiforme
convexas
y
o
Figura No. 2 Crecimiento en agar nutritivo, colonias ligosas, cremosas y opacas de 170 horas. Características morfológicas para la
Crecimiento
determinación
bacterias
Después de adicionar una asada de
presentes en el medio de cultivo
bacterias de 340 horas de cultivo en el
aislado.
medio
de
las
en
medio
liquido,
se
liquido.
observó
un
asentamiento en el fondo y una turbidez Tinción de Gram. Aplicada la técnica de
en el medio. (Figura No. 4)
tinción de Gram a una porción de bacterias de 170 horas de crecimiento,
Catalasa.
tomadas
peróxido de hidrogeno (H2O2) al 3% a
de
la
cepa
aislada,
se
Cuando
porción
se
tomada
adicionó
del
el
observaron al microscopio con objetivo
una
cultivo
de inmersión (100X) superbacilos de
bacteriano se observó una reacción
coloración morada, con formación de
positiva. (Figura No. 5)
esporangios centrales. (Figura No. 3) Oxidasa. Al haber adicionado una tira de Características
fisiológicas,
citocromo oxidasa sobre una colonia
bioquímicas y morfológicas para la
aislada en un medio de cultivo (Agar
determinación
Nutritivo),
de
las
bacterias
hubo
un
cambio
en
la
presentes en el medio de cultivo
coloración del sitio elegido, indicando
aislado.
una reacción positiva. (Figura No. 6)
Prueba de motilidad. Se colocó en
Fermentación de la lactosa. No hubo
contacto una porción de la colonia de
crecimiento en este medio, ya que es
tres semanas de cultivo con agua estéril,
selectivo para bacterias Gram Negativas,
se observó el movimiento de los bacilos
para el presente estudio se trabajó con
en microscopio (objetivo 40X), detallando
bacterias gran positivas.
una movilidad media, debida al tiempo. Fermentación de Sacarosa. Debido a la
(Figura No. 7)
fermentación de del carbohidrato en el Formación de esporas. Aplicada la
caldo, este torno a color amarillo, siendo
tinción con verde de malaquita (1.25 g),
una
que es un colorante débilmente básico, y
mediante
por tanto se une débilmente a la bacteria,
fermentación que produce ácidos fuertes.
se detectó la presencia de esporas y
(Figura No. 11)
endosporas
centrales
observadas
reacción el
positiva.
Esto
metabolismo
se
da
de
la
al
microscopio, de color verde (objetivo de
Fermentación Glucosa – Ácido Mixta.
inmersión 100X) (Figura No. 8)
La prueba fue positiva, porque los productos finales formados fueron ácidos
Licuación de la gelatina. Las colonias
orgánicos, que provocaron un fuerte
licuaron la gelatina, lo que significa que
descenso del PH inicial del medio. Esto
tiene la capacidad de producir enzimas
se detectó por la adición del indicador de
de tipo proteolítico (gelatinasas), que son
rojo de metilo. (Figura No. 12)
responsables
de
la
gelatinosis.
La
presencia de halos marcados con sulfato
Fermentación
de
las
Butanodiol. El Hidróxido de potasio y
proteínas resultantes de la reacción,
alfa naftol marcan los productos finales
presentando
que son compuestos neutros, que al
amonio
permite
una
diferenciar
reacción
positiva.
(Figura No. 9)
reaccionar
Glucosa
producen
un
-
color
Vía
rojo
característico. En esta prueba no hubo Hidrólisis de almidón. La presencia de
formación de dicha coloración por lo que
un halo transparente alrededor de la
es negativo.
colonia indicó que la prueba es positiva, es decir, que la bacteria ha hidrolizado el
Producción de H2O.
almidón mediante la amilasa.
cambio de color, siendo la prueba
No. 10)
(Figura
No se observó
negativa. El medio no libera ácido
sulfhídrico, por lo que no se forma
se hace que se libere el Indol, por tanto
precipitado negro o cambio de color.
no hubo cambio de coloración. Muestra negativa.
Indol. No cambio de color por la ausencia de la enzima triptofanasa, que
Esporangios
Figura No. 3. Bacilos Gram Positivos con esporangios de 170 horas.
Figura No. 4 crecimiento de bacterias en medio
líquido
de
170
horas
de
crecimiento.
Figura 5 Reacción Prueba de Catalasa
Figura 6 Prueba tira de citocromo
positiva.
oxidasa positiva.
Figura 7 Motilidad en bacilos positiva.
Figura esporas
Figura 9
Licuación
de
la
gelatina,
8
Tinción y
verde
endosporas
malaquita centrales.
Figura 10 Hidrólisis, presencia de halos.
marcada con sulfato de amonio.
Figura 11. Fermentación de sacarosa con rojo de fenol.
Figura positiva.
12
Fermentación
ácido-mixta
Grado de Patogenicidad
presencia de peróxido de hidrógeno en el Agar nutritivo. Este compuesto produce
Tetraciclina.
El
organismo
presentó
resistencia a la tetraciclina, un antibiótico
efectos oxidantes y radicales libres que atacan lípidos y proteínas.
que desacopla la fosforilación oxidativa y Hipoclorito de Sodio. Mostró un nivel
la síntesis proteica.
de
resistencia
intermedio,
siendo
Cloranfenicol. La bacteria presentó una
sensible ante la presencia de Hipoclorito
resistencia intermedia a este antibiótico
de sodio, el cual ataca los lípidos de las
que inhibe la síntesis proteica y bloquea
paredes y destruye encimas, matando la
la actividad de la péptido transferasa.
bacteria.
