Genetica Un Enfoque Conceptual Pierce

'^Cohesina

Separasa

Cohesina degradada Cromátida t

3>

I £.3?

Anafase

Metafase

(b) La cohesina a lo largo de los brazos del cromosoma mantiene unidos los homólogos en el quiasma.

H

Las monopollnas I mantienen los cinetocoros i hermanos orientados ; hacia el mismo polo.

I La cohesina a lo largo de los brazos cromosómicos se rompe y permite que los homólogos se separen...

I ...pero la cohesina en el centrómero está protegida.

I La cohesina en los centrómeros | se degrada, lo que permite que las cromátidas se separen.

Quiasma--.

Separasa

Degradación de ia cohesina a lo largo de los brazos

Metafase I

Separasa Degradación de la cohesina centromérica

Anafase II

Fig. 2-2 1. La cohesina y las monopollnas controlan la separación de las crom átidas y los crom osom as en (a) m itosis y (b) meiosis. mienzo de la meiosis la cohesina específica de la meiosis se en­ cuentra a lo largo de toda la longitud de los brazos de un cromoso­ ma y facilita la formación del complejo sinaptonémico (fig. 2-21b). La cohesina también actúa sobre los brazos del cromosoma de homólogos en los quiasmas, uniendo los dos homólogos unidos en sus extremos. Un grupo de proteínas llamadas monopolinas determina que los dos cinetocoros de las cromátidas hijas se orienten hacia el mismo polo en la metafase I y se fijen solo a los microtúbulos del mismo polo. En la anafase I la cohesina a lo largo de los brazos del cromo­ soma es degradada por la separasa, lo que permite que los dos ho­ mólogos se separen, pero la cohesina en el centrómero está pro­ tegida de la acción de la separasa; la cohesina centromérica se mantiene intacta e impide la separación de las dos cromátidas hermanas durante la anafase I de la meiosis. La combinación de cohesina centromérica y monopolinas 'asegura que los cromoso­ mas homólogos y no las cromátidas hermanas se separen duran­ te la anafase I (fig. 2-21b). Al fmal de la metafase II la cohesina centromérica ya no está protegida y se rompe bajo la acción de la separasa, lo que permite que las cromátidas hermanas se separen en la anafase II, al igual que lo hacen en la mitosis.

CONCEPTOS CLA¥E La cohesina mantiene unidas las cromátidas hermanas du­ rante la primera parte de la mitosis. En la anafase la separasa degrada la cohesina, lo que permite que las crom áti­ das hermanas se separen. La cohesina específica de la meiosis en el centrómero mantiene unidas las cromátidas hermanas durante la anafase I y las monopolinas orientan los cinetocoros hermanos hacia el mismo polo de modo que los cromosomas homólogos y no las cromátidas her­ manas se separen en la meiosis I. La degradación de la co­ hesina centromérica permite que las cromátidas hermanas se separen en la anafase II de la meiosis.

La meiosis en los ciclos vitales de las plantas y los animales El resultado global de la meiosis consiste en cuatro células haploides que son genéticamente variables. Veamos ahora cómo

37

38

Capítulo 2 Fig. 2-22. Las plantas alternan en tre estadios de vida diploides y haploides (femenino, / ; masculino, ? ).

•■Durante la meiosis el esporofito diploide (2n) produce esporas haploldes (1n) que se transforman en los gametofitos.

fe

^ Gam eto Ó

\

( V i Esporas

G am e tofito (haploide,

Durante la mitosis los gametofltos producen gametos haploides.

n) Fertilización

Q

...que se fusionan ; durante la fertilización I para formar un cigoto i dipioide.

Durante la mitosis el cigoto se transforma en el esporofito diplolde.

participa la meiosis en el ciclo vital de las plantas multicelulares y los animales multicelulares. La meiosis en las plantas. Casi todas las plantas tienen un ci­ clo vital complejo que incluye dos generaciones (estadios) distin­ tas: el esporofita dipioide y el gametofito haploide. Estos dos es­ tadios se alternan; los esporofitos producen esporas haploides mediante la meiosis y los gametofitos producen gametos haploi­ des mediante la mitosis (fig. 2-22). Algunas veces este tipo de ci­ clo vital se denomina alternancia de generaciones. En su trans­ curso los productos directos de la meiosis se llaman esporas, no gametos; las esporas atraviesan una o más divisiones mitóticas para producir los gametos. Aunque los términos utilizados para aludir a este proceso son algo diferentes de los que se emplean en forma habitual en relación con los animales (y de algunos de los utilizados hasta ahora en este capítulo), los procesos en las plantas y los animales son básicamente los mismos: en ambos ca­ sos la meiosis da lugar a una reducción del número de cromoso­ mas que produce células haploides. En las plantas que dan flores el esporofito es lá parte vegetati­ va obvia de la planta; el gametofito consiste solo en algunas cé­ lulas haploides dentro del esporofito. La flor, que es parte del es­ porofito, contiene las estructuras reproductivas. En algunas plan­ tas se hallan estructuras reproductivas masculinas y femeninas en la misma flor; en otras, estas estructuras se localizan en flores di­ ferentes. En cualquiera de los casos la parte masculina de la flor, el estambre, contiene células reproductivas diploides llamadas microsporocitos, cada una de las cuales atravesará la meiosis pa­ ra producir cuatro microsporas haploides (fig. 2-23a). Cada microspora se divide por mitosis para producir un grano de polen in­ maduro constituido por dos núcleos haploides. Uno de estos nú­ cleos, llamado núcleo del tubo, dirige el crecimiento de un tubo polínico. El otro, denominado núcleo generativo, se divide pot mitosis para producir dos células espermáticas. El grano de po­ len, con sus dos núcleos haploides, es el gametofito masculino. La parte femenina de la flor, el ovario, contiene células diploi­ des llamadas megasporocitos; cada uno de los megasporocitos

sufre una meiosis para producir cuatro m egasporas haploides (fig. 2-23b), de las cuales solo sobrevivirá una. El núcleo de la megaspora superviviente se divide tres veces por mitosis para producir un total de ocho núcleos haploides que forman el game­ tofito femenino, el saco embrionario. Entonces, la división del ci­ toplasma produce células separadas, una de las cuales se convier­ te en el huevo. Cuando la planta florece, los estambres se abren y liberan los granos de polen. El polen alcanza el estigma de una flor: una pla­ taforma pegajosa situada en la punta de un tallo largo llamado es­ tilo. En la base del estilo está el ovario. Si un grano de polen ger­ mina, da lugar a un tubo que crece a lo largo del estilo hacia el ovario. Las dos células espermáticas atraviesan este tubo y entran en el saco embrionario (fig. 2-23c). Una de ellas fertiliza a la cé­ lula huevo y se produce un cigoto dipioide que se desarrolla has­ ta convertirse en un embrión. La otra céíula espermática se fusio­ na con dos núcleos incluidos en una misma célula para dar lugar a un endospermo 3n (triploide) que almacena material nutricional y que será utilizado más tarde por la planta embrionaria. Estos dos acontecimientos de fertilización se denominan fertilización doble.

CONCEPTOS CLAVE En el estam bre de una planta que da flores la meiosis ‘ produce m icrosporas haploides que se d ivid e n por m i­ tosis para p roducir una célula esperm ática haploide en un grano de polen. Dentro del ovario la m eiosis produ­ ce cuatro m egasporas haploides, de las c u a le s solo una se d ivid irá tres veces por m itosis para producir ocho núcleos haploides. Durante la polinización una célu la esperm ática fertiliza la célu la huevo p ara produ­ cir un cigoto dipioide; la otra se fusiona con dos nú­ cleos para fo rm ar el endosperm o.

Cromosomas y reproducción celular

(a)

(b )

Qi ■

Estambre

P is t ilo ¡

Ovario— w i )

w

w

V ?!«: Microsporocito y'"' (diploide) ^

h I X mbre los I ‘ocitos diploides 1 sutren meiosis,,.

H I

Flor

D iploide,

...para producir cuatro microsporas haploides.

Cuatro microsporas (haploides)

Megasporocito (diploide) •

B '

Los megasporocitos diploides atraviesan

i

la meiosis...

2n I ...para producir cuatro megasporas haploides. pero una sola sobrevivirá.

Cuatro megasporas (haploides) Solo una sobrevive

! Cada una se divide por mrtosis para producir un grano de polen con do.s ,,,,n,údeos.h,apfoides.

r

Q i

Núcleo generativo ’ haploide

i El núcleo del tubo dirige el crecimiento de un tubo polínico.

Grano de polen

t y pora que sobrevive se divide tres veces por mltosis,...

2 núcleos

^ Núcleo del tubo haploide 4 núcleosí** 0 . ..para producir ocho ...j núcleos haploides.

Tubo polínico I El núcleo generativo ; por mltosis para prod dos células espermáticas.

8 núcleos ^ E l citoplasma se divi i para producir célula .... separadas,...

Dos células espermáticas haploides Núcleo del tubo

División^^ citoplasmática

m

Célula binucleada

• ]

.. . una de las cuales se convierte en el huevo.

\ m

Espermatozoide

y Clon

(c)

doble

ocurre cuando las dos células espermáticas de un

Endospermo (triploide, 3 m)

^ i

La L ; otra célula espe fusiona con la célula oinuclea fU! rmar un endospermo

10 de

polen entran en

el saco embrionario. 0 9 Una célula espermática

pioduce un cigoto diploide. I

Embrión (diploide, 2rí)

Fig. 2-23.

i

i fertiliza la célula huevo y se ;

Reproducción sexual en las plantas que dan flores.

Dos de los núcleos

!

.

quedan incluidos dentro

!

i

de la misma célula...

I

ÍB

■ ■ ■y

otros núcleos

i

se reparten en células

i

separadas.

39

40

CapítuLo 2 La meiosis en los animales. La producción de gametos en el macho, llamada espermatogénesis, tiene lugar en los testículos. Allí, las células primordiales diploides se dividen por mitosis pa­ ra producir células diploides llamadas esperniatogonias (fig. 2-24a). Cada espermatogenia puede sufrir mitosis repetidas, que dan origen a numerosas espermatogonias adicionales. Como alternativa, una espermatogonia puede iniciar la meiosis y entrar en la profase I. La célula, llamada ahora espermatocito prima­ rio, sigue siendo diploide porque los cromosomas homólogos aún no se han separado. Cada espermatocito primario completa la meiosis I para dar origen a dos espermatocitos secundarios haploides que luego atravesarán la meiosis II y producirán dos espermátidas haploides cada uno. Por tanto cada espermatocito primario genera un total de cuatro espermátidas haploides que maduran y se convierten en espermatozoides. La producción de gametos en la hembra, llamada ovogénesis, comienza en forma muy similar a la espermatogénesis. Dentro de los ovarios las células germinales primordiales diploides se divi­

(a ) Gam etogénesis m asculina (esperm atogénesis)

den por mitosis para producir ovogonias (fig. 2-24 b ). Al igual que las espermatogonias, las ovogonias pueden sufrir mitosis re­ petidas o bien entrar en la meiosis. Una vez en la profase I estas células aún diploides se denominan ovocitos primarios. Cada ovocito primario completa la meiosis I y se divide. En este momento el proceso de ovogénesis comienza a dife­ rir del proceso de espermatogénesis. En la ovogénesis, la citocinesis es desigual; la mayor parte del citoplasma es cedida a una de las dos células haploides, el ovocito secundario. La cé­ lula menor, que contiene la mitad de los cromosomas pero solo una pequeña parte del citoplasma, se llama primer cuerpo po­ lar, el que puede seguir dividiéndose o no. El ovocito secunda­ rio completa la meiosis II y, otra vez, la citocinesis es desigual: la mayor parte del citoplasma pasa a una de las células. La cé­ lula mayor, que adquiere la mayor cantidad de citoplasma, es el óvulo, el gameto femenino maduro. La célula más pequeña es el segundo cuerpo polar. Solo el óvulo puede ser fertilizado y los cuerpos polares generalmente se desintegran. La ovogéne-

(b ) Gam etogénesis fem enina (ovogénesis)

1En el testículo las espermatogonias

i En el ovano las,ovogonias pueden

i pueden sufrir rondas repetidas de mitosis

! atravesar rondas repetidas de meiosis y

i y producir más espermatogonias.

í producir ovogonias adicionales o...

Espermatogonia (2«)

Ovogonia (2«)

j Una espermatogonia puede entrar en la profase I

i ,, .entrar en la profase 1y transformarse

!; y convertirse en un espermatocito primario.

í en ovocitos primarios.

Espermatocito primario (2n)

Ovocito primario (2í i )

i Cada espermatocito primario completa

1Cada ovocito primario completa la meiosis I y

I la meiosis I, lo que pr

; produce un ovocito secundario grande y un

“

I espermatocitos secur

i cuerpo polar más peqi^eño, que se desintegra.

Espermatocito secundario (líi)

Ovocito secundario (In )

luego atraviesan la : II para producir dos látidas haploides : cada uno. q

Espermátidas (lo) p J ____________ L

Maduración '

• Prinner cuerpo polar i El ovocito secundario completa la meiosis II y i produce un óvulo y un segundo cuerpo polar i que también se desintegra.

Óvulo (1m)

#Segundo cuerpo polar

[Las espermátidas maduranj í hasta convertirsG ©n ; (espermatozoides, !

r Espermatozoides J

r

j

r

J

í Un espermatozoide y un óvulo se fusionan la fertilización para producir ly n cigoto diploide,.................... ..................

\durante

Cigoto (2n)

Fig. 2-24.

Formación de gam etos en los anim ales.

Cromosomas y reproducción celular sis, entonces, produce un solo gameto maduro a partir de cada ovocito primario. Hemos examinado el lugar de la meiosis en el ciclo sexual de dos organismos, las plantas que dan flores y un animal multice­ lular típico. Estos ciclos son solo dos de las tantas variedades en­ contradas entre los organismos eucariontes. Aunque los sucesos celulares que generan las células reproductivas en las plantas y ios animales difieren en el número de divisiones celulares, en el número de gametos haploides producidos y en el tamaño relativo de los productos finales, el resultado global es el mismo: la meio­ sis origina células haploides genéticamente variables que luego se fusionan durante la fertilización para producir la progenie diploide.

CONCEPTOS CLA¥E En los testículos una esperm atogonia diploide atraviesa la meiosis y produce un total de cuatro células espermáticas haploides. En el ovario una ovogonia diploide atra­ viesa la meiosis y produce un solo óvulo grande y cuer­ pos polares más pequeños que a menudo se desinte­ gran.

RELACION DE CONCEPTOS _

rNTRF C A P ÍT I£ í)S

de la genética. Hemos examinado cuatro conceptos principa­ les: 1) las diferencias que existen entre los procariontes y los eucariontes en cuanto a la organización y la condensación del material genético, 2) el ciclo celular y sus consecuencias gené­ ticas, 3) la meiosis, sus consecuencias genéticas y cómo difie­ re del ciclo celular de la mitosis y 4) qué papel desempeña la meiosis dentro del ciclo reproductivo de las plantas y los ani­ males. Varios de los conceptos presentados en este capítulo sirven como base importante para el estudio de los temas analizados en otros capítulos del libro. Las diferencias fundamentales en la organización del material genético de los procariontes y los eucariontes son importantes cuando exploremos *el funciona­ miento molecular del DNA. La presencia de las histonas en los eucariontes afecta la forma en que se copia (cap. 12) y se lee (cap. 13) el DNA. El contacto directo entre el DNA y los orgánulos citoplasmáticos en los procariontes, y la separación del DNA por la meinbrana nuclear en los eucariontes, tienen con­ secuencias importantes para la regulación génica (cap. 16) y el modo en que se modifican los productos génicos antes de tra­ ducirse a proteínas (cap. 14). La menor cantidad de DNA por célula en los procariontes también afecta la organización de los genes en los cromosomas (cap. 11). Un concepto crítico en este capítulo es la meiosis, que sirve como base celular de los cruzamientos genéticos en la mayor parte de los organismos eucariontes. Es la base de las reglas de la herencia presentadas en los capítulos 3 a 6 y también el fun­ damento de casi todos los demás capítulos de este libro.

En este capítulo se analizan los procesos que dan lugar a la reproducción celular, el punto de partida

RESUMEN ■ i f '

« Una célula procarionte posee una estructura simple, sin envol­ tura nuclear, y generalmente un solo cromosoma circular. La estructura de una célula euearionte es más compleja, con un núcleo y múltiples cromosomas lineales constituidos por DNA acoplado con histonas. « La reproducción celular requiere el copiado del material gené­ tico, la separación de las copias y la división celular. » El único cromosoma de una célula procarionte se duplica y cada copia se mueve hacia lados opuestos de la célula y se produce la división celular. e En las células eucariontes la reproducción es más compleja que en las células procariontes, puesto que se requieren los procesos de mitosis y meiosis para garantizar la transferencia de un juego completo de información genética a cada célula nueva. e En las células eucariontes los cromosomas se encuentran en pares homólogos. s Cada cromosoma funcional está constituido por un centrómero, un telómero y múltiples orígenes de replicación. Los centrómeros son los puntos en los que se ensambla el cinetoeoro

y a los que se unen los microtúbulos. Los telómeros son los extremos estables de los cromosomas. Después de que se ha copiado un cromosoma las dos copias permanecen unidas por el centrómero y se forman las eromátidas hermanas. 9 El ciclo celular, que está formado por los estadios por los que pasa una célula euearionte entre sus divisiones, consiste en: 1) la interfase, en la que la célula crece y se prepara para la divi­ sión, y 2) la fese M, en la que tienen lugar las divisiones nu­ clear y celular. Esta fase incluye la mitosis, el proceso de divi­ sión nuclear, y la citocinesis, la división del citoplasma. « La interfase comienza con Gj, fase durante la cual la célula crece y sintetiza las proteínas necesarias para su división, se­ guida de la fase S, durante la cual se duplica el DNA celular. La célula entra luego en la fase G^, en la cual ocurren otros acontecimientos bioquímicos necesarios para la división celu­ lar. Algunas células salen de la fase Gj y entran en un estado de no división llamado Gg. • La fase M comprende la profase, la prometafase, la metafase, la anafase, la telofase y la citocinesis. En estos estadios los cromosomas se contraen, la membrana nuclear se rompe y se forma el huso. Los cromosomas se alinean en el centro de la célula. Las eromátidas hermanas se separan y se convierten en

41

42

Capítulo 2 cromosomas independientes que luego migran a los extremos opuestos de la célula. La membrana nuclear se forma nueva­ mente alrededor de los cromosomas en cada extremo de la célula y el citoplasma se divide. • El resultado habitual de la mitosis es la producción de dos cé­ lulas idénticas desde el punto de vista genético. • Los microtúbulos están compuestos por tubulina y tienen ex­ tremos “+” y El movimiento de los cromosomas durante la anafase es a través de la eliminación de tubulina en los ex­ tremos “+” y » La progresión a lo largo del ciclo celular es controlada por la interacción de ciclinas con cinasas dependientes de las ciclinas. • La reproducción sexual, que produce una progenie genética­ mente variable y contribuye a una evolución acelerada, incluye la meiosis, en la cual se producen células sexuales haploides, y la fertilización, la fusión de células sexuales. La meiosis com­ prende dos divisiones celulares. Durante la meiosis I ocurre el entrecruzamiento y se separan los cromosomas homólogos. En la meiosis II se separan las eromátidas hermanas. • El resultado habitual de la meiosis es la producción de cuatro células haploides que son variables desde el punto de vista genético. • La variación genética en la meiosis se produce por el entrecruzamiento y por la distribución aleatoria de los cromoso­ mas maternos y paternos. • La cohesina mantiene unidas a las eromátidas hermanas. En

la metafase de la mitosis y la metalase II de la meiosis la hi­ drólisis de la cohesina permite que las eromátidas hermanas se separen. En la meiosis I la cohesina eentromérica se man­ tiene intacta y mantiene unidas a las eromátidas hermanas de modo que en la anafase I se separan los cromosomas homólo­ gos y no las eromátidas hermanas. • En las plantas los microsporocitos diploides de los estambres sufren la meiosis y cada uno produce cuatro microsporas ha­ ploides. Cada microspora se divide por mitosis para producir un niícleo del tubo haploide y dos células espermáticas ha­ ploides. En el ovario los megasporocitos diploides atraviesan la meiosis y cada uno de ellos produce cuatro macrosporas haploides, una sola de las cuales sobrevivirá. La megaspora que sobrevive se divide tres veces por mitosis para producir ocho niícleos haploides, uno de los cuales forma el huevo. Durante la polinización, una célula espermática fertiliza a la célula huevo y la otra se fusiona con dos núcleos haploides para formar un endospermo 3n. • En los animales las espermatogonias diploides inician la meiosis y dan origen a espermatocitos primarios diploides, los que luego completan la meiosis I para producir dos esper­ matocitos secundarios haploides. Cada espermatocito secun­ dario atraviesa la meiosis II y produce un total de cuatro cé­ lulas espermáticas haploides a partir de cada espermatocito primario. Las ovogonias diploides del ovario entran en la meiosis y se convierten en ovocitos primarios diploides, cada uno de los cuales completa la meiosis I para producir un ovo­ cito secundario haploide grande y un cuerpo polar haploide pequeño. El ovocito secundario completa la meiosis II y pro­ duce un óvulo grande haploide y un segundo cuerpo polar más pequeño.

TERMINOS IMPORTANTES proearionte (p. 18) eucarionte (p. 18) eubacteria (p. 18) arehaea (p. 18) núcleo (p. 18) histona (p. 18) cromatina (p. 18) par homólogo (p. 2 1 ) diploide (p. 2 2 ) haploide (p. 2 2 ) telómero (p. 23) origen de rephcación (p. 23) cromátida hermana (p. 23) ciclo celular (p. 23) punto de control (p. 24)

interfase (p. 24) fase M (p. 24) mitosis (p. 24) citocinesis (p. 24) profase (p. 25) prometafase (p, 25) metafase (p. 25) , anafase (p. 25) telofase (p. 25) cohesina (p. 27) motor molecular (p, 27) meiosis (p. 30) fertilización (p. 30) profase I (p. 30) sinapsis (p. 30)

bivalente (p, 30) tétrada (p. 30) entrecruzamiento (p. 31) metafase I (p. 31) anafase I (p. 31) telofase I (p. 31) intercinesis (p. 31) profase II (p. 31) metafase II (p, 31) anafase II (p. 31) telofese II (p. 31) reeombinación (p. 31) separasa (p. 36) securina (p. 36) microsporocito (p. 38)

microspora (p. 38) megasporocito (p. 38) megaspora (p. 38) espermatogénesis (p. 40) espermatogonia (p. 40) espermatocito primario (p. 40) espermatocito secundario (p. 40) espermátida (p. 40) ovogénesis (p. 40) ovogonia (p. 40) ovocito primario (p. 40) ovocito secundario (p. 40) primer cuerpo polar (p. 40) óvulo (p. 40) segundo cuerpo polar (p. 40)

Problemas 1. Una estudiante que examina una sección fina de la pun­ ta de una raíz de cebolla y registra el ntimero de células que están en cada estadio del ciclo celular observa 94 célu­ las en la interfase, 14 células en la profase, 3 células en la prometafase, 3 células en la metafase, 5 células en la ana-

fase y 1 célula en la telofase. Si un ciclo celular completo en la punta de la raíz de la cebolla requiere 2 2 horas, ¿cuánto dura en prom edio cada estadio del cielo? Suponga que todas las células se encuentran en Un ciclo celular acti­ vo (no en Gp).

Cromosomas y reproducción celular ®Solución Este problema se resuelve en dos pasos. Primero se calculan las proporciones de células en cada estadio del ciclo celular, que se corresponden con el tiempo que pasa una célula promedio en ca­ da estadio. Por ejemplo, si las células pasan el 90% de su tiempo en la interfase, entonces, en cualquier momento dado, el 90% de las células estarán en la interfase. El segundo paso consiste en convertir las proporciones en intervalos, lo que se consigue mul­ tiplicando estas proporciones por el tiempo de duración total del ciclo celular ( 2 2 horas). Paso 1. Calcule la proporción de células en cada estadio. La proporción de células en cada estadio es igual al número de célu­ las que se encuentran en ese estadio dividido por el niímero total de células examinadas: Interfase

94/j2o= 0,783

Profase Prometafase

2 0 = 0,117 3/,,o= 0,025

Metafase

3/,2o= 0,025

Anafase

5/i20= 0,042

Telofase

V,2 o= 0,008

Ahora podemos corroborar nuestros cálculos asegurándonos de que las proporciones sumen 1 , lo que es cierto. Paso 2. Determine la duración promedio de cada estadio. Para determinar la duración promedio de cada estadio multipli­ que la proporción de células en cada estadio por el tiempo de du­ ración del ciclo completo: Interfase Profase Prometafase Metafase Anafase Telofase

0,783 0,117 0,025 0,025 0,042 0,008

x x x x x x

22 horas 22 horas 22 horas 22 horas 22 horas 22 horas

= = = = = =

17,23 2,57 0,55 0,55 0,92 0,18

horas horas horas horas horas horas

2. Una célula en G] de la interfase posee 8 cromosomas. ¿Cuántos cromosomas y cuántas moléculas de DNA se encon­ trarán por célula a medida que esta célula progrese a través de los siguientes estadios: Gj, metafase de la mitosis, anafase de la mitosis, después de la citocinesis en la mitosis, metafase I de la meiosis, metafase II de la meiosis y después de la citocinesis de la meiosis II?

mitosis y la anafase II de la meiosis (los cromosomas homólogos, no las cromátidas, se separan en la anafase I de la meiosis). El nú­ mero de cromosomas, al igual que el número de moléculas de DNA, se reduce solo mediante la división celular. Apliquemos ahora estos principios al problema. Una célula en Gj posee 8 cromosomas, cada uno constituido por una sola cromátida; entonces, en Gj encontramos 8 moléculas de DNA. El DNA se duplica en el estadio S; entonces, en G 2 , hay 16 molécu­ las de DNA por célula. Sin embargo, las dos copias de cada mo­ lécula de DNA permanecen unidas por el centrómero y, por tan­ to, sigue habiendo solo 8 cromosomas. Mientras la célula atravie­ sa la profase y la metafase del ciclo celular, el número de cromo­ somas y de moléculas de DNA se mantiene constante; entonces, en la metafase, hay 16 moléculas de DNA y 8 cromosomas. En la anafase las cromátidas se separan y cada una se convierte en un cromosoma independiente; en este punto el número de cromoso­ mas aumenta de 8 a 16. Este aumento es temporal puesto que so­ lo dura hasta que la célula se divide en la telofase o después de ella. El número de moléculas de DNA sigue siendo de 16 en la anafase. El número de moléculas de DNA y de cromosomas por célula se reduce por citocinesis después de la telofase, porque los 16 cromosomas y moléculas de DNA se distribuyen en este pun­ to entre dos células. Por tanto, después de la citocinesis, cada cé­ lula posee 8 moléculas de DNA y 8 cromosomas, los mismos nú­ meros que había al comienzo del ciclo celular. Ahora busquemos los números de moléculas de DNA y de cro­ mosomas a lo largo de la meiosis. En Gj hay 8 cromosomas y 8 moléculas de DNA. El número de moléculas de DNA aumenta a 16 en el estadio S pero el número de cromosomas se mantiene en 8 (cada cromosoma está formado por dos cromátidas). Por tanto, la célula entra en la metafase I con 16 moléculas de DNA y 8 cro­ mosomas. En la anafase I de la meiosis los cromosomas homólo­ gos se separan, pero el número de cromosomas se mantiene en 8 . Tras la citocinesis, los 8 cromosomas originales se distribuyen en­ tre dos células, de modo que el número de cromosomas por célula desciende a 4 (cada uno con dos cromátidas). Las 16 moléculas de DNA originales también se distribuyen entre dos células de manera que el número de moléculas de DNA por célula es 8 . No hay sínte­ sis de DNA durante la intercinesis y cada célula aún conserva 4 cro­ mosomas y 8 moléculas de DNA durante la metafase II. En la anafase II las dos cromátidas de cada cromosoma se separan, lo que eleva el número de cromosomas por célula a 8 en forma tempora­ ria, mientras que el número de moléculas de DNA por célula se mantiene en 8 . Después de la citocinesis, los cromosomas y las mo­ léculas de DNA se distribuyen nuevamente entre dos células, lo que da origen a 4 cromosomas y 4 moléculas de DNA por célula. Estos resultados se resumen en el siguiente cuadro:

• Solución Estadio Recuerde las reglas acerca del recuento de cromosomas y mo­ léculas de DNA: 1) para determinar el número de cromosomas cuente el número de centrómeros funcionales y 2 ) para determinar el número de moléculas de DNA cuente las cromátidas. Pien­ se cuidadosamente cuándo y cómo cambian los números de cro­ mosomas y de moléculas de DNA en el curso de la mitosis y la meiosis. El número de moléculas de DNA solo se incrementa en la fase S, cuando el DNA se duplica, y solo disminuye cuando la célula se divide. El número de cromosomas se incrementa únicamente cuando las cromátidas hermanas se separan en la anafase de la

Número de cromosomas por célula

G, ^ 2

Metafase de la mitosis Anafase de la mitosis Tras la citocinesis de la mitosis Metafase I de la meiosis Metafase II de la meiosis Tras la citocinesis de la meiosis II

8 8 8

16

Número de moléculas de DNA por célula 8

16 16 16

8

8

8

16

4 4

8

4

43

44

Capítulo 2 PREGUNTAS DE COMPRENSIÓN 1. Mencione algunas diferencias genéticas entre las células

procariontes y las eucariontes. 2. ¿Por qué los virus que infectan las células de mamíferos son útiles para el estudio de la genética en estos anima­ les? *3. Enumere tres sucesos fundamentales que deben ocurrir durante la reproducción sexual.

11. ¿Por qué las dos células producidas por el ciclo celular

son genéticamente idénticas? 12. ¿Qué son los puntos de control? Mencione algunos de los

puntos de control importantes en el ciclo celular. ¿Cuáles son las dos clases generales de componentes que regulan la progresión a través del ciclo celular? 13. ¿Cuáles son los estadios de la meiosis y cuáles son los acon­

tecimientos más importantes que tienen lugar en cada uno? 4. Describa el proceso de reproducción de las células proca­ riontes. 5. Nombre tres elementos estructurales esenciales de un cro­

mosoma eucarionte funcional y describa sus írinciones. *6 , Esquematice y denomine cuatro tipos de cromosomas di­ ferentes según la posición del centrómero.

*14. ¿Cuáles son los resultados principales de la meiosis? 15. ¿Qué dos procesos propios de la meiosis explican la varia­ ción genética? ¿En qué punto de la meiosis tienen lugar estos procesos? *16. Enumere semejanzas y diferencias entre la mitosis y la meio­

sis. ¿Qué diferencias considera más importantes y por qué? 7. Enumere los estadios de la interfase y los acontecimientos

principales que tienen lugar en cada uno. *8 . Enumere los estadios de la mitosis y los eventos principa­ les que tienen lugar en cada uno.

17. Explique brevemente por qué las eromátidas hermanas se mantienen unidas en la anafase I pero se separan en la anafase de la mitosis y la anafase II de la meiosis.' 18. Describa el proceso por el cual se producen los gametos

9. Describa brevemente cómo se mueven los cromosomas

hacia los polos del huso durante la anafase. *10. ¿Cuáles son los resultados del ciclo celular que tienen im­

portancia desde el punto de vista genético?

masculinos en las plantas. Describa el proceso de forma­ ción de gametos femeninos en las plantas. 19. Describa el proceso de espermatogénesis en los animales.

Describa el proceso de ovogénesis en los animales.

PREGUNTAS Y PROBLEMAS DE APLICACION 2 0

. Una especie determinada tiene tres pares de cromosomas: un par acrocéntrico, un par metacéntrico y un par submetacéntrico. Dibuje una célula de esta especie como se ve­ ría si estuviera en la metafase de la mitosis.

*23. Todas las siguientes células, que se muestran en varios es­

tadios de la mitosis y la meiosis, provienen de una misma especie de planta extraña. ¿Cuál es el número diploide de cromosomas en esta planta? Indique el nombre de cada estadio mostrado de la mitosis o la meiosis.

21. Un biólogo examina una serie de células y cuenta 160 cé­

lulas en interfase, 2 0 células en profase, 6 células en prometafase, 2 células en metafase, 7 células en anafase y 5 células en telofase. Si el ciclo celular completo requiere de 24 horas, ¿cuál es la duración promedio de la fase M de estas células? ¿Y de la metafase?

.>

*22. Una célula en Gj de la interfase posee 12 cromosomas.

¿Cuántos cromosomas y cuántas moléculas de DNA se encontrarán por célula cuando esta célula original progre­ se hacia los siguientes estadios? a. Gj de la interfase b. Metafase I de la meiosis c. Profase de la mitosis d. Anafase I de la meiosis e. Anafase II de la meiosis f. Profase II de la meiosis g. Tras la citocinesis que sigue a la mitosis h. Tras la citocinesis que sigue a la meiosis II

24. Una célula posee x cantidad de DNA en Gj de la interfa­

se. ¿Cuánto DNA (en múltiplos o fracciones de x) habrá por célula en los siguientes estadios? a. G2 b. Anafase de la mitosis c. Profase II de la meiosis d. Tras la citocinesis asociada con la meiosis II 25. Indique si los siguientes eventos tienen lugar en la mitosis, la meiosis o en ambas. Marque todos los estadios po­ sibles.

Cromosomas y reproducción celular Acontecimiento Segregación independiente Separación de las cromátidas Entrecruzamiento Los pares bivalentes se alinean en la placa ecuatorial

Estadio(s)

26. Una célula en la profase II de la meiosis posee 12 cromo­ somas. ¿Cuántos cromosomas habría en una célula del mismo organismo si estuviera en la profase de la mitosis? ¿Y en la profase I de la meiosis? *27. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster posee cua­ tro pares de cromosomas, mientras que la mosca del ho­ gar Musca domestica posee seis. Suponiendo que el resto de las características sean iguales, ¿en qué especie espera­ ría ver más variación genética entre la progenie de un cru­ zamiento? Explique su respuesta. *28. Una célula posee dos pares de cromosomas submetacéntricos que llamaremos I.,, I^, 11^ y 11^, (los cromosomas I^ y son homólogos y los cromosomas 1 1 ^ y 1 1 ^ también). Él alelo M está localizado en el brazo largo del cromosoma I^ y el alelo m se encuentra en la misma posición en el cromosoma I^. El alelo P está localizado en el brazo corto del cromosoma I^ y el alelo p se encuentra en la misma posición en el cromosoma Ij^. El alelo R se localiza en el cromosoma 1 1 ^ y el alelo r en la misma posición del cro­ mosoma II,.

a. Dibuje estos cromosomas y señale los genes M, m, P, p, R y r según como aparecerían en la metafase I de la meiosis. Supon­ ga que no hay entrecruzamiento. b. Considerando la separación aleatoria de los cromosomas en la anafase I dibuje los cromosomas presentes (con los genes se­ ñalados) en todos los tipos posibles de gametos que se origi­ narían a partir de esta célula después de la meiosis. Suponga que no hay entrecruzamiento. 29. Un caballo posee 64 cromosomas y un burro 62. Un cruce

entre una yegua y un burro produce una muía, que gene­ ralmente es estéril. ¿Cuántos cromosomas posee una mula? ¿Se le ocurre alguna razón que explique el hecho de que la mayoría de las muías sean estériles? 30. Las células somáticas normales de los caballos poseen 64

cromosomas {2n - 64). ¿Cuántos cromosomas y molécu­ las de DNA se presentarán en los siguientes tipos de célu­ las de caballo? Tipo celular

Número Número de de cromosomas moléculas de DNA

a. Espermatogenia b. Primer cuerpo polar c. Ovocito primario d. Espermatocito secundario

PREGUNTAS AVANZADAS 31. Entre el 80 y el 90% de las anomalías cromosómicas más frecuentes en los seres humanos surgen porque los cro­ mosomas no se dividen correctamente en la ovogénesis. ¿Se le ocurre alguna razón que explique el hecho de que la falta de división de los cromosomas pueda ser más fre­ cuente en la gametogénesis femenina que en la gametogénesis masculina?

33. Las abejas hembras son diploides y los machos son ha-

ploides. Los machos haploides producen esperma y pue­ den aparearse en forma exitosa con las hembras diploides. Los huevos fertilizados se desarrollan en hembras y los huevos no fertilizados se desarrollan en machos. ¿En qué piensa que difiere el proceso de producción de esperma en las abejas macho del mismo proceso1

X V, X v: = alto X v: = V4 alto X ■v: = V4 enano

Nótese que existen dos formas de generar una progenie heterocigótica: un heterocigoto puede recibir el alelo T del primer pa­ dre y el alelo t del segundo padre, o recibir el alelo t del primer padre y el alelo T del segundo padre.

o Si tiramos H

un dado,.,,

•■■en promedio una de cada seis veces obtendremos un tres,, O ,,,y una de cada seis veces : obtendremos un cuatro.

Q

Entonces, la probabilidad de obtener un ; tres o un cuatro es Ve + Vs = ^/e= V4,

Fig. 3-7. Las reglas de la m ultiplicación y de la adición pueden utilizarse para detferminar la probabilidad de cier­ tas com binaciones de eventos.

Después de determinar las probabilidades de obtener cada tipo de progenie podemos utilizar la regla de la adición para especifi­ car las proporciones fenotípicas resultantes. Debido a la domi­ nancia, una planta alta puede poseer el genotipo TT, Tt o tT\ en­ tonces utilizando la regla de la adición podemos calcular la pro­ babilidad de la progenie alta, que será 4= ^/^. Dado que un tínico genotipo {tt) codifica el fenotipo enano, la probabi­ lidad de obtener una progenie enana es de V..

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56

Capítulo 3 Hasta‘el momento hemos introducido dos métodos para resol­ ver los cruzamientos genéticos: el cuadrado de Punnett y el mé­ todo de las probabilidades. En este punto usted debe estar pre­ guntándose cuál es el sentido de molestarse en hacer cálculos de probabilidades, ya que el cuadrado de Punnett es más sencillo y rápido. Para cruzamientos simples monohíbridos el cuadrado de Punnett es más simple y fácil de usar. Sin embargo, para analizar cruzamientos más complicados que involucran dos o más locus, el método de las probabilidades es más claro y rápido. La expansión binomial y las probabilidades. Cuando se utili­ zan probabilidades es importante tener en cuenta que existe tal vez más de una manera en la cual pueden ocurrir los eventos. Consideremos una pareja de padres en la que ambos son heterocigóticos para el albinismo, un trastorno recesivo que causa re­ ducción de la pigmentación de la piel, los ojos y el pelo en los se­ res humanos (fig , 3-8). Cuando se aparean dos padres heterocigóticos para el albinismo (Aa x Aa), la probabilidad de tener un hi­ jo albino (aa) es un cuarto y la de tener un hijo con pigmentación normal (AA oAa) es tres cuartos. Supongamos que queremos sa­ ber cuál es la probabilidad de que esta pareja tenga tres hijos, to­ dos con albinismo. Hay una sola manera por la cual pueden tener tres hijos con albinismo: el primer hijo es albino y el segundo hi­ jo es albino y el tercer hijo es albino. Aquí simplemente aplica­ mos la regla de la multiplicación: V4 x V4 x V4 = Vg^. Preguntémonos ahora cuál es la probabilidad de que esta pare­ ja tenga un hijo albino y otros dos hijos con pigmentación nor­ mal. La situación es más complicada. El primer hijo puede tener albinismo mientras que el segundo y el tercero no estar afectados; la probabilidad para esta secuencia de eventos es V4 x x = Alternativamente, el primero y el tercer hijo pueden tener pigmentación normal y el segundo hijo padecer albinismo; la probabilidad de esta secuencia es: V4 x x Por último, los primeros dos hijos pueden tener pigmentación normal y el ter­ cero padecer albinismo; la probabilidad de esta secuencia es: X X V4 = Dado que ta n to la primera secuencia como la se­ gunda o la tercera producen un hijo con albinismo y dos hijos normales podemos aplicar la regla de la adición y sumar las pro­ babilidades: % 4 + 9 /g4 + 9 /g4 = 27/^^^ Si quisiéramos calcular la probabilidad que tiene esta pareja de concebir cinco hijos, de los cuales dos padezcan albinismo y tres tengan pigmentación normal, se torna más complicado deducir las diferentes combinaciones de hijos y sus probabilidades. Eista tarea puede simplificarse si aplicamos la expansión binomial. El binomio toma la forma (a + by, donde a equivale a la pro­ babilidad de un evento, h ala probabilidad del evento alternativo y n al número de veces que ocurre el evento. Para deducir la pro­ babilidad de que dos de cinco hijos tengan albinismo: a = la probabilidad que tiene un hijo de padecer albinismo = V4 b - la probabilidad que tiene un hijo de presentar pigmentación

El binomio para esta situación es (a 4 - b)^ porque la pareja tie­ ne cinco hijos (n = 5). La expansión es: (a + b'f =

+ Sa'^b + lOa^tí^ + IQa^b^ + Sab'^ + b^

El primer término de la expansión (a^) equivale a la probabili­ dad de que los cinco hijos tengan albinismo, dado que a es la pro­ babilidad de tenerlo. El segundo término (Sa'^b) equivale a la probabilidad de tener cuatro hijos con albinismo y uno con pig-

Fig.

3 - 8 . El a lb in is m o en los s e r e s h u m a n o s s u e le here­ d a r s e co m o u n a c a ra c te rís tic a r e c e s iv a . (Richard Dranitzke/SS/Photo Researchers.)

mentación normal, el tercer término (lOa^b'^) equivale a la proba­ bilidad de tener tres hijos con albinismo y dos con pigmentación normal y así sucesivamente. Para obtener la probabilidad de cualquier combinación de eventos, insertamos los valores d e a y b; entonces la probabilidad de tener dos de cinco hijos con albinismo es: 10a2¿3 = 10(V4)2(%)3 = 270/^^^^

0,26

Utilizando los otros términos de la expansión podemos deter­ minar fácilmente la probabilidad de cualquier combinación de­ seada de albinismo y pigmentación. ¿Cómo expandimos el binomio en este ejemplo? En general, la expansión de cualquier binomio (a -1- b)" consiste en una serie de términos n + 1. En el ejemplo anterior con n = 5, entonces n + l = 6 términos: , Sa'^b, lOa'^b^, lOa^b^ , Sab^^y b^. Para escribir estos términos primero hay que determinar sus exponentes. El ex­ ponente de a en el primer término siempre comienza con la po­ tencia del binomio, es decir n. En nuestro ejemplo n = 5, enton­ ces el primer término es a^. El exponente de a decrece de a uno en cada término sucesivo; entonces el exponente de a es 4 en el segundo término (a"^), 3 en el tercer término (a^) y así sucesiva­ mente. El exponente de b es cero en el primer término (sin b) y va aumentando de a uno en cada término sucesivo, en nuestro ejemplo aumenta de O hasta 5. El siguiente paso es determinar el coeficiente de cada término. El coeficiente del primer término siempre es 1, por lo tanto en nuestro ejemplo queda la^, o simplemente a^. El coeficiente del

Principios básicos de La herencia segundo término es siempre el mismo que la potencia del bino­ mio (n), en nuestro ejemplo este valor es 5 y el término queda 5a*b. Para obtener el coeficiente del tercer término se debe mirar el término precedente; multiplicar el coeficiente (en nuestro ejemplo es 5) por el exponente de a en ese término (4) y luego di­ vidirlo por el número de término (en este caso es 2 , por ser el se­ gundo término). Entonces el coeficiente del tercer término de = 10 y el término queda nuestro ejemplo es (5 x 4)/2 = ÍOa^b^. Se debe seguir el mismo procedimiento para obtener ca­ da término sucesivo. Otra manera de determinar la probabilidad de una combinación particular de eventos es utilizar la siguiente fórmula:

CONCEPTOS CLA¥E La expansión binomial puede utilizarse para determ inar la probabilidad de una serie de eventos en particular. Un cruzam iento de prueba es un cruzam iento entre un indi­ viduo de genotipo desconocido y otro con genotipo homocigótico recesivo. El resultado del cruzamiento de prueba puede revelar el genotipo desconocido.

Dominancia Incompleta p =

s!t!

donde P equivale a la probabilidad total de un evento X con la probabilidad a de ocurrir í veces y de un evento Y con proba­ bilidad b de ocurrir t veces. Para nuestro ejemplo del albinis­ mo el evento X sería la ocurrencia de un hijo con albinismo (V4 ) y el evento Y sería la aparición de un hijo con pigmenta­ ción normal (^Z^); i’ igualaría al número de hijos con albinismo (2) y í al número de hijos con pigmentación normal (3). El sím­ bolo ! se denomina factorial y significa el producto de todos los intermedios desde n hasta 1. En este ejemplo n = 5; enton­ ces n! = 5 x 4 x 3 x 2 x 1. Aplicando esta fórmula para obtener la probabilidad de dos hijos con albinismo de un total de cinco hijos, obtenemos: P=

5! 2!3!

Este valor es el mismo que el obtenido con la expansión bino­ mial.

Cruzamiento de prueba Una herramienta útil para analizar los cruzamientos genéticos es el cruzamiento de prueba, en el cual un individuo de genoti­ po desconocido se cruza con otro de genotipo homocigótico re­ cesivo para el rasgo en cuestión. En la figura 3-6 se ilustra un cru­ zamiento de prueba (también llamado cruzamiento retrógrado), el cual revela el genotipo del primer individuo. Suponga que le entregan una planta de arveja alta sin ningu­ na información sobre sus padres. Dado que el fenotipo alto es un rasgo dominante en la planta de arveja, su planta podría ser tanto homocigótica (TT) como heterocigótica (Tí), hecho que no sería posible distinguir. Se podría determinar su genotipo a partir de un cruzamiento de prueba. Si la planta fuese homoci­ gótica (TT), el cruzamiento de prueba producirá toda la proge­ nie alta {TT x tt ^ todos Tí); si fuese de genotipo heterocigótico (Tt), el cruzamiento de prueba producirá la mitad de la progenie alta y la otra mitad enana (Tí x íí Tt y tt). Cuando se realiza un cruzamiento de prueba, cualquier alelo recesivo en el genotipo desconocido se expresará en la proge­ nie porque será apareado con un alelo recesivo del padre ho­ mocigótico recesivo.

