NOTA CLÍNICA Hemoglobina Stanleyville II [78(EF7)Asn → Lys]. Primer caso descrito en España
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Fernando Ataúlfo Gonzáleza, Paloma Roperoa, Silvia de la Iglesiab, Marta Poloa, Celina Benaventea y Ana Villegasa a
Servicio de Hematología. Hospital Clínico San Carlos. Madrid. Servicio de Hematología. Hospital Dr. Negrín. Las Palmas de Gran Canarias. Las Palmas. España. b
FUNDAMENTO Y OBJETIVO: Las hemoglobinopatías estructurales son el resultado de mutaciones en los genes de globina que determinan una alteración cualitativa en la expresión de dichos genes. En la mayoría de ellas la alteración estructural no condiciona ningún cambio significativo, por lo que cursan de forma silente o asintomática. En este trabajo presentamos un nuevo caso de hemoglobina (Hb) Stanleyville II. PACIENTES Y MÉTODO: El probando es una mujer de 72 años, raza blanca y origen canario. En la analítica presentaba Hb de 14,3 g/dl, hematocrito del 44,4%, volumen corpuscular medio de 85,8 fl, Hb corpuscular media de 27,7 pg y concentración de Hb corpuscular media de 32,2 g/l; el índice de anisocitosis era del 15,1%, reticulocitos del 1,2%, HbA2 del 3,1% y HbF del 1,6%. En la electroforesis en acetato de celulosa a pH alcalino y en el isoelectroenfoque se separó una Hb anormal a la altura de la HbS. En agar citrato a pH ácido la Hb anormal no se separaba de la HbA. Por cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa se eluyó una cadena anormal más precoz que la normal. RESULTADOS: En el análisis molecular, que se completó con la secuenciación de los productos de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de los genes 1 y 2, se demostró la mutación AAC → AAA en el codón 78 del segundo exón del gen 2 en estado heterocigoto, que determina un cambio de asparagina por lisina. CONCLUSIONES: La sustitución de un aminoácido con carga neutra, como la asparagina, por otro con carga muy positiva, como la lisina, en el segmento EF, que corresponde a la superficie externa de la estructura terciaria de la cadena de globina, determina un cambio neto en la carga de la cadena. Esto permite su fácil diferenciación por métodos electroforéticos y cromatográficos. Sin embargo, como la localización no es fundamental para la estabilidad, solubilidad y afinidad por el oxígeno del tetrámero, cursa de forma silente o asintomática. La Hb Stanleyville II se había descrito hasta ahora en familias de raza negra del Congo, Uganda, Zaire, EE.UU., Alsacia y Brasil. Este caso representa el primero descrito en España.
Las hemoglobinopatías estructurales son el resultado de mutaciones en los genes que codifican las cadenas de globina de la hemoglobina (Hb), mutaciones que determinan una alteración cualitativa en la expresión de dichos genes1. La naturaleza y localización del aminoácido sustituido determinan cambios en la estabilidad, solubilidad y función (afinidad por el oxígeno) de la molécula de Hb, que finalmente son los responsables de las manifestaciones clínicas de las hemoglobinopatías2. Sin embargo, en la mayoría de ellas la alteración estructural no condiciona ningún cambio significativo, por lo que cursan de forma silente3. En este trabajo presentamos un nuevo caso de Hb Stanleyville II, que cursa de forma asintomática.
Palabras clave: Hemoglobinopatías. Alfatalasemia. Hemoglobina Stanleyville II.
Pacientes y método
Hemoglobin Stanleyville II [78(EF7)Asn → Lys]. First case described in Spain BACKGROUND AND OBJECTIVE: Structural hemoglobinopathies are the result of mutations in the genes of globin, which determine a qualitative alteration in the expression of these genes. Most alterations do not originate any significant change, and correspond to silent or asymptomatic forms. This study proves a new case of hemoglobin (Hb) Stanleyville II. PATIENTS AND METHOD: The propositus was a 72 years old Caucasian woman, from the Canary Islands. Her hematological data were: Hb 14.3 g/dl; hematocrit 44.4%; mean corpuscular volume 85.8 fl; mean corpuscular hemoglobin 27.7 pg; red cell distribution width 15.1%; reticulocytes 1.2%; HbA2 3.1% and HbF 1.6%. Electrophoretic studies in cellulose acetate electrophoresis at alkaline pH = 8.6 and isoelectrofocusing showed an anomalous Hb similar to HbS. The anomalous Hb did not appear in agar citrate electrophoresis (pH 6.0). The analysis by reverse phase high perfomance liquid chromatography for globin chains showed an X anomalous after A. RESULTS: Molecular analysis by sequentiation of the polymerase chain reaction products genes 1 and 2 showed the mutation AAC → AAA at CD78 of second gene 2 in heterozygote state, which leads the change of asparagine to lysine. CONCLUSIONS: The substitution of an amino acid with neutral charge like asparagine for another one with positive charge like lysine in the segment EF, which corresponds to the external surface of the tertiary structure of the chain of globin, determines the change of charge in the chain. This allows an easy differentiation by electrophoretic and chromatographic methods. Nevertheless, owing to its position in the chain, which is not critique for the stability, solubility and affinity for the oxygen allows for silent or asymptomatic forms. The Hb Stanleyville II had been described before in black families of the Congo, Uganda, USA, Alsace and Brazil. This case represents the first case described in Spain.
Key words: Hemoglobinopathies. Alpha thalassaemia. Hemoglobin Stanleyville II. Correspondencia: Dr. F.A. González. Servicio de Hematología y Hemoterapia. Hospital Clínico San Carlos. Prof. Martín Lagos, s/n. 28040 Madrid. España. Correo electrónico:
[email protected] Recibido el 7-2-2008; aceptado para su publicación el 27-3-2008.
