IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS PRESENTES EN AGUAS FRESCAS POR TÉCNICAS MOLECULARES

Muestra


Pruebas


Teorico


Practico


Aguas frescas


* NMP (tubos 18×15 o tubos durham y tabla para NMP)
* Cuenta total (M. cultivo)
* Medios selectivos (ENDO, EMB)


Biologia molecular
¿Que bacterias estan presentes en teoria?


Revisar articulos


ADN de colonias


Electroforesis


PCR


RFLP´s Enzimas


Genbank


NEBcutter Y buscar enzimas































Junio, 2014





INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD VICTORIA
DEPTO. DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA


ASIGNATURA: Biología II

NOMBRE DEL CATEDRÁTICO: M. C. Martha Isabel Benavides Martínez

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN:
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS PRESENTES EN AGUAS FRESCAS POR TÉCNICAS MOLECULARES

ASESOR: Dr. Juan Flores Gracia.

INTEGRANTES:
Morelia Ruiz Garfias
Valeria Lizbeth Saldivar Núñez
Jesús Enrique Ramírez Castro
Giovanni Osmar Sánchez Ortiz
Alba del Rosario Alejandro Medrano
Grupo: 42
Introducción
Las aguas frescas son bebidas que se elaboran con frutas, en ocasiones leche condensada, cereales y/o semillas, además de agua y azucares para endulzar. Es una bebida tradicional mexicana, sin alcohol y que se consume fría, la finalidad no es tan solo refrescarse, sino que son fuente de vitaminas y minerales, que contribuyen a fortalecer el sistema inmunológico, y algunas de ellas tienen cualidades antioxidantes.
Suelen encontrarse en comercios donde las contienen en vitroleros o depósitos que pueden ser de plástico o de aluminio. Estos cumplen ciertas reglas sanitarias para dar a la venta pública, pero… ¿en realidad que tan "limpia" se pueden encontrar estas aguas frescas?, ¿Qué tipo de bacterias podemos encontrar en ellas? y si las hay, ¿estos microorganismos pueden causar infecciones al hombre? Los métodos de identificación de bacterias, son herramientas para poder responder a estas preguntas.
Una de ellas si queremos ser más precisos, tener una respuesta segura y rápida sería la PCR- RFLP's (Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica), la cual consta de extraer el DNA de las bacterias y luego cortar con enzima para así poder identificarlas (Dr. Juan Flores Gracia, comunicación personal).
Dados los problemas congénitos que presentan los sistemas de identificación fenotípicos (no todas las cepas de una misma especie muestran características homogéneas, una misma cepa puede generar diferentes patrones en ensayos repetidos y también las limitaciones en las bases de datos, entre otros), los métodos moleculares se han establecido como procedimientos complementarios, alternativos o incluso de referencia a los fenotípicos. En la década de los 80, comenzó la búsqueda de candidatos que, siendo genes estables, permitieran establecer relaciones filogenéticas entre las bacterias, como los genes que codifican para las subunidades ribosómicas 5S, 16S, 23S y sus espacios intergénicos. La conservación del gen ARNr 16S se observó por primera vez en el género Bacillus. Posteriormente, en la década de los ochenta se comenzó a explorar el papel taxonómico de este gen y a definir sus capacidades, estableciendo en los microorganismos procariotas dos

dominios (Archaea y Eubacteria). Posteriormente la última edición del Manual Bergey establece taxonómicamente dos dominios (Archaea y Bacteria). Hasta el 2003, se contabilizaron 1115 géneros y 6185 especies de Bacteria y 79 géneros y 281 especies de Archaea. Cada mes suelen describirse alrededor de 70 especies nuevas. (Cercenado, E. y Cantón, R.2010).
Objetivos generales
Demostrar la presencia de bacterias en aguas frescas que puedan ser infecciosas mediante técnicas moleculares.
Objetivos específicos
Aislar diferentes tipos de bacterias obtenidas a partir de diferentes aguas frescas en diferente medio de cultivo.
Detectar e identificar bacterias patógenas para el hombre en aguas frescas por el método de PCR-RFLP's.
Antecedentes
En artículo publicado en 1989 por la Revista del Consumidor, en su estudio por medio de técnicas microbiológicas en aguas frescas, reportan irregularidades higiénicas en el manejo y conservación del agua utilizada en su preparación, así como la presencia de Escherichia coli, esta bacteria puede causar graves enfermedades gastrointestinales.