Las siete características que Mendel eligió para estudiar exten­ samente en las plantas de arveja mostraban dominancia, pero ob­ servó que no todas las características tenían rasgos que exhibían dominancia. Llevó a cabo algunos cruzamientos relacionados con el tiempo que tardaban las plantas de arveja en florecer. Cuando cruzó dos variedades homocigóticas que diferían en su tiempo de floración en un promedio de 2 0 días, el tiempo que de­ moraron en florecer las Fj fue intermedio entre los tiempos de floración de ambos padres. Cuando el heterocigoto presenta un fenotipo intermedio entre los dos homocigotos se dice que ese rasgo muestra dominancia incompleta. El color del fruto de la planta de berenjena también exhibe do­ minancia incompleta. Cuando una planta homocigótica que pro­ duce frutos de color púrpura {PP) se cruza con una planta homo­ cigótica que produce frutos blancos (pp) toda la progenie Fj heterocigótica {Pp) produce frutos violáceos (fig. 3-9a). Cuando las plantas Fj se cruzan entre sí, la progenie F 2 produce de frutos color púrpura {PP), de frutos violáceos {Pp) y V4 de frutos blancos {pp), como se muestra en la figura 3-9b. Esta relación 1:2:1 es diferente de la relación 3:1 que se esperaría observar si el color del fruto de la berenjena exhibiera dominancia completa. Cuando un rasgo muestra dominancia incompleta las relaciones genotípicas y fenotípicas de la descendencia son iguales, porque cada genotipo tiene su propio fenotipo. Es imposible obtener plantas de berenjena puras para el fruto violáceo porque todas las plantas con frutos de este color son heterocigóticas. Otro ejemplo de dominancia incompleta es eí color de las plu­ mas de los pollos. Un cruzamiento entre un pollo homocigótico negro y un pollo homocigótico blanco produce una Fj de pollos grises. Si estos Fj grises son cruzados entre sí, producen pollos F2 en la relación 1 negro:2 grises:! blanco. En los caballos, las manchas de leopardo en el pelaje blanco presentan dominancia incompleta sobre el pelaje blanco sin manchas. Los caballos LL son blancos con muchas manchas oscuras, los heterocigotos Ll tienen menos manchas y los homocigotos ll son completamente blancos, sin manchas (fig. 3-10). En el capítulo 5 se analizan con mayor profundidad el concepto de dominancia y algunas de sus variantes.

CONCEPTOS CLAVE La dominancia incompleta aparece cuando el individuo heterocigótico presenta un fenotipo intermedio entre los dos fe­ notipos homocigóticos. Cuando un rasgo exhibe dom inan­ cia incompleta, el cruzamiento entre dos heterocigotos pro­ duce en la progenie las proporciones fenotípicas de 1 :2 : 1 .

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58

Capítulo 3 (a) Generación P Fruto púrpura

Fruto blanco

3 pp

PP

*

Gametos p

P

j

L-

‘

Fecundado

A

Generación F, Fruto violeta

** .

.

.

Fruto violeta

Fig. 3 - 1 0 . El pelaje de los caballos con m anchas de leopardo exhibe dominancia incompleta. (PhotoDisc.) Pp

Gametos P

Pp

p

p p j _____ I

1______ L

(b) Generación PP

Púrpura

Violeta

pp i 1

Violeta

Blanco

. Conclusión: Relación genotípica

|

1 P P :2 P p :\ pp

Relación fenotípica Ipúrpura: 2 violetas: 1blanco!

suele simbolizarse con una o más letras y un signo positivo (+). Las letras elegidas se basan en el fenotipo mutante (atípico). Por ejemplo, el alelo mutante que produce ojos amarillos en la mos­ ca de la fruta oriental se representa como ye (por yellow, que sig­ nifica amarillo en inglés), en tanto que el alelo para el color de ojos silvestre se representa como ye'*'. En otra manera de distin­ guir los alelos, si el fenotipo mutante es recesivo, la primera letra es minúscula y si el fenotipo mutante es dominante, es mayúscu­ la: por ejemplo, la hojuela angosta (In) de la soja es recesiva en relación con la hojuela ancha {Ln). Algunas veces, en el alelo sil­ vestre no se colocan las letras y solo se utiliza el signo positivo (-F). En algunos casos se utilizan superíndices o subíndices para distinguir entre los genes; Lfr, y Lfr 2 representan dos alelos do­ minantes en diferentes locus, que producen hojas de márgenes la­ cerados en la planta de amapola; representa un alelo que res­ tringe el largo de las orejas en las cabras. Para distinguir los alelos presentes en un genotipo individual se puede utilizar una barra oblicua. El genotipo de una cabra heterocigótica para orejas pequeñas puede escribirse como El'^/EP-, o simplemente +/El^. Si se escriben los genotipos correspondientes a más de un locus se los puede separar con un espacio. Una cabra heterocigótica para un par de alelos que prdducen orejas pequeñas y heterocigótica para otro par de alelos que producen bocio puede designarse como El'^/EP' G/g (del inglés goiter, bocio).

Fig. 3- 9. El color del fruto en la planta de berenjena se hereda como un rasgo de dominancia incompleta. INTEGRACIÓN DE CONCEPTOS

i

Proporciones en los cruzamientos simples Símbolos genéticos Como ya hemos visto, los cruzamientos genéticos suelen repre­ sentarse con símbolos para designar los diferentes alelos. Tradi­ cionalmente se utilizan las letras minúsculas para designar los alelos recesivos y las maytísculas para los alelos dominantes. Pa­ ra un mismo alelo pueden utilizarse dos o más letras; el alelo re­ cesivo que da forma de corazón a las hojas del pepino se designa como hl y el alelo recesivo que da forma anormal a la cabeza del espermatozoide del ratón se designa azh. El alelo más común para una característica (denominado sil­ vestre o w ild type, porque es el más frecuente en la naturaleza)

Ahora qtie hemos tenido alguna experiencia con los cruzamien­ tos genéticos podemos revisar las proporciones en que aparece la progenie de los cruzamientos simples, en los cuales se tiene en cuenta un único locus. Comprender estas proporciones y los geno­ tipos parentales que las producen nos permitirá analizar cruza­ mientos simples rápidamente, sin necesidad de realizar un cuadra­ do de Punnett. Luego utilizaremos estas proporciones para trabajar en cruzamientos más complejos que involucran varios loci. Solo hay que entender cuatro proporciones fenotípicas (cuadro 3-2). La proporción 3:1 surge del cruzamiento genético simple de ambos padres heterocigóticos para un rasgo dominante (Aa x Aa). La segunda proporción fenotípica es 1:2:1, que aparece en la

Principios básicos de La herencia

Cuadro 3-2 .............

Proporciones fenotípicas para los cruzamientos genéticos simples (cruzamientos para un solo locus)

proporción

G e n o tip o s p a re n ta le s

G e n o tip o s d e la p ro g e n ie

T ip o de d o m in a n c ia

3:1

Aa X Aa

V4

'A aa

Dominancia

1 : 2:1

Aa X Aa

V4

V 2 Aa: V 4 aa

D om inancia incom pleta

Aa X aa

y

Aa: y

2

Aa X AA

V 2 Ai?: y

2

A A xA A

Todos AA

Dominancia o dominancia incompleta

Aa X aa

Todos

aa

D om inancia o dom inancia incom pleta

AA X aa

Todos

Aa

D om inancia o dom inancia incom pleta

AA

Todos

Progenie uniforme

x

Aa

2

D om inancia o dom inancia incom pleta

Dominancia incompleta

AA

Dominancia

Nota: una línea en el genotipo, com o en A_, indica que cualqu iera de los alelos es posible.

progenie resultante del cruzamiento de dos padres heterocigóticos para una característica que exhibe dominancia incompleta (Aa X Aa). La tercera proporción fenotípica es 1:1, resultante del apareamiento de un padre homocigótico con un padre heterocigótico. Si la característica exhibe dominancia, para producir una proporción de 1 : 1 el padre homocigótico de este cruzamiento de­ be portar los dos alelos recesivos {Aa x ad), porque el cruzainiento de un padre homocigótico dominante y otro heterocigótico {AA X Aa) produciría toda la progenie con el rasgo dominante. Para una característica con dominancia incompleta, la proporción fe­ notípica 1 : 1 resulta del cruzamiento de un heterocigótico con cualquier homocigótico {Aa x aa, o A a X AA). La cuarta proporción fenotípica no es realmente una propor­ ción, ya que toda la progenie presenta el inismo fenotipo. Varias combinaciones parentales producen este resultado (cuadro 3-2). Un cruzamiento entre dos padres homocigóticos, ya sean idénti­ cos (A4 X AA o aa y. aa) o diferentes (AA x aa), producirá siem­ pre una progenie con fenotipos iguales entre todos los individuos. Una progenie con fenotipo igual también puede resultar de un cruzamiento de un padre homocigótico dominante y un padre he­ terocigótico {AA X Aa). Si nos interesan las proporciones genotípicas en lugar de las fe­ notípicas, solo hay tres resultados para recordar (cuadro 3-3): la proporción 1 :2 : 1 , producida por un cruzamiento entre dos heterocigotos; la proporción 1 : 1 producida por un cruzamiento entre un homocigoto y un heterocigoto; y la progenie uniforme producida por el cruzamiento entre dos homocigotos. Estas simples propor­ ciones genotípicas y fenotípicas, y los genotipos parentales que las producen nos proveen la clave para comprender los cruza­ mientos de un único locus y de loci múltiples, como se verá en la próxima sección.

Cruzamientos dihfbridos Además de sus trabajos en cruzamientos monohíbridos, Men­ del se dedicó a cruzar variedades que diferían en dos caracterís­ ticas (cruzamientos dihíbridos). Por ejemplo, tenía una varie­ dad de arvejas homocigóticas que producía semillas redondas y con el endospermo ainarillo y otra variedad homocigótica que producía semillas rugosas y con el endospermo verde. Cuando cruzó las dos variedades, toda la progenie Fj poseía semillas re­ dondas y con el endospermo amarillo. Luego autofecundó la Fj y obtuvo la siguiente progenie F 2 : 315 semillas redondas y ama­ rillas; 1 0 1 semillas rugosas y amarillas; 108 semillas redondas y verdes, y 32 semillas rugosas y verdes. Reconoció que estos rasgos aparecían en una proporción aproximada de 9:3:3:1; es decir que de la progenie eran redondas y amarillas, eran redondas y verdes, eran rugosas y amarillas y Vjg eran rugosas y verdes.

Cuadro 3-3

1 Proporciones genotípicas para Los cruzamientos genéticos simples (cruzamientos para un solo locus)

P ro p o rc ió n

1

:2 : 1

1:1

Cryzafnientos de toci múitíp Ahora extenderemos el principio de segregación de Mendel a los cruzamientos más complejos de alelos en loci múltiples. La comprensión de la naturaleza de estos cruzamientos requerirá un principio adicional: el de la distribución independiente.

Progenie uniforme

G en o tip o s p a re n ta le s

G e n o tip o s d e la p ro g e n ie

Aa X Aa

V 4 AA: y 2 Aa: V 4 aa

Aa X aa

V 2 Aa: y

2

Aa X AA

y

2

A A xA A

Todos AA

aa X aa

Todos aa

AA X aa

Todos Aa

2

Aa: y

AA

60

Capítulo 3 Principio de la distribución independiente

E x p e rim e n to P r e f u n ta ; ¿Los alelos que codifican diferentes rasgos se segregan de manera independiente? (a) M cio cio s

G e n e ra c ió n P Semillas redondas, amarillas

Semillas rugosas, verdes

rryy

RR YY

i Gametos

f)-'

RY"

(__

J Fecundado

(b)

Generación F,

Semillas redondas amarillas

RrYy

T Gametos R Y

1

T

ry

r¥

Ry

l

J Autofecundación

(c)

Resultados

Generación F 2 RY

ry

Ry

rY

RRYY

R rY y

RRYy

R rY Y

R rY y

rry y

R ry y

rr Yy

RY

ry

§•

J

RRYy

R ry y

RRyy

R rY Y

rr Yy

R rY y

Ry

■R rY y

y rrY Y

rV

Relación fenotípica 9 redondas, amarillas: 3 redondas, verdes; 3 rugosas, amarillas: 1 rugosa, verde

Conclusión: El alelo que codifica el color del endosperma se segregó de manera independiente del alelo que codifica la forma de las semillas, lo ^que produjo una relación 9:3;3:1 en la progenie F2 .

Fig. 3 - 1 1 , Los cruzamientos dihíbridos de Mendel revelaron el principio de la distribución independiente.

Mendel llevó a cabo un número de cruzamientos dihíbridos pa­ ra pares de características y siempre obtuvo una proporción de 9:3:3:1 en la F 2 . Esta proporción tiene un perfecto sentido con respecto a la segregación y la dominancia si le agregamos un ter­ cer principio que reconoció en sus cruzamientos dihíbridos: el principio de la distribución independiente (la segunda ley de Mendel). Este principio establece que los alelos que se encuen­ tran en loci diferentes se separan en forma independiente uno de otro. Un error frecuente es suponer que el principio de segregación y el de distribución independiente se refieren a dos procesos diferen­ tes. El principio de la distribución independiente es en realidad una extensión del principio de segregación. El principio de segregación establece que los dos alelos de un locus se separan al formarse los gametos; el principio de la distribución independiente establece que cuando esos dos alelos se separan, su separación es indepen­ diente de la separación de los alelos ubicados en otros loci. Veamos ahora cómo el principio de la distribución indepen­ diente explica los resultados que obtuvo Mendel en sus cruza­ mientos dihíbridos. Cada planta posee dos alelos que codifican cada característica, de manera que las plantas parentales deberían portar los genotipos RR YY y rryy (fig. 3-lla). El principio de se­ gregación indica que los alelos de cada locus se separap y que un alelo de cada locus pasa a cada gameto. Los gametos producidos por la planta de semillas redondas y amarillas contendrán enton­ ces los alelos RY, en tanto que los gametos provenientes de la planta parental de semillas rugosas y verdes contendrán los ale­ los ry. Al unirse estos dos tipos de gametos se produce una Fj en que todos los individuos poseen genotipo Rr Yy. Dado que el re­ dondo es dominante sobre el rugoso y el amarillo es dominante sobre el verde, el fenotipo de toda la Fj será redondo y amarillo. Cuando Mendel autofecundó las plantas de la Fj para producir la F 2 , se separaron los alelos de cada locus dirigiéndose un alelo hacia cada gameto. Aquí es donde cobra relevancia el principio de la distribución independiente. Cada par de alelos puede sepa­ rarse de dos maneras: 1) 7? se separa junto con Y y r se separa jun­ to con dando lugar a los gametos RY y ry; o 2) R se separa jun­ to con y y r se separa junto con Y dando lugar a los gametos Ry y rY. El principio de la distribución independiente dice que los alelos de cada locus se separan en forma independiente; es decir que ambos tipos de separación pueden ocurrir igualmente y los cuatro tipos de gametos {RY, ry, Ry, rY) pueden ser producidos en proporciones equivalentes (fig. 3 -llb ). Cuando estos cuatro tipos de gametos se combinan para producir la generación Fj, la pro­ genie queda constituida por ®/¡g semillas redondas y amarillas; ^/jg rugosas y amarillas; ^/,g redondas y verdes, y V,g rugosas y verdes, lo cual resulta en las proporciones fenotípicas de 9:3:3:1 (fig. 3-llc).

Relación entre el principio de la distribución independiente y la meiosis Una peculiaridad importante del principio de la distribución in­ dependiente es que se aplica a las características codificadas en loci ubicados en cromosomas diferentes porque, al igual que el principio de segregación, se basa por completo en el comporta­ miento de los cromosomas durante la meiosis. En la anafase I de la meiosis, cada par de cromosomas homólogos se separa inde-

Principios básicos de La herencia pendientemente de los otros pares (véase fig. 2-19); entonces los genes ubicados en diferentes pares de cromosomas homólogos se distribuirán de manera independiente. Los genes que se localizan en el mismo cromosoma viajarán juntos durante la anafase I y lle­ garán al mismo destino, dentro del mismo gameto (a menos que ocurra el entrecruzamiento). De esta manera, los genes ubicados en el mismo cromosoma no se distribuyen de manera indepen­ diente (a menos que estén ubicados lo suficientemente alejados como para que ocurra el entrecruzamiento en cada división meiótica, como se verá en el capítulo 7),

Redonda, amarilla

(a)

X

RrYy

RrYy

Ó ti cruzamiento dihíbrido se separa ! en aos cruzamientos monohíbridos P ro p o itiu n e s esp erada s para la prim era característica (forma)

Proporciones esperadas para la se gu n d a característica (color)

CONCEPTOS CLA¥E

Y)'

L El principio de la distribución independiente establece que los genes que codifican diferentes características se separan independientemente uno de otros cuando se for­ man los gametos, debido a la separación independiente de los cromosomas homólogos durante la meiosis. Sin embargo, los genes localizados en zonas cercanas dentro del mismo cromosom a no se separan de manera inde­ pendiente.

Cruzan-,;ento'

Cuando los genes de los dos loci se separan independientemen­ te, los cruzamientos dihíbridos pueden analizarse como dos cru­ zamientos monohíbridos. Examinaremos los cruzamientos dihí­ bridos de Mendel {Rr Yy X Rr Yy) considerando por separado ca­ da característica ( f i g . 3 -12a ) . Si consideramos solo la forma de las semillas, el cruzamiento sería Rr x Rr, lo cual daría en una proporción fenotípica de 3;1 (^/^ de semillas redondas y de se­ millas rugosas, véase cuadro 3-2). Luego consideremos la otra característica, el color del endospermo. El cruzamiento sería en­ tonces Yy X Yy, lo cual produciría una proporción fenotípica de 3:1 ( ^ / 4 de semillas amarillas y de semillas verdes en la proge­ nie). Ahora podemos combinar las proporciones de estos cruza­ mientos monohíbridos mediante la regla de la multiplicación pa­ ra obtener la proporción de la progenie esperada con las diferen­ tes combinaciones de forma y color de las semillas. La propor­ ción de progenie con semillas redondas y amarillas es: (la pro­ babilidad de semilla redonda) x (la probabilidad de semilla amarilla) = La proporción de progenie con semillas redondas y verdes es de x V4 = la proporción de progenie con se­ millas rugosas y amarillas es de x y la proporción de progenie con semillas rugosas y verdes es de x V4 = l/jg. Los diagramas ramificados constituyen un método convenien­ te para organizar todas las combinaciones de características (fig. 3-12b). En la primera columna, se enumeran las proporciones de los fenotipos para una característica (en este ejemplo es redon­ da y V4 rugosa). En la segunda columna, se enumeran las propor­ ciones de los fenotipos para la segunda característica (V^ amari­ lla y V4 verde), a continuación de cadauno de los fenotipos de la primera columna: colocar amarilla y verde al lado del fe­ notipo redonda y nuevamente al lado del fenotipo rugosa. Luego se dibujan líneas entre los fenotipos de la primera columna y ca­ da uno de los fenotipos de la segunda columna. Ahora se debe se­ guir el trazado de cada una de las ramas del diagrama, multipli-

X

T

¥4 1 1

Redonda

A m a r illa

1/4

rr

Rugosa

pe,

Proporciones esp e rad a s para a m b a s características

Y)J

R rY y V R r Y y

Cruzarrs.enio m - ..y se determina la I probabiiidad de cada i característica. i t

3/4

1/4 >y

Verde

E l Se combinan las probabilidades asociadas con las carac! terístícas individuales utilizando el método ramificado.

(b )

Aplicación de las probabilidades y del diagrama ramificado a los cruzamientos dihíbridos

Redonda, amarilla

¥4 ¥ 4

R_

1

¿R

Y

.

]

3/4 ;-r 3/4= 9 /,5

A m a r illa

i Redondas, am arillas 1

Redonda 1/4 yy V e rd e

.

¿ R yy ! 3/4 X 1/4=

3/ , g

^

i Redondas, ve rd e s

1

J rrY_

3 /4

A m a r illa

rr Rugosa 1/4

’A

yy

V e rd e

1

¥4 > ¥4= 3 / 1 6 i Rugosas, am a rillas

I» .

j i/4 y 1/4= ¥16 ' Rugosas, ve rd e s

Fig. 3 - 1 2 . Para determ inar los fenotipos y las propor­ ciones esperadas en la descendencia de un cruzam iento dihíbrido (Rr Yy x R r Yy) puede utilizarse un diagram a ramificado. cando las probabilidades de cada rasgo a lo largo de esa rama. Una rama conduce de redondo a amarillo, lo que produce una progenie de semillas redondas y amarillas. Otra rama conduce de redondo a verde, dando por resultado una progenie redonda y verde, y así sucesivamente. La probabilidad de obtener una pro­ genie con determinada combinación de rasgos se calcula utilizan­ do la regla de la multiplicación: la probabilidad de obtener semi­ llas redondas (^/¿^) y amarillas (^/^) es de x = ^/j^. La venta­ ja del diagrama ramificado reside en que permite tener en cuenta todas las posibles combinaciones de los rasgos que pueden apa­ recer en la progenie. Puede utilizarse para determinar las propor­ ciones genotípicas y fenotípicas de cualquier número de caracte­ rísticas. Para los cruzamientos que involucran loci múltiples es mucho más rápido utilizar las probabilidades que el cuadrado de Punnett. Las proporciones genotípicas y fenotípicas pueden calcular-

61

62

Capítulo 3 Redonda, amarilla

Rugosa, verde

go, podemos obtenerla rápidamente si dividinTos este cruzamien­ to en una serie de cruzamientos de locus simple:

X R rY y

rryy

Proporciones esp eradas Proporciones Proporciones esperadas para la prim era esperad as para la para am bas característica se gu n d a característica características

Rr X

rr

Cruzamiento

Yy X

R r Y y X rryy

yy

'r - í - I = L

Cruzamiento

Genotipo de la progenie

Aa X Aa B bx Bb cc X Cc Dd X dd Ee X Ee

aa bb cc dd ee

Vz Yy; , Amarilla

Rugosa

Vi yy Verde

V V

4

y

2

4

’A

Cruzamiento

V2 R r Redonda

Probabilidad

La probabilidad de que un descendiente de este cruzamiento tenga un genotipo aa bb cc dd ee puede ahora calcularse con fa­ cilidad utilizando la regla de la multiplicación: x x Vj x X V4 = V2 5 5 . Este cálculo presume que los genes de los cinco loci se distribuyen de manera independiente.

CONCEPTOS CLAVE

R rY y

Redondas, amarillas Rryy y z x ’A - m

^

Redondas, verdes

Un cruzam iento que incluye varias características puede analizarse dividiéndolo en varios cruzamientos de locus único y utilizando la regla de la multiplicación para deter­ m inar las proporciones de cada combinación de caracte­ rísticas (siempre que los genes se distribuyan de manera independiente).

rrY y

'/2Xl/2=t/4 Rugosas, amarillas

I

= Vi , Rugosas, verdes

Fig. 3-1 3. Un diagram a ram ificado puede utilizarse pa­ ra determ inar los fenotipos y las proporciones esperadas en la descendencia de un cruzamiento dihíbrido de prue­ ba (Rr Yy x rr yy).

se rápidamente combinando, mediante la regla de la multiplica­ ción, las proporciones simples de los cuadros 3-2 y 3-3. El méto­ do de las probabilidades es muy eficiente si necesitamos calcular la probabilidad de ocurrencia de un fenotipo o genotipo en parti­ cular dentro de la progenie de un cruzamiento. Supongamos que necesitamos conocer la probabilidad de obtener el genotipo Rr yy en la del cruzamiento dihíbrido de la figura 3-11. La probabi­ lidad de obtener el genotipo Rr en un cruzamiento Rr x Rr es de y 2 y la de obtener el genotipo yy en un cruzamiento Yy x Yy es de V4 (véase cuadro 3-3). Aplicando la regla de la multiplicación, calculamos que la probabilidad de obtener el genotipo Rryy es de '/2 X ’/ 4 = ‘/gPara ilustrar la ventaja del método de las probabilidades, con­ sideremos el cruzamiento Aa Bb cc Dd Ee x Aa Bb Cc dd Ee. Su- ’ pongamos que queremos calcular la probabilidad de obtener una descendencia con el genotipo aa bb cc dd ee. Si utilizáramos el cuadrado de Punnett para calcular esta probabilidad estaríamos trabajando durante meses hasta encontrar la solución. Sin embar­

Cruzamiento di híbrido de prueba Vamos a practicar el uso del diagrama ramificado para determi­ nar los tipos y proporciones fenotípicas en un cruzamiento dihí­ brido de prueba, entre las plantas F, de semillas redondas y ama­ rillas {Rr Yy) que Mendel obtuvo de sus cruzamientos dihíbridos y las plantas de semillas rugosas y verdes {rr yy) (fig. 3-13). Di­ vidiremos el cruzamiento en varios cruzamientos de locus tínico. El cruzamiento Rr x rr produce V2 de la progenie redonda {Rr) y V2 de la progenie rugosa (rr). El cruzamiento Yy x j y produce V2 de la progenie amarilla {Yy) y V2 de la progenie verde {yy). Utili­ zando la regla de la multiplicación, encontramos que la propor­ ción de progenie redonda y amarilla será de V2 (la probabilidad de redonda) x V2 (la probabilidad de amarilla) = V^. En la descen­ dencia aparecerán cuatro combinaciones de rasgos con las si­ guientes proporciones; de RrYy, redondas y amarillas; de Rr yy, redondas y verdes; de rr Yy, rugosas y amarillas; y de rr yy, rugosas y verdes.

Problema Los principios de la segregación y de la distribución independien­ te son importantes no solo porque explican cómo funciona la he­ rencia, sino porque también proveen los medios para predecir el resultado de los cruzamientos genéticos. Esta capacidad predictiva ha hecho de la genética una herramienta poderosa en la agri­ cultura y en otros campos, y la posibilidad de aplicar estos prin­ cipios es importante para todos los estudiantes de genética. La práctica es esencial; ninguna lectura ni memorización pueden

Principios básicos de La herencia sustituir la experiencia que se adquiere buscando las soluciones a los problemas específicos de genética. Los estudiantes pueden tener algunas dificultades cuando no están seguros por dónde comenzar o cómo organizar el problema y planear la solución. En genética cada problema es diferente, por lo tanto no hay una serie de pasos comunes que puedan aplicarse a todos. Es necesario utilizar la lógica y el sentido común para analizar el problema y llegar a la solución. Sin embargo, algunos pasos pueden facilitar el proceso; resolver el problema siguiente servirá como ilustración. En los ratones, el pelaje de color negro (B) es dominante res­ pecto del color marrón (¿>) y un patrón liso (S) es dominante res­ pecto del moteado blanco (í). Tanto el color como el patrón de moteado están controlados por genes que se distribuyen en forma independiente. Se cruza un ratón negro moteado con uno marrón liso, ambos homocigotos. Todos los ratones de la F, son negros y lisos. Luego se realiza un cruzamiento de prueba mediante el apa­ reamiento de los ratones de la Fj con ratones marrones moteados, a. Describa los genotipos de los padres y los ratones de la F j. b. Describa los genotipos y fenotipos, junto con sus proporcio­ nes, que se esperan de la progenie del cruzamiento de prueba. ®Solución

Paso 1. Determine las preguntas para ser respondidas. ¿Cuál es la pregunta o las preguntas que se formulan en este problema? ¿Se está preguntando acerca de los genotipos, las proporciones genotípicas o las proporciones fenotípicas? Este problema le pi­ de que describa los genotipos de los padres y de la F,, los geno­ tipos y fenotipos esperados de la progenie del cruzamiento de prueba y sus proporciones esperadas. Paso 2. Anote la información básica que da el problema. Este problema provee información importante acerca de las relaciones de dominancia de las características y de los ratones que están siendo cruzados. El negro es dominante respecto del marrón y el patrón liso es dominante respecto del moteado blanco. Además, los genes codificantes para estas dos características se distribu­ yen de manera independiente. Aquí se dan los símbolos para los diferentes alelos {B para el negro, b para el marrón, S para el liso y í para el moteado). Si no estuvieran, habría que elegirlos. Es útil registrarlos al comienzo de la solución: B—negro b—marrón

ben poseer por lo menos un alelo negro (B) y un alelo liso (S). Hasta este momento usted no puede estar seguro acerca de los otros alelos, entonces represente los genotipos de la El como B? S? Los ratones marrones moteados en el cruzamiento de prueba deben ser bb ss, porque tanto el color marrón como el patrón mo­ teado son rasgos recesivos que solo se expresarán si se presentan dos alelos recesivos. Registre estos genotipos en los cruzamien­ tos que ha escrito en el paso 2 : homocigoto marrón, liso bbSS

homocigoto negro, moteado BBss

negro, liso B? S? Cruzamiento de prueba

negro, liso

marrón, moteado

B? S?

bb ss

Paso 4. Fragmente el problema en partes más pequeñas. Pri­ mero, determine el genotipo de la Fj. Luego de determinar este genotipo, puede predecir los resultados del cruzamiento de_ prue­ ba y determinar los genotipos y los fenotipos de la progenie del cruzamiento. En segundo lugar, debido a que este cruzamiento involucra a dos loci que se distribuyen en forma independiente, sería conveniente desglosarlo en dos cruzamientos de locus úni­ co: uno para el color del pelaje y otro para el patrón de moteado del color. Tercero, utilice un diagrama ramificado para determi­ nar la proporción de la progenie del cruzamiento de prueba con diferentes combinaciones de los dos rasgos. Paso 5. Trabaje en las diferentes partes del problema. Co­ mience determinando el genotipo de la progenie F ,. La prime­ ra ley de Mendel indica que los dos alelos de un locus se sepa­ ran y cada uno va hacia otro gameto. Por eso, los gametos pro­ ducidos por el padre negro y moteado contienen los alelos Bs y los producidos por el padre marrón liso contienen los bS, los cuales se combinan para producir la progenie F, con el fenoti­ po BbSs: homocigoto marrón, moteado bb ss

homocigoto negro, moteado BB ss

S—liso s—moteado blanco

Luego, escriba los cruzamientos que se plantean en el problema. P

homocigoto negro, moteado

X

'I'

homocigoto marrón, liso

Gametos

V__

negro, liso Cruzamiento de prueba

negro, liso

0

x

marrón, moteado

Paso 3. Anote cualquier información genética que pueda de­ terminarse a partir de los fenotipos aislados. Por los fenotipos y conociendo que son homocigóticos, usted sabe que los ratones de la generación P deben ser BB ss y bb SS. Los ratones de la El son negros y lisos, ambos rasgos dominantes, y por lo tanto de-

F,

Y

J

Bb Ss

Utilice el genotipo de la F, para trabajar con el cruzamiento de jjrueba {Bb Ss x bb ss) disgregándolo en dos cruzamientos de lo­ cus únicos. Primero considere el cruzamiento para el color del pelaje: Bb x bb. Cualquier cruzamiento entre un heterocigoto y un genotipo homocigótico recesivo produce una progenie con una relación fenotípica L1 (véase cuadro 3-2):

6:

64

Capítulo 3

Bb

X

bb

V2 Bb negro Vj bb marrón Luego realice el cruzamiento para el patrón de moteado: Ss x ss. Este cruzamiento también es entre un heterocigoto y un genotipo homocigótico recesivo y producirá una progenie lisa (Ss) y V2 moteada (,m) (véase cuadro 3-2). Ss

X

ss

La prueba de bondad de ajuste de %2

i

V2 Ss liso V2 > 5 5 moteado Por último, determine las proporciones de la progenie con com­ binaciones de estas características utilizando el diagrama ramifi­ cado. V2 Ss liso

■—-►

1 uL negro debemos de­ terminar primero cuáles son los resultados esperados. La prueba de la yj- siempre debe aplicarse a los números de la progenie, nun­ ca a las proporciones ni a los porcentajes. Consideremos un locus para el color del pelaje en los gatos domésticos, para el cual el co­ lor negro (B) es dominante sobre el gris (b). Si cruzamos dos ga­ tos negros heterocigóticos (Bb x Bb), esperaríamos una propor­ ción de gatitos negros y grises de 3:1. Una serie de cruzamientos de este tipo produjo un total de 50 gatitos, 30 negros y 20 grises.

Principios básicos de La herencia Estos números son nuestros valores observados. Podemos obte­ ner los valores esperados multiplicando las proporciones espera­ das por el número total de la progenie. En este caso el número es­ perado de gatitos negros sería x 50 = 37,5; y el número espe­ rado de gatitos grises sería V4 x 50 = 12,5. El valor de la y} se calcula utilizando la siguiente fórmula: (observados - esperados)^ x 2 = Eesperados donde X representa la sumatoria de las diferencias entre los valo­ res observados y los esperados, elevadas al cuadrado y divididas por los valores esperados. Para calcular el valor de y} para los ga­ titos negros y grises, en primer lugar deberíamos restar el núme­ ro de gatitos negros observados menos el número de gatitos ne­ gros esperados (30 - 37,5 = -7,5) y elevar este número al cuadra­ do: -7,5^ = 56,25. Luego dividimos este resultado por el número de gatitos negros esperados; 56,25/37,5 = 1,5. Repetimos los cál­ culos para los gatitos grises: (20 - 12,5)^712,5 = 4,5. Para obtener el valor final de sumamos los valores (observados-esperados)^'/esperados: 1,5 + 4,5 = 6,0. El paso siguiente consiste en determinar la probabilidad aso­ ciada con este valor de calculado, que es la probabilidad de que la desviación entre los valores esperados y los observados se deba al azar. Este paso requiere la comparación del valor obteni­ do de (6 ,0 ) con los valores teóricos que poseen los mismos grados de libertad en una tabla de Los grados de libertad re­ presentan el número de formas en las cuales las clases observa­

Cuadro 3-4

das son libres para variar. En la prueba de bondad de ajuste de los grados de libertad son iguales a n - 1 , donde n es el número de fenotipos diferentes esperados. En nuestro ejemplo tenemos dos fenotipos esperados (negro y gris); entonces n = 2 y los gra­ dos de libertad son 2 - 1 = 1 . Ahora que ya hemos calculado el valor de y obtenido los grados de libertad asociados, podemos obtener la probabilidad mediante una tabla de (cuadro 3-4). Los grados de libertad es­ tán indicados en la columna de la izquierda y las probabilidades, en la parte superior del cuadro; en el cuerpo del cuadro se indi­ can los valores de asociados con estas probabilidades. Prime­ ro encontremos la fila correspondiente a los grados de libertad apropiados; en nuestro ejemplo con 1 grado de libertad corres­ ponde a la primera fila del cuadro. Luego, debemos encontrar a lo largo de esa fila el valor teórico que mejor coincide con nues­ tro valor de calculado (6,0). Los valores teóricos de aumen­ tan de izquierda a derecha a lo largo de la fila y los valores de las probabilidades disminuyen en ese mismo sentido. Nuestro valor de de 6,0 se ubica entre el valor de 5,024, asociado con una probabilidad de 0,025; y el valor de 6,635, asociado con una pro­ babilidad de 0 ,0 1 . Entonces la probabilidad asociada con nuestro valor de es menor de 0,025 y es mayor de 0,01. Esto significa que existe me­ nos del 2,5% de probabilidad de que la desviación obtenida entre los valores observados y esperados de gatitos negros y grises se deba al azar. La mayor parte de los científicos utiliza un nivel de probabili­ dad de 0,05 como su valor de línea de corte: si la probabilidad de que el azar sea el responsable de la desviación observada es igual

Valores críticos de la distribución 0,1

0,05

0,025

0,01

0,455

2,706

3,841

5,024

6,635

7,879

0,211

1,386

4,605

5,991

7,378

9,210

10,597

0,216

0,584

2,366

6,251

7,815

9,348

1 1,34.5

12,838

0,207

0,484

1,064

3,357

7,779

9,488

11,143

13,277

14,860

5

0,412

0,831

1,610

4,351

9,236

1 1,070

12,832

1 5,086

16,750

6

0,676

1,237

2,204

5,348

10,645

12,592

14,449

16,812

18,548

7

0,989

1,690

2,833

6,346

12,017

14,067

16,013

18,475

20,278

8

1,344

2,180

3,490

7,344

13,362

15,507

17,535

20,090

21,955

9

1,735

2,700

4,168

8,343

14,684

16,919

19,023

21,666

23,589

10

2,156

3,247

4,865

9,342

15,987

18,307

20,483

23,209

25,188

11

2,603

3,816

5,578

10,341

17,275

19,675

21,920

24,725

26,757

12

3,074

4,404

6,304

1 1,340

18,549

21,026

23,337

26,21 7

28,300

13

3,565

5,009

7,042

12,340

19,812

22,362

24,736

27,688

29,819

14

4,075

5,629

7,790

13,339

21,064

23,685

26,1 19

29,141

31,319

15

4,601

6,262

8,547

14,339

22,307

24,996

27,488

30,578

32,801

0,995

0,975

1

0,000

0,000

0,016

2

0,010

0,051

3

0,072

4

GL

p, probabilidad; CL, grados de libertad.

0,9

0,5

0,005

6E

66

Capítulo 3 riaciones entre los valores observados y los esperados, a menos que exista una fuerte evidencia que indique lo contrario. Es im­ portante tener en cuenta que aunque obtengamos una probabili­ dad de, por ejemplo, 0 ,0 1 , aun existe un 1 % de probabihdad de que las diferencias entre los valores observados y los esperados se deban solo al azar. En la figura 3-14 se ilustra el cálculo del valor de

G e n e ra ció n P Flores púrpuras ■

Flores blancas

X

T Cruzam iento

Generación F 1

Una planta con flores púrpuras se cruza con una planta de flores blancas y la F, se autofecunda...

Flores pút puraí

I Autofecundación ^ G e n e r a c ió n F 2

4-

--- -í ...para producir en la progenie ---- ^ ---- F2 105 individuos con flores ^ ; púrpuras y 4 5 individuos con 105 púrpuras ¡ flores blancas (una proporción 45 blancas i aparente de 3:1),

3/4

x

1 5 0

= 112,5

Blancas

1/4

x

1 5 0

=

Total

= =

= = x' =

(105-1 12,5)^ 112,5

56,25 1 1 2

,5

0,5

+ +

(45-37,5)^ 37,5 y luego se calcula ef valor 56,25 37,5

+

Grados de libertad = n -1 Grados de libertad = 2-1 = 1 Probabilidad (del cuadro 3-4) 0,1 < p < 0,5

m

37,5

I Los valores esperados se I - 1 obtienen multiplicando l las proporciones I esperadas por el total...

y (O-E)

Las diferencias entre las proporciones esperadas y las ob­ servadas pueden ocurrir debido al azar. La prueba de bon­ dad de ajuste de puede utilizarse para evaluar si las desviaciones entre los números observados y los espera­ dos se deben al azar o a algún otro factor significativo.

RELACIÓN DE CONCEPTOS ENTRE CAPÍTULOS

Esperado Púrpuras

CONCEPTOS CLAVE

de

1,5 = 2,0

^

I La probabilidad asociada con el valor de calculado está entre 0,10 y 0,50, lo que indica una alta probabilidad de j que la diferencia entre los | i valores esperados y los 4 observados se deba al azar. \

Conclusión: No hay diferencias significativas entre los valores esperados y los observados.

Fig. 3-1 4. La prueba de la se utiliza para determ i­ nar la p ro b a b ilid a d de q u e la d ife re n c ia entre lo s v a lo r e s o b s e r v a d o s y lo s e s p e r a d o s s e d e b a a l a zar.

o mayor de 0,05 suponen que las diferencias observadas se deben al azar. Cuando esta probabilidad es menor de 0,05 los científicos aceptan que el azar no es el responsable de la desviación y exis­ te una diferencia significativa. La expresión diferencia significa­ tiva quiere decir que algún factor distinto del azar es responsable de que los valores observados sean diferentes de los esperados. Respecto de nuestros gatitos, quizás uno de los genotipos experi­ mentó mayor tasa de mortalidad antes de que la progenie haya si­ do contabilizada o quizás haya otro factor que afecta las propor­ ciones observadas. Al elegir 0,05 como valor de corte, los científicos se han pues­ to de acuerdo en aceptar que el azar es el responsable de las va­

En este capítulo se han introducido varios conceptos impor­ tantes de la herencia y se han presentado técnicas para hacer predicciones sobre el tipo de descendencia que producirán los padres. Se han introducido dos principios clave de la herencia: los de segregación y de distribución independiente. Estos prin­ cipios sirven como fundamento para comprender gran parte de la herencia. También se proporcionaron ciertos términos esen­ ciales y técnicas para la discusión y el análisis de cruzamien­ tos genéticos. Un concepto crítico es la conexión entre el com­ portamiento cromosómico durante la meiosis (cap. 2 ) y los símbolos aparentemente abstractos utilizados en los cruza­ mientos genéticos. Los principios explicados proveen conexiones importantes con gran parte del contenido que sigue en este libro. En los ca­ pítulos 4 a 7, aprenderemos acerca de factores adicionales que afectan el resultado de los cruzamientos genéticos: el sexo, las interacciones entre los genes, el ligamiento entre los genes y el medio ambiente. Estos factores se basan en los principios de segregación y distribución independiente. En los capítulos 10 a 2 1 , en los cuales nos centramos en los aspectos moleculares de la herencia, la importancia de estos principios no es tan obvia, pero la mayoría de los procesos nucleares se basan en la heren­ cia de los genes cromosómicos. En los capítulos 22 y 23, vira­ remos hacia la genética cuantitativa y poblacional. Estos capí­ tulos se basan en forma directa en los principios de la herencia y solo pueden comprenderse teniendo un conocimiento afian­ zado del mecanismo de herencia de los genes. Por lo tanto, el material presentado aquí sirve como fundamento para casi to­ da la herencia. Por último, este capítulo introduce la resolución de proble­ mas, la cual se encuentra en el corazón de la genética. El desa­ rrollo de hipótesis que expliquen fenómenos genéticos (como el tipo y las proporciones de la progenie producida en un cru­ zamiento genético) y la prueba de estas hipótesis mediante los cruzamientos genéticos y recolectando datos adicionales, son comunes a toda la genética. A lo largo de este libro se hace hin­ capié en la capacidad para pensar analíticamente y formular conclusiones lógicas a partir de las observaciones.

Principios básicos de La herencia

I

g e n é tic a

^

¿pescan& a en

muertos tienen derecho a la privacidad genética? Una ilustración destacada de los proble­ mas éticos que rodean a esta pregunta es la propuesta de los "biohistoriadores" de utilizar el DNA del presidente Abraham Lincoln para saber si pudo haber sufrido el síndrome de Marfan. Durante toda su vida, Lincoln experimentó ataques repetidos de depresión. A los biógrafos y a los estu­ diantes de este hombre les gustaría cono­ cer si estos ataques pudieron haber estado relacionados con los síntomas dolorosos, de tipo artríticos asociados a veces con el síndrome de Marfan. El síndrome de Marfan es un trastorno autosómico dominante que ha sido ligado al gen FBNl en el cromosoma 15. FBNl codifica una proteína llamada fibrilina, esencial para la formación de las fibras elásticas en el tejido conectivo. Cuando la fibrilina está malformada, como sucede en el caso del síndrome de Marfan, el tejido conectivo del cuerpo se torna poco elásti­ co y conduce a los huesos alargados y la debilidad tisular potencialmente fatal en pulmones, ojos, corazón y vasos sanguí­ neos. Las piernas muy largas de Lincoln y otras características de su aspecto han lle­ vado a que algunos se preguntaran si po­ día haber sufrido este síndrome. Después del asesinato de Lincoln el 14 de abril de 1865, se le realizó una necrop­ sia. Se guardaron muestras del cabello, huesos y sangre en el National Museum of Health and Medicine en Washington, O.C. Si se pudiera encontrar el DNA suficiente en buen estado en estas muestras se po­ dría determinar si Lincoln sufría de síndro­ me de Marfan. Algunos personas que apoyan esta in­ vestigación se preguntan por qué alguienla objetaría. Se ha efectuado el escrutinio de muchos otros detalles de la vida priva­ da de Lincoln. ¿Por qué deben estar exen­ tos sus genes? Es cierto que Lincoln no puede dar su consentimiento para esta in-

p

2

,^ S r . L i n c o l n ’

The Granger Collection, New York.

vestigación, pero es difícil imaginar que el presidente fallecido desde hace tanto tiempo se preocupe por lo que se hace con su DNA. Tampoco tiene sentido solici­ tar el consentimiento de sus descendien­ tes. Los supervivientes inmediatos que tie­ nen en común el DNA con una persona fa­ llecida razonablemente podrían considerar que su propia privacidad está en riesgo con esta investigación. Pero el hecho de que han pasado muchas generaciones des­ de la muerte de Lincoln y de que no tiene ningún descendiente directo vivo reduce la relación de cualquier hallazgo con las vi­ das de sus descendientes. Los que se oponen plantean muchas preocupaciones. Temen la tendencia al "esencialismo genético" que reduciría a Lincoln a sus genes y tal vez sobresimplifi-

RESUMEN Gregor Mendel, un monje austríaco que vivía en lo que hoy es la República Checa, fue el primero en descubrir los princi­ pios de la herencia dirigiendo experimentos con plantas de arvejas.

Arthur L. Caplan y Ron Green caría nuestro conocimiento de su vida. Se preocupan de que la prueba sin consenti­ miento pueda sentar el precedente para otras formas de pruebas sin permiso. ¿Nuestra privacidad genética será invadida por cualquier propósito socialmente útil? ¿Es realmente cierto que los muertos no tienen derechos? Como persona viva que anticipa su muerte, ¿deseo-que otras per­ sonas, sin mi consentimiento, expongan asuntos que intenté mantener en secreto durante mi vida? Luego están las opiniones de los que su­ fren el síndrome de Marfan. Algunos consi­ deran la investigación propuesta como un precedente peligroso para la invasión de la privacidad. Sin embargo, otros dan la bienvenida a cualquier luz que pudieran arrojar los hallazgos sobre su enfermedad. Una persona que sufre de ese síndrome se­ ñala; "El mejor presidente que hemo.s teni­ do y el segundo mejor presidente, Franklin Roosevelt, tenían discapacidades físicas". Ella se pregunta ¿qué puede estar mal en aprender cuánto pueden lograr personas con su trastorno?