Gentamicina.
nivel
Alcohol Isopropílico. Se observó un
intermedio frente a la Gentamicina, la
nivel de resistencia mayor, lo que supone
cual interfiere en la síntesis normal de
que dicho antiséptico no es efectivo
proteínas.
es
contra el organismo estudiado. Por lo
efectiva con bacterias Gram Negativas,
general el alcohol Isopropílico hace que
en este caso es Gram positiva.
los lípidos de la membrana protectora se
Presento
Además
está
un
prueba
solubilicen, Pruebas con Antisépticos.
dejando
inofensiva
la
bacteria.
Peróxido de Hidrógeno. El organismo mostró un nivel de sensibilidad en
Figura 13. Antibióticos con presencia de halos de inhibición.
Figura 14. Prueba con antisépticos, inhibición intermedia.
PRUEBA
RESULTADO Forma
Características
del
cultivo
circular,
concéntrico.
y con
Superficie
BIBLIOGRAFÍA un
anillo rugosa.
Calvo-Zúñiga et. al, Ecología aplicada, Vol. 9, 2010
Umbonada y convexa. Margen entero y ondulado. Tamaño de la colonia 1cm aprox.
Crecimiento en medio
+
líquido Tinción de Gram Prueba de Catalasa
+
Sosa et al., 2011.
+
Myeong-Hoon Joo et al., 2007.
+
Prueba de Oxidasa
Myeong-Hoon Joo et al., 2007.
Prueba de Motilidad
+
Formación
+
de
Sosa et al., 2011.
Sosa et al., 2011.
Endosporas (Método Schaeffer-Fulton) Licuación de Gelatina
+
Sosa et al., 2011.
Hidrólisis de Almidón
+
Sosa et al., 2011.
Fermentación
-
Lactosa
de (Agar
2007.
MacconKey) Fermentación
de
+
sacarosa Fermentación Glucosa
–
Myeong-Hoon Joo et al.,
Sosa et al., 2011.
+ Ácido
Koleman et al. , 1983.
Mixta (Rojo de Metilo) Fermentación Glucosa -
-
Vía Butanodiol Voges
Cuervo, 2010.
Proskauer
Producción H2S
-
Bergey-Holt, et. al,2000
Citrato
-
Myeong-Hoon Joo et al., 2007.
Indol
-
Blanco et al. , 2009.
ANTIBIÓTICOS Género Bacillus sp. RESPUESTA
SUSTANCIA
DIÁMETRO DE
CLASIFICACIÓN
INHIBICIÓN Tetraciclina
Inhibición de
0.8 cm
Resistente
1.7 cm
Intermedio
1.4 cm
Intermedio
0 cm
-
crecimiento Cloranfenicol
Inhibición de crecimiento
Gentamicina
Inhibición de crecimiento
Control
-
ANTISÉPTICOS Peróxido de
Inhibición de
Hidrógeno
crecimiento
Hipoclorito de
Inhibición de
Sodio
crecimiento
Alcohol
Inhibición de
Isopropílico
crecimiento
control
-
Discusión
4.5 cm
Sensible
4.5 cm
Sensible
0.6 cm
Resistente
0.6 cm
-
horas.
Presenta
un
metabolismo
aeróbico facultativo, en el que participan La bacteria estudiada fue clasificada
enzimas
como un bacilo Gram positivo, de células
oxidasa, amilasa y proteasas que licúan
considerablemente
gelatinas. Estas últimas, junto con la
grandes,
cuyo
como
crecimiento se observa en colonias
resistencia
circulares,
antibióticos
cremosas,
opacas
y
que
catalasa,
presentó
como
la
citocromo
frente
a
tetraciclina,
umbonadas. Este microorganismo es
Cloranfenicol y Gentamicina sugieren
formador de endosporas centrales, las
que
cuales pueden ser visibles a partir de 24
patógena.
la
bacteria Cada
es
potencialmente una
de
las
características expuestas, especialmente
confianza en cuanto a la identificación de
el particular tamaño de sus células,
la bacteria.
indican
que
corresponde
la al
bacteria
género
Conclusión
aislada
Bacillus
sp,
posiblemente perteneciente a la especie
La bacteria aislada de la muestra de
B.
han
suelo corresponde al género Bacillus sp.,
determinado que esta bacteria juega un
esto, según los resultados de las pruebas
rol fundamental en el manejo de los
morfológicas, fisiológicas y bioquímicas.
nutrientes, dada su capacidad de fijar
La
nitrógeno en el suelo (Cuervo, 2010) y en
obtenidos fue complementada con los
el establecimiento y protección de la
recursos
plantas Arabidopsis thaliana y Phaseolus
sugieren que la bacteria en cuestión
vulgaris
puede pertenecer a la especie
megaterium.
(López-Bucio
Estudios
et
al.,
2007).
interpretación
de
los
bibliográficos,
Pruebas y análisis más profundos son
megaterium.
Se
requeridos para tener un mayor grado de
moleculares
para
resultados
los
requieren
cuales
B.
estudios
determinar
con
exactitud la especie.
Bibliografia Aksoy, et al. 2008. Isolation Of Bacillus Megaterium From Aphis Pomi (Homoptera: Aphididae) And Assessment Of Its Pathogenicity. Journal of Plant Pathology, Volumen 90 (3), páginas 449-452. Blanco et al. , 2009. Detección de Bacillus cereus toxigénicos en productos lácteos con especias y leches deshidratadas colectadas en Costa Rica. Cuervo, Jenny.2010. Aislamiento Y Caracterización De Bacillus Spp Como Fijadores Biológicos De Nitrógeno Y
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