En el estudio de DagmarUtzinger y colaboradores (1992), hablan en su trabajo "Calidad Microbiológica y Valor Nutricional de Frutas Frescas que se Venden en Puestos Callejeros", de una investigación de aguas frescas en estos puestos de San José, Costa Rica, en donde encontraron por medio de técnicas microbiológicas (número más probable y métodos de análisis cualitativos) a especies de bacterias como Salmonella spp y Shigella spp así como coliformes totales y fecales en las frutas que con mayor frecuenciase expenden en

dichos puestos; los resultados indicaron que más del 38% de las muestras de frutas presentan contaminación con coliformes totales y más del 30% con coliformes fecales. Asi mismo, se detectó en más de 10%de las muestras la presencia de E. coli alcanzándose porcentajes superiores al 20% en las muestras de nance (nombre que se le da a un fruto pulposo) y sandía, en donde reportan que para estas aguas no se aisló Salmonella spp ni Shigella spp.

El análisis del agua reveló que el 53% de ésta contenía coliformes fecales, lo cual probablemente se debe a la deficiente higiene de los utensilios que los vendedores ambulantes usan para recolectar este líquido.

Camacho, A., M.Giles, A. y colaboradores en 2011. En su trabajo "TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS", Utilizan varios métodos para la identificación de microorganismos entero patógenos en alimentos y aguas para evaluar la calidad sanitaria de los cuales nos dimos referencia. Ellos presentan diversos artículos de estos métodos como el "Análisis Microbiológico de Agua y hielo para consumo humano.(Determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica de Número más Probable (NMP)" que nos sirvió de referencia a que tipos de microorganismos podríamos encontrarnos; "Determinación de coliformes totales por cuenta en placa" que habla de la determinación de coliformes a trasvés de éste método y llegar a resultados; "Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico", todos estos artículos fueron base y referencia para los procedimientos.

Hipótesis
En las aguas frescas para consumo humano se encuentran bacterias entero-patógenas, al ser preparadas de una manera anti-higiénica y/o por contaminación, debido al mal manejo.

Metodología
Para la realización del presente estudio, se consultaron artículos de interés, relacionados con el tema. En lo que respecta a la obtención de las muestras de agua, se procedió a obtenerlas directamente de un establecimiento expendedor de aguas frescas, en donde se tomaron un total de tres muestras, una de agua de melón, otra de horchata y la última de frutas, esto con el objetivo de encontrar diferencias en las especies de bacterias, ya que cada una de estas aguas tienen diferente forma de preparación (agua de melón con leche condensada, azúcar, hielo y agua; la de horchata con arroz, canela, azúcar, hielo y agua; y la de frutas con, leche condensada,variedad de frutas, azúcar, hielo y agua).
En cuanto al trabajo de laboratorio, este se inicio con la limpieza previa y esterilización para dar comienzo a los métodos microbiológicos y moleculares, a continuación se describe la metodología utilizada en esta investigación:
Limpieza previa: Esta consistió en eliminar las partes de suciedad o residuos no infecciosos (resto de pegamento, cinta adhesiva, tinta de rotulado, etc.) del material utilizado como, tubos de ensayo y tubos durham; para esto se empleó el raspado con cepillo, esponjas metálicas, paños, etc. Así mismo se lavó este material repetidas veces bajo el chorro de agua corriente; una vez hecho esto se dejó secar en la rejilla de alambre boca abajo a temperatura ambiente.
Esterilización: Se esterilizó el material una vez lavado previamente, así como los medios de cultivo ya preparados (agar Nutritivo, agar EMB, caldo lactosado), estos se depositaron en el autoclave (vapor a presión) en un tiempo de 15-20min una vez llegada a la presión indicada.
Después de la limpieza y esterilización se nos proporciono un esquema de trabajo para conocer los pasos a seguir, y así cumplir con los objetivos señalados anteriormente.



ESQUEMA DE TRABAJO
Se realiza de nuevo la electroforesis para la extracción de PM de fragmentos para compararlos e identificar.
Se realiza de nuevo la electroforesis para la extracción de PM de fragmentos para compararlos e identificar.