Preguntas para

el análisis

• En su opinión, ¿se debe someter al DNA de Lincoln a un análisis para síndrome de Marfan? ¿O se debe dejar a Lincoln "descansar en paz"? • ¿Cuándo se debe solicitar el consenti­ miento de miembros de la familia super­ vivientes u otras personas relacionadas con el fallecido para la investigación genética? • ¿Debe existir un límite temporal para es­ te consentimiento? • ¿Existen algunas razones mejores que otras para esta investigación? ¿En algún momento se debe abrir el DNA de una persona al escrutinio público?

_ .: m • El éxito de Mendel puede atribuirse a su elección de la planta de ai'veja como organismo experimental, a la utilización de carac­ terísticas con algunos fenotipos fácilmente distinguibles, a su enfoque experimental y a su atención cuidadosa a los detalles.

67

68

Capítulo 3 • Los genes son factores heredados que determinan una carac­ terística. Las formas alternativas de los genes se llaman alelos. Los alelos se localizan en un lugar específico, un locus, en un cromosoma, y el conjunto de genes que un individuo posee es su genotipo. El fenotipo es la manifestación o apa­ riencia de una característica, que puede ser física, bioquímica o conductual. >Los fenotipos se producen por los efectos combinados de ge­ nes y factores ambientales. Solo se hereda el genotipo y no el fenotipo. ' El principio de segregación establece que un organismo indi­ vidual posee dos alelos que codifican un rasgo y que estos dos alelos se separan en proporciones iguales cuando se for­ man los gametos. ' El concepto de dominancia indica que cuando están presentes dos alelos diferentes en un heterocigoto, solo se observa en el fenotipo el rasgo de uno de ellos, el alelo “dominante”. Se di­ ce que el otro alelo es “recesivo”. Los dos alelos de un genotipo se localizan en cromosomas homólogos, los cuales se separan durante la anafase I de la meiosis. La separación de los cromosomas homólogos provo­ ca la segregación de los alelos. Los tipos de progenie producidos a partir de un cruzamiento genético pueden predecirse mediante la aplicación del cua­ drado de Punnet o de las probabilidades. La probabilidad es la posibilidad de que ocurra un evento determinado. La regla de la multiplicación de las probabili­ dades establece que la probabilidad de que dos o más even­ tos independientes ocurran simultáneamente se calcula mul­ tiplicando sus probabilidades independientes. La regla de la adición de las probabilidades establece que la probabilidad de que ocurra alguno de dos o más eventos mutuamente ex-

cluyentes se calcula mediante la suma de las probabilidades de los eventos. • La expansión binomial puede utilizarse para determinai- la probabilidad de una combinación determinada de eventos. • Un cruzamiento de prueba revela el genotipo (homocigótico o heterqcigótico) de un individuo que posee un rasgo dominan­ te y consiste en cruzar a ese individuo con otro que posee el genotipo homocigótico recesivo. • La dominancia incompleta se produce cuando un heterocigoto posee un fenotipo que es intermedio entre los* fenotipos de los dos homocigotos. » El principio de la distribución independiente establece que los genes que codifican diferentes características se distribuyen en forma independiente cuando se forman los gametos. « La distribución independiente se basa en la separación al azar de los pares de cromosomas homólogos durante la anafase I de la meiosis. Se produce cuando los genes que codifican dos características se localizan en diferentes pares de cromoso­ mas. s Cuando los genes se distribuyen en forma independiente, pue­ de utilizarse la regla de la multiplicación de las probabilida­ des para obtener la probabilidad de heredar más de un rasgo. Es decir que un cruzamiento que incluya más de un rasgo puede ser disgregado en cruzamientos simples y la probabili­ dad de cada combinación de rasgos puede obtenerse multipli­ cando las probabilidades para cada rasgo. e Las proporciones, de la progenie observadas en un cruzamien­ to genético pueden desviarse de las esperadas debido al azar. Se puede utilizar la prueba de bondad de ajuste de y } para de­ terminar la probabilidad de que la diferencia entre los núme­ ros observados y los esperados se deba al azar.

T ER M IN O S IM PORTANTES

gen (p. 49) alelo (p. 49) locus (p. 49) genotipo (p. 49) homocigoto (p. 49) heterocigoto (p. 49) fenotipo (p. 49) cruzamiento monohíbrido (p. 49) generación P (parental) (p. 49)

generación Fj (filial 1) (p, 50) cruzamientos recíprocos (p. 50) generación Fj (filial 2) (p. 50) dominante (p. 51) recesivo (p. 51) principio de segregación (pri­ mera ley de Mendel) (p. 51) concepto de dominancia (p. 51)

teoría de la herencia cromosómica (p. 52) cruzamiento retrógrado (p. 53) cuadrado de Punnet (p. 53) probabilidad (p. 54) regla de la multiplicación (p. 54) regla de la adición (p. 55) cruzamiento de prueba (p. 57)

dominancia incompleta (p. 57) silvestre {wild type) (p. 58) cruzamiento dihíbrido (p. 59) principio de la distribución independiente (segunda ley de Mendel) (p. 60) prueba de bondad de ajuste de y} (p. 64)

Principios básicos de La herencia

Pro'blemas 1 . En los conejos, el pelo corto (S) es dominante sobre el pelo largo (s). Se llevan a cabo los siguientes cruzamientos que pro­ ducen la progenie mostrada. Nombre todos los genotipos posi­ bles de los padres de cada cruzamiento.

Padres corto b. corto c. corto d. corto e. largo a.

X corto X corto X largo X largo X largo

Progenie 4 cortos y 2 largos 8 cortos • 1 2 cortos 3 cortos y 1 largo 2 largos

• Solución Pai'a este problema, es útil primero recolectar tanta información acerca de los genotipos de los padres como sea posible, basándo­ nos en su fenotipo. Luego podemos mirar los tipos de progenie que producen, para obtener la información que nos falta. Tenga en cuenta que el problema pregunta por todos los genotipos po­ sibles de los padres. a.

corto

X

corto

4 cortos y 2 largos

Como el pelo corto es dominante sobre el pelo largo, un conejo con pelo corto podría ser tanto SS como Ss. Los dos descendien­ tes de pelo largo deben ser homocigóticos (ss) porque el pelo lar­ go es recesivo y solo aparecerá en el fenotipo cuando ambos alelos presentes sean para el pelo largo. Debido a que cada padre contribuye con uno de los dos alelos de la progenie, cada padre debe portar el alelo s y, por lo tanto, debe ser Ss. b. corto X corto

8

1 2

3 cortos y 1 largo

Sobre la base de su fenotipo, el padre de pelo corto podría ser homocigótico (SS) o heterocigótico (Ss), pero la presencia de un descendiente de pelo largo indica que el padre de pelo corto de­ be ser heterocigótico (Ss). El padre de pelo largo debe ser homocigótico (.«’). e. largo x largo

2

largos

Como el pelo largo es un rasgo recesivo, ambos padres deben ser homocigóticos para el alelo de pelo largo (í.y). 2. En los gatos, el pelaje negro es dominante sobre el gris. Se aparea una hembra de pelo negro cuya madre es gris con un macho gris. Si esta hembra tiene una camada de seis gatitos, ¿cuál es la probabilidad de que tres sean negros y tres grises?

®Solución Como negro (Gj es dominante sobre gris fgj, un gato negro pue­ de ser homocigótico (GG) o heterocigótico (Gg). La hembra ne­ gra de este problema debe ser heterocigótica (Gg) porque su ma­ dre es gris (gg) y ella tuvo que heredar uno de los alelos de su madre. El macho gris es homocigótico (gg) porque el gris es re­ cesivo. Por lo tanto el cruzamiento es: Gg hembra negra

X

88

i

macho gris

V, Gg negro ^ 2 88 gris

cortos

Los padres de pelo corto pueden ser SS o Ss. Los 8 descendien­ tes son todos de pelo corto (S_), y por lo tanto al menos uno de los padres debería ser homocigótico (SS). Si ambos padres fue­ ran heterocigóticos, se esperaría de progenie de pelo largo (ss), hecho que no observamos. El otro padre podría ser homoci­ gótico (SS) o heterocigótico (Ss). Como uno de los padres es ho­ mocigótico, toda la descendencia será de pelo corto. Teóricamen­ te es posible, aunque poco probable, que ambos padres sean heterocigóticos (Ss x Ss). Si éste fuera el caso, esperaríamos que 2 de los 8 descendientes fueran de pelo largo. Aunque no se obser­ va progenie de pelo largo, es posible que solo por casualidad no se hayan producido conejos de pelo largo entre la progenie de 8 miembros de este cruzamiento. c. corto X largo

d. corto X largo

cortos

El padre de pelo corto podría ser SS o Ss. El padre de pelo largo debe ser ss. Si el padre de pelo corto fuera heterocigótico (fe), se esperaría que la mitad de la descendencia fuera de pelo largo, sin embargo no observamos este tipo de progenie. Por lo tanto, es más probable que este padre sea homocigótico (SS). En teoría es posible, aunque poco probable, que el padre sea heterocigótico y que solo por casualidad no se hubiera producido progenie de pe­ lo largo.

Podemos utilizar la expansión binomial para determinar la pro­ babilidad de obtener tres gatitos negros y tres grises en la camada de seis. Llamemos a a la probabilidad de que un gatito sea ne­ gro y ¿ a la probabilidad de que un gatito sea,gris. El binomio es (a + b)^ y su expansión es: (a

b)^ = a^ + 6a^b + 15a^b^ + 20a^b^ + 1 5 aV + 6a^b^ +

(Véase el texto para una explicación de cómo expandir el bino­ mio.) La probabilidad de obtener tres gatitos negros y tres grises en una camada de seis está dada por el término 20a^b^. La pro­ babilidad de a y ¿ es de V, para ambas, entonces la probabilidad global es 20('/^)\^/^)^ = % 3. Se cruzan los siguientes genotipos: Aa Bb Ce Dd x Aa Bb Ce Dd. Determine la proporción de la progenie de este cruzamiento que tenga los siguientes genotipos: (a) Aa Bb Ce Dd, (b) aa bb ec dd, (c) Aa Bb ec Dd.

®Solución Este problema es fácil de resolver si se separa el cruzamiento en cruzamientos simples y se aplica la regla de la multiplicación pa­ ra encontrar las diferentes combinaciones de genotipos:

6

70

Capítulo 3 Locus Locus Locus Locus

1 2 3 4

Aa x A a = AA, ’/jAa, aa B bxB b^ 'l^bb Ce x C c = V4 CC, V2 Ce, V4 cc D d x D d = V4 Z3D, V4 dd

Para encontrar la probabilidad de cualquiera de las combinacio­ nes de los genotipos, simplemente se deben multiplicar las pro­ babilidades de los diferentes genotipos: a.

Aa Bh Ce Dd V2

b. aa bb ce dd c. Aa

CC Dd

(Bb)

(A a ) X

V4 (aa)

x

x

(Ce)

‘/^ (bb) x V4 (ce)

V2 (Aa) x

(Bb)

x

x

Vj (Dd) = Vj^

X

(dd) = ^1^^^

V4 (cc) x V, (M ) = V3 2

4. En el maíz, los granos ptírpuras son dominantes sobre los amarillos y los llenos sobre los encogidos. Se cruza una planta de maíz de granos púrpuras y llenos con una planta de granos amarillos y encogidos y se obtiene la siguiente progenie: ptírpuras, llenos 1 1 2 ptírpuras, encogidos 103 amarillos, llenos 91 amarillos, encogidos 94 ¿Cuáles son los genotipos más probables de los padres y de la pro­ genie? Ponga a prueba su hipótesis genética con una prueba de la y}.

Nuestra explicación genética predice que, de este cruzamiento, deberíamos ver de progenie de granos púrpuras y llenos; V4 de progenie de granos púrpuras y encogidos; V4 de progenie de gra­ nos amarillos y llenos; V4 de progenie de granos amarillos y en­ cogidos. Se produjeron un total de 400 descendientes. Entonces se espera x 400 = 100 de cada fenotipo. Los números obser­ vados no encajan exactamente con los esperados. ¿Puede ser que la diferencia entre lo que observamos y lo que esperamos se de­ ba al azar? Si la probabilidad de que el azar solo sea responsable de la diferencia entre lo observado y lo esperado es alta, presumi­ remos que la progenie se ha producido en la relación 1 : 1 : 1 ; 1 es­ perada para este cruzamiento. Si la probabilidad de que la dife­ rencia entre lo observado y lo esperado se deba al azar es baja, los descendientes realmente no están en la relación esperada y al­ gún otro factor significativo debe ser responsable de la desvia­ ción. Los números observados y esperados son: Fenotipo púrpura lleno púrpura encogido amarillo lleno amarillo encogido

Esperado '/4 x400=: 1 0 0 x400 = 1 0 0 '^4 x400 = 1 0 0 V4 x 4 0 0 = 1 0 0

1 1 2

103 91 94

Para determinar la probabilidad de que la diferencia entre lo ob­ servado y lo esperado se deba al azar, calcularemos un .valor mediante la fórmula [(observado - esperado)^/esperado]:

• Solución r = La mejor forma de empezar este problema es disgregando este cruzamiento en cruzamientos simples para una sola característica (el color de la semilla o su forma):

Observado

(112-100)2

(103 - 100)2

100

100

(91 -

1 0 0 ) 2

100

(94 - 100)2 100

P

púrpura x amarillo

lleno x encogido

Fj

112+ 103 = 215 púrpuras 112 + 91 =203 llenos 91 + 94 = 185 amarillos

103 + 94 = 197 encogidos

Púrpura x amarillo produce aproximadamente púrpura y amarillo. El cruzamiento entre un heterocigoto y un homocigoto suele producir una proporción de 1:1. Como el púrpura es domi­ nante, el padre púrpura debe ser heterocigótico (Pp) y el padre amarillo homocigótico (pp). La progenie púrpura producida por este cruzamiento será heterocigótica (Pp) y la progenie amarilla homocigótica (pp). Ahora examinemos la otra caracterísíica. Lleno x encogido produce ^1^ lleno y V2 encogido, o una relación de 1 : 1 , y por lo tanto estos fenotipos también son producidos por un cruzamien­ to entre un heterocigoto (Ff) y un homocigoto (jfy, la progenie de granos llenos será heterocigótica (Ff) y la de granos encogidos será homocigótica (ff). Ahora combinemos los dos cruzamientos y utilicemos la regla de la multiplicación para obtener los genotipos globales y las pro­ porciones de cada genotipo: púrpura, lleno PpFf Pp . F f - V,¿ púrpura . X P p jf f - 'V ^ 2 púrpura Pp Ff= V2 amarillo ¡Pp ff= y 2 amarillo

X

amarillo, encogido

X P P Íf x Vj¿ lleno = V, U púrpura, lleno x encogido = V4 púrpura, encogido x lleno = V4 amarillo, lleno x Vj encogido = V4 amarillo, encogido

122

100

92

3 2

100

144

6 2

100

100

81

36

100

100 1,44 + 0,09

+

0,81

+

0,36 = 2,70

Ahora que tenemos el valor de %2, debemos determinar la proba­ bilidad de que ese valor se deba al azar. Para obtener esta proba­ bilidad, primero calculamos los grados de libertad, los cuales pa­ ra una prueba de bondad de ajuste de son « - 1 , donde n es igual al número esperado de clases fenotípicas. En este caso, hay cuatro clases de fenotipos esperados, entonces los grados de li­ bertad son igual a 4 - 1 = 3. Ahora debemos buscar el valor de %2 en una tabla de yj- (véase cuadro 3-4). Seleccionamos la hilera que corresponde a 3 grados de libertad y buscamos a lo largo pa­ ra encontrar nuestro valor de y} calculado. El valor de y} de 2,7 se encuentra entre 2,366 (una probabilidad de 0,5) y 6,251 (una probabilidad de 0,1). Por lo tanto, la probabihdad asociada ip) con el valor de y} calculado es 0,5 < /? < 0,1. Ésta es la probabi• lidad de que la diferencia entre lo que observamos y lo que espe­ ramos se deba al azar, la cual en este caso es relativamente alta y por lo tanto es probable que el azar sea responsable de la desvia­ ción. Podemos concluir que la progenie sí aparece en la propor­ ción 1 : 1 : 1 : 1 , predicha por nuestra explicación genética.

Principios básicos de La herencia

PREGUNTAS DE COMPRENSIÓN den aparecer entre la progenie de cruzamientos simples y los genotipos de los padres que pueden originar cada pro­ porción.

1. ¿Por qué el enfoque de Mendel del estudio de la herencia fue tan exitoso? 2. ¿Cuál es la relación entre los términos alelo, locus, gen y genotipo!

*7. ¿Cuál es la teoría de la herencia cromosómica? ¿Por qué es importante?

*3. ¿Cuál es el principio de segregación? ¿Por qué es impor­ tante? 8

4. ¿Cuál es el concepto de dominancia? ¿En qué difiere la dominancia de la dominancia incompleta?

9. ¿Cómo se relaciona el principio de la distribución inde­ pendiente con la meiosis?

5. Indique cuáles son las proporciones fenotípicas que pueden aparecer entre la progenie de cruzamientos simples y los genotipos de los padres que pueden originar cada propor­ ción. 6

. ¿Qué es el principio de la distribución independiente? ¿Cómo se relaciona con el principio de segregación?

10. ¿Cómo es la prueba de bondad de ajuste de que se uti­ liza para analizar los cruzamientos genéticos? ¿Qué indi­ ca la probabilidad asociada con un valor de acerca de los resultados de los cruzamientos?

. Indique cuáles son las proporciones genotípicas que pue­

PREGUNTAS Y PROBLEMAS DE APLICACION 11. ¿Qué características de un organismo lo harían apropiado para estudiar los principios de la herencia? ¿Puede nom­ brar varios organismos con estas características? *12. En los pepinos, el color naranja de la fruta (R) es domi­ nante sobre el color crema (r). Una planta de pepinos homocigótica para las frutas naranjas se cruza con una plan­ ta homocigótica para las frutas color crema. Se cruza la Fj consigo misma para producir la F^a. Determine los genotipos y fenotipos de los padres, de la Fj, y de la Fj. b. Determine los genotipos y fenotipos de la descendencia de un cruzamiento retrógrado entre la Fj y los padres na­ ranjas. c. Determine los genotipos y fenotipos de un cruzamiento retrógrado entre la Fj y los padres crema.

b. grupo sanguíneo B grupo sanguíneo B

c. grupo sanguíneo B grupo sanguíneo A

8 gatitos con grupo sanguíneo A

d. grupo sanguíneo A grupo sanguíneo A

7 gatitos con grupo sanguíneo A, 2 con grupo sanguíneo B

e. grupo sanguíneo A grupo sanguíneo A

10 gatitos con grupo sanguíneo A

f. grupo sanguíneo A grupo sanguíneo B

4 gatitos con grupo sanguíneo A, 1 con grupo sanguíneo B

*13. En los conejos, el color del pelaje es una caractenstica

determinada genéticamente. Algunas hembras negras siempre producen progenie negra, mientras que otras pro­ ducen tanto progenie negra como blajica. Explique cómo puede producirse este resultado.

15. Joe tiene un gato blanco llamado Sam. Cuando Joe cruza

a Sam con un gato negro, obtiene Vj de gatitos blancos y ' ¡ 2 de gatitos negros. Cuando se cruzan los gatitos negros entre ellos, todos los gatitos que producen son negros. So­ bre la base de estos resultados, ¿arribaría a la conclusión de que el color del pelaje blanco o negro en los gatos es un rasgo recesivo? Explique su razonamiento.

*14. En los gatos, el grupo sanguíneo A está producido por un

alelo (/^) que es dominante sobre uno (¡®) que produce el grupo B. No existe el grupo 0. A continuación se dan los grupos sanguíneos de los gatos machos y hembras aparea­ dos y los grupos sanguíneos de sus crías. Determine los genotipos más probables para los padres de cada camada. Progenitor macho

16. En la oveja, la lana brillante (L) es producida por un alelo

Progenitor hembra Crías

a. grupo sanguíneo A grupo sanguíneo B

4 gatitos con grupo sanguíneo A, 3 con grupo sanguíneo B

gatitos con grupo sanguíneo B

6

'

que es dominante sobre el alelo para la lana normal (/)• Una oveja adulta (femenina) con lana brillante se aparea con un macho adulto de lana normal. Luego la oveja da a luz a un solo cordero con lana normal. ¿Es posible determinar el genotipo de los dos padres a partir de esta única camada? ¿Por qué? Si fuera posible, determine sus genoti­ pos. Si no, ¿por qué no?

71

72

Capítulo 3 *17. En los seres humanos, la alcaptonuria es una alteración metabólica en la cual las personas afectadas producen ori­ na negra (véase la introducción en este capítulo). La al­ captonuria está determinada por un alelo (a) que es rece­ sivo respecto del alelo para el metabolismo normal (A). Sally tiene un metabolismo normal, pero su hermano tie­ ne alcaptonuria. El padre de Sally tiene alcaptonuria y su madre tiene un metabolismo normal. a. Determine los genotipos de Sally, su madre, su padre y su hermano. b. Si los padres de Sally tuvieran otro hijo, ¿cuál es la probabilidad de que ese hijo tenga alcaptonuria? c. Si Sally se casa con un hombre con alcaptonuria, ¿cuál es la probabilidad de que su primer hijo tenga alcaptonu­ ria?

b. Todos los niños del mismo sexo c. Seis niñas y un niño d. Cuatro niños y tres niñas e. Cuatro niñas y tres niños 24. La fenilcetonuria es una enfermedad producida por un gen recesivo. Dos padres normales tienen un hijo con la enfermedad. a. ¿Cuál es la probabilidad de que un espermatozoide del padre contenga el alelo de la fenilcetonuria? b. ¿Cuál es la probabilidad de que un óvulo de la madre contenga el alelo de la fenilcetonuria? c. ¿Cuál es la probabilidad de que su próximo hijo tenga fenilcetonuria? d. ¿Cuál es la probabilidad de que su próximo hijo sea heterocigótico para el gen de la fenilcetonuria?

18. Suponga que está criando gerbos mongoles. Usted nota que algunos tienen puntos blancos, mientras otros tienen un pelaje liso. ¿Qué tipo de cruzamientos podría llevar a cabo para determinar si los puntos blancos se deben a un alelo recesivo o a uno dominante?

*25. En las cucarachas alemanas, las alas curvas (cv) son re­ cesivas respecto de las alas normales (cv^). Se cruza una cucaracha homocigótica de alas normales con una cucara­ cha homocigótica de alas curvas. Se cruzan las Fj para producir la F 2 . Suponga que el par de cromosomas que contiene el locus para la forma de las alas es metacéntrico. Dibuje este par de cromosomas como aparecería en los padres, en la Fj y en cada clase de progenie E2 duran­ te la metafase I de la meiosis. Suponga que no se produce entrecruzamiento. En cada estadio, marque un lugar para los alelos de la forma de las alas (cv y cV**) sobre los cro­ mosomas.

*19. El fenotipo pelado de los terriers enanos (rat terriers) americanos es recesivo respecto de la presencia de pelo. Suponga que usted tiene un terrier enano con pelo. ¿Có­ mo podría determinar si este perro es homocigótico o heterocigótico para este fenotipo? 20. En las bocas de dragones, el color rojo (R) de la flor muestra dominancia incompleta sobre el color blanco (r). Las heterocigóticas producen flores rosas. Una boca de dragón roja se cruza con una blanca y las F, se cruzan pa­ ra producir la Fj. a. Determine los genotipos y fenotipos de las Fj y F2 , junto con las proporciones esperadas. b. Si se realiza un cruzamiento retrógrado de la Fj con el padre blanco, ¿cuáles serán los genotipos y los fenotipos de la descendencia? c. Si se realiza un cruzamiento retrógrado de la Fj con el padre rojo, ¿cuáles serán los genotipos y los fenotipos de la descendencia? 21. ¿Cuál es la probabihdad de arrojar un dado de seis lados y obtener los siguientes niimeros? a. 2 b. 1 o 2 c. Un ntímero par d. Cualquier número menos un 6 *22. ¿Cuál es la probabihdad de arrojar dos dados de seis la­ dos y obtener los siguientes números? a. 2 y 3 b. 6 y 6 c. Al menos un 6 d. Dos números iguales (dos 1, o dos 2, o dos 3, etc.) e. Un número par en ambos dados f. Un número par en al menos un dado *23. En una famiha de siete hijos, ¿cuál es la probabilidad de obtener los siguientes números de niños y niñas? a. Todos niños varones

*26. En los cobayos, el alelo para el pelaje negro {B) es domi­

nante sobre el alelo para el marrón (b). Se cruza un coba­ yo negro con uno marrón y producen cinco cobayos F, negros y seis marrones. a. ¿Cuántas copias del alelo negro (B) habrá en cada cé­ lula de un cobayo F, negro en los siguientes estadios: Gj, G2 , metafase de la mitosis, metafase I de la meiosis, me­ tafase II de la meiosis y después de la segunda citocinesis que sigue a la meiosis? Suponga que no se produce entrecruzamiento. b. ¿Cuántas copias del alelo marrón {b) habrá en cada cé­ lula de un cobayo F¡ marrón en esoS mismos estadios? Suponga que no se produce entrecruzamiento. 27. En las sandías, el fruto amargo {B) es dominante sobre el

dulce (b) y las manchas amarillas {S) son dominantes so­ bre la ausencia de manchas (5 ). Los genes para estas dos características se distribuyen en forma independiente. Se cruza una planta homocigótica que tiene fruto amargo y manchas amarillas con una homocigótica de fruto dulce y sin manchas. Se cruzan las Fj para producir la F 2 . a. ¿Cuáles serán las proporciones fenotípicas de la F2 ? b. Si se realiza un cruzamiento retrógrado de una planta F j con el padre amargo, de manchas amarillas, ¿qué feno­ tipos y en qué proporciones se esperan en la descenden­ cia? c. Si se realiza un cruzamiento retrógrado de una planta F| con el padre dulce y sin manchas, ¿qué fenotipos y en qué proporciones se esperan en la descendencia? 28. En los gatos, las orejas enrolladas (Cu) son producidas

por un alelo que es dominante sobre un alelo para las ore­

Principios básicos de la herencia jas normales (cu). El color negro se produce por un alelo que se' distribuye en forma independiente (G), que es do­ minante sobre un alelo para el color gris (^). Un gato gris homocigótico para las orejas enrolladas se aparea con uno negro homocigótico de orejas normales. Todos los gatos de la Fj son negros y poseen orejas enrolladas. a. Si se aparean dos de los gatos de la Fj, ¿qué fenotipos y en qué proporciones se esperan en la Fj? b. Un gato de la Fj se aparea con un gato callejero que es gris y posee orejas normales. ¿Qué fenotipos y en qué proporciones se esperan para la progenie de este cruza­ miento? *29. Se cruzan los siguientes genotipos: Aa Bb Ce dd Ee x Aa bb Ce Dd Ee. ¿Cuáles serán las proporciones de los si­ guientes genotipos entre la progenie de este cruzamiento? a. Aa Bb Ce Dd Ee b. Aa bb Ce dd ee c. aa bb cc dd ee d. /lA BB CC DD EE 30. En los ratones, un alelo para los ojos color damasco (a) es recesivo respecto del marrón {a*). En un locus que se dis­ tribuye en forma independiente, un alelo para el color tos­ tado (f) del pelaje es recesivo respecto del pelaje negro (í+). Se cruza un ratón que es homocigótico para los ojos marrones y el color del pelaje negro, con otro que posee ojos de color damasco y pelaje tostado. Los Fj resultantes se cruzan entre sí para producir la Fj. En una camada de ocho ratones F 2 , ¿cuál es la probabilidad de que dos de ellos tengan ojos color damasco y pelaje tostado? 31. En los pepinos, el fruto opaco {D) es dominante sobre el brilloso (d), el fruto naranja (R) es dominante sobre el crema (r) y los cotiledones amargos (B) son dominantes sobre los no amargos {b). Las tres características están co­ dificadas por genes localizados en diferentes pares de cro­ mosomas. Se cruza una planta homocigótica para el fruto opaco y naranja y cotiledones amargos con una de fruto brilloso y color crema y de cotiledones no amargos. Los Fj se cruzan entre sí para producir la F 2 . a . Determine los fenotipos y sus proporciones esperadas de la F j . b. Se cruza un planta F, con una de frutos brillosos y co­

lor crema y cotiledones no amargos. Determine los fenoti­ pos junto con las proporciones esperadas entre la proge­ nie de este cruzamiento. *32. A y a son alelos localizados en un par de cromosomas metacéntricos. B y b son alelos que se localizan en un par de cromosomas acrocéntricos. Se realiza un cruzamiento entre individuos que poseen los siguientes genotipos: Aa Bb X aa bb. a. Dibuje los cromosomas tal como aparecerían en cada tipo de gameto producido por los individuos de este cru­ zamiento. b. Para cada tipo de progenie resultante de este cruza­ miento, dibuje los cromosomas tal como aparecerían en una célula en G,, en y en la metafase de la mitosis. 33. En el topote de velo negro (sailfin molly), el color dorado se debe a un alelo que es recesivo respecto del alelo para el color normal (G). Se cruza un pez dorado con un pez normal. Entre la descendencia, 8 8 son normales y 82 son dorados. a. ¿Cuáles son los genotipos más probables de los padres de este cruzamiento? b. Evalúe la verosimilitud de su hipótesis realizando una prueba de la y}. 34. En los cobayos, el alelo para el pelaje negro {B) es domi­ nante sobre el del pelaje blanco {b). En un locus que se distribuye en forma independiente, un alelo para el pelaje áspero {K) es dominante sobre el del pelaje suave (r). Se cruza un cobayo homocigótico para el pelaje áspero de color negro con otro de pelaje suave de color blanco. En una serie de apareamientos, se cruzan los Fj con cobayos de pelaje blanco y suave. De estos apareamientos surgen los siguientes fenotipos en la descendencia: 24 cobayos negros con el pelaje áspero; 26 negros y suaves; 23 blan­ cos y ásperos, y 5 blancos y suaves. a. Compare los niímeros observados en la progenie con los esperados para este cruzamiento, utilizando la prueba de la y}. b. ¿Qué conclusiones pueden extraerse áp los resultados de la prueba de la c. Sugiera una explicación para estos resultados.

PREGUNTAS AVANZADAS 35. El enanismo es un rasgo recesivo en el ganado vacuno

Hereford. Un ganadero del oeste de Texas descubre que varios de los terneros de su rebaño son enanos y quiere eliminar cuanto antes este rasgo no deseado de la colonia. Suponga que el ganadero lo contrata como consultor ge­ nético para aconsejarlo sobre la manera de eliminar el ras­ go del enanismo de su rebaño. ¿Que cruzamientos le aconsejaría que realice para asegurar que se ha eliminado el alelo que causa el enanismo? 36. Un genetista descubre un ratón obeso en la colonia de su

laboratorio y lo aparea con un ratón normal. Todos los F, de este cruzamiento son de tamaño normal. Cuando se cruzan dos Fj, ocho de los ratones F j son de tamaño nor­ mal y dos son obesos. El genetista luego cruza dos de sus ratones obesos y encuentra que toda la progenie de este cruzamiento es obesa. Estos resultados lo llevan a con­ cluir que la obesidad en los ratones es causada por un ale­ lo recesivo. Una segunda genetista de otra universidad también descu­ bre un ratón obeso en la colonia de su laboratorio. Realiza los mismos cruzamientos que el otro genetista y obtiene

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Capítulo 3 idénticos resultados. Ella también concluye que la obesi­ dad en los ratones es causada por un alelo recesivo. Un día los dos genetistas se encuentran en una conferencia de genética, se enteran de los experimentos del otro y deci­ den intercambiar los ratones. Ambos hallan que cuando cruzan dos ratones obesos de diferentes laboratorios, toda la progenie es normal. Sin embargo, cuando cruzan dos ratones obesos del mismo laboratorio, toda la descenden­ cia es obesa. Explique sus resultados. 37. El albinismo es un rasgo recesivo en los seres humanos. Un genetista estudia una serie de familias en las cuales ambos padres son normales y por lo menos un hijo es al­ bino. El genetista razona que en estas familias ambos pa­ dres deben ser heterocigóticos y que el albinismo debería aparecer en un cuarto de los hijos. Para su sorpresa, el ge­ netista encuentra que la frecuencia de albinismo entre los hijos de estas familias es considerablemente mayor de un cuarto. ¿Podría pensar en alguna explicación para la apa­ rición de una frecuencia mayor de la esperada para el al­ binismo entre estas familias?

38. En la salamandra Plethodon cinereus se distinguen dos fe­

notipos: la forma roja y la forma negra. Algunos biólogos sugirieron que el fenotipo rojo se debe a un alelo autosómico que es dominante sobre uno negro. Lamentablemen­ te, estas salamandras no se aparean en cautiverio y, por lo tanto, la hipótesis de que el rojo es dominante sobre el ne­ gro nunca ha sido probada. Un estudiante de biología encuentra en el bosque 30 salamandras hembras, algunas rojas y otras negras, que están poniendo huevos. Coloca cada hembra con sus huevos (alrededor de 20-30 huevos por hembra) en bolsas de plástico separadas y se las lleva al laborato­ rio. Allí, cría los huevos hasta que nacen las salaman­ dras, y registra sus fenotipos junto con el de sus ma­ dres. Así, el estudiante tiene el fenotipo de 30 hembras y su progenie, pero no posee ninguna información acer­ ca del fenotipo de los padres. Explique cómo puede determinar el estudiante si el ro­ jo es dominante sobre el negro con esta información del fenotipo de las madres y su descendencia.

JETERMINACION DEL SEXO Y CARACTERÍSTICAS LIGADAS AL SEXO La guerra de los sexos en los Isópodos Determ inación del sexs Sistemas; cromosómicos de determina­ ción del sexo Sistemas genéticos de determinación del sexo Determiinación ambiental del sexo Determinación del sexo en Drosophila

melanogaster Deternninación del sexo en los seres humanos Caracte:rísticas ligadas al sexo

El sexo en el isópodo Armadillidium vutgare suele se r determ inado por los cromosom as sexuales, pero los machos genéticos pueden convertirse en hem bras funcionales po r la presencia de bacterias infectantes. (Ted Kinsman/Photo Researchers.)

Ojos blancos ligados al X en Drosophila La no disyunción y la teoría de la herencia cromosómica Organismo modelo: la mosca de la fruta Drosophila melanogaster Daltonismo ligado al X en seres humanos Símbolos para los genes ligados al cromosoma X Compensación de la dosis Características ligadas al cromosoma Z Caraaterísticas ligadas al cromosoma Y

La guerra de tos sexos en los isópodos________ 1 sexo es un tema extraño y fascinante. En la mayoría de los organismos existen dos sexos -macho y 4 hembra- y, en la vasta mayoría, los dos sexos aparecen en proporciones más o menos iguales. La ra­ zón de la igualdad en el número de machos y hembras fue explicada por primera vez por Ronald Fisher, uno de los fundadores de la genética poblacional moderna. Fisher señaló que en las especies de reproduc­ ción sexual los machos como grupo y las hembras como grupo contribuyen cada uno con la mitad de los genes de la siguiente generación porque todo individuo tiene una madre y un padre. Cuando un sexo es; ra­ ro, los miembros individuales de ese sexo contribuyen colectivamente con el 50% de los genes, de modo que cada individuo dentro del sexo raro pasa más genes que los individuos del sexo frecuente. Cualquier factor genético que favorezca la producción del sexo raro pasará a más descendientes, y el sexo raro au­ mentará en frecuencia hasta alcanzar el 50%, después de lo que no existe ninguna ventaja más para pro­ ducir ese sexo. De esta forma, la selección natural favorece una proporción de sexos de 50:50. Pese a la selección para la igualdad en el número de machos y hembras ocurren excepciones y estas ex­ cepciones ponen en evidencia la forma en que la evolución moldea la determinación del sexo. Un ejemplo fascinante es el isópodo terrestre, Armadillidium vulgare. Estos isópodos, habitualmente conocidos como bichos bolita, son nativos de Europa y de la región mediterránea, pero han sido transportados accidental­

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Capítulo 4 mente a todo el mundo por los seres humanos y son habitantes frecuentes de jardines y céspedes en mu­ chas áreas templadas, que iocluyen gran parte de los Estados Unidos. El sexo en los seres humanos, otros mamíferos y muchos otros lorganismos es determinado por la presencia de cromosomas sexuales, en que las hembras poseen dos cromosomas X y los machos poseen un cromosoma X y un cromosoma Y mucho más pequeño. En A. vulgare la situación está invertida: las hembras poseen dos cromosomas sexuales di­ ferentes, llamados Z y W y los machos poseen dos cromosomas Z similares. Sin embargo, en muchas po­ blaciones de A. vulgare esteisistema natural de determinación del sexo por los cromosomas sexuales ha si­ do usurpado por un grupo singular de bacterias. Estas bacterias Wolbachia residen en las células de los isópodos y, de una forma que io es totalmente conocida, determinan que los machos se infecten con la bac­ teria para desarrollarse como hembras. Estos isópodos de sexo invertido son genéticamente machos, con dos cromosomas Z, pero desarrollan rasgos de hembra y se reproducen como hembras completamente fun­ cionales. ¿Por qué las bacterias Woliachia se toman el trabajo de convertir a los isópodos macho en hembras? La respuesta reside en la forma en que las bacterias se transmiten. Wolbachia se encuentra en el citoplasma de las células de los isópodos y se transmite de un isópodo a otro estrictamente a través del citoplasma del óvulo de un isópodo; como el espermatozoide contiene escaso citoplasma o ninguno, las bacterias no son transmitidas por los machos. Por tanto, las bacterias que terminan en el interior de un isópodo macho se encuentran en un extremo muerto. La selección natural, al actuar sobre las bacterias, favorece cualquier rasgo que haga que las bacterias lleguen a una hembra y ha conducido a la capacidad de las bacterias pa­ ra convertir los machos en hembras. No obstante, la selección natural actuando sobre el isópodo favorece una proporción de sexo de 50:50 (como se explicó antes) y, en un sentido evolutivo, los isópodos han con­ traatacado desarrollando un gen autosómico dominante que a veces supera los efectos feminizantes de las bacterias. En esta situación fascinante los isópodos y las bacterias están trabados en un tira y afloje evolu­ tivo, en el que el efecto de la selección sobre las bacterias favorece a los isópodos hembra y sobre los isó­ podos favorece a igual númeroide machos y hembras. El sexo en los bichos bolita es solo un ejemplo de las formas variadas en que se determina el sexo y cómo influye en la herencia. En el capítulo 3 estudiamos Ibs principios de segregación y distribución independiente de Mendel y vi­ mos que estos principios explican mucho acerca de la naturaleza de la herencia. Después del redescubri­ miento de los principios de Mendel en 1900 los biólogos comenzaron a realizar estudios genéticos sobre una gran serie de organismos diferentes. Cuando aplicaron los principios de Mendel más ampliamente se observaron excepciones, y por ello fue necesario crear extensiones de los principios básicos de la heren­ cia. En este capítulo exploraremos una de las extensiones principales de los principios de Mendel: la he­ rencia de características codificadas por genes localizados en los cromosomas sexuales, que difieren entre hombres y mujeres (fig. 4-1). Se dice que estas características y los genes que las producen están ligados al sexo. Para comprender la herencia de las características ligadas al sexo primero debemos saber cómo se determina el sexo: por qué algunos miembros de las especies son machos y otros son hembras. La deter­ minación del sexo es el tema central de la primera parte del capítulo. En la segunda parte se examina có­ mo se heredan las características codificadas por genes de los cromosomas sexuales. En el capítulo 5 ex­ ploraremos algunas otras formas de interacción del sexo y la herencia. Cuando consideremos la determinación del sexo y las características ligadas al sexo será útil pensar en dos principios importantes. En primer lugar, existen varios mecanismos diferentes de determinación del se­ xo y, fundamentalmente, el tipo de mecanismo controla el modo de herencia de las características ligadas al sexo. En segundo lugar, los cromosomas sexuales X e X como otros pares de cromosomas, pueden aparearse durante la meiosis y distribuirse, pero no son ho­ mólogos (sus secuencias génicas no codifican las mismas caracte­ rísticas): la mayor parte de los^ genes dél cromosoma X son dife­ rentes de los genes del cromosoma Y. En consecuencia, los machos y las hembras no poseen el mismo número de alelos en los locus ligados al sexo. Esta diferencia

R a n g o f e n o t íp ic o

codifica flores rojas.

B

.' ^

codifica ' flores blancas, i

B la n c o d o m in a n t e

A 'A 2

A 'A

B

Si el heterocigoto es rojo,

i el alelo a ’ es dominante ; sobre el alelo A^.

H

/

.J \ ..... Si el heterocigoto es blanco, el alelo A^, es dominante sobre el alelo A '.

D o m in a n cia in co m p leta

A 'A 2 ' ^ S i el fenotipo del heterocigoto se ubica entre los fenotipos de los dos homocigdtos, la donninancia es incompleta.

Fig. 5"2 . El tip o de d o m in a n cia q u e ex h ib e un rasgo d e ­ p en d e d e có m o se r e la c io n a el fe n o tip o del h e tero cig o to co n lo s fe n o tip o s d e lo s h o m o cig o to s.

Cuadro 5-1I

Diferencias entre dominancia, dominancia incompleta y codominancia

Tipo de dom inancia

Definición

Dominancia

El fenotipo del heterocigoto es igual al de uno de los hom oci­ gotos

Dominancia incompleta

El fenotipo del heterocigoto es intermedio (cae dentro del es­ pectro) entre los fenotipos de los dos homocigotos

Codominancia

El fenotipo del heterocigoto in­ cluye los fenotipos de ambos homocigotos

ta iia; p o r ta n to , los tip o s M N n o su elen te n e rs e en c u e n ta e n las tra n sfu sio n e s san g u ín e a s. E l lo cu s M N c o n tie n e dos a le lo s: el alelo Ü ^, q u e c o d ific a p a ra el an tíg en o M , y el alelo L ^ , q u e -c o ­ d ifica p a ra el a n tíg e n o N . L o s h o m o c ig o to s co n g e n o tip o ex p re sa n el a n tíg e n o M en sus g ló b u lo s ro jo s y tienen tip o san­ g u ín eo M . L o s h o m o c ig o to s co n g e n o tip o ex p resan e l antí­ g eno N y tie n e n tip o sa n g u ín e o N. L o s h e te ro c ig o to s c o n g e n o ti­ p o Ü^lJ^ e x h ib e n c o d o m in a n c ia , e x p re san lo s an tíg en o s M y N, y tien en tip o sa n g u ín e o M N . E n el cu a d ro 5-1 se re s u m e n las di­ fere n c ias e n tre d o m in a n c ia , d o m in a n c ia in c o m p le ta y c o d o m i­ nancia. El tip o d e d o m in a n c ia q u e ex h ib e u n c a rá c te r suele d e p e n d e r del n ivel d e l fen o tip o e x a m in a d o . U n e je m p lo es la fib ro s is quística, u n o d e lo s tra sto rn o s g e n ético s m ás fre c u e n te s en lo s in d iv i­ d uos d e ra z a b la n c a y h a b itu a lm e n te c o n sid e ra d o una e n fe rm e d a d recesiv a. L a s p e rso n a s c o n fib ro sis q u ís tic a p ro d u cen g ran d es c a n tid ad e s d e m o c o e sp e so y p eg ajo so , q u e o b stru y e las v ía s res­ p ira to ria s p u lm o n a re s y lo s c o n d u cto s q u e v a n del p á n c re a s al in­ testin o y q u e c a u sa in fe c c io n e s resp ira to ria s frécuentes y p ro b le ­ m as d ig e stiv o s. A u n c o n tra tam ien to m é d ic o estos p a c ie n te s su­ fren p ro b le m a s m é d ic o s c ró n ic o s y p o te n c ia lm e n te fa ta le s . E l g e n re s p o n sa b le d e la fib ro sis q u ístic a , u b icad o en e l brazo larg o d el c ro m o so m a 7, co d ific a u n a p ro te ín a d e n o m in a d a regu­

lador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística, a fo rtu n a d a m e n te a b re v ia d o C E T R , q u e a c tú a co m o u n a p u e r ta en la m e m b ra n a ce lu la r y re g u la el m o v im ien to d e iones c lo r u ro ha­ c ia a d en tro y a fu e ra d e la célu la. L os p a c ie n te s afectí^dos tienen u n a fo rm a m u ta d a y d isfu n c io n a n te d e C E T R que d e te rm in a que el can al se m a n te n g a c e rra d o y q u e los io n e s clo ruro se acu m u le n en la cé lu la . E sta a c u m u la c ió n c o n d u ce a la fo rm ació n d e m oco e sp eso y p ro d u c e los sín to m a s de la e n fe rm e d a d . L a m a y o ría d e las p e rs o n a s tien en d o s c o p ia s del a le lo no rm al d e C F T R y so lo p ro d u c e n p ro te ín a C E T R fu n cio n al. L o s p a c ie n ­ tes co n fib ro sis q u ístic a tie n e n dos c o p ia s d el alelo m u ta d o de C F T R y so lo p ro d u c e n la p ro te ín a C F T R d efec tu o sa. L o s h e te ro ­ c ig o to s, q u e p o se e n u n a le lo d e C F T R n o rm a l y otro d e fe c tu o so , p ro d u c e n ta n to p ro te ín a fu n c io n a l c o m o d efec tu o sa. P o r lo tanto, a n iv el m o le c u la r a m b o s alelo s son c o d o m in a n te s y a q u e se ex­ p resan e n lo s h e te ro c ig o to s. S in em b arg o , d a d o que u n a le lo nor­ m al p ro d u c e su fic ie n te p ro te ín a C F T R fu n c io n a l para p e r m itir el

104 Capítulo 5 tran sp o rte, n o rm a l de c lo ru ro los h e te ro c ig o to s n o tien e n efec to s ad v erso s y el alelo C F T R m u ta d o p a re c e ser re c e siv o a n iv el fi­ sio ló g ico . E n re su m en , d e b e n d e sta c a rse v arias c a ra c te rístic a s im p o rta n ­ tes de la d o m in an cia . E n p rim e r lugar, la d o m in a n c ia es re s u lta ­ do d e in te ra c c io n e s e n tre g en es d e u n m ism o lo c u s; e n o tras p a ­ lab ras, la d o m in a n c ia es u n a in te ra c c ió n alélica. E n se g u n d o lu ­ gar, la d o m in a n c ia n o a lte ra la fo rm a e n la q u e se h e re d a n lo s g e ­ n es; solo in flu y e en su m a n e ra d e e x p re sa rse en el fen o tip o . P o r lo tan to , la in te ra c c ió n a lé lic a q u e c a ra c te riz a la d o m in a n c ia es u n a in te ra c c ió n e n tre lo s productos d e lo s g en es. P o r líltim o, la d o m in a n c ia d e p e n d e d e l o jo c o n q u e se m ire , es d e c ir q u e su c la ­ sificac ió n d e p e n d e d el n iv el en el cu a l se e x a m in a el fen o tip o . C o m o v im o s e n la fib ro sis q u ística , un ale lo p u e d e e x h ib ir c o d o m in a n c ia en un n iv e l y ser rec e siv o en o tro nivel.