El probando es una mujer de 72 años, de raza blanca y origen canario, con antecedentes de diabetes mellitus, en quien se observó una variante de Hb al realizar una determinación de Hb glucosilada. La sangre se extrajo en ácido edético y los parámetros hematológicos se midieron con un autoanalizador STKR Coulter (Coulter Electronics, Hialeach, Fl, EE.UU.). La HbA2 se determinó por cromatografía de intercambio aniónico4 y la cuantificación de la HbF se hizo siguiendo el método de Betke et al5. El estudio de Hb se realizó mediante electroforesis en acetato de celulosa a pH alcalino (pH: 8,6), isoelectroenfoque en gel de poliacrilamida (pH: 5,5-8,5), electroforesis en gel de agar citrato (pH: 6,0), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de fase reversa para cadenas de globina6 y HPLC de intercambio iónico7. La estabilidad de la Hb se determinó mediante el test del isopropanol8 y su función mediante la determinación de la P50 en la curva de equilibrio del oxígeno realizada en un TCS Hemox-Analyzer (TCS Medical Products Co., Huntingdon Valley, PA, EE.UU.)9. El estudio molecular para descartar la existencia de deleción de alfatalasemia se realizó por Southern blot, con las endonucleasas de restricción Bam HI y Bgl II, y las sondas (1,5 kilobases [kb] Pst I) y (1,8 kb Sac Y)10. El análisis molecular se completó con la secuenciación automática de los productos de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de los genes 1 y 2, con el equipo comercial de reacción ABI Prism TM dRhodamine Terminator Cycle Squencing Ready (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), y la secuencia se analizó en un secuenciador ABI Prism 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems)11.
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Fig. 2. Agar citrato. Carril 1: control ASC. Carril 2: probando. Carril 3: control AF.
β
42.28
48.552
38.112
31.285
28.717
22.298
15.11 15.837
Hemo
24.325
9.987
34.11
9.555
35.598
19.117
Fig. 1. Isoelectroenfoque. Carril 1: probando. Carril 2: control AFSC. Carril 3: individuo sano.
αχ αΑ
Fig. 3. Separación de cadenas de globina por cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa. Se eluyen cadenas A; X y A.
Fig. 4. Análisis secuencial del fragmento de ADN amplificado que contiene el gen 2. Secuenciación directa (A): AAC → AAA en el codón 78 del gen 2. Secuenciación reversa (B): GTT → TTT en el codón 78 del gen 2.
Resultados En el estudio hematimétrico la paciente presentaba: Hb de 14,3 g/dl, hematócrito del 44,4%, volumen corpuscular medio de 85,8 fl, Hb corpuscular media de 27,7 pg, concentración de Hb corpuscular media de 32,2 g/l, índice de anisocitosis del 15,1% y reticulocitos del 1,2%. La HbA2 constituía el 3,1% y la HbF el 1,6%. En la electroforesis en acetato de celulosa a pH alcalino y en el isoelectroenfoque se separó una Hb anormal, que
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se separaba a la altura de la HbS (fig. 1). En agar citrato a pH ácido la Hb anormal no se separó de la HbA (fig. 2). Por HPLC de fase reversa se eluyó una cadena anormal más precoz que la normal (fig. 3), y por HPLC de intercambio iónico, una Hb anormal que constituía el 20%. El test del isopropanol fue negativo y el estudio funcional de la Hb total fue normal (P50: 26 mmHg). El estudio por Southern blot con las endonucleasas de restricción Bam HI y Bgl II y las sondas (1,5 kb Pst I) y (1,8 kb
Sac Y) descartó la existencia de una deleción de alfatalasemia asociada. El estudio molecular (fig. 4) demostró la mutación AAC → AAA en el codón 78 del segundo exón del gen 2 en estado heterocigoto, que determina un cambio de asparagina por lisina. Discusión Las hemoglobinopatías estructurales constituyen, junto con las talasemias, las alteraciones monogénicas más frecuentes en
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el mundo y se erigen como uno de los problemas de salud pública más importantes en algunas regiones del planeta3. Hasta la actualidad se han descrito más de 800 variantes estructurales de la Hb. Sin embargo, en la mayoría de ellas la alteración estructural no condiciona ningún cambio significativo, por lo que cursan de forma silente o asintomática2. En el caso que se presenta, la sustitución de un aminoácido con carga neutra, como la asparagina, por otro con carga muy positiva, como la lisina, en el segmento EF, que corresponde a la superficie externa de la estructura terciaria de la cadena de globina, determina un cambio neto en la carga de la cadena. Esto permite su fácil diferenciación por métodos electroforéticos y cromatográficos12. Sin embargo, dado que la localización no es fundamental para la estabilidad, solubilidad y afinidad por el oxígeno del tetrámero, cursa de forma silente o asintomática13. La Hb Stanleyville II se ha descrito previamente en familias de raza negra del Congo, Uganda, Zaire, EE.UU. y Alsacia12-16. También se ha identificado en 4 individuos brasileños, 3 de raza negra y uno caucásico; en todos ellos estaba asociada a + talasemia por la deleción de 3,7 kb en el agrupamiento de globina. En estos últimos casos los autores refieren que la mutación molecular se en-
cuentra en el gen 117. Sin embargo, en nuestro caso, al realizar la caracterización molecular del ADN se observó que el cambio de la asparagina por una lisina en la posición 78 de la cadena de globina está condicionado por la mutación de una citosina por adenina en el tercer nucleótido del codón 78 en el segundo exón del gen 2 (AAC → AAA). Este caso representa el primero descrito en España y constituiría el segundo de raza diferente de la raza negra en la literatura médica.
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