Método: NÚMERO MÁS PROBABLE-333 (NMP)
Este método se basa en la determinación de presencia o ausencia de bacterias yestimación de la densidad de la población. Para esto se utilizaron 9 tubos de ensayode 18 x 100 con un tubo durham dentro para cada muestra, para lo cual se vertieron tres diferentes cantidades de caldo lactosado así como de la muestra:
Tres con 9 ml de caldo lactosado con 1ml de cada muestra.
Tres con 9.9 ml de caldo lactosado con .1ml de cada muestra
Tres con 10 ml de caldo lactosado con.01ml de cada muestra.
Posteriormente se depositaron a la incubadora por 24hrs a 37°C, ya que estas son las condiciones adecuadas para el posible crecimiento de las bacterias que se podrían encontrar en cada una de las muestras. (Ver tabla 1)

Método: CUENTA TOTAL (CT)
Para la realización de este método, una vez preparado el agar éste se vació en nueve cajas Petri dado a que se utilizaron tres cajas por cada muestra, ya que se tomaron en cuenta solo las tres últimas diluciones de las cinco que se realizaron (10-3, 10-4 y 10-5), estodebido a que su concentración sería menor y el conteo de las colonias presentes se facilitaría.
Una vez realizado lo anterior, en cinco tubos durham con .9ml de caldo lactosado se vertieron, .1ml de muestra en el primer tubo para luego así tomar de éste .1ml, vaciarlo en el siguiente tubo y así sucesivamente hasta llegar a la quinta dilución. Una vez acabado esto se incubaron por 24hrs a 37°C. (Ver tabla 2).



NMP 333
DISOLUCIÓN
MELON
HORCHATA
FRUTAS
9 ml – 1ml
+++
- - -
+++
9.9 ml – 0.1ml
+++
+ - -
+++
10 ml - 0.01ml
+++
- - -
++ -
Tabla 1. Resultados obtenidos en el método del NMP.

CT
MUESTRA
DILUSION
# COLONIAS
1
10ˉ3
18
1
10-4
5
1
10-5
0
2
10ˉ3
2
2
10-4
0
2
10-5
0
3
10ˉ3
0
3
10-4
1
Tabla 2. Resultados obtenidos del método CT.


Con los resultados del NMP se tomarontres tubos positivos (con o sin presencia de gas y presencia de turbidez) de la solución de 9.9ml de caldo lactosado, dado que este se presentó en todas las muestras como positivo;con la ayuda de una asa bacteriológica se tomó una muestra de cada uno de los tubos positivos y se sembraron en agar EMB, por el método de estría, siguiendo las condiciones de asepsia requeridas; posteriormente las placas de agar fueron incubadas a 37ºc por 24 hrs.








Purificación de la cepa.
Una vez observado el crecimiento y la morfología de las colonias en el agar EMB, para la obtención de cultivos puros, se tomó una muestra de cada una de las colonias que presentaban características diferentes (color, forma, textura, elevación) y se sembraron por separado en agar nutritivo, incubándose a 37ºc por 24 hrs.(Ver imágenes)








Transcurridas las 24hrs, se tomó una colonia de las cajas con agar nutritivo y se inoculó en 0.9ml de caldo lactosado, posteriormente se incubó por 24hrs a 37°C.







Para la obtención de ADN a partir de cultivos bacterianos, se utilizó el método deDNAzol.
A partir del cultivo bacteriano se toma 300µlde muestra y se coloca en un tubo de 1.5 ml, se agregan 300µl de DNAzol.
Se incuba por 1 hora; cada 10 min se mezcla.
Se centrifugapor 10 minutos a 5000 rpm.
El sobrenadante se transfiere a un tubo nuevo de 1.5 ml.
Se precipita el ADN, agregando 500µl de etanol al 100%.
Se mezcla porinversión.
Se centrifuga, 8 min a 8000 rpm para precipitar y obtener el ADN.
Se lava el precipitado (pellet) con 500µl de etanol al 75%; se centrifuga a 14500 rpm por 7 min.
Posteriormente seseca a temperatura ambienteelpellet obtenido. Disolver en 30 µl de agua ultra pura.
Se almacena las muestras de ADN obtenido a -20ºc, para su posterior análisis.