CONCEPTOS CLAVE La dom inancia implica interacciones entre genes de un mismo locus (genes alélicos) y es un aspecto del fenoti­ po; la dom inancia no afecta la manera en la que se here­ dan los genes. El tipo de dom inancia de una determ inada característica depende a menudo del nivel fenotípico eva­ luado.

Penetrancia y expreswidad E n los cru z a m ie n to s g e n ético s p re s e n ta d o s h a sta a h o ra h e m o s c o n sid e ra d o solo las in te ra c c io n e s de ale lo s y h e m o s su p u esto q u e to d o o rg an ism o in d iv id u a l q u e tie n e u n g e n o tip o p a rtic u la r ex p re sa el fen o tip o e sp e rad o . P o r e je m p lo , su p o n g a m o s q u e el g en o tip o R r sie m p re p ro d u c e sem illas re d o n d a s y q u e el g e n o ti­ p o rr sie m p re p ro d u c e sem illa s ru g o sa s. S in em b a rg o p a ra a lg u ­ n as cara c te rístic a s e sta su p o sic ió n es in c o rre c ta ; el g e n o tip o n o sie m p re p ro d u c e el fe n o tip o esp e ra d o , fe n ó m e n o d en o m in ad o

d en a lte ra r o su p rim ir c o m p le ta m e n te el e fe c to de u n g e n p articu ­ lar. P o r e je m p lo , u n g e n p u e d e c o d ific a r un e n zim a q u e produce u n fe n o tip o p a rtic u la r so lo d en tro d e u n ra n g o lim ita d o d e tem pe­ ratu ra. A te m p e ra tu ra s m á s altas o m ás b a ja s la en z im a n o funcio­ n a y el fe n o tip o n o es ex p resa d o ; d e e ste m o d o el a le lo q u e codi­ fic a e s ta e n z im a es p e n e tra n te so lo d e n tro d e u n ra n g o p articu lar de te m p e ra tu ra . M u c h a s c a ra c te rístic a s m u e stra n p e n e tra n c ia in­ c o m p le ta y e x p re s iv id a d v ariab le; así, la sim p le p re s e n c ia de un g en n o g a ra n tiz a su e x p re sió n .

CONCEPTOS CLAVE La penetrancia es el porcentaje de individuos que tienen un genotipo específico que expresa el fenotipo asociado. Expresividad es el grado en el cual se expresa un rasgo. La penetrancia incom pleta y la expresividad variab le son resultado de la influencia de otros genes y de los facto­ res am bientales sobre el fenotipo.

Alelos letales E n 1905 L u c ie n C u e n o t in fo rm ó u n p a tró n p artic u la r d e heren­ cia en el ra tó n . C u a n d o a p a re a b a dos ra to n e s am arillo s, c e rc a de dos te rc io s d e la p ro le e ra a m a rilla y u n te rc io era d e o tr o color. C u a n d o c ru z ó ra to n e s a m arillo s h a lló q u e to d o s los d e sc e n d ie n ­ tes e ra n h e te ro c ig o to s; n u n c a fu e c a p a z d e o b ten er u n r a tó n am a­ rillo q u e v e rd a d e ra m e n te se re p ro d u je ra . M á s tai'de lo s in v e stig a ­ d o res re c o n o c ie ro n q u e e l ale lo a m a rillo d e b e ser letal e n lo s hom o c ig o to s (fig. 5-4). U n alelo letal es el q u e causa la m u e r te en u n a e ta p a te m p ra n a d e l d e sa rro llo - a m e n u d o antes d el n a c im ie n ­ t o - p o r lo q u e a lg u n o s g e n o tip o s p u e d e n n o a p arecer e n l a proge­ nie. C u e n o t c ru z ó o rig in a lm e n te dos ra to n e s h e te ro c ig ó tic o s p ara el c o lo r a m a rillo : Yy x Yy. E n c o n d ic io n e s n o rm ales se esp eraría que e ste c ru z a m ie n to p ro d u je ra YY, V , Yy y V. yy (v é a s e fig.

penetrancia incompleta. L a p en etran cia in co m p leta se observ a en la p o lid a c tilia hu m an a, trasto rn o en q u e se p resen tan d ed o s extras en los p ies y las m an o s (fig. 5-3). N o o bstan te ex isten varias fo rm as d iferen tes d e p o lid actilia h u m an a, el rasg o su ele ser cau sad o p o r un alelo d o m in ante. E n ocasiones las p erso n as p o se e n el alelo p a ra la, p o h d a c tih a (com o lo ev id en cia el h ech o d e q u e sus hijos h ere d an este trasto rn o ) p ero p e ­ se a eso tien en u n n ú m ero n o rm al de d ed o s en las m a n o s y los pies. En estos caso s el gen p a ra la p o lid ac tilia n o tien e u n a p en e tra n c ia com pleta. L a penetrancia se d efine co m o el p o rc e n ta je d e in d iv i­ d uos con un g en o tip o esp ecífico q u e ex p resa el fe n o tip o esperado. P o r ejem plo, si ex am in am o s a 4 2 p erso n as q u e tien en u n alelo p a ­ ra p o lid actilia y observ am o s q u e 38 de ellas son p o lid actílieas, la pen etran cia sería de “ ^ ,9 0 (90% ). U n co n c e p to re la c io n a d o es el d e la expresividad, el g rad o en el cu al se e x p re s a u n a c a ra c te rístic a . A d e m á s d e la p e n e tra n c ia in ­ co m p le ta , la p o lid a c tilia m u e stra u n a e x p re siv id a d v ariab le. A l­ gu n as p e rso n a s p o lid a c tíh c a s p o se e n d e d o s e x tra s e n m a n o s y p ies q u e so n c o m p le ta m e n te fu n c io n a le s, m ie n tra s q u e o tra s p o ­ se e n solo u n p e q u e ñ o c o lg a jo d e p ie l ex tra. L a p e n e tra n c ia in c o m p le ta y la ex p re siv id a d v a ria b le se d eben a lo s efe c to s d e o tro s g e n e s y a lo s fa c to re s a m b ie n ta le s q u e p u e ­

Fi g. 5 - 3 . La p o lid a c tilia h u m an a (d e d o s a d ic io n a le s ) ex­ hibe p e n e tra n c ia in co m p le ta y e x p re s iv id a d v a r ia b le . (Bioph o t o A s s o c i a t e s / S c i e n c e S o u r c e / P h o t o R e s e a r c h e r s .)

Extensiones y modificaciones de Los principios básicos 105 5-4). L os rato n e s h o m o c ig ó tic o s YY son c o n c e b id o s p e ro n u n c a co m p letan su d e sarro llo , lo q u e d e ja u n a re la c ió n 2 : 1 de rato n es Yy (am arillo s) y rato n e s yy (no a m arillo s) e n la p ro le o b serv ad a; to d o s los rato n e s a m arillo s so n h e te ro c ig ó tic o s (Yy). O tro e jem p lo de alelo letal, d e sc rito o rig in a lm e n te p o r E rw in B au r en 1907, se e n c u e n tra en las p la n ta s c o n o c id a s c o m o b o ca de dragón. L a c ep a au rea d e esta s p la n ta s tie n e h o ja s am arillas. C uando se c ru z a n dos p la n ta s c o n h o jas a m a rilla s, d o s terc io s de la p ro g en ie tie n e h o ja s a m a rilla s y un te rc io tie n e h o ja s verdes. C uando se c ru z a v e rd e c o n v erd e, to d a la p ro g e n ie tie n e h o jas verdes, p e ro cu an d o se c ru z a a m arillo c o n v erd e, la m ita d de la p ro g en ie es v e rd e y la o tra m ita d es a m arilla, lo q u e c o n firm a q u e to d as las b o c a d e d ra g ó n co n h o ja s a m a rilla s so n h e te ro c ig ó tic a s. L a relació n 2:1 casi sie m p re es p ro d u c id a p o r u n ale lo le ta l re c e ­ sivo, p o r lo q u e la o b se rv a c ió n d e e sta re la c ió n en la p ro g e n ie de un c ru zam ien to e n tre in d iv id u o s c o n ig u a l fe n o tip o es u n a fu erte in d icació n d e qu e u n o d e lo s alelo s es letal. E n los dos e jem p lo s p re se n ta d o s los ale lo s le ta le s so n recesiv o s p o rq u e p ro d u c e n la m u e rte so lo en los h o m o c ig o to s. A d ife re n cia de este e fe c to so b re la su p e r v iv e n c ia el e fe c to d e l a le lo so b re el c o lo r es d o m in a n te ; tan to en los ra to n e s c o m o en las b o c a de d ra ­ gón u na so la c o p ia del a le lo en el h e te ro c ig o to es su fic ie n te p a ra p ro d u c ir c o lo r am arillo . L o s alelo s le ta le s ta m b ié n p u e d e n ser d o ­ m in an tes; en este caso lo s h o m o c ig o to s y lo s h e te ro c ig o to s p a ra el alelo m u eren . L o s ale lo s le ta les v e rd a d e ra m e n te d o m in an tes no p u ed en tra n sm itirse , a m e n o s q u e se e x p re se n d e sp u é s d el in i­ cio de la re p ro d u c c ió n , c o m o en la e n fe rm e d a d de H u n tin g to n .

CONCEPTOS CLAVE Un alelo letal causa la muerte, con frecuencia en etapas tempranas del desarrollo, por lo que uno o más genoti­ pos están ausentes en la progenie de un cruzamiento. Los alelos letales pueden modificar la relación de la pro­ genie resultante de un cruzamiento.

A m a r illo

Patrones de Las plumas de pato U n e je m p lo d e alelo s m ú ltip le s es el d el lo cu s que d e te rm in a el p atrón d e la s p lu m as d e los p ato s ánades rea le s. U n alelo, M , pro­ duce el p a tró n á n a de rea l silvestre. U n se g u n d o alelo, M ^ , p ro d u ­ ce u n p a tró n d iferen te d en o m in a d o restrin g id o , y un te r c e r alelo, m'^, p ro d u c e u n p atró n d e n o m in a d o oscuro. E n esta serie a lé lic a el restrin g id o es d o m in a n te so b re el ánade re a l y el oscuro, y el ána­ de real es d o m in a n te so b re el oscuro: > M > m ‘*. L os se is geno­ tipos p o sib les d e estos tres alelos y sus fe n o tip o s resu ltan tes son:

Genotipo

Fenotipo re s trin g id o

M ^M

re s trin g id o re s trin g id o

MM

á n a d e re a l

Mm'^

á n a d e re a l

A m a r illo

E n gen eral el n ú m ero d e genotipos p o sib le s e i l [n(« 4 - l ) ] / 2 , don­ de n es el n ú m e ro de alelos diferentes en u n m ism o locus. L o s cru­ zam ientos co n alelos m ú ltip les no difieren d e los cru zam ien to s de trabajo co n dos alelos; lo s p rincipios de segregación de M e n d e l si­ guen sien d o ap licables, c o m o se m u estra en el cru zam iento e n tre un pato de p atró n restrin g id o y u n ánade real (fig. 5-5).

X >>

1

1

\

\

F i

/ /

l

l

f

y .

y )'

J

J

laii

\

i

^ 1 ^

---------

G e n e ra ció n F , M u e rto s

'A i T C o n c lu s ió n :

5-4.

L a m a y o ría d e los siste m a s g e n ético s q u e h em os e x a m in a d o h asta a h o ra c o m p re n d e n d o s alelo s. E n lo s g u isa n tes d e M en d el, p o r e je m p lo , u n ale lo c o d ific a p a ra se m illa s re d o n d as y o tr o para sem illas ru g o s a s; en lo s g a to s un ale lo p ro d u c e p e laje n e g ro y otro p e la je g ris. P a ra a lg u n o s lo ci e x iste n m á s d e dos a le lo s d en­ tro de un g ru p o d e in d iv id u o s - e l lo c u s tie n e alelos m ú l ti p le s - . (L os alelo s m ú ltip le s p u e d e n tam b ién d e n o m in a rse s e r ie s alélicas.) A u n q u e a v e ces h a y m á s d e dos a le lo s en un g ru p o , el ge­ n o tip o d e c a d a in d iv id u o d ip lo id e co n siste e n solo dos a le lo s . La h e re n c ia d e la s c a ra c te rístic a s co d ific a d a s p o r a le lo s'm ú ltip le s no d ifiere d e la h e re n c ia d e ca ra c te rístic a s c o d ific ad as p o r d o s ale­ los, salvo q u e es p o sib le u n a m a y o r v a rie d a d d e g e n o tip o s y fe­ notipos.

o scu ro

G e n e ra ció n P

G a m e to s

ñ M i y , iF f > H Í 5 lp l e s

io s r a t o n e s

%

de

1/ 3

de

A m a r illo

N o a m a r illo s

VzYy

V4 yy

YY

m u e r e n , p o r lo q u e

la p r o g e n ie la progenie

son son

Yy, yy,

J

____

a m a r illo s n o a m a r illo s

Fig. Una propo rció n de 2:1 e n tre la p rog en ie d e un cru za m ien to e s re su lta d o d e la seg reg ació n de un a le lo letal.

El sistema ABO de grupos sanguíneos O tro s iste m a de ale lo s m ú ltip le s es el c o rre sp o n d ie n te a l locus p a ra lo s g ru p o s san g u ín e o s ABO. E ste lo cu s d ete rm in a e l grupo sa n g u ín e o ABO d e la p e rs o n a y, co m o en el c aso del lo c u s M N, c o d ific a p a ra a n tíg en o s e ritro c ita rio s. L o s tre s alelos c o m u n e s pa­ ra el lo c u s ABO son: I^ , q u e c o d ifica p a ra el antígeno A ; P , que co d ifica p a ra el a n tíg e n o B , y el alelo i, q u e co d ifica la a u se n c ia de a n tíg e n o (0). L as re la c io n e s de d o m in a n c ia entre lo s alelos ABO p u e d e n p re s e n ta rs e así: > i, P > i, = P . L os a le lo s /* e P son d o m in a n te s so b re el alelo i y so n c o d o m in an tes e n tr e sí; el fe n o tip o A B se d eb e a la p re sen c ia d e u n a le lo y u n a le lo P , lo q u e c o n d u c e a la p ro d u c c ió n d e los a n tíg e n o s A y B en lo s eri­ tro cito s. U n in d iv id u o c o n g e n o tip o ii n o p ro d u c e n in g u n o d e es-

106 Capítulo 5

G e n e ra ció n P R e s t r in g id o s

Ánade

real

•/ ** . .

X

M V

Mm** i

___I

Gametos

M j__________ j

L a n iñ a n o p o d ría h a b e r h e red a d o el a le lo /® de B a rry (B arry no p o d ía p o rta r u n a le lo /® al te n er tip o sa n g u ín eo A ); p o r tanto, la n iñ a d e b e h a b e r h e re d a d o d e su m a d re e l alelo i. B a rry debe h a­ b e r te n id o g e n o tip o y la n iñ a u n g e n o tip o /*^¡. D a d o q u e la ni­ ñ a h e re d ó el ale lo i d e B a rry tuvo q u e h a b e r h e re d a d o e l alelo P de su p a d re . C o n u n tip o san g u ín eo O, so lo p ro d u c id o p o r el g e ­ n o tip o n, C h a p lin n o p u d o h a b e r sid o el p a d re de la h ija de Barry. D u ra n te el ju ic io d e p a te rn id a d se lla m ó al estrado a tr e s patólo­ gos q u e d e c la ra ro n q u e e ra g e n é tic a m e n te im p o sib le q u e C haphn fu e ra e l p a d re d e la n iñ a . N o o b sta n te , el ju ra d o d ic ta m in ó que lo era y le o rd e n ó p a g a r la m a n u te n c ió n d e la n iña y las c o sta s lega­ les d e B arry .

CONCEPTOS CLAVE G e n e ra ció n F, Anade real

R e s t r in g id o s

1/4 M ^ M

1/4 M ® m ‘*

C o n c lu s ió n :

O sc u ro s

Si bien dentro de un grupo de individuos es posible que se presenten más de dos aleles (aleles múltiples), cada individuo diploide sigue teniendo solo dos aleles en ese locus.

1/4 M w **

la p r o g e n ie e s t á f o r m a d a p o r V2 re s trin g id o s ,

;

Interacción génica

1/4 á n a d e re a l y V i o s c u r o s , i

5-5. El p rin c ip io de M endel d e la se g re g a c ió n e s a p lic a b le a c ru z a m ie n to s con a le lo s m ú ltip le s . En e s te

Fig.

e je m p lo t re s a le lo s d e t e r m in a n e l t ip o d e p lu m a je d e lo s p a to s á n a d e s r e a le s : M " (r e s t r in g id o ) >

M

(á n a d e re a l) >

(o s c u r o ).

to s a n tíg en o s y tie n e tip o san g u ín e o 0. L o s seis g e n o tip o s c o m u ­ n es en e ste lo cu s y sus fe n o tip o s se m u e stra n en la figura 5-6a. S e p ro d u c e n an tic u e rp o s c o n tra c u a lq u ie r a n tíg e n o ex tra ñ o (v éase fig. 5-6 a). P o r e jem p lo , u n a p e rs o n a c o n tip o sa n g u ín eo A p ro d u c e an tic u e rp o s c o n tra el a n tíg e n o B d a d o q u e e ste ú ltim o le es ex trañ o . U n a p e rs o n a co n tip o sa n g u ín e o B p ro d u c e a n tic u e r­ p o s c o n tra el a n tíg e n o A y las p e rso n a s c o n tip o A B no p ro d u c e n n in g u n o d e esto s a n tic u erp o s d ad o q u e n i el a n tíg e n o A ni el a n ­ tíg e n o B le son ex trañ o s. U n a p e rs o n a co n g ru p o sa n g u ín eo O n o p o se e an tíg e n o A n i B , p o r lo q u e p ro d u c e a n tic u e rp o s c o n tra A y c o n tra B . L a p re s e n c ia d e an tic u e rp o s c o n tra a n tíg e n o s ABO e x ­ trañ o s d e te rm in a q u e las tra n sfu sio n e s sa n g u ín e a s e x ito sa s solo sean p o sib le s e n tre p e rso n a s co n cie rto s tip o s sa n g u ín e o s c o m p a ­ tib les (fig. 5-6b). L a h e re n c ia d e alelo s d el lo c u s ABO p u e d e ilu stra rse c o n u n ju i­ c io d e p a te rn id a d q u e in v o lu cró al fa m o so a c to r d e c in e C h a rlie C h ap lin . E n 1941 C h a p lin c o n o c ió a u n a jo v e n a c triz lla m a d a Jo an B arry, con la q u e tu v o u n ro m a n c e q u e d u ró h a s ta fe b re ro de 1942, p e ro 2 0 m ese s m ás ta rd e B arry d io a lu z a u n a b e b a y r e ­ clam ó q u e C h ap lin e ra el p a d re , p o r lo q u e e n ta b ló u n ju ic io p o r m a n u te n c ió n d e la c riatu ra. E n e sa ép o c a se e sta b a g e n e ra liz a n d o la tip ific a c ió n de g ru p o s sa n g u ín e o s y lo s ab o g a d o s d e C h a p lin so lic ita ro n q u e se h ic ie ra e sa d e te rm in a c ió n en C h a p lin , B a rry y la n iña. B arry te n ía g ru p o sa n g u ín eo A', la n iñ a te n ía g ru p o B y C h a p lin te n ía g ru p o 0. ¿ P u d o h a b e r sid o C h a p lin el p a d re d e la h ija de B arry ? S u re s p u e sta d e b e se r n o . Jo a n B a rry te n ía tip o sa n g u ín e o A , el q u e p u e d e se r p ro d u c id o p o r lo s g e n o tip o s o IH . S u h ija p o ­ se ía tip o B , q u e p u e d e ser g e n e ra d o p o r lo s g e n o tip o s P P o fi i .

E n lo s c ru z a m ie n to s d ih iljrid o s e x a m in a d o s en el c a p ítu lo 3 ca­ d a lo c u s te n ía u n e fe c to in d e p e n d ie n te so b re el fe n o tip o . C uando M e n d e l c ru z ó u n a p la n ta h o m o c ig ó tic a p a ra re d o n d o y am arillo (RR YY) c o n u n a p la n ta h o m o c ig ó tic a p a ra ru g o so y v e r d e ( r r yy) y lu e g o a u to fe rtiliz ó a la g e n erac ió n F l , o b tu v o u na p ro g e n ie F2 en las sig u ie n te s p ro p o rc io n e s:

R J '- .

re d o n d a , am arilla

R -y y

re d o n d a , verde

rrY _

ru g o s a , am arilla

rryy

ru g o sa , v erde

E n e ste e je m p lo lo s g en e s m o stra b a n d o s clases de in d e p e n d e n ­ cia. P rim e ro , los g e n e s d e cad a lo cu s so n in d e p e n d ie n te s respec­ to d e su segregación e n la m eiosis, q u e es lo q u e p ro d u c e la rela­ ción 9 :3 :3 ;1 en lo s fe n o tip o s de la p ro g e n ie , de a c u e rd o con el p rin c ip io d e se g re g a c ió n in d e p e n d ie n te d e M endel. S e g u n d o , los g en es so n in d e p e n d ie n te s e n su expresión fenotípica\ lo s alelo s R y r a fe c ta n so lo la fo rm a d e la se m illa y n o influyen s o b r e el co­ lo r del e n d o sp e rm a ; lo s alelo s Y e. y a fe c ta n solo el c o lo r y no in­ flu y en so b re la fo rm a d e la sem illa. C o n fr e c u e n c ia lo s g e n e s e x h ib e n d is trib u c ió n in d e p e n d ie n te p e ro n o a c tiia n e n fo r m a in d e p e n d ie n te re s p e c to d e s u e x p re­ sió n fe n o típ ic a , sin o q u e lo s e fe c to s d e lo s g enes d e u n locus d e p e n d e n d e la p re s e n c ia d e g e n es e n o tro s loci. E s te tip o de in te ra c c ió n e n tre lo s e fe c to s de lo s g e n e s d e d is tin to s lo c i (ge­ n es n o a lé lic o s ) se d e n o m in a interacción génica. C u a n d o ex is­ te in te ra c c ió n g é n ic a , io s p ro d u c to s d e lo s g en es d e d is tin to s lo c i se c o m b in a n p a ra p ro d u c ir n u e v o s fe n o tip o s q u e n o son p re d e c ib le s a p a rtir d e lo s e fe c to s d e u n ú n ic o lo cu s. E n n u es­ tra c o n s id e ra c ió n d e la in te ra c c ió n g é n ic a c e n tra re m o s l a aten ­ ció n en la in te ra c c ió n e n tr e lo s e fe c to s d e lo s g en es d e d o s lo ­ ci, a u n q u e so n h a b itu a le s las in te ra c c io n e s e n tre lo s g e n e s de tres, c u a tro o m á s lo c i.

Extensiones y modificaciones de Los principios básicos IC

(b) (a) F e n o tip o

G e n o t ip o

(tipos sanguíneos)

T ip o d e a n t íg e n o

A n t ic u e r p o s e l o r g a n is m o

o

jBj» O

AB

A y B

ii

A

B

g e n e ra d a s p o r ía n t ic u e r p o s (a n t ic u e r p o s

N in g u n o

Fig.5-6. T ip o s s a n g u ín e o s ABO y t r a n s f u s io n e s s a n g u ín e a s p o s ib le s .

N in g u n o

A yl

AB

O

(s in

(a n tic u e rp o s

i • • • • • • m • • • m !• m a n tiB )

a n tíA )

I Los donantes de tipo O I pueden donar a cualquier I receptor: son donantes ! universales.

CONCEPTOS CLAVE En ia interacción génica los genes de distintos ioci contri­ buyen a determ inar una única característica fenotípica.

Interacción génica que produce fenotipos nuevos E x a m in e m o s p rim e ro la in te ra c c ió n g é n ic a en la q u e los g en es d e dos lo ci in te ra c c io n a n p a ra p ro d u c ir u n a ú n ic a c a rac te rístic a, c o m o o c u rre co n el c o lo r d el fru to d el p im ie n to Capsicum annuum . E sta p la n ta p ro d u c e p im ie n to s c o n u n o d e c u a tro co lo res p o sib les: ro jo , m arró n , a m a rillo o v erde. S i u n a p la n ta h o m o c ig ó tic a d e p im ie n to s ro jo s es c ru z a d a c o n u n a p la n ta h o m o c ig ó tic a de p im ie n to s v erd es, to d as las p la n ta s d e la g e n e ra c ió n F j tie n en p im ie n to s ro jo s (fig. 5-7a). C u an d o se c ru z a n e n tre s í p la n ta s de la g e n e ra c ió n F p la re la c ió n en la g e n e ra c ió n F 2 es 9 ro jo s:3 m arro n es:3 am arillo s: 1 v e rd e (fig. 5-7b). E sta re la c ió n d ih íb rid a (cap. 3) es p ro d u c id a p o r u n c ru z a m ie n to e n tre d o s p la n ta s q u e so n h e te ro c ig ó tic a s p a ra dos lo c i {Rr Ce x R r Ce). E n los p im ie n ­ to s un alelo R d o m in a n te e n el p rim e r lo cu s p ro d u c e p ig m e n to ro ­ jo ; el alelo re c e siv o r en ese lo c u s d e te rm in a q u e n o se p ro d u z c a p ig m e n to ro jo . U n ale lo d o m in a n te C en el seg u n d o lo c u s d e te r­ m in a la d e sc o m p o sic ió n d e l p ig m e n to v e rd e c lo ro fila, m ie n tra s q u e el ale lo recesiv o c p e rm ite q u e la c lo ro fila p e rsista . E n to n c e s,

a n t ic u e r p o s ) ar\tiA y a n tiB i

Los glóbulos rojos que no reaccionan .! con los anticuerpos del receptor i permanecen uniformemente dispersos. | I La sangre del donante es compatible ! con la del receptor. Los glóbulos rojos que reaccionan con | anticuerpos del receptor se aglutinan, i ; La sangre del donante es incorrp t ble con la sangre del receptor. i

Los receptores AB pueden aceptar sangre de cualquier donante: son receptores universales.

los g e n e s d e am b o s lo c i in te ra c tú a n p a ra p ro d u c ir lo s c o lo re s vis­ tos en la g e n e ra c ió n F , d e p im ien to s:

Genotipo

Fenotipo

R ^C _

ro jo

R _ec

marTÓn

rr C_

a m a rillo

rr cc

v e rd e

A fin d e ilu stra r c ó m o p u e d e n u sa rse la s reglas d e la herencia de M e n d e l p a ra e n te n d e r la h e re n c ia d e la s c a ra c te rístic a s deter­ m in a d a s p o r la in te ra c c ió n g én ica co n sid e re m o s el cru zam ien to de p ru e b a e n tre u n a p la n ta F j del c ru z a m ie n to m o s tra d o en la fi­ g u ra 5 -7 {Rr Cc) y u n a p la n ta de p im ie n to s verdes (rr cc). Como se d e sc rib ió en el c a p ítu lo 3 (pp. 6 1 -6 2 ) en el caso d e lo s loci in­ d e p e n d ie n te s, este c ru z a m ie n to p u ed e re so lv e rse d e sc o m p o n ié n ­ d o lo e n d o s c ru z a m ie n to s sim ples. E n el p rim e r lo c u s e l genoti­ p o h e te ro c ig ó tic o R r es cru za d o c o n el h o m o c ig ó tic o r r , lo que p ro d u c e u n a p ro g e n ie m ita d R r y m ita d rr. A sim ism o , e n el se­ g u n d o lo c u s el g e n o tip o h e te ro c ig ó tic o C c es cru zad o c o n el ge­ n o tip o h o m o g ó tic o ce y p ro d u c e u n a p ro g e n ie m itad C c y mitad cc. D e a c u e rd o c o n lo s p rin c ip io s d e M e n d e l de d is trib u c ió n in­ d e p e n d ie n te estas p ro p o rc io n e s d e c a d a lo c u s p u ed en co m b in a r­ se u sa n d o la re g la d e la m u ltip lic a ció n : la p ro b a b ilid a d d e obte­ n e r el g e n o tip o R r Cc es la p ro b a b ilid a d d e R r ( V j m u ltip lic a d a

108 Capítulo 5 (a) G e n e ra ció n P Rojo

n o tip o s d e c a d a lo c u s y m u ltip lic a r las p ro b a b ilid a d e s d e los ge­ notipos, n o las de lo s fe n o tip o s, y a q u e lo s fen o tip o s n o pueden d e te rm in a rse sin c o n s id e ra r lo s efe c to s d e lo s g en o tip o s e n todos los lo ci c o n trib u y e n te s. O tro e je m p lo d e in te ra c c ió n g é n ica q u e p ro d u c e fe n o tip o s n ue­ vos es la d e lo s g en es q u e d e te rm in a n la fo rm a de la c r e s ta en los p o llo s. L a c re s ta es la e stru c tu ra c a rn o s a so b re la c a b e z a de los p o llo s. L o s g e n e s d e d o s lo c i (R, r y P, p ) in te ra c c io n a n p a ra de­ te rm in a r lo s cu a tro tip o s d e c restas m o s tra d o s en la figura 5-8. Se p ro d u c e u n a c re s ta co n fo rm a de n u e z c u a n d o h ay al m e n o s un alelo R d o m in a n te en e l p rim e r lo cu s y al m e n o s un a le lo d o m i­ n an te P e n e l se g u n d o lo c u s (g e n o tip o R _P _). Ui\ p o llo con al m en o s u n a le lo d o m in a n te en el p rim e r lo c u s y dos a le lo s recesi­ vos en el se g u n d o lo cu s (g en o tip o R _ p p ) p o se e u n a c r e s ta con fo rm a d e ro sa . Si h a y d o s alelo s rec e siv o s e n el p rim e r lo c u s y al m e n o s u n o d o m in a n te e n el seg u n d o lo c u s (g enotipo rr P__), el p o llo tie n e u n a c re s ta c o n fo rm a d e g u is a n te . P o r ú ltim o , si am ­ b o s lo ci c o n tie n e n d o s ale lo s rec e siv o s (rr p p ), el ave tie n e una cre sta sim p le .

V e rd e

t

X

RRCC

L

Cruzamiento

G e n e ració n F R o jo

R r Ce

(b)

Interacción génica con epistasis

G e n e ra ció n F ,

i

® *

RrCc

RrCc J

L Cruzamiento

=

í =

E n o c a sio n e s el e fe c to d e la in te ra c c ió n g é n ic a es q u e u n gen e n m a s c a ra (o c u lta ) el e fe c to d e o tro g en d e u n lo cu s d if e r e n te ’ fe­ n ó m en o c o n o c id o c o m o epistasis. E ste fe n ó m e n o es s im ila r a la d o m in a n c ia , salv o q u e la d o m in a n c ia im p lic a el e n m a s c a ra m ie n ­ to de g e n e s d el m ism o lo c u s (genes a lé lic o s). En la e p is ta s is el g en q u e e n m a s c a ra es d e n o m in a d o gen epistático y el g e n cuyo e fecto es e n m a s c a ra d o se d e n o m in a gen hipostático. L o s genes ep istá tic o s p u e d e n se r re c e siv o s o d o m in a n te s en c u a n to a sus efecto s.

G e n e ra ció n F j R o jo

9 /i6

M a rró n

-R_

3/i6

Conclusión:

R-, c c

A m a r illo

V e rd e

3/16rr C_

Vie rr cc

9 ro jo s; 3 m a rr o n e s : 3 a m a rillo s ; 1 v e r d e ____ ,

Fig. 5-7. In te ra cció n g é n ica en la q u e d o s lo ci d e te rm i­ n an u n a m ism a c a ra c te rís tic a , el co lo r d el fru to , en el pi­ m iento C apsicu m annuum .

p o r la p ro b ab ilid ad de Cc (V j), es d ec ir V^. L a p ro b a b ilid ad de c a ­ da g en o tip o en la p ro g e n ie resu lta n te del c m z a m ie n to de p ru e b a es:

Genotipo de la progenie

Probabilidad en cada locus

R rC c

X

V,

Probabilidad global

E pistasis recesiva. L a e p istasis re c e siv a se o bserva e n lo s ge­ nes q u e d e te rm in a n el c o lo r del p elaje d e lo s perros la b ra d o re s. E sto s p e rro s p u e d e n se r n e g ro s, m a rro n e s o a m arillo s; lo s d is tin ­ tos c o lo re s d e su p e la je so n d e term in a d o s p o r in te ra c c io n e s entre g en es d e d o s loci (a u n q u e alg u n o s o tro s lo c i tam b ién c o n trib u y e n a d e te rm in a r el c o lo r d el p e la je ; v é a n se p p . 112-115). U n locus d e te rm in a el tip o d e p ig m e n to p ro d u c id o p o r la s pélulas c u tá n e a s: u n alelo d o m in a n te B c o d ific a p a ra el p ig m e n to negro, m ie n tra s q u e el ale lo re c e siv o b c o d ific a p a ra el p ig m e n to m arrón. L o s a le ­ los de u n se g u n d o lo c u s afec ta n el depósito d e l p ig m e n to e n la vaina d el p e lo ; el alelo E p e rm ite q u e se d e p o site el p ig m e n to o s­ cu ro (n eg ro o m a rró n ), m ie n tra s que el a le lo recesiv o e p re v ie n e el d e p ó sito d el p ig m e n to o sc u ro y d e te rm in a q u e el pelo s e a a m a ­ rillo. P o r ta n to , la p re s e n c ia d e u n g e n o tip o ee en el s e g u n d o lo ­ cus e n m a s c a ra la e x p re sió n d e los alelo s n e g ro y m arrón d e l p ri­ m e r locus. L o s g e n o tip o s q u e d ete rm in a n el c o lo r del p e la je y sus fe n o tip o s son:

Fenotipo

p im ie n to s ro jo s

R r cc

%

X

‘A

, p im ie n to s m a rro n e s

rr Cc

'¡2

X

v'

p im ie n to s am a rillo s

rr cc

'produce las enzimas 1y H,

C o m p u e s to C

i

yy

..yj........... El alelo dominante w inhibe la conversión de A a B.

Fig. 5-9.

Las plantas con genotipo yy no codifican una forma funcional de la enzima II.

El pigmento am arillo en eí zapallo de verano es producido en una v ía sintética de dos pasos.

m in a n te y a q ue, a d ife re n c ia del e en el p e la je del p e rro L abrad o r, u n a so la c o p ia d el alelo es su fic ie n te p a ra in h ib ir la p ro d u c c ió n de p ig m en to . E l za p a llo de v e ra n o p ro v e e u n a b u e n a o p o rtu n id a d p a ra c o n si­ d e ra r c ó m o su rg e la e p ista sis a m en u d o c u a n d o lo s g e n e s afectan u n a serie de p a so s en u n a v ía b io q u ím ica . E s m u y p ro b a b le q u e el p ig m e n to am a rillo del z a p a llo sea p ro d u c id o en u n p ro ce so b io q u ím ic o d e d o s p a so s (fig. 5-9). U n c o m p u e s to in c o lo ro (b lan ­ co, d esig n a d o A en la fig u ra 5 -9 ) es co n v ertid o p o r la e n z im a I en el c o m p u e sto v e rd e B , el q u e lu eg o es c o n v ertid o en el c o m p u e s­ to C p o r la e n z im a II. E l c o m p u e sto C es el p ig m e n to a m a rillo de la fruta. L as p la n ta s co n g e n o tip o ww p ro d u c e n la e n z im a I y lo s z a p a ­ llo s p u e d e n se r v erd e s o a m a rillo s, según si ex iste a d e m á s p ro ­ d u c c ió n d e la e n z im a II. C u a n d o e stá p re s e n te el alelo Y en el se ­ g u n d o lo cu s, se p ro d u c e la e n z im a II y el c o m p u e sto B se c o n ­ v ie rte en el c o m p u e s to C, lo q u e g e n e ra u n a fru ta a m arilla. C u a n ­ do la p la n ta tie n e do s co p ia s d e }^, q u e n o c o d ific a u n a fo rm a fu n ­ c io n a l de la e n z im a II, el z a p a llo sig u e sien d o verde. L a p re se n ­ cia de W en el p rim e r lo c u s in h ib e la c o n v e rsió n del co m p u e sto A en el c o m p u e s to B ; las p la n ta s c o n g e n o tip o W__ n o p ro d u c e n el co m p u e sto B y la fru ta se m a n tie n e b lan c a , in d e p e n d ie n te m e n te de cu ále s se a n lo s ale lo s p re se n te s en el se g u n d o locus. M u c h o s caso s de e p ista sis su rg en de e sta fo rm a. U n g en (co m o el W) q ue tie n e e fec to en u n p a so in ic ial d e u n a v ía b io q u ím ic a será esp istá tic o p a ra los g e n e s (co m o el F y el y) q u e afec ta n los p a so s sig u ien tes, y a q u e el e fec to d e la e n z im a en el p a so m ás ta r­ d ío d ep e n d e del p ro d u c to d e la p rim e ra re a c c ió n .

Epistasis recesiva doble. C o n sid e re m o s u n e jem p lo m ás d e ta ­ llad o de e p istasis. E l a lb in ism o es la au se n c ia de p ig m e n to , y es un ra sg o g e n é tic o fre c u e n te en m u c h as p la n ta s y an im a le s. E l p ig m e n to se p ro d u c e casi sie m p re a trav és d e u n a v ía b io q u ím ic a de p a so s m ú ltip le s; p o r ta n to , el a lb in ism o in v o lu c ra en oc a sio n e s u n a in te ra c c ió n g én ica . R o b e rt T. D illo n y A m y R. W eth in g to n h a lla ro n q u e el alb in ism o en el c a ra co l co m ú n d e a g u a d u lc e Physa heterostroha p u e d e se r re su lta d o d e la p re s e n c ia d e c u a lq u ie ra de d o s alelo s re c e siv o s en d o s lo c i d ife re n te s. S e re c o le c ta ro n c a ­ ra c o le s in se m in a d o s de u n a p o b la c ió n n a tu ra l y se lo s c o lo c ó en taza s co n ag u a, d o n d e d e p o sita ro n h u ev o s. D e a lg u n o s de los h u ev o s n a c ie ro n cara c o le s alb in o s. C u a n d o se c ru z a ro n d o s c a ra ­ c o les alb in o s, to d a la g e n e ra c ió n fu e p ig m e n ta d a . A l e n tre c ru ­ z a r a e sta p ro g e n ie , la g e n e ra c ió n c o n sistió en d e c a ra c o ­

les p ig m e n ta d o s y d e eai'acoles a lb in o s. ¿ C ó m o se o b tu v o es­ ta p ro p o rc ió n 9 :7 ? L a p ro p o rc ió n 9:1 o b se rv a d a en la g e n e ra c ió n de c araco les p u e d e v e rs e c o m o u n a m o d ific a c ió n d e la p ro p o rció n 9 :3 :3:1 ob­ ten id a al c ru z a r 2 in d iv id u o s h e te ro c ig ó tie o s p ara d o s lo c i. La p ro p o rc ió n 9 :7 se o b tie n e c u a n d o los a le lo s d o m in an tes d e anibos lo ci (A_B_) p ro d u c e n c a ra c o le s p ig m e n ta d o s; todo otro g en o tip o p ro d u c e c a ra c o le s a lb in o s;

aaBB

A A bb

alb in o

a lb in o

A a Bb P ig m en tad o E n tre c ru z a m ie n to F,_

p ig m e n ta d o

aa B _

albino

^!,,A__bb

albino

Vjg aa bb

alb in o J

a ltin o

E s p ro b a b le q u e la p ro p o rc ió n 9:7 en e sto s c araco les s e a re s u l­ tado de u n a v ía d e d o s p a so s e n la p ro d u c c ió n d e p ig m e n to (fig. 5-10). E l p ig m e n to (c o m p u e sto C) se p ro d u c e solo d e s p u é s de q u e el c o m p u e s to A es c o n v e rtid o en el c o m p u e s to B p o r la e n z i­ m a 1 y d e q u e e l c o m p u e s to B es co n v e rtid o e n el c o m p u e s to C p o r la e n z im a II, S e re q u ie re al m en o s u n ale lo A d o m in a n te e n el p rim e r lo c u s p a ra p ro d u c ir la e n zim a I; d e m a n e ra sim ila r s e re ­ q u iere al m e n o s u n a le lo B d o m in a n te e n el segu n d o lo c u s p a ra p ro d u c ir la e n z im a II. S e p ro d u c e a lb in ism o c u an d o no h a y p ro ­ d u c c ió n d e c o m p u e s to C , lo q u e p u e d e o c u rrir de tres m a n e ra s. P rim ero , d o s a le lo s re c e siv o s e n el p rim e r lo c u s (g enotipo a a B_) p u e d e n p re v e n ir la p ro d u c c ió n d e la e n z im a I, p o r lo q u e n u n c a se sin te tiz a el c o m p u e s to B . O tra p o sib ilid a d e s q u e dos a le lo s r e ­ cesivos e n el se g u n d o lo c u s (g en o tip o A Jb b ) p rev en g an l a p ro ­ d u c c ió n d e la e n z im a II, c o n lo q u e el c o m p u e s to B n u n ca s e c o n ­ v ierte e n e l c o m p u e s to C . P o r ú ltim o , la p re s e n c ia de d o s a le lo s recesiv o s e n a m b o s lo ci (g e n o tip o aa bb) c o n d u c e en o c a s io n e s a la a u se n c ia d e la s e n z im a s I y II. E n este e je m p lo de in te ra c c ió n

Extensiones y modificaciones de Los principios básicos 11;

i Se requiere un alelo dominante en el locus | A para pro ' ' ’ izima I, que convierte | el compuesto A en el compuesto B, |

Q S e requiere un alelo dominante en el locus B para i producir ¡a enzima II, que convierte el compuesto B en el compuesto C (pigmento).

Caracoles A

Los caracoles pigmentados deben i producir las enzimas I y II, lo que requiere el genotipo A_B_.

Com puesto A — — Enzim a 1--- -► C om puesto B -----Enzim a II-----► C om puesto C ;

I

Caracoles

Caracoles aa H El albinismo es producido por la ausencia I de la enzima I (aa S J , por lo que nunca I se produce el compuesto B...

Q

bb

...o por la ausencia de la enzima II {A__bb), \ por lo que nunca se produce el compuesto C, o por la ausencia de ambas enzimas (aa bb).

génica, a es e p istá tic o a B y b qs e p istá tic o a A; am bos son alelo s ep istático s recesiv o s d a d o q u e se re q u ie re la p re s e n c ia de dos c o ­ p ias de a o do s co p ia s d e b p a ra su p rim ir la p ro d u c c ió n de p ig ­ m ento. E ste eje m p lo d ifie re d e la su p re sió n d el c o lo r d e p e la je en el p erro lab rad o r, y a q u e la p re s e n c ia d e alelo s re c esiv o s en c u a l­ q u iera de am b o s lo c i es c a p a z de su p rim ir la p ro d u c c ió n d e p ig ­ m en to en lo s c a raco le s, m ie n tra s q u e en el caso d e lo s p e rro s la ex p resió n d el p ig m e n to es su p rim id a p o r la p re s e n c ia de alelo s recesiv o s en u n ú n ic o lo cu s.