Electroforesis
Para preparar el gel de agarosa al 1.5%, se coloca buffer 1x sobre el soporte de la cámara de electroforesis.
Posteriormente se introduce el peine y se deja enfriar hasta que solidifique. Aprox. 15min.
Se agrega a la cámara de electroforesis, buffer 1x hasta cubrir el gel (1/2 cm de alto).
Para preparar la muestra de ADN, se hace una dilución de ADN mezclando 3µl de ADN con 1 µl de colorante.
Se cargan las muestras en los carriles.
Para separar las muestras de ADN se realiza la electroforesis a 100 volts durante 30 minutos.
Posteriormente el gelse observa en el transiluminador de LUV (Luz ultravioleta) para estimar la calidad y cantidad de las muestras de ADN.
Capturar imagen para resguardarlo.
En el ADN se coloco en los carriles 2, 4, 6 y 8, resultantes de las muestras de aguas de melón, horchata y las últimas dos de frutas correspondientemente.
Se observaron en el gel de agarosa al 1.5% bandas de ADN bien definidas, lo que indica que se obtuvo un ADN de buena calidad. Para realizar la PCR, las muestras de ADN fueron diluidas 1/20 (1µlde ADN en 19µlde agua ultra pura).


PCR
La PCR está diseñada según el principio natural de replicación de ADN. Es el proceso de tres pasos, designado como un ciclo, que se repite un númeroespecífico de veces.Un ciclo de PCR consiste en:
Desnaturalización
Alineación
Extensión
En la siguiente tabla se presentan las cantidades de cada uno de los reactivos utilizados en la PCR (Mix, Y1Y2 (primers),Taq polimerasa y DNA). Una vez realizada la mezcla se colocó en un termociclador por un periodo de 3 horas y media.
REACTIVO
CANTIDAD
mix
19.7µl
Y1Y2(primers)
2 µl
Taq polimerasa
0.3 µl
ADN (diluido)
3 µl
Tabla 3. Soluciones para la preparación dela mezcla de PCR.





ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE DNA
Se buscó la secuencia de nucleótidos de las bacterias que se consideraron estar presentes en las aguas frescas (Escherichia coli, Shiguella, Klebsiella y Salmonella) a través dela página NCBIó Gene Bank, para después hacer cortes simulados con enzimas de restricción (NEBcutter) para poder diferenciar a las bacterias.
RFLP's
Para visualizar los resultados de la PCR se realizo una electroforesis en un gel de agarosa al 1.5%.,los productos amplificados fueron cortados con la enzima de restricción Dde1, que fue la enzima que mejor referencia dio para la identificación de las bacterias de interés en el programa NEBcutter. Para poder comparar los pesos moleculares de los productos amplificados se dio el uso de un marcador de 10 fragmentos de ADN con rango desde 100 pb hasta 1000 pb con incrementos de 100 pb.
En la siguiente tabla se presentan las condiciones de digestión utilizadas para la enzima Dde1.
Reactivos
cantidad de muestra 1
cantidad de muestra 2
cantidad de muestra 3
cantidad de muestra 4
H2O
7.5 µl
12.5µl
14.5µl
14.5µl
Enzima
0.5µl
0.5µl
0.5µl
0.5µl
Buff.10x
2µl
2µl
2µl
2µl
DNA(PCR)
10µl
5µl
3µl
3µl







Tabla 4. Mezcla para realizar el corte con enzima.




Corte de producto amplificado (16s RNA ribosomal) con la enzima Dde 1 (carril 1, marcador; carril 2, muestra 2 de agua de horchata; carril 3 y 4, muestra 3 de agua de frutas)
Resultados
Para lograr la identificación de las bacterias presentes en las muestras de aguas frescas, se realizó una búsqueda de las secuencias de nucleótidos de las bacterias consideradas,a través de la página de Gene Bank (Banco de Genes). Una vez obtenidas las secuencias, se realizaron cortessimulados en la página de NEBcutter V2.0 con la enzima de restricciónDde1 para diferenciar las especies bacterianas. A través del programa UVIsoftUVImap Windows Application v10.02 se identificaron las bandas obtenidas a partir de la técnica de RFLP´s; obteniendo un patrón específico de corte, coincidiendo con los resultados de los cortessimulados.En los resultados del tamaño de los fragmentos puede haberdiferenciasentre 0 a 50 pb.
De acuerdo a los resultados obtenidos en los RFPL´s se logro la identificación de Enterococcusfecalis en las muestra de agua de horchata enel segundo carril. Para saber de qué bacteria se trataba, se buscó informacióndeque tipo de bacterias podían crecer en agar EMB, fue así que se dio con ésta que coincidía con los cortes, y que presentaba la morfología correcta al cultivo como son: colonias puntiformes, transparentes y pequeñas, además que en

el método del NMP mostraba solo un tubo positivo con turbidez en el caldo lactosado, dado a que esta bacteria no produce gas.
En el tercer carril se observo la presencia de Klebsiella que coincidió con los cortes simulados, además de tener de referencia los medios de cultivo que cumplían con las características morfológicas de ésta bacteria (colonias mucoides, rosa/violeta, lechosa/ acuosa) y en los tubos para el método NMP mostrando presencia de gas y turbulencia en el caldo lactosado, característica de esta bacteria presente, al igual que Escherichia Coli, puesto a que son bacterias fermentadoras. En el caso de Escherichia coli no se mostraron las bandas presentes en el cuarto carril por la falta de experiencia ante este tipo de trabajo en el laboratorio, pero supimos que se trataba de esta bacteria dada a las características morfológicas en el medio de cultivo EMB, colonias color negro verdoso con brillo verde metálico y que con los medios selectivos (pruebas estándar) podemos estar seguros de que se trataba de esta especie de bacteria.

Discusión
Las especies de bacterias que se encontraron en las aguas frescas fueron diferentes en cada una de las muestras, puesto a que los ingredientes utilizados son diferentes en cada una o varía como mínimo la contaminación que se pudo haber tenido al momento de manipular el producto. En el caso de las bacterias Klebsiella, y Escherichia coli, las cuales fueron positivas tanto en la muestra de agua de melón como en la de frutas, son más comunes en alimentos que incluyen productos lácteos y jugos no pasteurizados, frutas y hortalizas crudas, además de un manejo y almacenamiento insalubre de los alimentos preparados. Por otro lado las bacterias de la especie Enterococcus si se desarrollan en aguas pero no en medios de productos lácteos. Pero en general todas están entre las condiciones de crecimiento ya que son mesofílicas.

Con los artículos ya antes mencionados podemos citar que se encontraron algunas de esas bacterias ya antes referidas y se coincidió con algunas; pero a diferencia de ellos nosotros trabajamos además de las técnicas microbiológicas con las técnicas moleculares las cuales nos dieron un resultado más preciso y rápido por el cual identificamos a dichas bacterias.
Conclusión
Se cumplieron nuestros objetivos al demostrar que se detectó la presencia de bacteriasentero patógenas en las aguas frescas; se pudieron aislar en medios de cultivoestándar yselectivos(pruebas microbiológicas) y sedetectaron e identificaron las bacterias por elmétodo de PCR-RFLP's.
De las cuatro bacterias que propusimos solamente dos se identificaron Klebsiella y Escherichia coli y otra que no se esperaba, pero igual puede presentarse en las aguas frescas, que fue Enterococcus fecalis. Estas bacterias pueden ser patógenas al hombre dado a que son bacterias gastrointestinales, que pueden provocar ciertos síntomas, no tan graves pero si no se atienden se puede complicar y esto nos revela que hay una mala sanidad e higiene en la preparación de las aguas frescas.





Bibliografía/Referencias Literarias
Utzinger, D., Arias M. L.,etal., 1992. Calidad Microbiológica y Valor Nutricional de Frutas Frescas que se Venden en Puestos Callejeros. Sección de Microbiología de Alimentos. Facultad de Microbiología. Universidad de Costa Rica. San José, Costa Rica.
Artículo publicado en 1989 por la Revista del Consumidor, reporte especial "Aguas frescas".
Camacho, A., M. Giles, A. Ortegón, M. Palao, B. Serrano y O. Velázquez. 2011. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 3ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
Jang-Jih, Lu; Cherng-Lih, Perng; Shih-Yi, Lee; and Chih-Chieng, Wan. 2000. Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in Cerebrospinal Fluid. Journal of Clinical Microbiology.
Fernández Olmos, A.; García de la Fuente, C.; Saéz Nieto, J. A.; Valdezate Ramos, S. 2010. METODOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA. SEIMC. Edición N°1.

Referencias de Internet
NEW ENGLAND BioLabs Inc.

NCBI.


UVIsoftUVImap Windows Application v10.02

Biologia molecular
¿Que bacterias estan presentes en teoria?
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