CONCEPTOS CLAVE La epistasis es el enm ascaram iento de la expresión de un gen por otro gen en un locus diferente. El gen epistático produce el enm ascaram iento y el gen hipostático es el enmascarado. Los genes epistáticos pueden ser dom inan­ te s o recesivos.

vos, y a q u e e n to d a s lo s c ru z am ie n to s se g re g a ro n p a re s d e alelos de d o s lo ci con d istrib u c ió n in d e p e n d ie n te . L a p ro b a b ilid a d de h e re d a r u n o d e los d o s alelo s de u n lo c u s es V2 . D ado q u e hay dos loci, c a d a u n o c o n d o s alelo s, la p ro b a b ilid a d de h e r e d a r una c o m b in a c ió n p a rtic u la r d e g en es es d e Q l^ f - '/,g. E n e l caso de los c ru z a m ie n to s trih íb rid o s las p ro p o rc io n e s en la p ro g e rjie de­ ben e x p re s a rse en se s e n ta ic u a tro a v o s, y a q u e = Vg^. E n ge­ n e ra l la s p ro p o rc io n e s d e la p ro g e n ie d e b e n ser fra c c io n e s de (V 2 )^", d o n d e n es el n ú m e ro de lo ci c o n d o s alelos q u e segregan en el c ru z a m ie n to . L o s c ru z a m ie n to s p o c a s veces p ro d u c e n p ro g en ies d e exacta­ m e n te 16 in d iv id u o s, p o r lo q u e no sie m p re son o b v ia s la s m odi­ fic a c io n es e n la p ro p o rc ió n d ih íb rid a. L a s p ro p o rc io n e s dihíbridas m o d ific a d a s se o b se rv a n co n m a y o r fa c ilid a d si el n ú m e ro de in d iv id u o s c o n c a d a fe n o tip o se e x p re s a e n d ie c ise isa v o s: X 16

INTEGRACIÓN DE CONCEPTOS Interpretación de las proporciones producidas por la interacción génica E n el cuadro 5-2 se m u estran varias p ro p o rcio n es m odificadas que son resu ltad o de la interacció n génica. C ad a u n o d e estos e je m ­ plos rep resen ta un a m o d ificació n de la p ro p o rció n d ih íb rid a b ásica 9:3:3:1. A l in teip retar las bases g enéticas d e las p ro p o rcio n es m o d i­ ficadas debem os ten e r en cu en ta varios p u ntos. P rim ero , la heren cia d e los genes que pro d u cen estas características n o difiere de la h e ­ ren cia d e g enes que codifican p ara caracteres g en ético s sim ples. L os principios de M en d e l de segregración y distrib u ció n in d ep en ­ diente siguen siendo aplicables; cad a ind iv id u o p o se e dos alelos en cada locus, q u e se separan en la m eiosis y genes en distintos loci que se distribuyen d e m an era in dependiente. L a ú n ic a d iferen cia es la form a e n q ue interactú an los producios d e los g en o tip o s p a ra p ro ­ ducir el fenotipo. P o r tanto, no se p u ed e co n sid erar sep arad am en te la ex presión de los genes de cad a locus, sino que se d eb e ten er en cu en ta có m o interactú an los genes de distin to s loci. O tro p u n to es qu e, e n lo s eje m p lo s q u e h e m o s c o n sid e ra d o , las p ro p o rc io n e s fe n o típ ic a s sie m p re e stá n e x p re sa d a s e n d ie c ise isa ­

Fig. 5-1 0. El pigmento de los caracoles es producido en una vía sintética de dos pasos.

n ú m e ro d e in d iv id u o s de la p ro g e n ie con un fe n o tip o dado n ú m e ro to ta l d e in d iv id u o s e n la p ro g en ie

donde es la p ro p o rc ió n de p ro g e n ie c o n u n fe n o tip o particu­ lar. S i d e sp e ja m o s x (la p ro p o rc ió n d el fe n o tip o en d ieciseisav o s), ten em o s: n ú m e ro d e in d iv id u o s d e la p ro g e n ie c o n el fe n o tip o x 16 X = --------------------------------------------------------------------------------------n ú m e ro to ta l d e in d iv id u o s e n la p ro g en ie S u p o n g a m o s, p o r e je m p lo , que se c ru z a n dos in d iv id u o s homocig ó tic o s, se e n tre c ru z a la p ro g en ie F j y se o b tien e u n a genera­ ción F 2 c o n 63 ro jo s, 21 m a rro n e s y 28 b la n c o s. S e g ú n la fórm u­ la a n te rio r la p ro p o rc ió n fe n o típ ic a en la g e n e ració n F j es: rojo = (63 X 1 6 )/1 12 = 9; m a rro n e s = (21 x 1 6 )/1 12 = 3; b la n c o s = (28 X 1 6 )/1 12 = 4. L a p ro p o rc ió n fe n o típ ic a es 9:3:4. U n ú ltim o p u n to p a ra c o n sid e ra r es c ó m o asignar lo s genotipos a lo s fe n o tip o s en la s p ro p o rc io n e s m o d ific a d a s que r e s u lta n de la in te ra c c ió n g én ica . N o tra te de m e m o riza r los g e n o tip o s asocia­ dos c o n to d a s las p ro p o rc io n e s m o d ific a d a s com o se m u e s tra en el c u a d ro 5 -2. E n c a m b io , in ten te re la c io n a r las p ro p o rc io n e s m o­ d ifica d a s c o n las p ro p o rc io n e s c o n o c id a s, co m o la p ro p o rc ió n di­ h íb rid a 9 :3 :3 :1 . S u p o n g a q u e en el c ru z a m ie n to e n tre d o s plantas o b tie n e u n a p ro g e n ie c o n in d iv id u o s v erd es y V^g blancos. Si c o m p a ra m o s e sta p ro p o rc ió n 15:1 c o n la p ro p o rció n d ih íb rid a es-

112 Capítulo 5

í ’uadro

!j'- 2

Proporciones fenotípicas dihíbridas modificadas por interacción génica G e n o tip o

P ro p o rc ió n

T ip o d e in te ra c c ió n

E je m p lo

9:3:3;1

N inguna

Forma de las semillas y color del endosperma en los guisantes

9 :3 :4

Epistasis recesiva

Color del pelaje en los perros labradores

Epistasis dom inante

Color del zapallo

9:7

Epistasis recesiva doble

Albinismo en los cara^ coles

9:6:1

Interacción duplicada

I 5:1

Epistasis dominante doble

12:3:1

13:3

A ^bb

aaB _

aabb

12

Espistasis dominante y recesiva

13

*Cada proporción es producida por un cruzam iento dihítarido (Acj m ism o fenotipo.

Bbx Aa Bb).

tá n d a r 9 :3 :3 :1 , v em o s q u e ®/jg + es ig u a l a T odos lo s g en o tip o s a so ciad o s co n esta s p ro p o rc io n e s en el c ru z a m ie n ­ to d ih íb rid o (A_B_, A _bb y aa B_) d eb en d a r el m ism o fen o tip o , u n a p ro g e n ie v erde. E l g e n o tip o aa bb re p re se n ta Vjg de la p ro ­ g e n ie en u n cru z a m ie n to d iliíb rid o , la p ro g e n ie b la n c a en este cru zam ien to , A I a sig n a r g en o tip o s a lo s fen o tip o s en la s p ro p o rc io n e s m o d i­ fic a d a s io s estu d ia n te s se c o n fu n d e n en o c a sio n e s re s p e c to d e q u é le tra a sig n a r a q u é fen o tip o . S u p o n g a q u e o b tie n e la s sig u ien tes p ro p o rc io n e s fen o típ ic a s; n egros:^/jg m arrones:'*/jg b lan co s. ¿Q u é g en o tip o a sig n am o s a la p ro g e n ie m a rró n , A _bb o aa B_1 C u a lq u ie r re s p u e sta es c o rre c ta p o rq u e las le tra s so n so lo sím b o ­ lo s a rb itra rio s p a ra la in fo rm a c ió n g e n é tic a . L o im p o rta n te p a ra d a rs e c u e n ta d e e sta p ro p o rc ió n es q u e el fe n o tip o m a rró n surge cu a n d o e x isten dos ale lo s re ce siv o s en un m ism o locus.

CONCEPTOS CLAVE La interacción génica produce a menudo proporciones fe­ notípicas modificadas. Estas proporciones pueden com ­ prenderse si se las relaciona con otras proporciones co­ nocidas.

Las barras soníibreadas representan com binaciones de genotipos que dan el

o b te n e r ra s g o s p a rtic u la re s y p ro d u jero n lo s diversos tip o s que vem o s hoy. C a d a c ru z a m ie n to en tre p e rro s a p o rta u na s e le c c ió n d e genes d e u n c o n ju n to d e g en es a n c e stra le s; estos g e n e s d efi­ n e n las c a ra c te rístic a s d e u n a ra z a p articu lar. U n a d e la s d ife re n c ia s m á s obvias e n tre lo s p erros es e l co lo r del p ela je . L a g e n é tic a d e l c o lo r del p e la je es b astan te c o m p le ja ; p a rtic ip a n m u c h o s g e n e s y se p ro d u c e n n u m e ro sa s in te ra c c io n e s en tre g en e s d e d istin to s lo c i. C o n sid e ra re m o s siete loci (e n la hsta q u e sig u e ) cjue son im p o rta n te s p a ra p ro d u c ir m u ch as d e las n o ta b le s d ife re n c ia s d e c o lo r y dib u jo e n tre la s razas. A l in te rp re ­ tar la b a se g e n é tic a d e la s d iferen cias d e c o lo r del p e la je d e los p erro s c o n s id e re c ó m o se m o d ific a la e x p re s ió n 'd e un g e n p a rti­ c u la r p o r lo s e fec to s de lo s o tro s genes. T e n g a e n cu en ta q u e otros lo ci no lista d o s a q u í p u e d e n m o d ific a r lo s c o lo re s p ro d u c id o s por estos siete lo c i y q u e n o to d o s los g e n e tista s están de a c u e rd o ac e rc a d e la g e n é tic a d e la v a riac ió n d el c o lo r en algunas ra z a s . .

1 ■ L o c u s Agouti (A): e ste lo c u s tie n e c in c o alelo s c o m u n e s que d e te rm in a n la p ro fu n d id a d y d istrib u ció n d el color en e l p e la ­ je d e u n p erro :

a*

La genética compleja del color del pelaje de los perros L a g e n é tic a d el co lo r del p e la je en los p e rro s es u n e je m p lo e x ­ c e le n te d e c ó m o p u e d e n in te rv e n ir in te ra c c io n e s c o m p le ja s e n tre g en es en la d e te rm in a c ió n d e l fe n o tip o . L o s p e rro s d o m é stic o s e x h ib e n u n a c a n tid a d so rp re n d e n te d e fo rm as, ta m a ñ o s y colo res. D u ra n te m iles d e añ o s los seres h u m a n o s c ru z a ro n p e rro s p a ra

a^

P ig m e n to n e g ro h o m o g é n eo A g o u ti o g ris d e tip o lobo. L os p e lo s co d ificad o s p o r e ste ale lo tie n e n a sp e c to d e “sal y p im ie n ta ”, p r o d u c i­ d o p o r u n a b a n d a d e p ig m en to a m a rillo sobre u n p e lo n eg ro . A m a rillo . E l p ig m e n to negro e stá su sta n c ia lm e n te re d u c id o ; p o r lo q u e to d o el p e lo e s am arillo. M a rc a s en silla d e m o n ta r (co lo r o sc u ro en el lo m o , c o n m a rc a s to s ta d a s e x ten sas so b re la cabeza y la s p a ta s). B ic o lo r (co lo r o sc u ro sob re la m a y o r p arte del c u e rp o , c o n m a rc a s to s ta d a s so b re las p a ta s y las cejas).

Extensiones y modificaciones de Los principios básicos 11 Si bien'A® y su e le n se r d o m in a n te s so b re lo s o tro s alelos, las re la c io n e s d e d o m in a n c ia so n c o m p le ja s y n o e stá n d ilu c id a ­ das p o r co m p leto .

L a s re la c io n e s d e d o m in a n c ia e n tre e sto s alelos s o n p o c o co­ n o c id a s.

6 . L o c u s de manchado (S ): los ale lo s d e e ste lo cu s d eterm in an 2 . L o c u s negro (B): e ste lo cu s d e te rm in a si p u e d e fo rm a rse el p ig m e n to n eg ro . E l co lo r fin al d el p e la je d e ü n p e rro d e p e n d e de lo s e fecto s de g e n es e n o tro s lo c i (c o m o lo s lo c i A , C, D y E ). S on co m u n e s d o s alelo s:

B

P e rm ite q u e se p ro d u z c a el p ig m e n to n e g ro ; el p erro será n eg ro si ta m b ié n p o se e c ie rto s alelo s e n lo s lo c i A , C, D y E. b N o p u e d e p ro d u c irse el p ig m e n to n eg ro ; lo s p erro s p ig m e n ta d o s p u e d e n ser d e c o lo r ciio c o la te , h íg ad o , to s ta d o o ro jo . B es d o m in a n te so b re b.

3 . Locus albino (C): e ste lo cu s d e te rm in a si se e x p re s a rá to d o el color. H a y cin co ale lo s en e ste locus:

C c‘^*’

c’’ c

C o lo r to ta lm e n te e x p resad o . C h in ch illa. S e e x p re sa m en o s co lo r; el p ig m e n to está c o m p le ta m e n te a u se n te en la b a s e d e lo s p e lo s larg o s y p ro d u c e u n p e la je p álid o . P e la je to ta lm e n te b la n c o c o n h o c ic o y o jo s o scu ro s, P e la je to ta lm e n te b la n c o c o n o jo s azules, T o ta lm e n te a lb in o . L o s p e rr o s tie n e n u n p e la je to ta lm e n te b la n c o c o n o jo s y h o c ic o ro sa d o s.

S e p re s u m e q u e las re la c io n e s d e d o m in a n c ia e n tre esto s a le ­ los es C > > c'^ > > c, n o o b sta n te los ale lo s y c son raro s y n o se h an c o m p le ta d o c ru z a m ie n to s q u e in c lu y a n to d o s los g en o tip o s p o sib le s.

4 . Locus d e dilución (D): este lo c u s, c o n dos a le lo s, d e te rm in a si el c o lo r será d ilu id o . P o r e je m p lo , e l p ig m e n to n eg ro d ilu i­ do a p a re c e az u la d o y el am a rillo d ilu id o a p a re c e c o lo r crem a. E l e fe c to de d ilu c ió n se p ro d u c e p o r u n a d istrib u c ió n irre g u la r del p ig m e n to en la v a in a d e l pelo:

D P ig m e n ta c ió n in ten sa, d D ilu c ió n del p ig m e n to . D es d o m in a n te so b re d.

5 . Locus de e x te n s ió n (E): c u a tro ale lo s ,de este lo c u s d e te rm i­ n an d ó n d e se ex p re sa el g e n o tip o d el lo c u s A . P o r eje m p lo , si u n p e rro tie n e el ale lo A® (n egro h o m o g é n e o ) en el lo cu s A , el p ig m e n to n eg ro se e x tien d e p o r to d o el p e la je o se ve re s trin ­ g id o a a lg u n as áreas seg ú n lo s alelo s p re se n te s en el lo cu s E. L as á reas d o n d e n o se e x p re sa el lo c u s A p u e d e n ap a re c e r de co lo r am arillo , ro jo o to sta d o segiín la p re s e n c ia d e g en es p a r­ tic u la re s en otros lo ci. C u an d o e stá p re se n te e l ale lo A® e n el lo cu s A , lo s c u a tro ale lo s d el lo cu s E tie n e n lo s sig u ien tes efectos:

E e’”' e

M á s c a ra n e g ra c o n p e la je to sta d o . Se expresa el locus A en todo el p elaje (negro hom ogéneo), M o te a d o , e n el q u e lo s c o lo res n e g ro y a m a rillo a p a re c en en c a p as p a ra d a r u n asp e cto a tig rad o , A u se n c ia d e n e g ro en el p ela je , n o o b sta n te el h o c ic o y lo s ojo s p u e d e n se r n egros.

si a p a re c e rá n m a n c h a s b lan ca s. E x iste n cu atro a le lo s com u­ nes: S S in m a n c h a s. M a n c h a d o irla n d é s; n u m e ro sa s m a n c h a s b la n c a s . sP M a n c h a d o p ie b a ld o ; d iv ersas c a n tid a d e s de b la n c o , í* M a n c h a d o p ie b a ld o ex trem o ; c a s i to d o b la n c o .

S es c o m p le ta m e n te d o m in a n te so b re í*, y i* ; í ' y sP son do­ m in a n te s so b re s'*' {S > íP > í* ) . L a relación* e n tre 5 ' y íP es­ tá p o c o d e fin id a e in c lu so p u ed e n o tra ta rse de a le lo s separa­ dos. L o s g e n e s d e o tro s lo ci p o c o co n o c id o s ta m b ié n pueden m o d ific a r el p a tró n d e m an ch a d o .

7. Locus de moteado (T): este lo c u s d e te rm in a la p re s e n c ia de p e q u e ñ a s m a n c h a s c o lo rea d as en la s á re a s b la n c a s, lo que se d e n o m in a m o te ad o :

T t

M o te a d o ; p e q u e ñ a s m a n c h a s c o lo re a d a s en la s áreas b la n ca s. S in m o te a d o .

T es d o m in a n te so b re í. E l m o te a d o n o p u e d e e x p re s a rs e si un p e rro tie n e p e la je h o m o g é n e o (S_). P a ra ilu stra r c ó m o in te ra c tú a n los g e n e s d e estos lo c i p a ra de­ te rm in a r el c o lo r d el p e la je en los p e rro s c o n sid e re m o s algunos e je m p lo s:

Labrador. L o s la b ra d o re s p erd ig u e ro s (fig. 5 - l l a ) p u e d e n ser n eg ro s, m a rro n e s o a m a rillo s. L a m a y o ría so n h o m o c ig o to s ASAS CC D D S S tt; p o r ta n to , v arían solo en lo s lo ci B y E. L o s alelos AS, C y D p e rm ite n q u e se ex p rese el p ig m e n to oscuro; q u e un pe­ rro se a n e g ro d e p e n d e d e q u é genes se e x p re san en lo s lo c i B y E. C o m o y a se dijo a n tes en e ste capítulo, to d o s los la b ra d o re s negros d eb en p o rta r al m en o s u n alelo B y u n a le lo E {B_E_). L o s perros m a rro n e s son bb h o m o c ig ó tic o s y tie n e n al m enos u n a le lo E {bb E_). L o s p e rro s a m a rillo s son re su lta d o de’ la p re s e n c ia de ee (B_ee o bb ee). L o s la b ra d o re s son h o m o cig ó tico s p a ra e l alelo S, q u e p ro d u c e u n co lo r h o m o g én eo ; las p o c a s m anchas b la n c a s que a p a re c e n en a lg u n o s peiTos d e e sta ra z a se deben a o tr o s genes m o d ific a d o re s. Se p re s u m e q u e el ale lo p a ra las m o tas (ticking o 7) n o e x is te en lo s la b ra d o re s; sin em b arg o , estos p e rro s tie n e n pe­ lajes h o m o g é n e o s y las m o tas se e x p re sa n so lo en los p e rro s m an­ ch ad o s; p o r ende, la a u se n c ia del alelo T es incierta. Beagle. C a si to d o s lo s b ea g le s (fig. 5-1 Ib ) son h o m o c ig ó tic o s a^as B B C C D D

tt, a u n q u e en o c a sio n e s se p re s e n ta n otros a lelo s en esto s loci. E l ale lo a* p ro d u c e el dib u jo en fo r m a de si- ■ lia d e m o n ta r - lo m o y flan c o s o scu ro s, c o n c ab eza y p a ta s testad a s - c a ra c te rístic o d e e sta raza. L o s a le lo s B , C y D p e rm ite n que se p ro d u z c a el c o lo r n e g ro , si b ien su d istrib u c ió n se v e lim itada p o r el a le lo a^. E l g e n o tip o ee se p ro d u c e a veces y g e n e ra unos p o co s b e a g le s to ta lm e n te to stad o s. L a ap arición d e m anchas b la n c a s en lo s b e a g le s se d e b e al ale lo s^. A u n q u e a v e c e s apare­ ce m o te a d o , la m a y o ría d e los b e ag le s so n tt.

Dálmata. L o s d á lm a ta s (fig. 5 -llc ) tie n e n una c o m p o sició n g e n é tic a in te re sa n te . C a si to d o s son h o m o c ig ó tic o s A'^A^ CC DD

114 Capítulo 5

(c ) # - '. 5

% i' 6

I Fig. 5-1 1. El color del pelaje de los perros es determ i­ nado por interacciones entre genes de varios ioci. (a) La mayor parte de los labradores tienen genotipo CC DD SS tt que varía solo en los Ioci B y E. (b) La mayor parte de los beagle

E E s'^s'^ TT, p o r lo q u e so lo v a ría n en e l lo c u s B . N ó te se q u e e s ­ to s p e rro s p o se e n un g e n o tip o AM® C C D D EE, lo q u e p e rm ite la fo rm a c ió n d e u n p e la je h o m o g é n e o , q u e será n eg ro si e stá p re s e n ­ te el g e n o tip o B _ o m arró n (lla m a d o h íg ad o ) si e stá p re se n te el g e n o tip o bb. S in em b a rg o , la p re s e n c ia d el ale lo í * p ro d u c e p e la ­ j e b la n c o y e n m a sc a ra la e x p re sió n del c o lo r h o m o g é n e o . E l c o ­ lo r del p e rro solo a p a re c e en las m a n c h a s p ig m e n ta d a s, q u e se d e ­ ben a la p re s e n c ia del ale lo T de m o tea d o . E n el cu a d ro 5-3 se m u e stra n lo s g en o tip o s c o m u n e s d e o tra s ra z a s de p erro s.

¡C u a d ro 5 - 3 1

tienen genotipo b b cc d d s p ¡p tt^ (j-) l q j dálmatas tienen ge­ notipo 4M ,s CC DD EE S V íIM" T T c o n v a r i a c i o n e s e n el’ lo c u s 6 de m a n e r a q u e lo s p e r r o s s o n n e g ro s ( B J o m a r r o n e s

(bb).

(Parte

a: Kent y D onna D annen. Parte b: Tara Darling. Parte C: Ph o to D isc).

Complementación: determinar si las mutaciones están en los mismos Ioci o en Ioci diferentes ¿ C ó m o sa b e m o s si la s d istin ta s m u ta c io n e s q ue a fe c ta n u n a ca­ ra c te rístic a o c u rre n en el m ism o lo cu s (so n alélicas) o e n Ioci di­ fe re n te s? E n la m o sc a d e la fru ta, p o r e je m p lo , blanco e s u n a m u­ tació n lig a d a al X cjue p ro d u c e o jos b la n c o s e n lu g ar d e lo s ojos ro jo s h a lla d o s en las m o s c a s silvestres. A lbaricoque es u n a m uta­ ció n re c e s iv a lig a d a al X q u e p ro d u c e o jo s d e color n a ra n ja cla­

Genotipos frecuentes en distintas razas de perros

R aza

C e n e s h o m o c ig ó t ic o s u s u a l e s -

O tro s g e n e s p re se n te s en e s t a s ra za s

Basset hound

BB CC DD EE tt

flV,

Beagle

BB CC DD sPsP tt

S, sP, s'

E, e

Bulldog inglés

BB CC DD tt

Chihuahua

tt

A^ ay, a ^ é B, b C,

a

b

P

b

10

10

p b

s

P r o g e n ie no

Progenie

r e c o m b in a n t e

r e c o m b in a n t e

N ú m e ro de p r o g e n ie

> s

a ■

■

p

b

p

-«•

ms

s

■

t -i

s ■ m »

b

p

b

P

40

40

10

b 10

P r o g e n ie no

P r o g e n ie

recom binante

r e c o m b in a n t e

_ C o n c lu s ió n : los fe n o t ip o s d e la d e s c e n d e n c ia so n los m ism o s, p e r o los n ú m e ro s d ifie r e n s o b re la b a se d e la configuración d e los alelos; d e a c o p la m ie n t o o d e re p u ls ió n .

Fig. 7-8. La c o n fig u ra ció n d e lo s g e n e s lig a d o s d en tro d el c ro m o so m a (d e a co p la ­ m ien to o re p u lsió n ) a fecta lo s r e s u lt a d o s de lo s c ru z a m ie n to s de p ru e b a. L o s lo c i lig a ­ d o s d e la m o s c a a z u l a u s t r a lia n a

Lucilia cuprina

d e t e r m in a n el c o lo r d e l t ó r a x y d e l p u p a r io .

Esta configuración, en la que cada cromosoma contiene un ale­ lo silvestre y un alelo mulante, se denomina repulsión o configu­ ración trans. La configuración de los alelos del progenitor heterocigótico, sea una configuración de acoplamiento o una de re­ pulsión, determina cuáles serán los fenotipos c|ue se expresarán con mayor frecuencia entre la progenie de un cruzamiento de prueba. Cuando la configuración de los alelos es la de acoplainiento, los tipos de progenie que resultarán serán en su mayoría aquellos con tórax verde y pupario pardo y aquellos con tórax púrpura y pupario negro (fig. 7-8a); pero si los alelos del progenitor heteroeigótico tienen una configuración de repulsión, los tipos de pro­ genie que resultarán serán en su mayoría aquellos con tórax ver­ de y pupario negro y aquellos con tórax púrpura y pupario pardo ( f i g . 7-8b). Nótese que los genotipos de los progenitores que se muestran en la figura 7-8a y b son los mismos (p*p b^b x p p bb) y que la gran diferencia entre las proporciones de los fenotipos de la progenie de los dos cruzamientos se debe por completo a la

configuración de los cromosomas ya de acoplamiento, ya de re­ pulsión. Es esencial conocer la configuración de los alelos dentro de los cromosomas a fin de predecir de manera correcta el resul­ tado de cruzamientos en los cuales los genes están ligados,

CONCEPTOS CLAVE En un cruzam iento la configuración de los alelos ligados dentro de los cromosom as es clave para determ inar su resultado. Cuando dos alelos silvestres se encuentran dentro de un crom osom a homólogo y dos alelos mutantes dentro del otro, la configuración de los alelos es la de acoplam iento; en cambio, cuando cada crom osom a contiene un alelo silvestre y un alelo mutante, la configu­ ración es la de repulsión.

Ligamiento, recombinación y mapeo de genes eucariontes 16

INTEGRACIÓN DE CONCEPTOS

ü l

Relación entre distribución independiente, ligamiento y entrecruzamiento Hemos analizado tres situaciones que se refieren a los genes en diferentes loci. Primero, los genes pueden ubicarse dentro de cro­ mosomas distintos; en ese caso se distribuyen de manera inde­ pendiente y se combinan al azar cuando se forman los gametos. Un individuo heterocigótico en dos loci (Aa Bb) produce cuatro tipos de gametos {AB, ab, Ab y aB) en proporciones iguales: dos tipos de gametos no recombinantes y dos tipos de gametos recombinantes. En segundo lugar, los genes pueden estar completamente liga­ dos, lo que significa que se encuentran dentro del mismo cromo­ soma y que están tan cerca los unos de los otros que es muy po­ co probable que se produzca un entrecruzamiento entre ellos. En este caso los genes no se recombinan. Un individuo heterocigóti­ co para dos genes estrechamente ligados con configuración de acoplamiento: A B

produce tan solo gametos no recombinantes que contienen alelos AB o ab. Los alelos no se separan para formar nuevas combina­ ciones, como Ab o aB. La tercera situación, el ligamiento incompleto, es intermedia entre los dos extremos que constituyen la distribución indepen­ diente y el hgamiento completo. En este caso los genes están li­ gados físicamente dentro del mismo cromosoma, lo que evita que se produzca la distribución independiente. Sin embargo, entrecruzamientos ocasionales provocan c^ue se rompa el ligamiento y permiten que los genes se recombinen. Un individuo heterocigó­ tico en dos loci con ligamiento incompleto produce cuatro tipos de gametos -dos tipos recombinantes y dos tipos de gametos no recombinantes- pero los gametos no recombinantes se producen con mayor frecuencia que los recombinantes puesto que el entrecruzamiento no ocurre en todos los procesos de meiosis. El liga­ miento y el entrecruzamiento son dos fuerzas que se oponen: me­ diante el ligamiento los alelos que están en diferentes loci se jun­ tan, se restringe su capacidad para asociarse libremente, mientras que el entrecruzamiento rompe el ligamiento y permite que los alelos se separen y formen nuevas combinaciones. En este capítulo ya hemos definido el término recombinación como la redistribución de los alelos en nuevas combinaciones. En este momento podemos distinguir entre dos tipos de recombina­ ción que difieren respecto del mecanismo que da origen a estas nuevas combinaciones de alelos. La recombinación intercromosómica es la que ocurre entre genes que se encuentran en cromosomas diferentes. Se origina a partir de la distribución independiente: la segregación al azar de los cromosomas durante la anafase I de la meiosis. La recombi­ nación intracromosómica es la que ocurre entre genes que se encuentran dentro del mismo cromosoma. Se origina a partir del entrecruzamiento: el intercambio de material genético durante la profase I de la meiosis. Los dos tipos de recombinación producen nuevas combinaciones de alelos en los gametos; por tanto no se puede diferenciar la una de la otra examinando los tipos de game­ tos producidos. No obstante, a menudo es posible identificar el ti­ po de recombinación al considerar l&s frecuencias de los tipos de gametos: la recombinación intercromosómica produce un 50% de

gametos no recombinantes y un 50% de gametos recombinantes, mientras que la recombinación intracromosómica por lo general produce menos de un 50% de gametos recombinantes. Sin em­ bargo, cuando los genes se encuentran muy alejados los unos de los otros dentro del mismo cromosoma, la recombinación intra­ cromosómica también produce un 50% de gametos recombinan­ tes. Por ende, los dos mecanismos son indistinguibles desde el punto de vista genético.

Evidencia de las bases físicas de la recombinadón La teoría de la herencia cromosómica de William Suttón, que establecía que los genes se ubican físicamente dentro de los cro­ mosomas, fue sustentada por el descubrimiento de Nettie Stevens y Edmund Wiison respecto de que el sexo en los insectos se aso­ ciaba con un determinado cromosoma (pp. 77-78 del cap. 4) y por la demostración de Calvin Bridges de que la no disyunción de los cromosomas X se relacionaba con la herencia del color de los ojos en Drosophila (pp. 84-85 del cap. 4). En 1931 aparecie­ ron más evidencias en aval de la teoría de la herencia cromosó­ mica cuando Harriet Creighton y Barbara McClintock (fig. 7-9) obtuvieron pruebas que demostraban que la recombinación, intra­ cromosómica era resultado del intercambio físico entre cromoso­ mas. Creighton y McClintock descubrieron un tipo de maíz que tenía un cromosoma 9 anormal, que contenía un botón que se te­ ñía densamente con el colorante en uno de los extremos y una pe­ queña porción de otro cromosoma unida al otro extremo. Este cromosoma aberrante les permitió distinguir visualmente las dos unidades que conformaban el par homólogo. Ambas investigadoras se dedicaron a estudiar la herencia de dos características del maíz determinadas por genes del cromoso­ ma 9: en un locus, un alelo dominante (C) producía granos con

Fig.

7 - 9 . B a rb a ra M cC lin to ck (iz q u ie r d a ) y H a rr ie t

C r e i g h t o n (d e re ch a ) a p o rta ro n e v id e n c ia s re sp e c to d e que

lo s g e n e s s e u b ica n d e n tro de lo s cro m o so m a s.

(K a ri iMara-

m oro sch /C ortesía de Coid Spring Hartaor L aboratory A rchives.)

170 Capítulo 7 color, mientras que un alelo recesivo (c) producía granos sin co­ lor; en otro locus ligado un alelo dominante (Wx) producía gra­ nos amiláceos, mientras que un alelo recesivo (wx) producía gra­ nos cerosos. Creighton y McClintock obtuvieron una planta que era heterocigótica en ambos loci con configuración de repulsión, con los alelos para granos con color y cerosos en el cromosoma aberrante y los alelos para granos sin color y amiláceos en el cro­ mosoma normal: B o tó n

P o r c ió n a d ic io n a l

\ I

wx

m Cruzaron esta planta heterocigótica con una planta homocigótica para granos sin color y heterocigótica para granos cerosos: C

wx c —— X — Wx c

Wx wx

Este cruzamiento produciría diferentes combinaciones de ca­ racterísticas en la progenie, pero la única manera para que resul­ te una progenie con granos cerosos y sin color es a través de un entrecruzamiento en el progenitor doblemente heterocigótico:

mosoma. Este resultado es precisamente lo que observaron Creighton y McClintock, que confirmaron de esta manera la teo­ ría de la herencia cromosómica. Curt Stern contribuyó con una demostración similar utilizando marcadores cromosómicos en Drosophila casi al mismo tiempo. Analizaremos las bases mole­ culares de la recombinación con mayor detalle en el capítulo 12.

Predicción del, resultado de criizanilentos con genes ligados Conocer la configuración de los alelos dentro del cromosoma permite predecir los tipos de progenie que resultarán a partir de un cruzamiento con genes ligados y determinar cuáles de estos ti­ pos serán los que se produzcan con mayor frecuencia. Para deter­ minar las proporciones de los tipos de la descendencia requiere un dato adicional: la frecuencia de recombinación. Ésta brinda información respecto de cuán a menudo aparecen nuevas combi­ naciones de alelos en los gametos y permite predecir las propor­ ciones de los fenotipos de la descendencia que resultarán a partir de un cruzamiento determinado con genes ligados. En cuanto a los pepinos, el alelo que corresponde a la caracterís­ tica de fruta lisa (t) es recesivo respecto del de ñuta rugosa (I), y el alelo que corresponde a la característica de fruta brillante {d) es recesivo respecto del de fruta opaca (D). Los genetistas determina­ ron que esos dos genes tienen una frecuencia de recombinación de 16%. Si por ejemplo, se cruza una planta homocigótica para las ca­ racterísticas de fruta rugosa y opaca con una planta homocigótica para las características de fruta lisa y brillante, y luego se realiza un cruzamiento de prueba utilizando la generación Fj : T

Er.fecruzam iento

wx®

P r o g e n ie c o n g r a n o s a m ilá c e o s c o n c o lo r

P r o g e n ie

co n

g ra n o s

iv.v

c e r o s o s sin c o lo r

N o t a : n o se m u e s t r a n t o d o s lo s g e n o t ip o s d e la p r o g e n ie .

Debe tenerse en cuenta que si el* entrecruzamiento supone un intercambio físico entre los cromosomas, la progenie con granos cerosos y sin color que resulta de la recombinación debe tener un cromosoma con una porción adicional, pero sin el botón; y algu­ nos de los individuos de la progenie con granos amiláceos y con color deben tener un botón pero no la porción adicional de cro-

D

t

d

¿Qué tipos y qué proporciones de progenie resultarían de ese cruzamiento de prueba? El progenitor heterocigótico produce cuatro tipos de gametos, como se ilustra en la figura 7-10: dos tipos de gametos no recombinantes (JI____ D y t___ d) y dos tipos recombinantes (T___ d. y t____ D ). La frecuencia de recombinaoión indica que un 16% de los gametos producidos por el progenitor heterocigótico serán recombinantes. Puesto que hay dos tipos de gametos recombi­ nantes, cada tipo debería producirse con una frecuencia de = 8%. El resto de los gametos serán no recombinantes; por ende deben producirse con una frecuencia de 100% - 16% = 84%. Puesto que hay dos tipos de gametos no recombinantes, cada ti­ po debe producirse con una frecuencia de = 42% . El otro progenitor de este cruzamiento es homocigótico y por consi­ guiente produce un solo tipo de gameto (í___ d) con una probabihdad de 1,00. La progenie del cruzamiento resulta a partir de la unión de dos gametos y produce cuatro tipos de progenie (fig. 7-10). La pro­ porción esperada para cada tipo puede calcularse utilizando la re­ gla de la multiplicación, multiplicando en forma conjunta la pro­ babilidad de cada gameto que pudiera participar de la unión. La progenie resultante del cruzamiento de prueba con las caracterís­ ticas de fruta rugosa y opaca T

D

Ligamiento, recombinación y mapeo de genes eucariontes 17'.

I Los g en e:isias determ inaron que la frecuencia de recom Dinacion

i entre

dos genes del pepino es de 1 6 % . ¿ C ó m o p uede utilizarse

J esa inform ación para predecir los resultados de e.ste cru z am ie n to ? ■ F ru ta ru g o s a

F r u t a lis a

opaca

b r illa n t e

C r u z a m ie n t o

X

Prueba para la distribución independiente

de p ru e b a

D

T

Form ación de gametos

JL r d

T £l;a G a m e to s no

G a m e to s

G a m e t o s no

r e c o m b in a n t e s

r e c o m b in a n t e s

r e c o m b in a n t e s

F r e c u e n c ia

o ,42

p r o n o s t ic a d a de g a m e to s

0 ,4 2

0 ,0 8

0 ,0 8

1 ,0 0

l

l

l

J _

D ebido a que la frecuencia de recom b inación es de

- '''^ 6 %

la proporción total de

g am etos recom binantes I es de 0,16, F ru ta

| i F r e c u e n c ia d e progenie p r o n o s t ic a d a 0 ,4 2

rugosa opaca

X

1

= 0 ,4 2

Progenie no F ru ta

0 ,4 2

lisa

X

1

r e c o m b in a n t e

= 0 ,4 2

b r illa n t e

0 ,0 8

F ru ta b r illa n t e

X

1

= 0 ,0 8

ru g o sa

T

d

t

d P r o g e n ie

F ru ta

0 ,0 8

lis a o p a c a

cromosoma t ^ del progenitor recesivo) = 0,42. Las proporclones que corresponden a los otros tipos de la progenie pue­ den calcularse de manera similar (fig. 7-10). Este método puede utilizarse para predecir el resultado de cualquier cruzamiento con genes ligados cuando se conoce la frecuencia de recombinación.

X

I

r e c o m b in a n t e

En algunos cruzamientos los genes están obviamente ligados porque se observa con claridad que la cantidad de no recombi­ nantes es mayor que la de recombinantes. En otros cruzamientos la diferencia entre la distribución independiente y el ligamiento no es tan obvia. Por ejemplo, supongamos que se realiza un cru­ zamiento de prueba para dos pares de genes, como Aa Bb x aa bb y se observan los siguientes números con respecto a la progenie: 54 Aa Bb, 56 aa bb, 42 Aa bb y 48 aa Bb. ¿Es éste el resultado de una proporción 1:1:1:1 ? No exactamente, pero la diferencia es pequeña. Es posible que estos genes se estén distribuyendo de manera independiente y el azar haya producido las leves diferen­ cias entre los números que resultaron y la proporción 1:1:1:1 que se esperaba. De manera alternativa, los genes pueden estar liga­ dos, con un nivel de entrecruzamiento considerable y por ende el número de no recombinantes es apenas superior al número de recombinantes. ¿Cómo saber si las diferencias respecto de los re­ sultados que se esperaban para la distribución independiente son producto del azar o del ligamiento? Nos encontramos con un problema similar en cruzamientos en los cuales los genes no estaban ligados; el problema de distinguir qué diferencias respecto de los resultados esperados se debían al azar y cuáles se debían a otros factores. Este problema se trató en el capítulo 3 con la prueba de! y}, la cual sirve para evaluar la po­ sibilidad de que el azar sea el único responsable por las diferen­ cias entre las cifras observadas y las que se esperaban. L a prueba del y} también puede utilizarse para probar la correspondencia entre las cifras observadas y las esperables para la distribución in­ dependiente. La prueba para la distribución independiente entre dos genes li­ gados requiere el cálculo de una serie de tres pruebas de y}. A fin de ilustrar este análisis examinaremos los datos que surgen a par­ tir de un cruzamiento entre cucarachas alemanas, en las que el gen para cuerpo amarillo (y) es recesivo respecto del de cuerpo pardo y el de alas curvas (cv) es recesivo respecto del de alas rectas (cv^). El cruzamiento de prueba (j+y cv'^cv x yy cvcv) pro­ dujo la siguiente progenie:

= 0 ,0 8 .

t

D

t

d

La predicción de la frecuencia de la p rogenie se o btiene m ultiplicando

63

y'*'y cv^cv

cuerpo pardo, alas rectas

77

yy cvcv

cuerpo amarillo, alas curvas

28

y^y cvcv

cuerpo pardo, alas curvas

32

yy cv^cv

cuerpo amarillo, alas rectas

200

progenie total

las frecuencias de los gam etos.

Fig. 7--10.

La fre c u e n c ia de re co m b in a ció n p e rm ite p re ­ d e c ir la s p ro p o rc io n e s d e d e sc e n d e n c ia e s p e r a d a s p ara un c ru z a m ie n to q u e in c lu y e g e n e s lig a d o s.

se produce con una frecuencia de 0,42 (la probabilidad de here­ dar un gameto con el cromosoma 7_____ D del progenitor heterocigótico) X 1,00 (la probabilidad de heredar un gameto con el

Prueba para determinar las proporciones en cada locus. A fin dé determinar si los genes para el color del cuerpo y la forma de las alas se distribuyen de manera independiente se debe examinai' cada locus y determinar si las cifras que se observan difieren de las que se esperaban (al final de esta sección nos referiremos a la importancia de este paso). Teniendo en cuenta el cruzamiento en­

172 Capítulo 7 tre un heterocigoto y un homocigoto (y^y x yy) en el primer locus (para el color del cuerpo) se espera que se produzca una pro­ genie Vj y'*'y pardo y yy amarillo; es decir que se esperan 100 de cada tipo. Se observan 63 28 = 91 individuos con cuerpo pardo y 77 + 32 = 109 individuos con cuerpo amarillo. Si aplica­ mos la prueba de (véase cap. 3) a las cifras observadas y espe­ radas obtendremos;

Fenotipos Proporciones Cifras Cifras esperados esperadas esperadas obtenidí

Genotipos

pardo, rectas amarillo, curvas pardo. curvas amarillo, rectas

y^y cv'*' cv y y cvcv y^y cvcv

(observado - esperado)^ yy cV^ cv

esperado (91 - 100 )2 100

=— -h— = 0,81

(109

100 0,81 = 1,62

Los grados de libertad que se asocian con la prueba de (cap. 3) son n - l, donde n es igual al número de clases que se esperaban. En este caso se esperaban dos fenotipos; por tanto el grado de libertad es de 2 - 1 = 1. Al analizar los valores de la prueba de que se observa en el cuadro 3-4 advertimos que la probabilidad asociada con este valor de oscila entre 0,5 y 0,1. Debido a que la probabilidad está por encima de 0,05 (que es la probabilidad crítica para rechazar la hipótesis de que el azar produce las diferencias entre las cifras oljtenidas y las es­ peradas) llegamos a la conclusión de que no existe una diferen­ cia significativa entre la proporción de 1:1 que se esperaba pa­ ra la progenie del cruzamiento de prueba y la proporción que se obtuvo. A continuación se compararán las proporciones observadas y las esperadas para el segundo locus que determina el tipo de alas. En este locus, también se cruzaron un heterocigoto y un homocigoto {cv'''cv x cvcv) y se espera que produzca V, cV^cv de progenie con alas rectas y Vj cvcv de progenie con alas cur­ vas. Lo que en realidad se observa es lo siguiente: 63 + 32 = 95 individuos con alas rectas y 77 + 28 = 105 individuos con alas curvas; por consiguiente, el valor de la prueba de que se cal­ culó es:

100

50

63

Vj X V2 = V4

50

77

% = %

50

28

50

32

V2 X

"

V ,x V ,= V4

100 )2

100 100

(95 - 100 )2

'^ 4

*4 ^

(105 - 100 )2 100

25 25 — + -----= 0,25 + 0,25 = 0,50 100 100 El grado de libertad asociado con el valor de yj- también es de 2 - 1 =: 1, y la probabilidad asociada con él oscila entre 0,5 y 0,1. Nuevamente se considera que no existe una diferencia significa­ tiva entre lo que se obtuvo y lo que se esperaba para este locus tras el cruzamiento de prueba. Cocientes de prueba para determinar la distribución indepen­ diente. En esta instancia ya estamos en condiciones de realizar la prueba para la distribución independiente de los genes en los dos loci. Si los genes se distribuyen de manera independiente, puede utilizarse la regla de multiplicación a fin de obtener las probabi­ lidades y las cifras de la progenie que heredará las diferentes combinaciones de fenotipos:

Ahora las cifras observadas para la progenie pueden comparar­ se con las que se esperaban al emplear la prueba de y} : ^

(63 ~ 50 f (77 - 50 f (28 50 f ------------ + — ------- + -----------50 50 50 (32

50 f

50 En este caso existen cuatro clases de fenotipos esperados; por en­ de los grados de libertad equivalen a 4 - 1 = 3 y la probabiüdad aso­ ciada es mucho menor que 0,001. Esta probabilidad tan pequeña in­ dica que los fenotipos no se dan en las proporciones que se hubie­ ran esperado si ocurriera la distribución independiente. En conse­ cuencia, la conclusión es que en este caso los genes no se distribu­ yen de manera independiente y deben estar ligados. En síntesis, la prueba para deteiininar el ligamiento entre dos ge­ nes requiere una serie de pruebas de una prueba de x^para la se­ gregación de los alelos en cada locus en particular y luego una prue­ ba para la distribución independiente entre los alelos en diferentes loci. Las pruebas de x^ para la segregación en cada locus siempre deben llevarse a cabo antes de la de distribución independiente, ya que las probabilidades que se esperan respecto de la distribución in­ dependiente se basan en las que se esperan para cada locus. Supon­ gamos que los alelos de la cucaracha que utilizamos como ejemplo se distribuyeran de manera independiente y que algunas de las cu­ carachas con alas curvas murieran durante su desarrollo embriona­ rio; la proporción de individuos con alas curvas que se observai'ía sería de V, en lugar de V^. En este caso la prdporción de descenden­ cia con cuerpo amarillo y alas curvas esperada sobre la base de la distribución independiente debería ser de ' ^ 3 x = Vg en lugar de V4 . Sin la prueba de y} inicial para la segregación en el locus para alas curvas no hubiera sido posible saber que lo que debía esperar­ se respecto de la distribución independiente era Vg y no V^. Si se lle­ vara a cabo tan solo la prueba final para la distribución independien­ te y se aceptara una proporción esperada de 1 : 1 :1 : 1 , obtendríamos un valor de y¡- elevado y podríamos concluir de manera errónea que los genes estaban ligados. Si se obtuviera un valor de significativo (uno que tiene una probabilidad menor de 0,05) en cualquiera de las dos primeras pruebas para la segregación, no sería necesario realizar la prueba de x^ final para la distribución independiente, ya que en ese caso se desconocen los valores esperados reales.

Mapeo de genes con frecuencias de recombinadón Morgan y sus estudiantes desarrollaron la idea de que las dis­ tancias físicas entre los genes dentro de un cromosoma se relacio­

Ligamiento, recombinadón y mapeo de genes eucariontes 17 nan con las tasas de recombinación. Construyeron la hipótesis de que los entrecruzamientos ocurren más o menos al azar, distribui­ dos en el cromosoma, y que dos genes que se ubican a cierta dis­ tancia el uno del otro tienen mayor probabilidad de entrecruzar­ se que dos genes que se encuentran juntos. Propusieron que las frecuencias de recombinación podían constituir un medio muy conveniente para determinar el orden de los genes dentro del cro­ mosoma y que a partir de ellas se podrían estimar las distancias relativas entre los genes. Los mapas de cromosomas que se cal­ culan utilizando las frecuencias de recombinación se denominan mapas genéticos. Por el contrario, los mapas de cromosomas que se basan en las distancias físicas dentro del cromosoma (que por lo general se expresan en términos de pares de bases) se denomi­ nan mapas físicos. Las distancias en los mapas genéticos se miden en unidades de m apa (que se abrevia um); una unidad de mapa equivale a una recombinación del 1%. Las unidades de mapa también se deno­ minan centimorgan (cM), en honor a Thomas Hunt Morgan; un morgan equivale a 100 um. Las distancias genéticas que se mi­ den a partir de las tasas de recombinación son casi aditivas: si la distancia entre el gen A y el gen 5 es de 5 um, la distancia entre el gen £ y el gen C es de 10 um, y la distancia del gen A al gen C es de 15 um, entonces el gen B debe estar ubicado entre los ge­ nes A y C. Sobre la base de las distancias de mapa dadas se pue­ de construir un mapa genético simple respecto de los genes A, B, y C, como el que se muestra a continuación: -----------------------

15 u m

A J

------------------------

10 u m

•C

Asimismo, podríamos construir este mapa con C del lado iz­ quierdo y A del lado derecho: 15 u m

10 u m

5 um "> A

Los dos mapas son correctos y equivalentes porque con los da­ tos en cuanto a las posiciones relativas de tan solo tres genes lo máximo que puede determinarse es cuál es el gen que se ubica en el medio. Si lográramos obtener la distancia que existe con res­ pecto a otro gen, podríamos determinar la posición relativa de A y C respecto de ese gen. Un gen adicional D, examinado median­ te cruzamientos genéticos, podría producir la siguientes frecuen­ cias de recombinación: Par de genes Ay D By D C yD

Frecuencia de recombinación (%) 8 13 23

Nótese que C y D muestran los valores de recombinación más altos; por tanto, C y D deben ser los dos genes que se encuentran más alejados el uno del otro y A y B están en el medio de ambos. Si utilizamos las frecuencias de recombinación y no dejamos de

recordar que 1 um = recombinación del 1% podemos agregar el gen D a nuestro mapa: 23 u m 13 u m 15 u m

D A -e- 5 u m

B■

10 u m

►C

Mediante la realización de una serie de cruzamientos entre pares de genes es posible construir un mapa genético que indique la dis­ posición de los ligamientos de un cierto niímero de genes. En cuanto al desarrollo de un mapa cromosómico a partir de las frecuencias de recombinación se deben destacar dós aspectos. Pri­ mero, debe recordarse que la frecuencia de recombinación entre dos genes no puede superíir el 50% y que el 50% es también la tasa de recombinación para los genes ubicados en distintos cromosomas. En consecuencia, es imposible marcar la diferencia entre los genes ubicados en cromosomas distintos de los que se encuentran alejados pero dentro del mismo cromosoma. Si los genes tienen una recom­ binación del 50%, la máxima conclusión a la que puede llegarse en cuanto a ellos es que pertenecen a diferentes grupos de genes liga­ dos (a distintos grupos de ligamiento), y sea dentro de cromosomas diferentes o dentro del mismo cromosoma pero alejados los unos de los otros. El segundo aspecto que debe considerarse es que cuando se rea­ liza un cruzamiento de prueba para dos genes relativamente aleja­ dos pero dentro del mismo cromosoma se tiende a subestimar la verdadera distancia física porque el cruzamiento no revela los entrecruzamientos dobles que pueden ocurrir entre los dos genes (fig. 711). Un entrecmzamiento doble se produce cuando dos entrecruza­ mientos separados ocurren entre los mismos dos loei. Mientras que un entrecruzamiento simple produce combinaciones de alelos que no estaban presentes en los cromosomas de los progenitores, un se­ gundo entrecruzamiento entre los mismos dos genes invierte el efecto del primero y restaura así las combinaciones originales de alelos de los progenitores (fig. 7-11). Los entrecruzamientos dobles producen tan solo gametos no recombinantes y por lo tanto no pue­ de distinguirse entre la progenie que se produce a partir de entrecru­ zamientos dobles y la progenie que se produce cuando no hay en­ trecruzamiento alguno. Sin embargo, como veremos en la sección siguiente, es posible detectar entrecruzamientoá dobles examinando un tercer gen cpe se encuentra entre los dos entrecruzamientos. De­ bido a que los entrecruzamientos dobles entre dos genes pasan inad­ vertidos las distancias de mapa serán subestimadas cada vez que ocurran estos entrecruzamientos. Los cruzamientos dobles se pro­ ducen con mayor frecuencia entre genes que están alejados; por consiguiente los mapas genéticos que se realizan sobre la base de distancias cortas siempre son más precisos que los que se basan en distancias mayores.

CONCEPTOS CLAVE Un mapa genético revela el orden de los genes dentro del crom osom a y las distancias aproximadas entre los genes sobre la base de las frecuencias de recombinación. Cuando nos referimos a mapas genéticos, una recom bi­ nación del ]% equivale a 1 unidad de mapa, o 1 c e n ti­ morgan. Los entrecruzamientos dobles entre dos genes pasan inadvertidos; así las distancias de mapa entre ge­ nes que están alejados los unos de los otros por lo gene­ ral subestim an las distancias genéticas. .

174 Capítulo 7 Fíg. 7- I ] , U n entrecruzam iento do­ ble entre d o s g e n e s lig a d o s p ro d u ce s o lo g a m e to s no re c o m b in a n te s.

-- . i'f.zam .eT o Tr.bi?'

i í l u n entrecruzam ien |j K alterara ios

i

a le lo s q u e s e

I e n cuen tran en los I crom osom as I hom ólogos...

I ...pero un seg un do

m

enirecruzam iento revertirá los

• ib'.j ■ ’i »

efectos del p rim ero y restaurará la co m b inación original de alelos q ue se hereda de los progenitores,.!.

^

...de esta m an era solo se producirán g eno tip o s no recom binantes en los gam etos, aunque ciertas partes de los crom osom as se hayan reco m b m ad o.

Constryctíéfi de un mapa genético con cruzamientos de prueba de dos puntos Los mapas genéticos pueden construirse realizando una serie de cruzamientos de prueba entre pares de genes y examinando las frecuencias de recombinación entre ellos. Un cruzamiento de prueba que se lleva a cabo entre dos genes se denomina cruza­ miento de prueba de dos puntos o cruzamiento de dos puntos. Supongamos que se realizan una serie de cruzamientos de prue­ ba de dos puntos para cuatro genes, a, b, c, y d ,y que se obtuvie­ ron las siguientes frecuencias de recombinación:

La frecuencia de recombinación entre a y c es de 50%, lo que indica que ellos también pertenecen a grupos de ligamiento dife­ rentes. La frecuencia de recombinación entre b y c es de 20%; por consiguiente estos genes están ligados y separados por 20 unida­ des de mapa: Grupo de ligamiento 1

Grupo de ligamiento 2 Locus del gen en el cruzam iento de prueba ayb ay c ay d by c by d cy d

Frecuencia de recombinación 50 50 50 20 10 28

Podemos comenzar a construir un mapa genético para estos ge­ nes considerando las frecuencias de recombinación para cada par de genes. La frecuencia de recombinación entre a y b es de 50%, que es la frecuencia de recombinación que se espera cuando ocu­ rre la distribución independiente. De este modo, los genes a y b pueden hallarse en cromosomas diferentes o muy alejados dentro del mismo cromosoma; en consecuencia debemos ubicarlos en grupos de ligamiento diferentes suponiendo que estén en el misrrío cromosoma o no:

20 u m

La frecuencia de recombinación entre a y d es de 50%, lo que indica que estos genes pertenecen a diferentes grupos de liga­ miento, mientras que los genes b y d estáñ ligados, con una fre­ cuencia de recombinación de 10%. A fin de saber si el gen d se encuentra a 10 unidades de mapa a la derecha o a la izquierda del gen b debemos tener en cuenta la distancia entre c y d. Si el gen d se encuentra a 10 unidades de mapa a la izquierda del gen b, la distancia entre d y c debe ser de 20 um -i- 10 um = 30 um. Ésta es una distancia solo aproximada porque algún entrecruzamiento doble entre los dos genes pasará inadvertido y la distancia de ma­ pa será subestimada. Si, por otra parte, el gen d estuviera a la de­ recha del gen b, la distancia entre el gen y el gen c sería mucho más pequeña, aproximadamente: 2 0 u m -^ 1 0 u m = 10 um

Grupo de ligamiento 1

Grupo de ligamiento 2

Al examinar la frecuencia de recombinación entre c y dse pue­ de distinguir entre estas dos posibilidades. La frecuencia de re­ combinación entre c y d es de 28%; por tanto el gen d debe ubi­ carse a la izquierda del gen b. Nótese que la suma de las recom­ binaciones entre d y b (10%) y entre b y c (20%) es mayor que la recombinación entre d y c (28%). (A esto nos referíamos al decir que las tasas de recombinación son aproximadamente aditivas.) Esta discrepancia surge porque los entrecruzarnientos dobles en­

Ligamiento, recombinación y mapeo de genes eucariontes 17E viduo que es heterocigótico en los tres loci (Aa Bb Ce). Debe te­ nerse en cuenta que los genes tienen la configuración de acopla­ miento; es decir que todos los alelos dominantes están dentro de un cromosoma (A B C ) y todos los alelos recesivos seenc ). Entre es­ cuentran dentro del otro cromosoma (a_____ b tos tres genes pueden producirse tres tipos de entrecruzamientos: dos tipos de entrecruzamientos simples (fig. 7-12a y b) y un tipo de entrecruzamiento doble (fig. 7-12c). En cada tipo de entrecruzamiento dos de los cromosomas resultantes son recombinantes y dos son no recombinantes. Cabe recordar que en los cromosomas recombinantes que resul­ tan del entrecruzamiento doble los dos alelos de los extremos son los mismos que en los cromosomas no recombinantes, pero el ale­ lo del medio es diferente. Este resultado revela una clave importan­ te respecto del orden de los genes. En la progenie que resulta de un entrecruzamiento doble el alelo del medio es el único que debería diferir de los alelos presentes en la progenie no recombinante.

tre los dos genes en los extremos pasan inadvertidos, lo que pro­ duce una subestimación de la verdadera distancia de mapa. Aho­ ra ya se ha completado el mapa genético de estos genes: Grupo de ligamiento 1

Grupo de ligamiento 2 d

b



apellido, proporciona un registro exacto de las conexiones familiares. En la actualidad, los genetistas están usando esta propiedad de H. pylori para rastrear las migraciones históricas de las poblaciones humanas. En 2003 un equipo de genetistas dirigido por Mark Achtman en el Max Planck Instituto for Infection Biology en Berlín examinó las secuencias del DNA en ocho genes de la bacteria H. pylori recolectada de seres humanos de todo el mundo. Estos profesionales observaron que las secuencias bacterianas se agrupaban en cuatro grupos principales -dos de Africa, uno de Asia oriental y uno de Europa- que tienen una buena correspondencia con las poblaciones humanas a partir de las cuales se aislaron las bacterias. El análisis posterior reveló afinidades entre las poblaciones humanas dentro de los grupos y entre ellos. Por ejemplo, las bacterias provenientes de los maoríes (un grupo de nativos de Nueva Zelanda) estaban estrechamente relacionadas con las de Polinesia, lo que corrobora otra evidencia de que los maoríes se originaron de los isleños del Pacífico del sur que emigraron a Nueva Zelanda hace varios miles de años. De manera similar las bacterias de los indios estadounidenses se agruparon con las cepas Cuadro 8-1 Ventajas de utilizar.las bacterias bacterianas del este de Asia, de manera coincidente con el origen asiático de los nativos estadounidenses. Los genes de las bacterias y Los virus para ios estudios también encajaron junto con las migraciones humanas más recien­ genéticos tes: las cepas africanas se encontraron muy a menudo entre los afronorteamericanos en Louisiana y Tennessee y se hallaron cepas 1. L a re p ro d u c c ió n es ráp id a europeas de bacterias entre las personas en Singapur, África del Sur y América del Norte. 2. Se p ro d u c e n m u c h a s p ro g en ies Los resultados de estos estudios revelan que H. pylori viaja por 3. El g e n o m a h a p lo id e p erm ite q u e to d a s las m u ta c io n e s el mundo en los intestinos de sus huéspedes humanos y pueden se e x p re s e n de m o d o d irecto utilizarse para ayudar a resolver los detalles de las migraciones humanas pasadas. H. pylori es una bacteria extraordinariamente 4. La re p ro d u c c ió n a s e x u a l s im p lific a el a is ia m ie n to de diversa y atractiva. Exhibe un grado alto de variación, con más c e p a s g e n é tic a m e n te puras alelos que se encuentra en la mayoría de otras especies bacteria­ 5. El c u ltiv o en el la b o ra to rio es fá cil y requ iere p o c o es^ nas, pero también se relaciona con el intercambio y la recombi­ p a c ió nación genética frecuente y por eso las bacterias dentro de una 6. Los g e n o m a s so n p e q u e ñ o s cepa tienden a ser similares. Esta combinación de similitud den­ tro de las cepas y las diferencias entre ellas, junto con su transmi­ 7. E x is te n té c n ic a s p ara a isla r y m a n ip u la r sus g e n e s sión vertical dentro de las familias humanas, hace de H. pylori 8. T ie n e n im p o rta n c ia m é d ica particularmente conveniente para el estudio de afinidades huma­ nas. En este capítulo examinaremos algunos de los mecanismos 9. P u e d e n ser m o d ific a d o s m e d ia n te in g e n ie ría g e n é tic a por los cuales las bacterias como H. pylori intercambian y recomp a ra p ro d u c ir s u s ta n c ia s de v a lo r co m ercial binan sus genes.

200 Capítulo 8 Desde la década de 1940 los sistemas genéticos de las bacterias y de los virus han contribuido al descubri­ miento de muchos conceptos importantes en genética. En un principio el estudio de la genética molecular se centró casi por completo en sus genes; en la actualidad las bacterias y los virus son aún herramientas esen­ ciales por comprobar la naturaleza de los genes en los microorganismos más complejos, en parte porque ellos poseen varias características que los hacen adecuados para los estudios genéticos (cuadro 8-1). También se estudian los sistemas genéticos de bacterias y virus porque estos microorganismos desempe­ ñan papeles importantes en la sociedad humana. Como se ilustró con H. pylori, muchas bacterias son una parte importante de la ecología humana. Fueron cosechadas para producir varias sustancias importantes desde el punto de vista económico, y tienen una importancia médica inmensa ya que causan muchas en­ fermedades humanas. En este capítulo nos centramos en varios aspectos singulares de sistemas genéticos bacterianos y virales. Se describirán los procesos importantes de transferencia y recombinación génica, co­ mo los que contribuyen a la estructura genética de H. Pylori, y veremos el modo en que estos procesos pue­ den usarse para mapear los genes bacterianos y virales. Información acerca de H. pylori.

(www,wh«re¿manxom^^

Genética bacteriana

tetizar las moléculas esenciales y solo crecen en un medio suplementado con uno o más nutrientes. Por ejemplo, las cepas auxótro­ i bien la herencia en las bacterias es en esencia similar a la fas que son incapaces de sintetizar el aminoácido leucina no crecen herencia en los organismos más complejos, el genoma haen un medio mínimo, pero sí lo hacen en un medio al que se le ha­ ploide bacteriano y el tamaiio pequeño de las bacterias (que difi­ya agregado leucina. Un medio completo es el que contiene todas culta la observación de sus fenotipos) requieren diferentes enfo­ las sustancias, como el aminoácido leucina, requeridas por las bac­ ques y métodos. Primero consideraremos cómo se estudian las terias para crecer y reproducirse. bacterias y luego examinaremos los distintos procesos de transfe­ Los cultivos bacterianos suelen crecer en tubos de ensayo, que rencia de genes de una bacteria a otra. contienen un medio líquido estéril (fig. 8-2a). Al tubo se le agre­ gan unas pocas bacterias, que crecen y se dividen hasta que se agotan los nutrientes o -con más frecuencia- hasta que la con­ Técnicas para el estudio de las bacterias centración de sus productos de desecho se torna tóxica. Las bac­ terias también se cultivan en placas de Petri (fig. 8-2b). El medio Los microbiólogos han definido las necesidades nutricionales de de crecimiento suspendido en el agar se vierte hasta en la mitad numerosas bacterias y desarrollado medios de cultivo para su creci­ inferior de la placa de Petri, lo que proporciona una base sólida, miento en el laboratorio. Los medios de cultivo suelen contener una similar a un gel, para el crecimiento de la bacteria. La principal fuente de carbono, elementos esenciales como el nitrógeno y el fós­ ventaja de este método es que permite aislar y contar las bacte­ foro, algunas vitaminas y otros iones y nutrientes necesarios. Las rias, que son individualmente demasiado pequeñas para observar­ bacterias silvestres (protótrofas) pueden usar estos ingredientes se sin un microscopio. En un proceso denominado “plaqueo” se essimples para sintetizar todos los compuestos que requieren para su pai'ce una solución diluida de bacterias sobre la superficie de una crecimiento y reproducción. Se denomina medio mínimo al que placa de Petri con agar. A medida que las bacterias crecen y se di­ contiene solo los nutrientes requeridos por las bacterias protótrofas. viden se va formando un grupo de bacterias genéticamente idénti­ Las cepas mulantes denominadas “auxótrofas” carecen de una o cas (una colonia). Las cepas genéticamente puras de la bacteria más de las enzimas necesarias para metabolizai" los nutrientes o sin­ pueden aislarse mediante la recolección de bacterias provenientes

S

(a)

(b)

'A s a de

'P i p e t a

^Tapa

V a r illa d e v i d r i o

in o c u la c ió n

S o lu c ió n d ilu id a d e c é lu la s

'P l a c a d e P e tri

b a c t e r ia n a s M e d io líq u id o e s t é r il

1M e d io inoculado

1Las b a cte rias"

El m edio de

i Se agrega una

i con bacterias.

¡ crecen y se

crecim iento se *

i solucion diluida de

^ suspende en agar

_ oacterias a la placa _

i dividen.

! similar a la gelatina

de Petri.

La

:ion

bacieriana se

í

j 1Después de u n a

esparce de modo|_; días las b acte rias se [ ; ; uniform e ; j multiplican y fo rm a n ; m ediante la

Fig. 8-2.

j

i j incubación d e 1 o 2 j

L a s b a cte ria s pueden c u ltiv a rse en (a) un m edio líq u id o o (b) un m edio só lid o .

varilla de vidrio.

colonias visibles. í

i

Sistemas genéticos bacterianos y virales

H g . 8-3. L a s b a c te ria s pued en d e s a r r o lla r s e en m e d io s s ó lid o s y p r e s e n ­ ta r d iv e r s o s fe n o tip o s , (a) Proteus m irabilis. (b) Serratia m arcescens

co n v a r ia c io ­

(c) Staphylococcus aureus. id ) Bacillus cereus. (Partes a y d, Bioplioto A s­ n e s d e c o lo r,

sociates/Photo Researchers; parte b, doctor E. Bottone/Peter Arnold; parte c, Dr. Fred Hossler/Visuals Unlim ited.)

de una colonia individual y transfiriéndolas a un tubo de ensayo o a una placa de Petri nuevos. Dado que las bacterias individuales son demasiado pequeñas pa­ ra observarlas en forma directa a menudo es más fácil estudiar los fenotipos que afectan el aspecto de la colonia (fig. 8-3) o pueden de­ tectarse mediante pruebas químicas simples. Los auxótrofos suelen ser los fenotipos estudiados. Supongamos que se quieren detectar auxótrofos incapaces de sintetizar leucina (mutantes leu^). Primero n

Sembrar las bacterias er Q Placa de réplica de las colonias píaca con un medio que mediante la presión de una contiene leucina. Crecen tanto i " ' de terciopelo sobre íew^ como ias leu'. i I I

se siembran las bacterias en una placa de Petri que contiene un me­ dio con leucina; sobre éste crecerán tanto los protótrofos que poseen el alelo leu^ como los auxótrofos que poseen los aleles leur (fig. 84). A continuación, mediante una técnica conocida como siembra en placa de réplica, se transfieren unas pocas células de cada una de las colonias de la placa original a dos nuevas placas de réplica; una que contiene un medio al cual se le agregó leucina y la otra, con un medio selectivo; es decir, un medio que carece de leucina. Las bac-

r a Las células se adhieren al I terciopelo.

Kt

Presionar sobre nuevas placas de Petri, Las células de cada colonia se transfieren a las placas nuevas.

j t i Las auxótrofas para leucina (/ecr) se identifican por su incapacidad de crecer en un medio sin suplemento.

IVIango H

\

M e d io sin le u c in a

Las bai icuperan de í una col rece en un medio supiementado y se cultivan para estudios complementarios

S o lo c r e c e n las b a c t e r ia s

leu+

- C o lo n ia te r c io p e lo

f a lla n t e

( e s t e r i li z a d a F

C u lt iv o

C u lt i v o

b a c t e r ia n o

IM e d io co n le u c in a

Fig. 8"4. L a s c e p a s b a c te ria n a s m u ta n te s pued en a is la r s e s o b re la b a se d e s u s re q u e rim ie n to s n u tr ic io n a le s .

C re c e n b a c t e r ia s

leu+

y

leu-

Conclusión: una colonia'que crece solo en un medio ' supiementado tiene una mutación en el gen que codifica ia síntesis de un nutriente esencial.

202 Capítulo 8

Fig. 8-5. Casi todas las bacterias poseen un cromoso­ ma único circular, que se observa aquí al em erg er de una célula bacteriana rota. (David L. Nelson y Michael M. C o x . Lehninger Principies of Biochemistry, 4 tli. edition

(N ew York: W orth Publishers,

2004) de Huntington Potter y David Dressier, Harvard M ed ical School, De­ p artam ento de N eurobiología, fig. 24-4, p, 926.)

estará formada por bacterias leu~. Los auxótrofos que crecen en un medio suplementado pueden entonces cultivarse para estudios adi­ cionales.

Genoma bacteriano

terias leu^ crecerán en ambos medios, pero las mutantes leur solo se desarrollarán en el medio suplementado por leucina, ya que no pue­ den sintetizar su propia leucina. Toda colonia que se desarrolle en el medio que contiene leucina, pero no en el medio que carece de ella.

Las bacterias son microorganismos unicelulares que carecen de membrana nuclear. La mayor parte de los genomas bacterianos consisten en un cromosoma circular que contiene una molécula de DNA única cuya longitud es de varios millones de pares de ba­ ses (fig. 8-5). Por ejemplo, el genoma de E. coli posee unos 4,6 millones de pares de bases (bp) de DNA. Sin embargo, algunas bacterias (como V. cholerae) contienen cromosomas múltiples, y unas pocas tienen, incluso, cromosomas lineales. Los cromoso­ mas bacterianos suelen estar organizados de manera eficiente, con escasa cantidad de DNA entre los genes.

Plásmidos

___

Además de tener un cromosoma, muchas bacterias poseen plásmi­ dos, que son pequeñas moléculas circulares de DNA (fig. 8-6). Algu­ nos plásmidos están presentes en muchas copias de una célula, mien­ tras que otros solo presentan una o dos. En general los plásmidos po­ seen genes que no son esenciales para la función bacteriana, pero pue­ den desempeñai' un papel importante en el ciclo de vida y en el creci­ miento de sus huéspedes bacterianos. Algunos plásmidos estimulan el apareamiento entre bacterias; otros contienen genes que matan a otras bacterias. Es de destacar que los plásmidos se utilizan ampliamente en ingeniería genética (cap, 18) y algunos de ellos participan en la di­ seminación de la resistencia bacteriana a los antibióticos. La mayoría de los plásmidos son circulares y constan de varios mi­ les de pares de bases de longitud, aunque se han encontrado plásmi­ dos de cientos de miles de pares de bases. Dado que posee su propio origen de replicación, un plásmido se replica en forma independien­ te del cromosoma bacteriano. La replicación parte del origen en una o dos direcciones hasta que se copia el plásmido en su totalidad. En la figura 8-7 el origen de replicación es oriV. Unos pocos plásinidos cuentan con múltiples orígenes de replicación. Los episomas son plásmidos capaces de replicarse libremente o integrados a los cromosomas bacterianos. El factor F (fertilidad) de E. coli (fig. 8-8) es un episoma que controla el apareamiento y el in­ tercambio génico entre células de E. coli, como se analizará en la próxima sección.

CONCEPTOS CLAVE Fig. 8-6. Muchas bacterias contienen plásmidos que son pequeñas moléculas circulares de DNA. Mic r o f o t o g r a f ía e le c t r ó n ic a d e d o s p lá s m id o s b a c t e r ia n o s p r o ­ d u c id o s c u a n d o un p lá s m id o o r ig in a l s u fr ió r e p lic a c ió n . La c o n e x ió n r e s t a n t e e n t r e lo s p lá s m id o s e s t á in d ic a d a p o r el c ír c u lo . (A.B. D o w sett/Scien ce Photo Library/Photo R esearchers.)

El genoma bacteriano característico consta de un cromosortia circular único que contiene varios millones de pares de bases. Algunos genes bacterianos se encuentran presentes en plásmidos, pequeñas moléculas circulares de DNA que se replican en forma independiente del cromosoma bacteriano.

Sistemas genéticos bacterianos y virales 2

La rephcacion de un plasmido comienza en i I el origen de replicacion, el sitio

oríV.

\

H \

B

Las cadenas se .separan y la rephc se produce en ambas direcciones

^ O rig e n d e r e p lic a c ió n

c I

alrededor !

,,, y, por ultimo, produce dos

i

I del circi

i

moléculas circulares de

DNA.

D N A re c ié n s i n t e t iz a d o

oriV)

(s it io

S e p a r a c ió n

f | _ Separación ■ ■í Ir

de los plásmidos

d e las caden as

D N A b ic a t e n a r io

h ijo s

Cadena n u e v a '

“ C ad en as se p a ra d a s en el s it io

oriV C ad ena v ie ja '

Fig. 8-7.

Un plásmido se replica en forma independiente de su cromosoma bacteriano.

g e n d e r e p lic a c ió n

(oriV)

L a r e p lic a c ió n c o m i e n z a e n el o ri­

y c o n t in ú a a lr e d e d o r d e l c ír c u lo . En e s t e d ia g r a m a la r e p lic a c ió n se p r o d u c e en d o s d ir e c c io n e s ; e n a lg u n o s

p lá s m id o s la r e p lic a c ió n es s o lo u n id ir e c c io n a l. (Fotografía de Píioto Researcíiers.)

Transferencia genética en las bacterias Las bacterias intercambian el material genético mediante tres mecanismos distintos, cada uno de los cuales supone algún tipo de transferencia y recombinación de DNA entre el DNA transfe­ rido y el cromosoma bacteriano. 1. La conjugación (flg. 8-9a) tiene lugar cuando el material ge­ nético pasa en forma directa de una bacteria a otra. En la conjugación dos bacterias se encuentran próximas y se for­ ma una conexión entre ellas. Un plásmido o una parte del cromosoma bacteriano pasa de una célula (donante) a otra célula (receptora). Después de la conjugación se produce el entrecruzamiento entre las secuencias homologas del DNA transferido y el cromosoma de la célula receptora. En la con­ jugación el DNA se transfiere solo de la célula donante a la receptora, sin intercambio recíproco de material genético. 2. La transformación (fig. 8-9b) tiene lugar cuando una bacte­ ria capta el DNA desde el medio en el cual desárrolla la bac­ teria. Después de la transformación,es posible la recombina­ ción entre los genes introducidos y los del cromosoma bac­ teriano. 3. La transducción (fig. 8-9c) tiene lugar cuando virus bacte­ rianos (bacteriófagos) transportan el DNA de una bacteria a la otra. Una vez en el interior de la bacteria el DNA recién introducido puede sufrir una recombinación con el cromoso­ ma bacteriano. No todas las especies bacterianas exhiben los tres tipos de transferencia genética. La conjugación es más frecuente en algu­ nas bacterias que en otras. En muchas bacterias la transformación se produce en una magnitud limitada, pero se han desarrollado técnicas de laboratorio que aumentan la tasa de DNA captado. La mayor parte de los bacteriófagos tienen un espectro liinitado de huéspedes; por eso, la transducción suele realizarse solo entre bacterias de la misma especie o de especies estrechamente rela­ cionadas.

Estos procesos de intercambio genético en las bacterias difie­ ren de la reproducción sexual de los eucariontes diploides en dos aspectos importantes. Primero, el intercambio de DNA y la repro­ ducción no están asociados en las bacterias. Segundo, el material genético donado que no se recombina dentro del DNA del hués­ ped casi siempre se degrada y, de ese modo, la célula receptora permanece haploide. Cada tipo de transferencia genética puede Estos genes regulan ia transferencia del plásm ido

Nec e ^ 'cas ai nsGicc" en e’ c ''o ^ c s j ""c i cace a o Es^as

hacia otras células

IS3

oriV ohT

(o r ig e n

rep inc

d e la

(o r ig e n

d e r e p lic a c ió n )

t r a n s f e r e n c ia ) Estos genes c o n tro la n la replicación del plásmido.

Factor F

Fig. 8-8. El factor F, un episoma circular de E. coli, con­ tiene ciertos genes que r e g u l a n la transferencia dentro de la célula bacteriana, la replicación y la inserción en el cro­ mosoma bacteriano. La r e p lic a c ió n se in ic ia en el s i t i o oriV. L a s s e c u e n c ia s d e in s e r c ió n (c a p . 1 1) /S3 e

IS2

c o n t r o l a n la in s e r­

c ió n e n el c r o m o s o m a b a c t e r ia n o y la e s c is ió n d e s d e é l.

204 Capitulo 8 (a ) C on ju gación I i-ormacion de un

j_____ | El D N A se replica y se iran stie re i___ ! Las células se

! p uente ato p lasm ático . j C é lu la

C é lu la

d o n a n te

re c e p to ra

| de una célula a la otra.

i

__ Ui entiecru zam len to en la célula receptora

i separan.

co n d u ce a.

\\ \ \

/

i reconnbinante.

DNA d e g r a d a ls r

\

A C ro m o s o m a b a c t e r ia n o

(c) T ran sd u cció n i Un virus infecta una L4 ■■■Inyecta

i célula bacteriana ... 1 I su D N A...

t

j El virus infecta una

c d ¡.t a r e lD N A

y se replica al

!

nueva bacteria ...

b acteriano. Se

I I

................................. 'A ' i c o n é l .

p roduce la lisls de

U ... y transporta e l u j El e n tre cri i i D N A bacten no

en la bactei 1 i conduce a.

a c ió n dei^ tora i

omosoma 1 nbinante.

1

la célula b acteriana.!

Fig. 8-9.

La

co n ju g a ció n , la tra n s fo rm a c ió n y

la

tra n sd u c c ió n

son tre s

p r o c e s o s de tr a n s fe r e n c ia g én ica en fa s

b a c te ­

r i a s . L o s t re s p r o c e s o s r e q u ie r e n q u e e l D N A t r a n s f e r id o s u f r a r e c o m b in a c ió n c o n el c r o m o s o m a b a c t e r ia n o p a r a q u e el D N A t r a n s f e r i­ d o s e a h e r e d a d o d e m o d o e s t a b le .

usarse para trazar mapas génicos, como se analizará en las sec­ ciones siguientes.

CONCEPTOS CLAVE El DNA puede transferirse entre las.bacterias por conju­ gación, transformación o transducción. Cada tipo de transferencia génica consiste en un m ovim iento unidirec­ cional de información genética hacia la célula receptora, a veces seguido por recombinación. Estos procesos no se relacionan con la reproducción celular de las bacterias.

Conjugación En el transcurso de su investigación Lederberg y Tatum estu­ diaron cepas auxótrofas de E. coli. Para su crecimiento la cepa Y 10 reciuiere los aminoácidos treonina (y genotípicamente era th r) y leucina (leu^) y la vitamina tiamina {thr), pero no necesi­ ta la vitamina biotina (bio^) ni los aminoácidos fenilalanina iphe'^) ni cisterna (cys^); el genotipo de esta cepa puede escribir­ se de la siguiente forma: th r leu^ th r bio^ phe* cys^. En cambio, la cepa Y24 requiere un medio que contenga biotina, fenilalanina y cisterna, pero puede prescindir de la treonina, la leucina y la tia­ mina; su genotipo es: thr'* leu* thi* bio^phe^ cys^. Durante un ex-

Sistemas genéticos bacterianos y virales 2

A

E xp erim en to

P r e iw n t a ; ¿existe intercam bio de inform ación genética en las bacterias?

m

Y IO

Y24

leu-thi-bio^ th r-

rv thV' en la cepa YIO; o bio^ bio'^, phe~ phe^ y cys^ en la cepa Y24) para que cada cepa se volviera protótrofa por mutación, una condición muy improbable. Lederberg y Tatum llegaron a la conclusión de que se había producido algún tipo de transferencia y recombina­ ción genética: Capa auxótrofa YIO

thr

¥24

thr^ leu'' thi^ hio phe cys

thr

leu

thi bio^ phe^ cys^

leu^ thi

hio* phe* cys*

ZZZZZZ^CZZZZZ 0

thr* leu* thi*

... por tanto, ninguna cepa auxótrofa I puede crecer en un medio mínimo

thr

I Cuando ias cepas Y 10 y Y 2 4 se mezclan,,.

Capa auxótrofa

Resultados

H

--.crecen ale colonias,..

,,,porque se ha producido una recombínación genetica y las bacterias pueden sintetizar todos ios nutrientes que necesitan.

Conclusión: efectivamente, se produjo intercambio genético y recombinación entre las dos cepas motantes.

Fig. 8-1 0. El experimento de Lederberg y Tatum de­ mostró que las bacterias están sujetas al intercambio genético.

leu

hio phe

cys

thi hio phe cys

thr* leu* thi* hio* phe* cys*

Lo que ellos no sabían era cómo se había producido. Para estudiar este problema, Bernard Davis construyó un tubo con forma de U (fig. 8-11), dividido en dos compartimientos por medio de un filtro de poros finos. Este filtro permitía el paso del medio lí­ quido de un lado a otro del tubo, pero los poros del filtro eran tan pe­ queños que no pennitían el paso de las bacterias. Se colocaron dos cepas auxótrofas de bacterias, una a cada lado del filtro, y se realizó una aspiración en forma alternativa en los extremos del tubo en U, lo que provocó que el medio fluyera en ambos sentidos entre un com­ partimiento y el otro. Pese a las horas de incubación en el tubo en U las bacterias sembradas en el medio mínimo no crecieron; no hubo intercambio genético entre las cepas. El intercambio de genes bacte­ rianos requería, sin lugar a dudas, el contacto directo entre las bacte­ rias. Este tipo de intercambio genético que supone el contacto célu­ la a célula en las bacterias se denomina “conjugación”. Células F*y F~ En la mayoría de las bacterias la conjugación de­ pende del factor fertilidad (F) que está presente en la bacteria donan­ te y ausente en la bacteria receptora. Las bacterias que contienen F se conocen como bacterias F^ y las que carecen de F son las bacte­ rias F“.

206 Capítulo 8

E xp erim en to P r e g u n ía : ¿cóm o se produce el intercam bio genético observado en e! experim ento de Lederberg y Tatum ?

Métodos

Cepa A

Cepa B a u x ó tro fa

a u x ó tro fa F lu jo

d e a ire

Cepa A

'C e p a B

i Cuando se separaron dos ; cepas auxótrotas mediante un filtro que permitió la í mezcla del medio pero no ' de las bacterias...

. no se produjeron ■bacterias protótrofas.

f Resultados

M e d io

M e d io

M e d io

M e d io

m ín im o

m ín im o

m ín im o

m ín im o

No hay

No hay

No hay c r e c im ie n t o

c r e c im ie n t o c r e c im ie n t o

No

hay

c r e c im ie n t o

C o n c iu s ió n ; el intercambio genético requiere que haya contacto directo entre las células bacterianas.

Fig. 8-1 1. Experimento del tubo en forma de U de Davis.

El factor F contiene un origen de replicación y cierto número de genes requeridos para la conjugación (véase fig, 8-8), Por ejemplo, algunos de estos genes codifican los pili sexuales (pilus, en singular), que son prolongaciones delgadas de la membrana celular. Toda célula c[ue contiene el factor F produce los pili se­ xuales, que hacen contacto con un receptor de una bacteria (fig. 8-12) y une las dos células. Entonces, el DNA se transfiere desde la célula F+ a la célula F“. La conjugación sólo se produce entre una célula que posee el factor F y una bacteria que carece de él. En la mayoría de los casos los únicos genes que se transfieren entre las bacterias F+ y F“ durante la conjugación son los que se encuentran en el factor F (fig. 8-13 a y b). La transferencia se ini­ cia cuando una de las cadenas del DNA del factor F forma una muesca en el sitio de origen (oriT). Un extremo del DNA roto se separa del círculo y pasa a la bacteria receptora (fig. 8-13c). La replicación se produce en la cadena rota, alrededor del plásmido circular y en reemplazo de la cadena transferida (fig. 8-13d). Da­ do que el plásmido de la célula F^ siempre se rompe en el sitio oriT, este sitio siempre ingresa en la bacteria receptora en primer lugar, seguido por el resto del plásmido. Así, la transferencia de material genético tiene una dirección definida. Una vez dentro de la bacteria receptora la cadena simple se replica y produce una copia del plásmido F circular y bicatenario (fig. 8-13e). Si el fac­ tor F completo se transfiere a la célula receptora F“, está célula se transforma en una célula F+. Células H fr . La conjugación transfiere el material genético del plásmido F desde una bacteria F+ a una bacteria pero no de­ termina la transferencia de los genes cromosómicos observada por Lederberg y Tatum. En las cepas Hfr (alta frecuencia) el fac­ tor F está integrado al cromosoma bacteriano (fig. 8-14). Las cé­ lulas Hfr se comportan como células F+, forman pili sexuales y se conjugan con las células F^. En la conjugación entre células Hfr y F“ (fig. 8-15a), el factor F integrado se rompe y el extremo de la cadena rota se mueve ha­ cia la bacteria F" (fig. 8-15b), como lo hace en la conjugación en­ tre las células F"^ y F“. En las células Hfr, el factor F se une al cro­ mosoma bacteriano, de modo que el cromosoma lo sigue hasta la célula receptora. La cantidad de cromosoma bacteriano que se transfiere depende del tiempo en el que ambas células permane­ cen en la conjugación. Una vez dentro de la célula receptora la cadena del DNA do­ nante se replica (fig. 8-15c) y puede producirse un entrecruzamiento entre la cadena y el cromosoma original de la célula F“ (fig. 8-15d). Esta transferencia génica entre células Hfr y F ' re­ presenta el modo en que se produjeron las células protótrofas recombinantes observadas por Lederberg y Tatum. Después de pro­ ducido el entrecruzamiento en la célula receptora el cromosoma donado se degrada y el cromosoma receptor recombinante per­ manece (fig. 8-15e) para replicarse y pasar a las generaciones si­ guientes por fisión binaria. En el apareamiento de Hfr x F" la célula F~ casi nunca se con­ vierte en F+ o Hfr porque el factor F se rompe en la mitad duran­ te el comienzo de la transferencia de la cadena, dejando una par­ te de F al comienzo y otra parte al final de la cadena que va a transferirse. Para convertirse en F+ o Hfr la célula receptora debe

Fig. 8-1 2. Un pilus sexual conecta las células F+ y F“ du­ rante la conjugación bacteriana. C é lu la s de E. coli e n c o n ju g a ­ c ió n . (Dr. Dennis Kunlaltera su función productora de pigmento.

f í l Las células resultantes tienen po C f y son incoloras.

Grano jaspeado

e n Cuando el Ds se transpone ; abandona el alelo C, que ipera su función.

' Conclusión; los g r a n o s

FB I i I

d e m a íz jaspeados s o n resultado del c o r t e d e los elementos Ds de ios g e n e s q u e controlan la producción de pigm ento durante el desarrollo.

Fi g.

Una célula en la que se transpuso el Ds i fuera del alelo C producirá pigmento, i lo que determinará el desarrollo de | manchas de color en un grano incoloro.I I | í

1 1 - 2 7 . La transposición da como resultado granos de maíz jaspeados.

extremo y dentro de cada repetición directa hay repeticiones ter­ minales invertidas. Cuando el elemento copia se transpone pro­ duce repeticiones directas flanqueantes de 5 pb de longitud en el sitio de su inserción. Al igual que los elementos Ty, el elemento copia contiene secuencias similares a las halladas en los genes gag y pol de los retrovirus (véase fig. 8-37). La cantidad de ele­ mentos copia en el genoma típico de la mosca de la fruta oscila entre 2 0 y 60. Otra familia de elementos transponibles descubierta en Drosophila corresponde a los elementos P. La mayoría de los ele­ mentos P funcionales miden alrededor de 2 900 pb de longitud,

aunque también hay elementos P más cortos con delaciones. To­ dos los elementos P poseen repeticiones terminales invertidas que miden 31 pb de longitud y producen repeticiones directas flanqueantes de 8 pb en el sitio en el que se insertan. Al igual que los elementos transponibles presentes en las bacterias los elemen­ tos P son transposones de DNA que se movilizan en forma de DNA. Todos los elementos codifican tanto una transposasa como un represor de la transposición. La función de este represor en el control de la transposición se demuestra en forma concluyente a través de la disgenesia híbri­ da, que es la aparición súbita de numerosas mutaciones, de abe-

Elem ento copia (< 5 000 pb) __________________ A __________________

V_____ ______ y Y

Repetición directa flanqueante

Repetición terminal larga (276 pb)

^-----V-----^-- \ Repetición Repetición term inal directa larga (276 pb) flanqueante

Fig. 1 1-28. El elemento copia es un elem ento transponible de DrosophUa.

310 Capítulo 11 rraciones cromosómicas y de esterilidad en la descendencia de un cruce entre una mosca macho (con elementos P) y una mosca hembra P' (sin elementos P). El cruce recíproco entre una mosca hembra P'^ y una mosca macho P- produce una descendencia nor­ mal. La disgenesia híbrida proviene de un estallido de transposiciones que se desencadena cuando se introducen elementos P en una célu­ la que no los poseía con anterioridad. Una célula que contiene ele­ mentos P produce un represor citoplasmático que inhibe la transpo­ sición. Cuando una mosca hembra P* produce óvulos la proteína re­ presora se incorpora al citoplasma del óvulo y esto impide el desa­ rrollo de transposiciones en el embrión y, por ende, la aparición de mutaciones. La descendencia resultante es fértil durante su adultez (fig. ll-29a). En cambio, una mosca hembra P' no produce el re­ presor y no almacena este compuesto en el citoplasma de sus óvu­ los. Cuando se produce la fertihzación de los óvulos con esperma­ tozoides pertenecientes a moscas macho P'*' la ausencia de represión permite que los elementos P aportados por los espermatozoides de­

(b) Disgenesia híbrida

(a) Sin disgenesia híbrida | | | Cruza de un macho Generación P

Y

i con una hembra P*\

i

sarrollen una transposición rápida en el embrión y detenriinen la producción de disgenesia híbrida (fig. ll-29b). Los elementos P parecen haber invadido a D. melanogaster du­ rante los últimos 50 años. En la actualidad casi todos los indivi­ duos pertenecientes a la especie D. melanogaster en estado sal­ vaje poseen elementos P, pero estos elementos transponibles son infrecuentes en las colonias de moscas de laboratorio estableci­ das hace más de 30 años. En realidad, ninguna cepa de D. mela­ nogaster obtenida antes de 1945 poseía estos elementos, lo que sugiere que los elementos P habrían invadido a D. melanogaster en una etapa reciente y se habrían diseminado con rapidez a tra­ vés de la especie. Como en la mayoría de los depósitos de los laboratorios no hay elementos P, éstos han sido utilizados experimentalmente como vectores con el fin de introducir DNA modificado o extraño en el genoma de Drosophila. Los elementos P han sido objeto de una extensa manipulación y se los ha transformado mediante ingenie­ ría genética para utilizarlos en diversas formas.

-----------------Generación P

X

X

' C

^

* B Producción de gametosj

'i'

11'

a¡-

' 1

\"

] i 1 1

’

......................... No hay represor 1 en el citoplasma del óvulo.

Elemento Cromosomas maternos con elementos P

F e r tiliz a c

___ I

Los cromosomas paternos poseen elementos P

Los cromosomas maternos no poseen elementos P

J

L

i De esta manera, | no se produce | disgenesia híbrida! V el desarrollo es í normal,.., |

Cigoto

t Generación F,

B

Producción de gametos!

Represores__

Cromosomas paternos sin elementos P

L

Un represor en el i citoplasma del óvulo i inhibe la transposición de los elementos P.

O Cruza de un macho i P ' con una hembra P

El De esta manera, los elementos

Mosca fértil a

P e n los cromosomas paternos sufren un estallido de transposición -disgenesia híbrida-...

■lo que produce i una progenie fértil.

Generación F

Mosca estéril Q ..que da como resultado I mutaciones, aberraciones I cromosómicas y una I progenie estéril.

Fig. 1 1-29. La disgenesia híbrida en D r o s o p h ila se debe a la transposición de los elementos P.

Conclusión: solo la cruza entre un macho y una! hembra P~ provoca disgenesia híbrida porque el i espermatozoide no aporta represores. •|

l

Estructura de Los cromosomas y elementos transponibLes 3 Si los.elementos P representan un agregado reciente en el genoma de D. melanogaster, ¿de dónde provienen? Una fuente pro­ bable es Drosophila willistoni, otra especie de mosca de la fruta. Drgsophila willistoni parece tener elementos P largos que son ca­ si idénticos a los hallados actualmente en D. melanogaster. Las investigadoras Marilyn Houck y Margaret Kidwell propusieron que los elementos P habrían saltado de D. willistoni a D. melano­ gaster a través de un ácaro. Todas las moscas de la fruta sson infectadas por una variedad de ácaros. Una especie de ácaro, Proctolaelaps regalis, infesta tanto a D. willistoni como a D. melanogaster. Este ácaro tiene piezas bucales en forma de agujas que le permiten perforar los huevos y alimentarse de ellos y de las larvas de las moscas. Houck y Kidwell sugirieron que mientras se alimenta de D. willistoní el ácaro adquiere DNA de la mosca de la fruta con ele­ mentos P que luego inyecta en una D. melanogaster en vías de desarrollo. Esta hipótesis es respaldada por el hallazgo de que los ácaros adquieren DNA de elementos P de moscas de la fruta P^.

El genoma humano contiene evidencias de varias clases de ele­ mentos transponibles que se mueven en forma de DNA a través del mecanismo de corte y pegado. No obstante, todos estos ele­ mentos parecen haber permanecido inactivos durante alrededor de 50 millones de años; las secuencias no funcionales que perdu­ ran se denominan fósiles de DNA.

Elementos transponibles en los seres humanos. Casi el 50% del genoma humano está compuesto por secuencias derivadas de elementos transponibles, aunque hoy la mayor parte de estos ele­ mentos son inactivos y ya no pueden transponerse. Uno de los elementos transponibles más comunes en el genoma humano es Alu, que recibe ese nombre por una enzima de restricción {AluY} encargada de dividir el elemento en dos partes. Todas las células humanas contienen más de 1 millón de copias de Alu relaciona­ das pero no idénticas en sus cromosomas. A diferencia de los retrotransposones descritos con anterioridad (elementos Ty en la le­ vadura y elementos copia en Drosophila), las secuencias Alu no son similares a los retrovirus; no tienen genes semejantes a gag y pol y en consecuencia, no son autónomas. En cambio, las secuen­ cias Alu son similares al gen que codifica la molécula de RNA 7S que transporta las proteínas recién sintetizadas a través del retícu­ lo endoplasmático. Las secuencias Alu producen repeticiones di­ rectas flanqueantes cortas cuando se insertan en el DNA y tienen características que sugieren que se habrían transpuesto a través de un RNA intermediario. La secuencia Alu pertenece a una clase de secuencias repetiti­ vas halladas con frecuencia en genomas de mamíferos y en algu­ nos otros genomas. Estas secuencias se denominan en forma co­ lectiva SINE, por lo general tienen entre 200 y 400 pb de longi­ tud y representan en total alrededor del 1 1 % del genoma huma­ no. La mayor parte de las SINE están acortadas en el extremo 5’, lo que probablemente se deba a que el proceso de transcripción inversa utilizado durante la transposición terminó antes de que se copiara la secuencia completa. Se ha determinado que las SINE producen las mutaciones observadas en más de 2 0 casos de en­ fermedades genéticas humanas. El genoma humano también tiene muchas LINE, que en cierta medida poseen una estructura similar a la de los retrovirus, pero no tan similar como la de los elementos Ty o copia. Al igual que las SINE, la mayor parte de las LINE presentes en el genoma hu­ mano están truncadas en el extremo 5 ’. Las LINE completas sue­ len tener alrededor de 6 0 0 0 pb pero como la mayoría de las co­ pias están acortadas la LINE promedio tiene solo alrededor de 900 pb. El DNA humano contiene tres familias de LINE princi­ pales con secuencias diferentes. Hay aproximadamente 900 000 copias de LINE en el genoma humano, que en conjunto represen­ tan el 21% del DNA humano total. Una de cada 600 mutaciones que producen enfermedades significativas en los seres humanos se producen debido a la transposición de una LINE o una SINE.

________INTEGRACION DE CONCEPTOS

CONCEPTOS CLAVE Hay una gran variedad de elementos transponibles en los eucariontes. Algunos se asemejan a los elementos transpo­ nibles de los procariontes, con repeticiones terminales in­ vertidas y transposición en forma de DNA. Otros son retrotransposones con repeticiones directas largas en sus extre­ mos y transposición a través de un RNA intermediario.

Clases de elementos transponibles Después de haber descrito el proceso de transposición revisa­ remos las principales clases de elementos transponibles .(cuadro 11-6).

Los elementos transponibles se pueden dividir en dos clases principales de acuerdo con su estructura y su movimiento. La pri­ mera clase corresponde a los transposones de DNA que poseen repeticiones terminales invertidas y se mueven en forma de DNA. Todos estos elementos producen repeticiones directas flanqueantes en los sitios en los que se insertan. Todas las formas activas de es­ tos elementos transponibles codifican una transposasa necesaria para su movimiento. Además, algunos elementos codifican una resolvasa, represores y otras proteínas. Su transposición puede ser replieativa o no replicativa pero nunca utilizan RNA intermediario. Son ejemplos de elementos transponibles de esta clase las IS y to­ dos los transposones complejos presentes en las bacterias, los ele­ mentos Ac y Ds del maíz y los elementos P de Drosophila. La segunda clase de elementos transponibles corresponde a los retrotransposones, que se transponen por intermedio de RNA. Es­ tos elementos producen repeticiones directas flanqueantes donde se insertan cuando se transponen transformados en DNA. Los re­ trotransposones no codifican transposasas pero algunos tienen una estructura similar a la de los retrovirus y son portadores de secuencias que producen transcriptasa inversa. La transposición se desarrolla cuando la transcripción produce un RNA interme­ diario, que luego se transcribe en DNA gracias a la acción de la transcriptasa inversa y se inserta en el sitio elegido. Son ejemplos de retrotransposones los elementos Ty de la levadura, los elemen­ tos copia de Drosophila y las secuencias Alu de los seres huma­ nos. Los retrotransposones no aparecen en los procariontes.

Evolución de los elementos transponibles Como se mencionó con anterioridad, los elementos transponi­ bles pueden hallarse en todos los organismos, con frecuencia en forma abundante. ¿Por qué son tan frecuentes? Se han propuesto tres hipótesis principales para explicar esta aparición universal. ■ La hipótesis de la función celular postula que los elementos transponibles cumplen una función beneficiosa dentro de la célu-

312 Capítulo 11

Características de las dos clases principales de elementos genéticos transponibles Elem ento genético tra n sp o n ib le Clase

Clase II (retrotransposón)

E stru c tu ra

Genes codificados

Transposición

Eje m p los

Repeticiones invertid as

Gen de la transposasa

Por un DN A ¡nterme-

IS Í (E. coíl)

terminales cortas; repeti­ ciones directas flan­ queantes cortas en el si­ tio donde se inserta el elemento

(y en ocasiones otros)

diario (replicativo o no replicativo)

Tn3 (E. coli) Ac, Ds (m aíz) Elementos P (D rosophU a)

Repeticiones directas terminales largas; repeti­ ciones directas flan­ queantes cortas en el si­ tio donde se inserta el elemento

Gen de la transcriptasa inversa (y en ocasio­ nes otros)

Por un RNA interme­ diario

la, como por ejemplo el control de la expresión de los genes o la regulación del desarrollo. Aunque la inserción de un elemento transponible puede alterar la expresión de los genes, hay pocos datos que indiquen que la transposición cumple un papel habitual en algunos de estos procesos celulares o en algún otro proceso. La hipótesis de la variación genética propone que los elemen­ tos transponibles se mantienen gracias a su actividad mutagénica y sugiere que cierto grado de variación genética es útil porque permite que las especies se adapten a los cambios ambientales. Aunque algunas mutaciones causadas por los elementos transpo­ nibles podrían permitir que las especies adquirieran rasgos bene­ ficiosos, la mayor parte de las mutaciones producidas por trans­ posiciones al azar ejercen efectos deletéreos. En consecuencia, aunque las mutaciones producidas por los elementos transponi­ bles podrían ser útiles en el futuro, su efecto inmediato suele ser nocivo y será rechazado. El hecho de que muchos organismos ha­ yan desarrollado mecanismos para regular la transposición sugie­ re la existencia de una presión selectiva para limitar su extensión. De hecho, si su único efecto fuera la generación de mutaciones cabría esperar que los elementos transponibles desaparecieran con el paso del tiempo. La hipótesis del DNA “egoísta” sostiene que los eleríientos transponibles no cumplen función alguna en la célula y que solo existen porque son capaces de replicarse y de diseminarse. Se puede considerar que estos elementos son parásitos “egoístas” del DNA que no aportan beneficios a la célula y que incluso en cierta medida pueden ser nocivos. Su capacidad de reproducirse y de diseminarse es lo que los hace tan comunes. No se sabe cuál de estas hipótesis es la explicación correcta de la existencia de los elementos transponibles, si es que alguna lo es. Son hipótesis que no se excluyen unas a otras y que podrían contribuir al desarrollo de los genes móviles. Más allá de las fuer­ zas evolutivas responsables de su existencia, los elementos trans­ ponibles han desempeñado un papel importante en la formación del genoma de muchos organismos. El gran tamaño de muchos genomas eucariontes es sobre todo el resultado de la abundancia de los elementos transponibles, en particular de los retrotransposones. Como se mencionó con anterioridad, alrededor del 50% de todas las mutaciones presentes en DrosophUa se deben a transpo­

Ty (levadura)

copia (DrosophUa) A lu (seres humanos)

siciones. La recombinación homóloga entre copias de elementos transponibles representa un determinante importante de la pro­ ducción de duplicaciones de genes y de otros reordenamieirtos cromosómicos. Además, algunos elementos transponibles po­ drían transportar DNA adicional con ellos al trasladarse a un si­ tio nuevo, lo que les permitiría movilizar secuencias de DNA que regulan los genes presentes en estas localizaciones y de esta ma­ nera alterar su expresión. En ciertos casos las células huésped adoptan los elementos transponibles con propósitos beneficiosos para ellas. Un ejemplo de esta clase es el mecanismo que produce la diversidad de anti­ cuerpos en el sistema inmunitario de los vertebrados. Como se comentará en el capítulo 2 1 , la capacidad del sistema inmunita­ rio para reconocer y atacar sustancias extrañas (antígenos) depen­ de de un mecanismo linfocítico que empalma varios segmentos de DNA con información para producir proteínas que reconocen antígenos. Hay tres segmentos de DNA, denominados V, D y J, que pueden adquirir muchas formas dentro de las-'células. Para el desarrollo de un linfocito los segmentos V, D y J se unen al azar para producir una proteína que reconoce un antígeno específico. Dentro de los diferentes linfocitos se pueden observar secuencias de unión distintas entre los segmentos V, D y J. La variedad d e, combinaciones determina la aparición de muchas formas y cada una reconoce un antígeno específico. El análisis meticuloso del proceso que permite la unión de V, D y J revela que su mecanis­ mo es el mismo que se utiliza para la transposición. Los genes -denominados RAGl y RAG2 - que participan en la unión de V, D y J podrían haber sido elementos transponibles que se inserta­ ron en la línea germinal de un antecesor vertebrado hace alrede­ dor de 450 millones de años. Otra función celular que podría haberse originado como resul­ tado de un elemento transponible es el proceso que mantiene los extremos de los cromosomas en los organismos eucariontes. Co­ mo se mencionó en una sección anterior de este capítulo, las DNA polimerasas son incapaces de replicar los extremos de los cromosomas. En las células germinales y en los organismos eu­ cariontes unicelulares la longitud del cromosoma se mantiene gracias a la acción de la telomerasa, una enzima que extiende los extremos del cromosoma por medio de la copia de secuencias re­

Estructura de Los cromosomas y elementos transponibLes 3 petidas de DNA a partir de un molde de RNA que forma parte de la enzima telomerasa. El mecanismo empleado por esta enzima es similar al proceso de transcripción inversa usado para la retrotransposición y la telomerasa está relacionada desde el punto de vista evolutivo con las transcriptasas inversas codificadas por ciertos retrotransposones. Estos hallazgos sugieren que un retrotransposón habría invadi­ do una célula eucarionte ancestral para darle la capacidad de co­ piar los extremos de los cromosomas y luego evolucionar hasta convertirse en un gen que codifica la enzima telomerasa moder­ na, Drosophila carece de la enzima telomerasa; los retrotranspo­ sones parecen haber reasumido el papel del mantenimiento de los telómeros en este organismo.

RELACION DE CONCEPTOS ENTRE CAPÍTULOS El material presentado en este capítulo se relaciona en forma importante con algunos temas ya comentados y con otros que se analizarán en capítulos posteriores. En el capítulo 2 se presentó la estructura macroscópica de los cromosomas y su comporta­ miento durante la mitosis y la meiosis. Este capítulo se basó en esa presentación al examinar los detalles moleculares de la es­ tructura de los cromosomas y el nivel superior de plegamiento y empaquetamiento del DNA que permite que estas moléculas tan grandes mantengan sus funciones y a la vez se adapten a un es­ pacio limitado dentro de la célula. La solución de este problema de almacenamiento y los elementos esenciales de los cromoso­ mas eucariontes fueron los temas principales de este capítulo, que completó la explicación de la estructura del DNA iniciada en el capítulo 1 0 . Los elementos genéticos transponibles y las secuencias de DNA que transportan forman parte de la estructura de los cromo­ somas. En capítulos anteriores se analizó el tema del entrecruzamiento, en el cual secuencias de DNA homólogo intercambian sus lugares, y se explicaron los reordenamientos cromosómicos, que consisten en la ruptura y la reasociación de segmentos cro­ mosómicos con el movimiento de bloques de genes hacia nuevas

ubicaciones. El traslado de los elementos transponibles es muy diferente de otros mecanismos que permiten el movimiento de los genes porque los elementos transponibles poseen secuencias que facilitan este traslado. Para comprender la estructura de estos elementos genéticos transponibles se deben conocer los funda­ mentos de la estructura y la secuencia del DNA, temas que se co­ mentaron en el capítulo 1 0 . Los elementos transponibles violan una premisa básica de la genética clásica -que los genes tienen una ubicación fija especí­ fica en un cromosoma-. Esta idea diferente del concepto mante­ nido durante tantos años explica por qué el descubrimiento de los elementos transponibles realizado por Barbara McClintock fue ignorado durante muchos años. Una característica común de la historia de la genética es que los descubrimientos fundamentales suelan pasarse por alto o no se reconozcan porque requieren un replanteamiento radical de los principios básicos. En la actuali­ dad los elementos transponibles se consideran secuencias de DNA ubicuas con implicancias importantes para la medicina, la tecnología de DNA recombinante y la evolución, pero la razón de su amplia diseminación todavía no se comprende por completo. En este capítulo se han revisado los fundamentos de los te­ mas que se presentarán en varios capítulos posteriores del li­ bro. La transposición requiere la replicación del DNA (cap. 12) o la transcripción inversa (cap. 14) y produce mutaciones en los genes (cap. 17). En el capítulo 16 analizaremos el, control de la expresión de los genes, que requiere cambios en la estruc­ tura de la cromatina. La estructura condensada de la cromatina tiende a inhibir la transcripción de la información genética; se sabe que algunas de las proteínas que participan en la activa­ ción y la represión de la transcripción afectan la unión del DNA a las histonas. La regulación de la transposición se reali­ za a través de algunos de los mecanismos que controlan la ex­ presión de otros genes y también se comentará en el capítulo 16. Otros temas que se comentarán con mayor detalle en los próximos capítulos son los orígenes de replicación (cap. 1 2 ) y la aplicación de las secuencias repetitivas al fmgerprinting (huella o impronta) del DNA (cap. 18). Los elementos transpo­ nibles son importantes para la producción de la diversidad del sistema inmunitario (cap. 2 1 ) y para la evolución molecular (cap. 23).

RESUMEN » Los cromosomas contienen moléculas de DNA muy largas que están empaquetadas en forma densa. Este empaqueta­ miento se logra gracias al desarrollo de estructuras terciarias y de la unión del DNA a proteínas. » El superenrollamiento es resultado de la tensión generada cuando se agregan o quitan giros a una molécula de DNA re­ lajada. La rotación excesiva produce el superenrollamiento positivo y la subrotación produce el superenrollamiento nega­ tivo. ®Las topoisomerasas controlan el grado de superenrollamiento por medio del agregado o la eliminación de giros en el DNA. • Un cromosoma bacteriano está compuesto por una sola molé­ cula de DNA circular que está unida a proteínas y presenta una serie de bucles amplios. Por lo general se observa en la

célula como una acumulación definida conocida como nu­ cleoide. • Todos los cromosomas eucariontes contienen una sola molé­ cula de DNA lineal muy larga que está unida a proteínas cromosómicas histonas y no histonas. La eucromatina está sujeta al ciclo normal de descondensación y condensación que for­ ma parte del ciclo celular. La heteroeromatina permanece muy condensada durante todo el ciclo celular. • El nucleosoma es una partícula central compuesta por ocho histonas (dos H2A, dos H2B, dos H3 y dos H4) y DNA (145147 pb) que rota alrededor de la partícula central. L a proteína H1 mantiene el DNA sobre el núcleo de histonas. « Los nucleosomas se pliegan en fibras de 30 nm que forman una serie de bucles de 300 nm de longitud; estos bucles se fi­

314 CapitüLo 11 jan en sus bases a través de proteínas asociadas con el ensam­ blaje nuclear. Los bucles de 300 nm se condensan para for­ mar una fibra de 250 nm de diámetro que se enrolla sobre sí misma en forma densa hasta producir una cromátida de 700 nm de espesor. • Los puffs cromosómicos son regiones localizadas en las que el DNA no está empaquetado que se asocian con la activa­ ción de la transcripción. Las regiones de los cromosomas que desarrollan este proceso son sensibles a la digestión por DNasa I, lo que indica que el DNA se desenrolla durante la transcripción. • Los centrómeros son regiones estructurales donde se unen las fibras del huso; los cromosomas sin centrómeros suelen per­ derse durante la división celular. Los centrómeros desempe­ ñan un papel importante en la regulación del ciclo celular. » Los telómeros estabilizan los extremos de los cromosomas. Las secuencias teloméricas están compuestas por muchas copias de secuencias cortas, que por lo general consisten en una serie de nucleótidos de citosina seguida por varios nueleótidos de adenina. Las secuencias asociadas con los telómeros, que son más largas, son contiguas a las secuencias teloméricas. • El valor C es la cantidad de DNA presente en el genoma de un organismo, s El DNA de los eucariontes presenta tres clases de secuencias. Las secuencias de DNA únicas muestran muy pocas copias. El DNA moderadamente repetitivo consiste en secuencias de longitud intermedia que se repiten entre cientos y miles de veces. El DNA altamente repetitivo representa secuencias muy cortas que se repiten una tras otra entre varios miles y millones de veces. • Los elementos transponibles son secuencias de DNA móviles que se insertan en muchas localizaciones dentro de un geno­ ma y con frecuencia producen mutaciones y reordenamientos del DNA, • La mayor parte de los elementos transponibles tienen dos ca­ racterísticas en comtín: repeticiones terminales invertidas y la producción de repeticiones directas cortas que se desarrollan en el sitio donde se inserta el elemento en el DNA.

La transposición puede producirse a través de una molécula de DNA o a través de la producción de una molécula de RNA que luego sufre una transcripción inversa para formar DNA. La transposición puede ser rephcativa, en la que se produce la copia del elemento transponible y su movimiento hacia un sitio nuevo, o no replicativa, en la que el elemento transponi­ ble se separa del sitio original y se traslada a uno nuevo. Los retrotransposones se trasladan a través de moléculas de RNA que sufren una transcripción inversa para convertirse en DNA. En muchos elementos transponibles la transposición está suje­ ta a un control estricto. Las IS son elementos transponibles bacterianos pequeños que solo poseen la información necesaria para su propio movi­ miento. Los transposones compuestos presentes en las bacte­ rias son elementos más complejos que poseen un fragmento de DNA interpuesto entre dos IS. Algunos elementos transpo­ nibles complejos presentes en las bacterias no contienen IS. Los transposones de DNA de las células eucariontes son simi­ lares a los hallados en las bacterias, porque finalizan con re­ peticiones invertidas cortas y producen repeticiones directas flanqueantes en el sitio en el que se insertan. Otros elementos transponibles de los eucariontes son los retrotransposones, que tienen una estructura similar a la de los retrovirus y de­ penden de RNA intermediarios para su transposición. La disgenesia híbrida es la aparición de numerosas mutacio­ nes, reordenamientos cromosómicos y esterilidad cuando los elementos transponibles P sufren un estallido de transposicio­ nes en Drosophila. El significado evolutivo de los elementos transponibles se desconoce pero se han propuesto tres hipótesis para explicar su aparición tan frecuente. La hipótesis de la función celular sugiere que los elementos transponibles desempeñarían algu­ na función importante en la célula, la hipótesis de la varia­ ción genética propone que los elementos trarfsponibles apor­ tan flexibilidad evolutiva al inducir mutaciones y la hipótesis del DNA “egoísta” sostiene que los elementos transponibles no benefician a la célula sino que son tan frecuentes porque pueden replicarse y diseminarse.

TERMINOS IMPORTANTES

elemento transponible (p. 288) superenrollamiento (p. 289) estado relajado del DNA (p. 289) superenrollamiento positivo (p, 289) superenrollamiento negativo (p. 289) topoisomerasa (p. 289) nucleoide (p, 290) eucromatina (p. 291)

heterocromatina (p. 291) proteína cromosómica no histona (p. 291) proteína de ensamblaje del cromosoma (p. 291) grupo de proteínas de alta movilidad (p. 291) nucleosoma (p. 292) cromatosoma (p. 292) DNA de unión (p. 293) cromosoma politénico (p. 294)

puff cromosómico (p. 294) secuencia centromérica (p. 295) secuencia telomérica (p. 297) secuencia asociada con el telómero (p. 298) valor C (p, 298) desnaturalización (derreti­ miento) (p, 298) temperatura de desnaturaliza­ ción ( r j (p. 299)

renaturalización (rehibridación o reapareamiento) (p. 299) hibridación (p. 299) secuencia de DNA única (p. 299) familia génica (p, 299) DNA repetitivo (p, 299) DNA moderadamente repetiti­ vo (p. 299) secuencia repetida en tándem (p.299)

I

Estructura de los cromosomas y elementos transpom'bles 31 secuencia 'repetida y dispersa (p. 299) secuencias nucleares cortas y dispersas (SINE, short interspersed element) (p. 299) elemento largo disperso (LINE, long interspersed element) (p. 299)

DNA altamente repetitivo (p. 299) repetición directa flanqueante (p. 300) repetición terminal invertida (p. 300) transposición (p. 301) transposón de DNA (p. 301)

retrotransposón (p. 301) transposición replicativa (p .3 0 1 )^ transposición no replicativa (p. 301) estructura de cointegración (p. 301) transposasa (p. 301)

resolvasa (p. 302) secuencia de inserción (IS) (p. 305) transposón compuesto (p. 305) secuencia delta (p. 306) disgenesia híbrida (p. 309)

Problemas 1. Una célula vegetal diploide contiene 2 mil millones de pares de bases de DNA. a. ¿Cuántos nucleosomas tiene la célula? b. Nombrar la cantidad de moléculas de cada tipo de proteínas histonas asociadas con el DNA genómico.

®Solución Cada nucleosoma tiene alrededor de 200 pb de DNA: entre 144 y 147 pb de DNA que giran dos veces alrededor del núcleo de histonas, entre 20 y 22 pb de DNA asociados con la proteína H1 y otros 30 a 40 pb de DNA pertenecientes al DNA de unión, a. Para determinar la cantidad de nucleosomas presentes en la cé­ lula debemos dividir la cantidad total de pares de bases de DNA (2 x 1 0 ®pb) por la cantidad de pares de bases presentes en un nu­ cleosoma: 2 X 10® nucleótidos 2

x

1 0

= 1 X 10^ nucleosomas

• Solución La ausencia de intrones y la presencia de una cadena de nu­ cleótidos de timina (que sería complementaria de los nucleótidos de adenina presentes en el RNA) en el extremo 3’ son caracterís­ ticas del RNA procesado. Estas similitudes con el RNA sugieren que el elemento se habría transcripto originalmente a mRNA, ha­ bría sido procesado para eliminar los intrones y agregar la cola de poli(A) y luego habría sufrido una transcripción inversa para transformarse en un DNA complementario que se habría inserta­ do en el cromosoma. 3. ¿Cuáles de los siguientes pares de secuencias podrían hallar­ se en los extremos de una secuencia de inserción? 5’ -TAA G G C C G -3’ a. 5 ’ - T A A G G C C G - 3 ’ y b.

5’ - A A A G G G C T A - 3 ’

y

5’ - A T C G G G A A A -3’

c.

5’ - G A T C C C A G ir -3 ’

y

5 ’ - C T A G G G T C A A -3

d.

5’ - G A T C C A G G T -3’

y

5’ - A C C T G G A T C -3’

e. f.

5’ - A A A A T T T T -3’

y

5’ -TTTTA A A A -3’

5’ - A A A A r iT T -3’

y

5 ’A A A A T T T T - 3 ’

^ nucleótidos por nucleosoma

• Solución En consecuencia, hay alrededor de 10 millones de nucleosomas en la célula. Cada nucleosoma posee dos moléculas de cada histona H2A, H2B, H3 y H4. Por ende, hay 2 x 10^ moléculas de cada histona H2A, H2B, H3 y H4. Cada nucleosoma se asocia con una copia de la histona H l; esto significa que hay 1 x 1 0 ’ moléculas de H l. b.

2. Algunas secuencias repetidas de los eucariontes poseen repe­ ticiones directas cortas adyacentes, lo que sugiere que proven­ drían de elementos transponibles. Estas mismas secuencias care­ cen de intrones y poseen una cadena de nucleótidos de timina en sus extremos 3’. ¿Estos elementos se transpusieron a través de se­ cuencias de DNA o de RNA? Explique su razonamiento.

Las respuestas correctas son d y f. Los extremos de todas las IS tienen repeticiones invertidas, que son secuencias presentes en la misma cadena que están invertidas y son complementarias entre sí. Las secuencias de la opción a son repeticiones directas y se producen en la parte externa de una secuencia de inserción pero no forman parte del elemento transponible propiamente dicho. Las secuencias de la opción b están invertidas pero no son coeqplementarias. Las secuencias de la opción c son complementarias pero no están invertidas. Las secuencias de la opción d. están in­ vertidas y son complementarias. Las secuencias de la opción e son complementarias pero no están invertidas y es interesante se­ ñalar que las secuencias de la opción / son tanto complementos invertidos como repeticiones directas.

PREGUNTAS DE COMPRENSIÓN *1, ¿Cómo se produce el superenrollamiento? ¿Cuál es la di­

ferencia entre superenrollamiento positivo y negativo? 2. ¿Qué funciones cumple el superenrollamiento en la célu­ la? *3. Describa la composición y la estructura del nucleosoma.

¿En qué se diferencian las partículas nucleares de los cromatosomas? 4. Describa los pasos a través los cuales la doble hélice de

DNA, que mide 2 nm de espesor, da origen a un cromo­ soma de 700 nm de espesor.

316 Capítulo 11 5.

*6 . *7. 8 . *9.

10.

*11.

*12.

¿Qué son los cromosomas politénicos y los puffs cromosómicos? Describa la función y la estructura molecular del centrómero. Describa la función y la estructura molecular de un telómero. ¿Qué es el valor C de un organismo? Describa los diferentes tipos de secuencias de DNA que existen en los eucariontes. ¿Cuál es la diferencia entre la eucromatina y la heterocromatina? ¿Qué características generales pueden hallarse en muchos elementos transponibles? Describa las diferencias entre la transposición replicativa y no replicativa. ¿Qué es un retrotransposón y cómo se mueve?

*13. Describa el proceso de transposición replicativa a través de DNA. ¿Qué enzimas requiere? *14. Dibuje y coloque los nombres de las partes de una se­ cuencia de inserción típica. 15. Dibuje y coloque los nombres de las partes de la estructu­ ra de un transposón compuesto bacteriano típico. 16. ¿En qué se parecen y en qué se diferencian los transposo­ nes compuestos y los retrotransposones? 17. Explique la forma en que los elementos Ac y Ds produ­ cen los granos de maíz jaspeados. 18. Explique brevemente la disgenesia híbrida y la forma en que los elementos P desencadenan este proceso. 19. ¿Cuáles son algunas de las diferencias entre las LINE y las SINE? *20. Resuma brevemente las tres hipótesis que explican la existencia diseminada de los elementos transponibles.

PREGUNTAS Y PROBLEMAS DE APLICACIÓN *'21. Compare los cromosomas de las células procariontes con los de las células eucariontes. ¿En qué se parecen y en qué se diferencian? 22. (a) En una célula eucarionte típica, ¿esperaría hallar más moléculas de la H1 o de la H2A? Explique su razona­ miento. (b) ¿Esperaría encontrar más moléculas de H2A o de H3? Explique su razonamiento. 23. Suponga que examinó los cromosomas politénicos de las glándulas salivales de larvas de moscas de la frata y con­ tó la cantidad de puffs cromosómicos en las distintas re­ giones del DNA. a. ¿Esperaría observar más puffs en la eucromatina o en la heterocromatina? Explique su respuesta. b. ¿Esperaría observar más puffs en las secuencias de DNA únicas, en el DNA moderadamente repetitivo o en el DNA altamente repetitivo? ¿Por qué? *'24. Una célula humana diploide contiene alrededor de 6 mil millones de pares de bases de DNA. a. ¿Cuántos nucleosomas hay en esta célula? (Suponga que el DNA de unión posee 40 pb.) b. ¿Cuántas histonas forman complejos con este DNA? *25. ¿Esperaría ver un mayor grado de acetilación en las regio­ nes de DNA sensibles a la digestión por DNasa I o un grado menor? ¿Por qué? 26. Suponga que un químico desarrolla un nuevo fármaco que neutraliza las cargas positivas en las colas de las histonas. ¿Cuál sería el efecto más probable de este nuevo fármaco sobre la estructura de la cromatina? ¿Ejercería este fárma­ co algún efecto sobre la expresión de los genes? Explique sus respuestas. 2 7 . Un YAC que solo contiene DNA altamente repetitivo no esencial se agrega a células de ratón que proliferan en culti­ vo. Las células se dividen en dos grupos, A y B. Luego se usa láser para dañar el centrómero en los YAC de las células del grupo A. Los centrómeros de los YAC del grupo B no se lesionan. A pesar de que los YAC no contienen DNA esen­ cial las células del grupo A se dividen con mayor lentitud que las del grupo B. Mencione una explicación posible.

*28. ¿Cuál de las siguientes dos moléculas de DNA tiene la menor temperatura de desnaturalización? ¿Por qué? AGTTACTAAAGCAATACATC TCAATGATTTCGTTATGTAG AGGCGGGTAGGCACCCTTA TCCGCCCATCCGTGGGAAT 29. ¿Cuáles de los siguientes pares de secuencias podrían ha­ llarse en los extremos de una secuencia de inserción? a.

b. c.

d. e. *'30.

a.

5’ -G G G C CA A TT-3’ 5’ -AAACCCTTT - 3 ’ 5’ -T T T C G A C -3’ 5 ’ -ACGTACG - 3 ’ 5’ -G C C C C A T -3’

y y y y y

5’ -CCCGGTTAA - 3 ’ 5’ -AAAGGGTTT - 3 ’ 5’ -CAGCTTT - 3 ’ 5’ -CGTACGT - 3 ’ 5’ -G C C C A T -3’

Un elemento transponible produce repeticiones directas flanqueantes que miden 4 pb de longitud’. Establezca la secuencia que encontrará a ambos lados del elemento transponible si este elemento se inserta en la posición in­ dicada en cada una de las siguientes secuencias. Elemento^^transponible

5 '-ATTCGAACTGACCG ATCA-;

b.

Elemento transponible

\

5'-ATTCGAACTGACCGATCA-;

*3 1 .

Drosophila melanogaster con ojos blancos es resultado de una mutación recesiva ligada al cromosoma X. En

I

Estructura de los cromosomas y elementos transponibles 3;

32.

*33.

*34.

35.

36.

ocasiones los matantes con ojos blancos originan una progenie que tiene ojos blancos con pequeñas manchas rojas. La cantidad, la distribución y el tamaño de las manchas rojas son variables. Explique la forma en que un elemento transponible podría ser responsable de este fenómeno de aparición de manchas. Se aparean dos cepas diferentes de Drosophüa melanogaster a través de cruces recíprocos. Cuando los machos del grupo A se cruzan con hembras del grupo B la proge­ nie es normal. En cambio, cuando las hembras del grupo A se cruzan con machos del grupo B se producen mu­ chas mutaciones y reordenamientos cromosómicos en los gametos de la progenie Fj y la generación F, es estéril. Explique estos resultados. Una secuencia de inserción contiene una gran deleción en su gen transposasa. ¿En qué circunstancias podría lo­ grar la transposición esta secuencia de inserción? ¿Qué factor cree que determina la longitud de las repeti­ ciones directas flanqueantes producidas durante la trans­ posición? Un elemento transponible codifica a una enzima transpo­ sasa. De acuerdo con esta información, ¿a qué conclusio­ nes puede arribar con respecto a la estructura probable y al método de transposición que utiliza este elemento? La zidovudina (AZT) es un fármaco que se emplea para el tratamiento de los pacientes con SIDA. La AZT blo­ quea la enzima transcriptasa inversa usada por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), que es el agente causante del SIDA. ¿Esperaría que la AZT ejerciera al­ gún efecto sobre los elementos transponibles? Si es así, ¿qué tipo de elementos transponibles se comprometerían y cuál sería el efecto más probable?

37. Un elemento transponible codifica una enzima transcrip­

tasa inversa. De acuerdo con esta información, ¿a qué conclusiones puede arribar con respecto a la estructura probable y al método de transposición que usa .este ele­ mento? \ 38. La transposición suele producir reordenamientos cromósómicos, como por ejemplo deleciones, inversiones y translocaciones. ¿Podría sugerir una razón por la cual la transposición ocasiona estas mutaciones cromosómicas? 39. Un genetista examina una espiga de maíz con la mayoría de los granos de color amarillo pero encuentra algunos granos con manchas de color púrpura, como se ilustra en la figura. Mencione una explicación posiísle de la apari­ ción de las manchas de color púrpura en granos que de lo contrario serían amarillos, que explica sus diferentes tamaños. (Sugerencia: consulte la sección sobre los ele­ mentos Ac y Ds en el maíz en las pp. 306-308.)

'

40. Un genetista que estudiaba el DNA de moscas japonesas

halló muchas copias de una secuencia que parecía'similar al elemento transponible copia de Drosophüa. Por medio de técnicas de DNA recombinante el genetista co­ locó un intrón en una copia de esta secuencia de DNA y lo insertó en el genoma de una mosca japonesa. Si la se­ cuencia es un elemento transponible similar al elemento copia, ¿qué esperaría que ocurriera con la secuencia in­ troducida en los genomas de la progenie proveniente de la mosca original?

PREGUNTAS AVANZADAS 41. Un explorador descubre una nueva especie de planta rara

y envía parte de su tejido a un genetista para que la eva­ lúe. El genetista aísla cromatina de la planta y la exami­ na con el microscopio electrónico, a través del cual ob­ serva una estructura similar a “cuentas sobre una cuer­ da”. Luego agrega una pequeña cantidad de nucleasa, que degrada la “cuerda” en “cuentas” individuales que contienen 280 pb de DNA cada una. Después de la di­ gestión con más nucleasa un fragmento de DNA com­ puesto por 1 2 0 pb queda unido a un núcleo de proteínas histonas. El análisis del núcleo de histonas revela las si­ guientes proporciones: H1 H2A H2B H3 H4 H7 (una histona nueva)

12,5% 25% 25% 0 % 25% 12,5%

De acuerdo con estas observaciones, ¿qué conclusiones po­ dría obtener el genetista acerca de la probable estructura del nucleosoma en la cromatina de esta planta?

42. Aunque el DNA altamente repetitivo es frecuente en los

cromosomas de los eucariontes, no codifica proteínas; en realidad, es probable que nunca se transcriba en RNA. Si el DNA altamente repetitivo no codifica RNA ni proteí­ nas, ¿por qué está presente en los genomas eucariontes? Sugiera algunas razones que expliquen la presencia dise­ minada del DNA altamente repetitivo. 43. Como se comentó en el capítulo, las secuencias Alu son

retrotransposones frecuentes en el genoma humano. Se cree que las secuencias Alu evolucionaron a partir del gen del RNA de 7 S, que codifica una molécula de RNA que participa en el transporte de las proteínas recién sin­ tetizadas a través del retículo endoplasmático. El gen del RNA de 7 S se transcribe gracias a la acción de la RNA polimerasa IH, que utiliza un promotor interno (véase cap. 13). ¿Cómo podría explicar esta observación la gran cantidad de copias de las secuencias Aliú 44. Houck y Kidwell propusieron que los elementos P pasaban

de D. willistoni a D. melanogaster a través de ácaros que se ahmentaban en las moscas de la fi-uta. ¿Qué evidencias cree que serían necesarias para demostrar que D. melanogaster adquirió los elementos P de esta manera? Proponga una se­ rie de experimentos que aporten estas .evidencias.

REPLICACION Y RECOMBINACION DEL DNA

12

• Prevención de los “descarrilam ientos” durante la replicación • Problema principal de la replicación • Replicación sem iconservativa Experimento de Meselson y StahI Modos de replicación Requisitos para la replicación Dirección de la replicación • Mecanismo de replicación Replicación del DNA bacteriano Replicación del DNA eucarionte Replicación en las arqueobacterias • Fundamento molecular de la recombinación Modelos de recombinación Enzimas necesarias para la recombinación

Modelo molecular de la DNA polimerasa ri, una polimerasa que saltea lesio­ nes, o sea que es capaz de establecer cortocircuitos ante distorsiones en la estructura del DNA, aunque a menudo comete errores durante la sin tesis del DNA que producen mutaciones. U- Trincao, R. E. Johnson, C. R. Escalante, S. Prakash, L. Prakash, A. K. AggarwaI, Structure of the Catalytic Core of S. cerevisiae DNA Polymerase Eta; Innplications for Translesion DNA Synthesis Mol. Cell 8, p. 41 7 (2001), Research Collaboratory for Structurai Bioinformatics. PDB H. M. Berman, J, Westbrook, Z. Feng, C. Gilliland, T. N. Bhat, H. Weissig, I. N. Shindyalov, R E, Bourne, The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28, pp. 235-242 (2000). http://www.pdb.org.]

Prevención de los "descarrilamientos durante La replicación avid tuvo una infancia difícil. Ya era bastante malo que su piel clara estuviera toda cubier­ ta de pecas, pero lo que él odiaba de verdad eran las camisas de mangas largas, los pan­ talones largos y el gran sombrero de paja que su madre le obligaba a usar, incluso durante el verano, cuando los demás niños vestían bermudas y camisetas. Sin embargo, cuando David creció comenzó a entender que su madre no había sido irracional porque supo que padecía una enfermedad genética rara denominada xerodermia pigmentosa, caracterizada por una sensibi-

D

RepHcación y recombinadón del DNA 319 lidad aguda-a la luz del sol y predisposición al cáncer de piel desencadenada por la exposición al sol. La xerodermia pigmentosa es una enfermedad autosómica recesiva producida por una deficiencia en uno de los va­ rios genes que participan en la síntesis y en la reparación del DNA. Las DNA polimerasas -las enzimas que sintetizan DNA- son máquinas moleculares hermosas y eficientes. Algunas de estas enzimas operan a una velocidad muy alta y sintetizan DNA a una velocidad superior a 1 000 nucleótidos por segundo, con menos de un error por cada mil millones de nucleótidos. Para lograr esta velo­ cidad y precisión estas DNA polimerasas requieren, si se las comparara con un tren muy veloz, una vía muy regular. Si el molde de DNA está dañado o bloqueado -por ejemplo, por distorsiones de la estructura induci­ das por la luz ultravioleta (UV)- la maquinaria encargada de la replicación se detiene y produce huecos en el DNA con consecuencias desastrosas para la célula. Para superar este problema, las células adquirieron DNA polimerasas especializadas más lentas capaces de saltear estas distorsiones que suelen bloquear a las polimerasas de alta velocidad y de gran fidelidad que son las máquinas de replicación habituales. Sin embai'go, el uso de estas polimerasas especiales “translesionales” tiene un precio: con frecuencia cometen errores en las secciones de DNA que sintetizan. No obstante, la ma­ yor parte de los errores puede corregirse gracias a los mecanismos de reparación del DNA y es poco proba­ ble que los errores ocasionados por las polimerasas que tienen baja fidelidad sean tan nocivos como los hue­ cos en el DNA producidos por la incapacidad de saltear la lesión. La importancia de las polimerasas de baja fidelidad se confirma en los pacientes con xerodermia pigmen­ tosa. Alrededor del 20% de los individuos con esta enfermedad tiene un defecto en el gen POLH que codifi­ ca para la DNA polimerasa T], una de las DNA polimerasas especializadas con capacidad para saltear las dis­ torsiones en el molde de DNA. Una de estas distorsiones se caracteriza por la presencia de uniones entre ba­ ses de timina adyacentes en la misma cadena de DNA; la unión de dos bases de timina se denomina dímero de timina y se produce debido a radiación UV. Como en la luz solar hay radiación UV, la exposición al sol produce la formación de dímeros de timina. En la mayoría de las personas las polimerasas especializadas sal­ tean los dímeros de timina, como la DNA polimerasa r\. La mayoría de los errores producidos por la DNA polimerasa Tj cuando saltea la lesión se reparan más adelante a través de otros mecanismos. No obstante los pacientes con xerodermia pigmentosa tienen un defecto en la DNA polimerasa T] y los dímeros de pirimidina no se saltean de la manera habitual, por lo que se desarrollan numerosas mutaciones que, en definitiva, pueden producir cáncer de piel. La síntesis de DNA es un proceso complejo, fundamental para el funcionamiento y el mantenimiento de la salud de la célula, en el que docenas de proteínas, enzimas y estructuras de DNA participan en el copiado del DNA; un solo componente defectuoso, como la DNA polimerasa T|, puede alterar todo el proceso y producir síntomas patológicos graves. Este capítulo se centra en la replicación del DNA, proceso a través del cual una célula duplica su DNA an­ tes de dividirse. Comenzaremos con el mecanismo básico de replicación basado en la estructura del DNA for­ mulada por Watson y Crick. Luego examinaremos varios modos diferentes de replicación, los requisitos pa­ ra ésta y la dirección universal de la síntesis de DNA. Analizaremos las enzimas y las proteínas que partici­ pan en el proceso y concluiremos el capítulo con la consideración de los detalles moleculares de la recombi­ nación, que se relaciona en forma estrecha con la replicación, y es esencial para la segregación de los cromo­ somas homólogos, la producción de variación genética y la reparación del DNA. información sobre los síntomas y la genética de la xerodermia pigmentosa , , ° — — ----------------> y sobre las DNA polimerasas translesionales .

www.whfreeman.com/pierce

K—

Problema principal de la replicación n un juego escolar un niño le susurra a otro un mensaje, como “el perro marrón de Juan huyó de su casa”, quien corre hacia un segundo niño para repetírselo. Este mensaje se transmite de un niño a otro a través del patio de la escuela hasta que regresa al mensajero original. En forma inevitable el último niño retorna con un mensaje muy diferente, como por ejemplo: “Juan Marrón tiene un cerdo que vive debajo de la entrada de su casa”. Cuanto más niños intervengan en el juego, más distorsionado quedará el mensaje. Este juego ilustra-un principio importante: siempre que se copia un mensaje surgen errores; cuantas más veces se copie, mayor será la cantidad de errores. Un organismo multicelular complejo enfrenta un problema análogo al de los niños en el juego escolar: con qué precisión se transmiten las instrucciones genéticas cada vez que la célula se

E

divide. La respuesta a este interrogante es fundamental para la re­ plicación. Se necesitan una gran cantidad de información genética y un número enorme de divisiones celulares para producir un organismo multicelular adulto; incluso una tasa de error baja durante el copiado sería catastrófica. Un cigoto unicelular humano contiene 6 mil millones de pares de bases (pb) de DNA. Si solo se produjera un error de copiado cada millón de pares de bases se acumularían 6 000 errores cada vez que la célula se divide, errores que se volverían más complejos con las divisiones celulares por millones sucesivas que se producen durante el desarrollo humano. 'No solo el copiado del mensaje debe ser muy preciso sino que además debe desarrollarse a gran velocidad. El cromosoma circular único de E. coli contiene alrededor de 4,6 millones de pares de bases. A una velocidad de más de 1 000 nucleótidos por minuto, la replicación de todo el cromosoma requeriría casi de 3

320 Capítulo 12 días. Sin emlpargo, como se mencionó antes, estas bacterias son capaces de dividirse cada 20 minutos. En realidad, E. coli replica su DNA a una velocidad de 1 000 nucleótidos por segundo con menos de un error cada mil millones de nucleótidos. ¿Cómo se lográ este proceso tan rápido y exacto?

Replkadón semkonservatiVa A partir del descubrimiento de la estructura tridimensional del DNA que propusieron Watson y Crick en 1953 (véase fig. 10-7) de inmediato se evidenciaron varios aspectos genéticos importan­ tes. La naturaleza complementaria de las dos cadenas de nucleó­ tidos en una molécula de DNA sugirió que, durante la replicación, cada cadena podía servir como molde para la síntesis de una cadena nueva. La especificidad del emparejamiento de bases (adenina con timina; citosina con guanina) implica que cada mol­ de solo puede determinar una secuencia de bases y, de esta ma­ nera, que dos moléculas de DNA construidas sobre el par de mol­ des serán idénticas al DNA original. Este proceso se denomina replicación semiconservativa porque cada una de las cadenas de nucleótidos originales permanece intacta (conservada) a pesar de que ya no está combinada en la misma molécula; la molécula de DNA original se semiconserva durante la replicación. En un principio se propusieron tres modelos alternativos para la replicación del DNA. En la replicación conservativa (fig. 12la ) toda la molécula de DNA de doble cadena sirve como molde para una nueva molécula de DNA y la molécula de DNA original se conserva en su totalidad durante la replicación. En la replica­ ción dispersiva, las dos cadenas de nucleótidos se dividen (dis­ persan) en fragmentos, que sirven como moldes para la síntesis de los nuevos fragmentos de DNA, que luego se vuelven a en­ samblar de alguna manera para formar dos moléculas de DNA completas. En este modelo, cada molécula de DNA resultante es­ tá compuesta por fragmentos del DNA nuevo y del anterior; no se conserva ninguna parte de la molécula original. La replicación semiconservativa (fig. 1 2 -lc) es un proceso intermedio entre los

(a) R e p lica ció n c o n s e rv a t iv a

dos modelos anteriores; las dos cadenas de nucleótidos se desen­ rollan y sirven como moldes para formar una molécula de DNA nueva. Estos tres modelos permiten realizar predicciones diferentes en relación con la distribución del DNA original y el DNA recién sintetizado después de la replicación. En la replicación conserva­ tiva, después de un ciclo de replicación, el 50% de las moléculas está compuesto por DNA original y el 50% corresponde a DNA nuevo. Después de un segundo ciclo de replicación, el 25% de las moléculas corresponde a DNA original y el 75% a DNA nuevo. Con cada ciclo adicional de replicación, la proporción de molé­ culas de DNA nuevo aumenta, aunque el número de moléculas de DNA original se mantiene constante. La replicación dispersiva siempre produce un híbrido con algunas moléculas de DNA ori­ ginal y algunas nuevas, pero la proporción de DNA nuevo dentro de las moléculas aumenta con cada evento de replicación. En cambio, en la replicación semiconservativa, un ciclo de replica­ ción produce dos moléculas híbridas, cada una compuesta por un 50% de DNA original y un 50% de DNA nuevo. Después de un segundo ciclo de replicación, la mitad de las moléculas es híbri­ da y la otra mitad solo está compuesta por DNA nuevo. Los ci­ clos adicionales de replicación producen una cantidad creciente de moléculas solo compuestas por DNA nuevo y se caracterizan por la persistencia de unas pocas moléculas híbridas.

Experímentó de Meselson y Stalil Para determinar cuál de los tres modelos de replicación corres­ ponde a las células de E. coli, Matthew Meselson y Franklin Stahl necesitaron distinguir las moléculas de DNA nuevas de las viejas y lo hicieron por medio del uso de dos isótopos de nitrógeno, (la forma común) y '^N (una forma pesada rara). Meselson y Stahl hicieron proliferar E. coli en un medio de cultivo que con­ tenía ^'“’N como única fuente de nitrógeno; después de muchas ge­ neraciones todas las células de E. coli habían incorporado el en las bases de purina y de pirimidina que formaban el DNA

(b) R e p lica ció n d is p e r s iv a

(c) R e p lica ció n s e m ic o n s e rv a t iv a

Fig. 12-1. L o s tr e s m o d e lo s de re p lic a c ió n p ro p u e sto s so n la re p lic a c ió n c o n s e r v a t iv a , la d is p e r s iv a y la s e m ic o n s e rv a t iv a .

J

RepLicadón y recombinación del DNA (véase fig. 10-10). Meselson y Stahl tomaron una muestra de las bacterias, sometieron al resto de las bacterias a un medio que so­ lo contenía y obtuvieron muestras adicionales luego de unas pocas generaciones celulares. En cada muestra el DNA bacteria­ no sintetizado antes del cambio del medio poseía y era rela­ tivamente pesado, mientras que el DNA bacteriano sintetizado después de la modificación estaba compuesto por y era rela­ tivamente liviano. Meselson y Stahl distinguieron el DNA pesado cargado con '•‘’N del DNA liviano cargado con ' ‘‘N por medio de centrifuga­ ción en gradiente de densidad (fig. 12-2). Esta técnica consiste en llenar un tubo de centrifugación con una solución salina pesa­ da y con la sustancia cuya densidad se desea medir -en este ca­ so, fragmentos de DNA. Luego se hace girar el tubo en una cen­ trífuga a velocidad elevada. Después de varios días de girar se de­ sarrolla un gradiente de densidad dentro del tubo con la mayor densidad abajo y la menor densidad arriba. La densidad de los fragmentos de DNA se relaciona con la de la sal; las moléculas livianas suben y las pesadas se hunden. Meselson y Stahl hallaron que el DNA de las bacterias que proliferaban en un medio con '■‘’N exclusivamente producía una sola banda en la posición específica del DNA con '^N (fig. 12-3a). El DNA de las bacterias transferidas al medio con ''^N y sometidas a un ciclo de replicación también producía una sola banda, pero en una posición intermedia entre la del DNA con solo '-“’N y la del DNA con solo '"*N (fig. 12-3b). Este resultado no es compatible con el modelo de replicación conservativa, que predice la existen­ cia de una banda pesada (las moléculas de DNA originales) y una banda liviana (las moléculas de DNA nuevas). Tanto el modelo semiconservativo como el dispersivo predicen la aparición de una sola banda de densidad intermedia. Para distinguir entre los dos modelos, Meselson y Stahl hicie­ ron proliferar las bacterias en un medio con '"*N para obtener una segunda generación. Después del segundo ciclo de replicación en el medio con '"^N, aparecieron dos bandas con la misma intensi­ dad, una en posición intermedia y la otra en la posición del DNA que solo contiene '"^N (fig. 12-3c). Todas las muestras obtenidas en los ciclos de replicación siguientes produjeron dos bandas y la banda que representaba al DNA liviano se tornó cada vez más in­ tensa (fig. 12-3d). Los resultados de Meselson y Stahl se relacio­ naron con la replicación semiconservativa y no son compatibles con los de las replicaciones conservativa y dispersiva.

CONCEPTOS CLAVE La replicación es sem iconservativa: cada cadena de DNA sirve como molde para la síntesis de una molécula de DNA nueva. Meselson y Stahl demostraron de manera concluyente que la replicación en E. col i es sem iconserva­ tiva.

Modos de replicación Los investigadores, continuando con el trabajo de Meselson y Stahl, confirmaron que otros organismos también empleaban la replicación semiconservativa. No se hallaron evidencias de repli­ caciones conservativas o dispersivas. Sin embargo, la replicación semiconservativa puede desarrollarse de varias maneras diferen­ tes, que difieren sobre todo en la naturaleza del molde de DNA -lineal o circular.

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^ |Se llena un tubo de una centrífuga con una solución salina pesada y fragmentos i de DNA. I

I

j

I Luego se centrifuga la solución ^ a alta velocidad durante 1varios días.

DNA con ' “’N DNA con ’ ^N

M

jSe desarrolla un gradiente de Idensidad dentro del tubo, El IDNA se desplazará hacia el sitio I donde su propia densidad sea la '¡misma que la de la sal. El DNA ¡pesado (con '^N) se moverá hada |el fondo; el DNA liviano (con '^'N) ¡permanecerá cerca de la superficie.

Fig. 12 - 2 . Meselson y Stahl utilizaron la centrifugación de equilibrio en gradiente de densidad para distinguir en­ tre el DNA pesado cargado con y el DNA m ás liviano cargado con '“'N. Las unidades de replicación se denominan replicones y cada uno contiene un origen de replicación. La replicación comienza en este origen y continúa hasta finalizada la replicación de toda la unidad. Los cromosomas bacterianos tienen un solo origen de replicación, mientras que los cromosomas eucariontes contienen varios de ellos. Replicación theta. Una forma frecuente de replicación que se desarrolla en el DNA circular, como por ejemplo el de E. coli y de otras bacterias, se denomina replicación theta (fig. 12-4a) porque produce una estructura similar a la letra griega theta (0 ). En este tipo de replicación, la doble cadena de DNA comienza a desenrollarse en el origen de replicación para formar cadenas simples de nucleótidos que luego sirven como moldes sobre los que se puede sintetizar DNA nuevo. El desenrollamiento de la doble hélice produce un bucle denominado burbuja de replica­ ción. Este desenrollamiento puede presentarse en uno de los ex­ tremos de la burbuja o en ambos, y se alarga en forma progresi­ va. La replicación del DNA en ambas cadenas que funcionan co­ mo moldes se produce de manera simultánea con el desenrolla­ miento. El punto de desenrollamiento, que es donde las dos cade­ nas de nucleótidos se separan de la doble hélice de DNA, se de­ nomina horquilla de replicación. Si hay dos horquillas de replicación, una en cada extremo de la burbuja de replicación, las horquillas proceden hacia afuera en

322 Capítulo 12

Experimento Pregunta: ¿Qué m odelo de replicación del DNA -conservativa, dispersiva o sem iconservativa- se desarrolla en E.coli? (a)

(b)

(c)

Transferencia y replicación en el medio con '^'N

Mctocio Medio con

Centrifugación'

Replicación en el medio con

Centrifugación!

i

i

(d )

Replicación en el medio con ’'*N

Centrifugación 1

Centrifugación]

'

Resultados Liviano ('"'N)

Pesado (’ ^N)

El DNA de las bacterias cultivadas en un medio con aparece como una i banda única.

1Despues de un ciclo de ü Después de un segundo ciclo de Las muestras tomadas I í replicación, el DNA aparece como ¡i replicación, el DNA revela dos bandas. después de ciclos i i una banda única en una posición ’j una en la posición del DNA híbrido (la adicionales de replicación i I intermedia entre la esperada para i mitad con ^^N y la mitad con^'^N) y la otraj | revelan dos bandas, tal el DNA con '^N y la esperada para i en la posición del DNA que solo i i como en la parte c. el DNA con ’^N. ; contenía’'*N. i '' f

.............. f..........

.

~ = = = = = = ::z~ ~ z

'w v a m m m .

DNA original Cadena paterna

Nueva cadena

%m 3ow m 0k

C onclusión: la replicación del DNA de E.coli es semiconservativa.

Fig. 12-3. Meselson y StahI demostraron que la replicación del DNA es semiconservativa.

ambas direcciones en un proceso denominado replicación bidireccional, que consiste en el desenrollamiento y la replicación si­ multáneas del DNA hasta que las dos horquillas se reúnen. Si hay una sola horquilla de replicación proseguirá alrededor de todo el círculo para obtener dos moléculas de DNA circulares completas, cada una compuesta por una cadena de nucleótidos vieja y una nueva. John Cairns aportó la primera evidencia compatible con la repli­ cación theta en 1963 por medio de la proliferación de bacterias en presencia de nucleótidos radiactivos. Después de la replicación ca­ da molécula de DNA presentó una cadena “caliente” (radiactiva) y una “fría” (no radiactiva). Caims aisló DNA de las bacterias des­ pués de la replicación y lo colocó en una grilla de un microscopio electrónico, que luego cubrió con una emulsión fotográfica. La ra­ diactividad presente en la muestra estimula la emulsión y produce una fotografía de la molécula (denominada autoiTadiografía), simi­ lar a la forma en que la luz estimula una película fotográfica. Co­ mo el DNA recién sintetizado tenía nucjeótidos radiactivos, Cairns pudo obtener una m icrofotografía del proceso de replicación, sim i­ lar a las observadas en la figura 12-4b.

desarrolla en algunos virus y en el factor F (un pequeño círculo de DNA extracromosómico que controla el apareamiento, co­ mentado en el cap. 8 ) de E. coli. Esta forma de replicación co­ mienza con un corte en una de las cadenas de nucleótidos que produce un grupo 3’-0H y un grupo 5 ’-fosfato. Se agregan nu­ cleótidos nuevos al extremo 3’ escindido y se usa la cadena inter­ na (no escindida) como molde. A medida que se agregan los nu­ cleótidos nuevos al extremo 3’, el extremo 5’ de la cadena escin­ dida se desplaza del molde, de la misma manera que un hilo se despliega de un cari'etel. El extremo 3 ’ crece alrededor del círcu­ lo y le da el nombre de modelo por círculos rodantes. La horquilla de replicación puede continuar alrededor del cír­ culo varias veces y producir muchas copias de la misma secuen­ cia. Cada vez que se cumple una vuelta alrededor del círculo el extremo 3’ en crecimiento desplaza la cadena de nucleótidos sin­ tetizada en el ciclo anterior. Luego la molécula lineal de DNA se separa del círculo y produce una molécula de DNA circular de doble cadena y una molécula de DNA lineal de cadena simple. La molécula lineal se circulariza antes o después de servir como molde para la síntesis de una cadena complementaria.

Replicación por círculos rodantes. Otra forma de replicación, denominada replicación por círculos rodantes (fig. 12-5), se

Replicación eucarionte lineal. Las moléculas de DNA circular que sufren ciclos de replicación tetha o por círculos rodantes po-

RepLicación y recombinación del DNA

í ■ E¡ DNA de doble I cadena se desenrolla i en el origen de I replicación...

B y produce moldes de cadena simple para la síntesis de DNA I nuevo. Se forma una burbuja I de replicación que suele tener i ! una horquilla de replicación i en cada extremo.

Las horquillas

i avanzan alrededor i del círculo.

B

Por ultimo se producen dos | I moléculas de DNA circular, j

Conclusión; la replicación theta produce dos moléculas de DNA circular.

(b) Horquilla de replicación Origen de replicación Burbuja de replicación

Fig. 12-4. La replicación theta es un tipo de replicación común en £. coli y en otros orga­ nismos que poseen DNA circular. (Microfotografias electrónicas de Bernard Hirt, L’Institut Suisse de Recherche Expérimentale sur le Cáncer.)

seen un solo origen de replicación. Debido al tamaño limitado de estas moléculas de DNA, la replicación que se inicia en un origen puede abarcar todo el cromosoma en un período razonable. En cambio, los cromosomas lineales grandes de los organismos eucariontes contienen demasiado DNA para replicarlo con rapidez a partir de un solo origen. La replicación eucarionte se desarrolla a una velocidad que oscila entre 500 y 5 000 nucleótidos por mi­ nuto en cada horquilla de replicación (bastante más lenta que la replicación bacteriana). Incluso aunque se obtenga una velocidad de 5 000 nucleótidos por minuto en cada horquilla de replicación, la síntesis de DNA a partir de un solo origen requeriría 7 días pa­ ra replicar un cromosoma humano típico compuesto por 1 0 0 mi­ llones de pares de bases de DNA. En realidad la replicación de los cromosomas eucariontes tarda algunos minutos u horas, pero no días. Esta velocidad es posible porque la replicación se desa-' rrolla a partir de miles de orígenes en forma simultánea. Los replicones eucariontes típicos poseen una longitud que os­ cila entre 20 000 y 300 000 pares de bases (cuadro 12-1). En ca­ da origen de replicación el DNA se desenrolla y produce una bur­

buja de replicación. Se lleva a cabo la replicación en ambas cade­ nas en cada extremo de la burbuja y las dos horquillas de replica­ ción se extienden hacia afuera. Finalmente, las horquillas de re­ plicación pertenecientes a replicones adyacentes contactan y los replicones se fusionan para forman grandes extensiones de DNA recién sintetizado (fig. 12-6). La replicación y la fusión de todos los replicones conduce al desarrollo de dos moléculas de DNA idénticas. En el cuadro 12-2 se resumen las características impor­ tantes de la replicación tetha, la replicación por círculos rodantes y la replicación eucarionte lineal.

CONCEPTOS CLAVE La replicación theta, la replicación por círculos rodantes y la replicación lineal difieren en el establecim iento y la progresión de la replicación, pero coinciden en la produc­ ción de moléculas de DNA nuevas por medio de una re­ plicación sem iconservativa.

24 Capítulo 12

Se inicia la replicadón con un corte en una de las cadenas de nudeótidos.

La síntesis de DNA comienza en el extremo 3' de la cadena escindida; la cadena interna se usa como molde. El extremo 5' de la cadena escindida se

El corte libera una molécula de DNA lineal j de cadena simple y una I de DNA circular de i cadena doble.

El DNA lineal puede circularizarse y servir como molde para la síntesis de una cadena complementaria.

........ o

- T

'

-

Conclusión: la replicación por círculos rodantes produce muchas moléculas ^de DNA circular.

o

-

- e

^

v

o

o

.■'-rvo

H g . 12-5. La replicación por círculos rodantes s e produce en algunos virus y en el factor F de £. coli.

Requisitos para la replicación

:uadro 12-1 Aunque el proceso de replicación posee muchos componentes, éstos se pueden combinar en tres grupos principales: 1. un molde compuesto por DNA de cadena simple 2

Número y longitud de los replicones

O rg an ism o

. materia prima (sustratos) que se ensamblarán para formar una cadena de nudeótidos nueva y

3. enzimas y otras proteínas que “leen” el molde y ensamblan los sustratos para formar una molécula de DNA Debido a la naturaleza semiconservativa de la replicación del DNA, una molécula de DNA de cadena doble se debe desenrollar para exponer las bases que actúan como molde para el ensambla­ je de cadenas polinucleotídicas nuevas, que son complementarias y antiparalelas con respecto a las cadenas molde. La materia pri­ ma a partir de la que se sintetizarán las cadenas de DNA nuevas son desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTP), cada uno com­ puesto por una azúcar desoxirribosa y una base (un nucleósido)

Cuadro 12-2

Número de o ríg en es de replicación

Longitud prom edio d e l replicón (pb)

1

4 200 000

500

40 000

3 500

40 000

X en o p u s la e v is (sapo)

15 000

ZOO 000

M us m u sc u lu s (ratón)

25 000

150 000

E sc h e ric h ia coli (bacteria) S a c c h a ro m y c e s c e re v isia e (levadura) D rosop h ila m elanogaste r (mosca de la fruta)

Fuente: Datos de B. L. Lewin, Genes V (Oxford: Oxford University Press, 1994), p. 536.

Características de la replicación theta, por círculos rodantes y eucarionte lineal

Modelo de rep licación

Molde de DNA

Theta

Circular

No

1

Unidireccional o bidireccional Dos moléculas de DNA circular

Por círculos rodantes

Circular

Sí*

1

Unidireccional

Una molécula de DNA circular y una molécula de DNA lineal que puede circularizarse

Lineal

No

Muchos

Bidireccional

Dos moléculas lineales

Eucarionte lineal

Corte de la Núm ero de cadena de rep lico n e s n u d e ó tid o s

U n id ireccio n al o bid ireccio n al

Productos

RepLicadón y recombinadón del DNA E

A

esta estructura compleja de proteínas y enzimas para evaluar el proceso de replicación de manera más detallada.

I Cada cromosoma contiene numerosos orígenes.

Origen

Origen 2

Origen 3

t i En cada origen, el DNA se desenrolla T y produce una burbuja de replicadón.

^

la g prodüce^eñ ambas cadenas en cada extremo de la burbuja a medida que la horquilla de replicadón avanza liada afuera.

... ...... ... ..... .... ..

ultimo, las horquillas pertenecientes a DurDUjas aayacentes se encuentran, los segmentos de DNA se fusionan...

i ...y producen dos moléculas de DNA lineal idénticas.

DNA recién sintetizado

Conclusión: la replicación eucarionte dei DNA produce dos moléculas de DNA lineal.

Fig. 12-6. En lo s c ro m o so m a s e u c a rio n t e s s e d e s a r r o ­ lla ía re p lic a c ió n lin e a l del DNA.

unido a tres fosfatos (flg. 12-7a). Durante la síntesis del DNA los nucleótidos se unen al grupo 3’-OH de la cadena nucleotídica en crecimiento (fig. 12-7b). El grupo 3 ’-OH del último nucleótido de la cadena ataca al grupo 5’-fosfato del dNTP que entra en el proceso. Dos fosfatos se separan del dNTP, y se forma una unión fosfodiéster entre los dos nucleótidos. La síntesis de DNA no se produce en forma espontánea. En cambio, requiere de un conjunto de enzimas y de proteínas que funcionan en forma coordinada. A continuación examinaremos

CONCEPTOS CLA¥E La síntesis de DNA requiere de un molde de D N A de ca-, dena simple, de desoxirribonucleósidos trifosfato, de una cadena nucleotídica en crecimiento y de un grupo de en­ zimas y de proteínas.

Dirección de la replicadón La síntesis de DNA consiste en la unión de nucleótidos nuevos de a uno por vez en el extremo 3’ de una cadena recién sintetizada. Las DNA polimerasas, o sea las enzimas que sintetizan el DNA, solo pueden agregar nucleótidos al extremo 3’ de la cadena proliferativa (no al 5’) y esto implica que las cadenas de DNA nuevas siempre se alargan en la misma dirección 5’ a 3 ’ (5’—>3’). Como los dos mol­ des de DNA de cadena simple son antiparalelos y la elongación de la cadena siempre respeta la dirección 5’^ 3’, si la síntesis de un molde se produce, digamos, de derecha a izquierda, la síntesis so­ bre el otro molde deberá desarrollarse en dirección contraria, o sea de izquierda a derecha (fig. 12-8). A medida que el DNA se desen­ rolla durante la replicación, la naturaleza antipai'alela de las dos ca­ denas de DNA implica que un molde se exponga en dirección 5’^ 3’ y el otro en dirección 3’—> 5’ (véase fig. 12-8); entonces, ¿cómo puede desarrollarse la síntesis en ambas cadenas de la horquilla de manera simultánea? A medida que el DNA se desenrolla, la cadena (molde) que se expone en dirección 3’-^ 5’ (la cadena inferior en las figuras 128 y 12-9) permite una síntesis continua de la cadena nueva en la dirección 5’—> 3’. Esta cadena nueva, que se replica en forma continua, se denomina cadena líder. La otra cadena que funciona como molde se expone en direc­ ción 5’-^ 3’ (la cadena superior en las figuras 12-8 y 12-9). Lue­ go de que se desenrolló un fragmento corto de DNA la síntesis debe desarrollarse en la dirección 5’^ 3’; esto implica que la sín­ tesis debe producirse en la dirección opuesta al desenrollamiento (fig. 12-9). Como solo es necesario desenrollar un fragmento cor­ to de DNA para iniciar la síntesis sobre esta cadena, la maquina­ ria replicativa comienza a funcionar sobre el molde con rapidez. En este punto, ya se ha desarrollado una longitud adicional de DNA, que representa un molde nuevo en el extremo 5 ’ de la ca­ dena nueva. La síntesis de DNA debe comenzar en la horquilla de replicación y continuar en la dirección opuesta al movimiento de la horquilla hasta encontrarse con el segmento de DNA replicado con anterioridad. Este proceso se repite una y otra vez e implica que la síntesis de esta cadena se desarrolle en salvas cortas y dis­ continuas. La cadena nueva que sufre replicación discontinua se denomina cadena retrasada. Los fragmentos cortos de DNA producidos por la replicación' discontinua de la cadena retrasada se denominan fragmentos de Okazaki (por Reiji Okazaki, quien los descubrió). En las células bacterianas, cada fragmento de Okazaki tiene entre 1 000 y 2 000 nucleótidos; en las células eucariontes, posee alrededor de 1 0 0 a 200 nucleótidos de longitud. Estos fragmentos de la cadena retra­ sada se unen para formar una molécula de DNA continua nueva. Relacionemos la dirección de la síntesis del DNA con los mo­ dos de replicación examinados con anterioridad. En el modelo

326 Capítulo 12 (a)

(b) Fosfatos

Cadena nueva

Cadena molde

^

^

O

O

3' OH

o

— o — p — o ~ P--0~ 0

0

1

H.C

.0 ^

c 3' OH

“

0

~

I hase •{g

Se sintetiza DNA nuevo a partir de desoxirribonucle ósidos trifosfato (dNTP).

Azúcar desoxirribosa B

En la replicación, el grupo 3 -OH del último nucleótido de la cadena ataca al grupo 5'-fosfato del dNTP entrante.

Q s e forma un | j enlace fosfodiéstef I entre los dos i i nudeótidos... f

\ Fig. 1 2 - 7 . Durante la replicación se sinte- B s e liberan dos fosfatos. tiza DNA nuevo a par­ tir de desoxirribonuDesoxirribonucleósido cleósidos trifosfato trifosfato (dNTP) (dNTP).

tetha (fig. 12-lOa), el DNA se desenrolla en un sitio específico, que es el origen, y se forma una burbuja de replicación. Si la bur­ buja tiene dos horquillas, una en cada extremo, la síntesis se de­ sarrolla de manera simultánea en ambas horquillas (replicación bidireccional). En cada horquilla la .síntesis de una de las cadenas molde se realiza en la misma dirección al desem-ollamiento; la cadena nueva es la cadena líder de la replicación continua. En la otra cadena molde, la síntesis se produce en dirección contraria al desenrollamiento; la cadena nueva es la cadena retrasada de la re­ plicación discontinua. Nos concentraremos en una de las cadenas

0

...y se liberan I iones fosfato

5'

que funcionan como molde dentro de la burbuja. Se debe desta­ car que la síntesis sobre esta cadena molde es continua en una horquilla, pero discontinua en la otra. Esta diferencia se debe a que la síntesis del DNA siempre se produce en la misma direc­ ción (5’—> 3’), pero las dos horquillas se mueven en direcciones contrarias. La replicación en el modelo por círculos rodantes (fig. 12-lOb) es un poco diferente porque no hay una burbuja de replicación. La replicación comienza en el extremo 3’ de la cadena nucleotídica escindida. Se lleva a cabo la replicación continua sobre el

H ...la síntesis de DNA en una 1 cadena avanza de derecha a izquierda..

K-

Molde .expuesto 5 '- ^ 3'

Dirección de la síntesis

I Dado que

las dos cadenas molde son aritiparaielas...

m

...y la síntesis ae UNA siempre es de 5'—»-3

Horquilla de replicación

Dirección de la síntesis

Fig. 12-8. La sín tesis de DNA se pVoduce en las dos cadenas molde de DNA en forma simultánea, pero en direcciones opuestas. La replicación del DNA en una sola horquilla de replicación comienza cuando la molécula de DNA de cadena doble se desenrolla para pro­ porcionar dos moldes de cadena simple.

'Molde expuesto i ...y sobre la otra cadena, de izquierda a derecha.

RepLicación y recombinadón del DNA 3¡ (a) Modelo theta

I En la cadena molde inferior, la síntesis del DNA avanza en forma continua en la dirección 5'—«-3' igual que el desenrollamiento.

Cadena

Desenrollamiento líder y replicación j

^

~

/

.DNA se desenrolla en el origen'

Cadenas molde Origen

3' S'

Desenrollamiento y replicación

Cadena líder

Cadena retrasada

DNA recién sintetizado

.

retrasada H

En la cadena molde superior, la síntesis del DNA se inicia en la horquilla y avanza en la dirección opuesta al desenrollamiento; por ende, el molde se agota con rapidez.

/;

y En cada horquilla, la síntesis de la cadena líder del DNA se produce en forma continua en la misma dirección que ei desenrollamiento.

t i La síntesis de la cadena retra-| sada del DNA se produce en forma discontinua en dirección opuesta al desenrollamiento.

(b) Modelo p o r círculos rodantes B

ii'C // Desenrollamiento / » reolicación

La síntesis del DNA se vuelve a iniciar sobre la cadena superior, en la horquilla, y se aleja cada vez más de la horquilla hasta que se queda sin molde.

Origen

i ) La síntesis continua del DNA ' se inicia en el extremo 3' de la cadena de nucleótidos escindida.

Cadena líder

A medida que la molécula de DNA se desenrolla, el extremo 5' se desplaza en forma progresiva.

S- 3 '

Desenrollamiento y replicación

(c) Replicación eucarionte lineal Ú En cada horquilla, la síntesis de la cadena I líder se produce en forma continua en la i misma dirección que el desenrollamiento. Q

ntesis del DNA sobre esta cadena es 'ntinua; los fragmentos cortos de DNA i producidos por la síntesis discontinua se : llaman fragmentos de Okazaki. L

Fragmentos de Okazaki \l

Origen Cadena líder Cadena retrasada

Cadena retrasada

Síntesis discontinua del DNA

S' 3'

Desenrollamientom y replicación '

S’í

e

¡¡

3'i

Cadena líder

Síntesis continua del DNA

Fig. 1 2-9. La sín tesis de DNA es continua en una cade­ na molde de DNA y discontinua en la otra.

molde circular a medida que se agregan nucleótidos nuevos en el extremo 3’. La replicación de las moléculas lineales de DNA, como la que se produce en las células eucariontes, genera una serie de burbu­ jas de replicación (fig. 12-lOc). La síntesis de DNA en estas bur­ bujas es igual a la que se observa en la replicación con una sola burbuja del modelo tetha; comienza en el centro de cada burbuja

Q

Desenrollamiento y replicación

Origen

La cadena retrasada se sintetiza ¡ en forma discontinua en direccionl opuesta al desenrollamiento, I

Fig. 12-10. El proceso de replicación es diferente en la replicación theta, por circuios rodantes y lineal.

‘ de replicación y continúa en dos horquillas, una en cada extremo, de la burbuja. En ambas horquillas la síntesis de la cadena líder se lleva a cabo en la misma dirección que el desenrollamiento, mientras que la síntesis de la cadena retrasada se produce en la dirección contraria al desenrollamiento.

328 Capítulo 12

CONCEPTOS CLA¥E Toda la síntesis del DNA se produce de 3’, lo que sig­ nifica que los nucleótidos nuevos siempre se agregan en el extremo 3’ de la cadena de nucleótidos proliferativa. En cada horquilla de replicación, la síntesis de la cadena líder se produce en forma continua, mientras que la sín­ tesis de la cadena retrasada se desarrolla de manera dis­ continua.

Proteínas Ide iniciación

I Las proteínas de iniciación se unen a oriC, el origen de replicación,.

Mecanismo de replicación La replicación posee cuatro fases: inicio, desenrollamiento, elongación y terminación.

// //

Replicación del DNA bacteriano El siguiente comentario sobre el proceso replicativo se concentra­ rá en los sistemas bacterianos, donde la replicación se evaluó de ma­ nera más exhaustiva y se comprende mejor. Aunque muchos aspec­ tos de la replicación en las células eucariontes son similares a los de las células procariontes, hay algunas diferencias importantes. En una sección posterior de este capítulo compararemos la replicación de las células bacterianas y de las eucariontes. Iniciación. El cromosoma circular de E. coli tiene un solo ori­ gen de replicación {oriC). La secuencia mínima necesaria para que funcione oriC mide 245 pares de bases y contiene varios si­ tios importantes. Las proteínas de iniciación se unen a oriC y producen el desenrollamiento de un fragmento corto de DNA. Este desenrollamiento permite que la helicasa y otras proteínas de unión a cadena simple se unan a la cadena polinucleotídica

(fig. 1241), Desenrollamiento. Como la síntesis del DNA requiere de un molde de cadena simple y como la doble cadena de DNA debe desenrollarse antes de que se lleve a cabo la síntesis la célula, de­ pende de varias proteínas y enzimas para lograr este desenrollamiento. Las DNA helicasas rompen las uniones hidrógeno entre las bases de dos cadenas de nucleótidos de una molécula de DNA. Las helicasas no pueden iniciar el desenrollamiento de la doble cadena de DNA; las proteínas de iniciación prirñero sepa­ ran las cadenas de DNA en el sitio de origen y exponen un frag­ mento pequeño de DNA de cadena simple al que se une una he­ licasa. Las helicasas se unen al molde de la cadena retrasada en cada horquilla de replicación y se mueven en dirección 5’^ 3’ a lo largo de esta cadena, lo que también determina el movimiento de la horquilla de replicación (fig. 1 2 - 1 2 ). Después de que la helicasa desenrolló el DNA, las cadenas nucieotídicas simples tienden a formar uniones hidrógeno y a renaturalizarse (volver a unirse). También se pueden formar estructu­ ras secundarias, como horquillas (véase fig. 10-17), entre nucleó­ tidos complementarios pertenecientes a la misma cadena. Para estabilizar el DNA de cadena simple el tiempo suficiente para que se desarrolle la replicación, las proteínas de unión a cade­ na simple (SSB, single-strand-binding proteins) forman uniones densas con el DNA de cadena simple expuesto (véase fig. 12-12). A diferencia de muchas proteínas que se unen al DNA, las SSB no dependen de la secuencia de bases: se unen a cualquier DNA

B

... y producen el desenI rollamien:o de un segmenio corto de DNA.

H El desenrollamiento permite I que la helicasa y otras proteínas de unión a cadena i simple se unan al DNA de ! cadena simple.

I ' J Helicasa

' ' -0 '

Proteínas de unión a cadena simple

Fig. 12-1 1. La replicación del DNA de E. coli comienza cuando las proteínas de iniciación se unen al oríC, que es el origen de replicación, lo que provoca el desenrollamiento de un fragmento corto de DNA.

de cadena simple. Las proteínas de unión a cadena simple forman tetrámeros (grupos de cuatro); cada tetrámero cubre entre 35 y 65 nucleótidos. Otra proteína esencial para el proceso de desenrollamiento es la enzima DNA girasa, una topoisomerasa. Como se comentó en el capítulo 1 1 , las topoisomerasas controlan el superenrollamiento del DNA. Durante la replicación una DNA girasa reduce las tensiones de torsión (torque) que se desaiTollan proximales a la horquilla de replicación como resultado del desenrollamiento (véase fig. 12-12). Esta enzima disminuye la fuerza de torque por rftedio del corte de la doble cadena en un segmento de la hélice de DNA, el pasaje de otro segmento de la hélice a través de la brecha y la reasociación de los extremos escindidos del DNA. Es­ ta acción elimina una vuelta de DNA y disminuye el superenrollamiento.

RepLicadón y recombinación deL DNA 32í

z ?

F ig ; 12-12.

La

Ú i j i u n ió n a la ca d e n a m o l­ i d e re tr a s a d a en cad a I h o rq u illa d e replicadna

helieasa desenrolla el DNA a través d e la

La DNA helicasa se une al molde de cadena retrasada en cada horquilla de replicación y se mueve en dirección 5' —► 3' a lo largo de esta cadena, en la que rompe los puentes de hidrógeno y desplaza la horquilla de replicación

B

Las proteínas de unión | a cadena simple ¡ estabilizan el DNA de cadena simple expuesto. í

É l La DNA girasa alivia la tensión proximal a la horquilla de replicación.

1/

ció n y d el m o vim ien to en d ire cció n 5 '- ^ 3 ' a lo la rg o de la ca d e n a .

Desenrollamiento DNAgirasa

Desenrollamiento

CONCEPTOS CLAVE La replicación com ienza en un origen de replicación, al que se une una proteína de iniciación que produce el de­ senrollamiento de una extensión corta de DNA. La DNA helicasa rompe las uniones hidrógeno de la horquilla de replicación y las proteínas de unión a cadena simple esta­ bilizan las cadenas separadas. La DNA girasa reduce la fuerza de torsión que se genera cuando se desenrollan las dos cadenas del DNA.

Cebadores (primers). Todas las DNA polímeras as requieren de un nucleótido con un grupo 3’-OH al que pueda agregarse el nucleótido nuevo. Debido a este requisito, las DNA polimerasas no pueden iniciar la síntesis sobre un molde desnudo; en cambio, ne­ cesitan un cebador -un grupo 3’-OH preexistente- para activar­ se, Entonces, ¿cómo comienza la síntesis de DNA? Una enzima denominada primasa sintetiza extensiones cortas de nucleótidos (cebadores o “primers”) para que se inicie la re­ plicación del DNA. La primasa sintetiza un fragmento breve de nucleótidos de RNA (con una longitud aproximada de 10 a 12 nu­ cleótidos) que aporta el grupo 3’-OH al que la DNA polimerasa podrá unir los nucleótidos de DNA. (Como la primasa es una RNA polimerasa, no requiere un grupo 3’-OH preexistente a par­ tir del cual puedan agregarse los nucleótidos.) Todas las molécu­ las de DNA tienen primero cebadores de RNA cortos unidos a la cadena; estos cebadores se eliminan más adelante y se sustituyen por nucleótidos de DNA. En la cadena líder, donde la síntesis de DNA es continua, solo se necesita un cebador en el extremo 5’ de la cadena recién sinte­ tizada. En la cadena retrasada, donde la replicación es disconti­ nua, se debe sintetizar un cebador nuevo en el comienzo de cada fragmento de Okazaki (fig, 12-13). La primasa forma un comple­ jo con la helicasa en la horquilla de replicación y se mueve a lo largo del molde de la cadena retrasada. Es probable que el com­ plejo primasa-helicasa presente en el molde de la cadena retrasa­ da de la otra horquilla de replicación sintetice el único cebador necesario para la cadena líder, en el extremo opuesto de la burbu­ ja de replicación.

DNA helicasa

Desenrollamiento Proteínas de unión a cadena simple

Desenrollamiento

CONCEPTOS CLAVE La prim asa sintetiza un fragmento corto de nucleótidos de RNA (cebadores o primers) que aportan un grupo ■ 3’-0H para que la unión de los nucleótidos de DNA per­ mita el inicio de su síntesis.

Elongación. Después del desenrollamiento del DNA y del agregado del cebador, las DNA polimerasas alargan la cadena de polinucleótidos por medio de la catalización de la polimerización del DNA. Las polimerasas mejor estudiadas son las de E. coli, que son por lo menos cinco. Dos de ellas, la DNA polimerasa I y la DNA polimerasa IH, participan en la síntesis del DNA duran­ te la replicación; las otras tres cumplen funciones especializadas en la reparación del DNA (cuadro 12-3). La DNA polimerasa III es un complejo multiproteico grande que actúa como el encargado principal de la replicación. Esta en­ zima sintetiza cadenas de nucleótidos por medio del agregado de nucleótidos nuevos en el extremo 3’ de las moléculas de DNA proliferativas y cumple dos tareas enzimáticas (véase cuadro 1 2 3). Su actividad de polimerasa de 5’—> 3’ le permite agregar nu­ cleótidos nuevos en dirección 5 ’—> 3 ’. Su actividad de exonucleasa de 3’—> 5’ le permite eliminar nucleótidos en dirección 3 ’—>5’, lo que posibilita la corrección de errores. Si un nucleótido con una base incorrecta se inserta en la molécula de DNA proliferativa, la DNA polimerasa III emplea su actividad de exonucleasa de 3’^ 5 ’ para retroceder y eliminar el nucleótido incorrecto. Lue­ go retoma su actividad de polimerasa de 5’-^ 3’. Las dos funcio­ nes juntas le permiten a la DNA polimerasa I I I sintetizar molécu­ las de DNA nuevas en forma eficiente y precisa. La DNA polime­ rasa III tiene una procesividad (processivity) elevada, lo que sig­ nifica que es capaz de agregar muchos nucleótidos a la cadena de DNA proliferativa sin separarse del molde en condiciones norma­ les se mantiene unida al molde y continúa la síntesis de DNA hastá su replicación completa. La primera polimerasa descubierta en E. coli, la DNA polime­ rasa I, también cumple funciones de polimerasa de 5 ’—> 3’ y de exonucleasa de 3’-^ 5 ’ (véase cuadro 12-3), lo que permite la sín­ tesis de DNA y la corrección de errores. Sin embargo, a diferen-

330 Capítulo 12 Cirasa

Helicasa

Origen

Primasa

Desenrollamiento I La primasa sintetiza fragmentos cortos de I nucleótidos de RNA y, de esta manera, aporta j un grupo 3'-0H al que la DNA polimerasa I puede añadir nucleotidos de DNA,

bobre la cadena líder, donde la replicación | es continua, solo se requiere un cebador en I el extremo 5' de la cadena nueva. I

Síntesis de DN/^

Cebador para la cadena retrasada

Desenrollamiento Cebador para la cadena retrasada

Desenrollamiento Cadena líder Continúa la j síntesis de DMA!

Cadena retrasada

Cadena líder

bn la cadena retrasada que se replica en forma discontinua, debe producirse un i cebador nuevo al comienzo de cada I fragmento de Okazaki.

Desenrollamiento

Cadena líder

12-1

Fig. 3. La p rim a sa s in t e t iz a e x te n s io n e s c o rta s de n u c le ó tid o s d e RNA y, de e s ta m anera, p ro p o rc io n a un g ru p o 3 -OH en el q ue la DNA p o lim e ra s a pu ed e a ñ a d ir n u c le ó tid o s d e DNA.

cia de la DNA polimerasa III la DNA polimerasa I también posee actividad de exonueleasa de 5’-^ 3’, que utiliza para eliminar los cebadores introducidos por la primasa y para reemplazarlos por nucleótidos de DNA por medio de su movimiento en dirección 5 ’^ 3’. La DNA polimerasa I tiene una procesividad menor que la DNA polimerasa III. La eliminación y la sustitución del ceba­ dor parecen constituir las funciones principales de la DNA poli­ merasa I. Las DNA polimerasas II, IV y V actúan durante la re­ paración del DNA.

Cuadro 12-3

A pesar de sus diferencias, todas las DNA polimerasas de E. coli

1

2

. sintetizan cualquier secuencia especificada por la cadena molde „ . sintetizan en dirección 5’^ 3’ a través del agregado de nu­ cleótidos a un grupo 3’-OH

Características de las DNA polimerasas de

E. coli

DNA p o lim e r a s a

P o lim e r iz a c ió n d e 5 -> 3

E x o n u e le a s a de 3 5

E x o n u e le a s a de 5 3

1

Sí

Sí

Sí

Elimina y reemplaza a tos cebadores

II

Sí

Si

No

Repara el DNA; reinicia la replicación después de que el DNA dañado detiene la síntesis

III

Sí

Sí

No

Elonga el DNA

IV

Sí

No

No

Repara el DNA

V

Sí

No

No

Repara el DNA, sintetiza DNA con lesiones interpuestas

F u n c ió n

RepLicación y recombinadón del DNA 3: 3. usan, dNTP para sintetizar el DNA nuevo

(a)

Cadena molde

\

4. necesitan un cebador para iniciar la síntesis

6

. producen cadenas nuevas que son complementarias y antipa­ ralelas con respecto a las cadenas molde y

Cebador de RNA añadido por la primasa

./I............ 1..... I La DNA poümerasa III aareaa nucleótidos de DNA ai cebador.

5. catalizan la formación de una unión fosfodiéster por medio de la unión del grupo 5’-fosfato del nucleótido entrante con el grupo 3’-OH del nucleótido preexistente en la cadena proliferativa, proceso en el que se desprenden dos fosfatos

DNA polimerasa I (b) m u

7. se asocian con varias otras proteínas

0: ‘(r

CONCEPTOS CLA¥E

3’. 5. El DNA nuevo se sintetiza a partir de dNTP; para que se polimerice el DNA se escinden dos fosfatos de un dNTP y el nucleótido resultante se agrega al grupo 3’-OH de la cadena de nucleótidos en crecimiento. 6

INTEGRACION DE CONCEPTOS Reglas básicas de la

7. Las cadenas de nucleótidos nuevas son complementarias y antiparalelas con respecto a sus cadenas molde.

replicación

La replicación bacteriana requiere de varias enzimas (véase cuadro 12-4), de proteínas y de secuencias de DNA que actúen en forma integrada para sintetizar una molécula de DNA nueva. Es­ tos componentes son importantes, pero no debemos permitir que

Selección de nucleótidos

. La replicación es continua en la cadena líder y discontinua en la cadena retrasada.

8. La replicación se desarrolla a una velocidad muy elevada y es sorprendentemente precisa, gracias a la selección exacta de los nucleótidos, a la corrección durante la lectura {proofreading) y a mecanismos de reparación.

Corrección durante la lectura {proofreading)

DNA

polimerasa S!

J La DNA polimerasa aparea nucleótidos y \ durante la replicación del DNA con un i alto índice de precisión.

...la DNA polimerasa se detiene y,,.

a iM

la base ^ : : ...elimina e í i incorrecta meo

i

...para reemplazarla por la correcta. La replicación continúa.

Reparación de los errores de apareamiento

DNA nuevo

/!

É l En ocasiones la corrección durante la lectura falla y se inserta una base incorrecta en el DNA nuevo.

I Las enzimas que reparan los errores de apareamiento reconocen la deformidad provocada por la base apareada en forma incorrecta en la estructura secundaria ...

B

...y sustituyen la base apareada en forma errónea por la correcta.

Conclusión: la aplicación secuencia! de i muchos mecanismos asegura la j replicación del DNA con gran precisión. |

Fig. 12-16. Se requiere una serie de procesos para asegurar la increíble precisión de la replicación del DNA. Entre ellos se encuentran la selección del DNA, la corrección durante la lectura (proofreading) y la reparación de los errores de apareamiento.

334 Capítulo 12

j Cuadro'12-4

Componentes que se requieren para la replicación en las células bacterianas

Com ponente

Función

Proteína de iniciación

Se une al origen y separa las cadenas de DNA para iniciar la replicación

DNA helicasa

Desenrolla el DNA en la horquilla de replicación

Proteínas de unión a cadena simple

Se une al DNA de cadena simple y evita la renaturalización

DNA girasa

Se mueve proximal a la horquilla de replicación, corta y vuelve a unir el DNA de do­ ble hélice para liberar el torque que se produce como resultado del desenrollamien­ to en la horquilla de replicación

DNA primasa

Sintetiza cebadores cortos de RNA para proporcionar un grupo 3 '-OH para la unión de los nucleótidos de DNA

DNA polim erasa III

Alarga una nueva cadena de nucleótidos a partir del grupo 3 ' -OH provisto por el cebador

DNA polimerasa I

Elimina los cebadores de RNA y los sustituye por moléculas de DNA

DNA ligasa

Une fragmentos de Okazaki por medio del sellado de las muescas en la estructura de azúcar-fosfato del DNA recién sintetizado.

Replicación del DNA eucarionte Aunque la replicación en los eucariontes se asemeja a la repli­ cación bacteriana en muchos aspectos, también presenta algunos desafíos adicionales. En primer lugar el tamaño mucho más gran­ de de los genomas eucariontes requiere que el comienzo de la re­ plicación se inicie en muchos orígenes. En segundo lugar, los cromosomas eucariontes son lineales, mientras que los cromoso­ mas procariontes son circulares. En tercer lugar, el molde de DNA está asociado con proteínas histonas en nucleosomas y el ensamblaje de los nucleosomas se produce de inmediato después de la replicación del DNA, Orígenes eucariontes. Los investigadores aislaron los primeros orígenes de replicación en eucariontes en células de levadura por medio de la demostración de que ciertas secuencias de DNA con­ ferían la capacidad de replicarse cuando se transferían de un cro­ mosoma de levadura a fragmentos de DNA circulares pequeños (plásmidos). Estas secuencias de replicación autónomas (ARS) permitían la replicación de cualquier fragmento de DNA con el que se unieran. Luego se demostró que estas secuencias eran los orígenes de replicación de los cromosomas de las levaduras. Los orígenes de replicación presentes en los diversos organismos tie­ nen secuencias bastante variables, aunque por lo general contie­ nen numerosos pares de bases A - T. En la levadura los orígenes están formados por 100 a 200 pb de DNA. Un complejo multiproteico, el complejo de reconocimiento del origen (ORC), se fi­ ja en los orígenes y desenrolla el DNA en esas regiones. Es inte­ resante señalar que los ORC también sirven para regular la trans­ cripción.

CONCEPTOS CLA¥E El DNA de las células eucariontes contiene muchos oríge­ nes de replicación. En cada origen un com plejo multiproteico de reconocimiento del origen se une para iniciar el desenrollam iento del DNA.

Permiso de replicación del DNA. Las células eucariontes em­ plean miles de orígenes y de esta manera pueden replicar todo el genoma en un tiempo adecuado. Sin embargo, el uso de muchos orígenes crea un problema especial con la coordinación de la re­ plicación: todo el genoma se debe replicar en forma precisa una sola vez en cada ciclo celular para que ningún gen quede sin re­ plicar y ningún gen se replique más de una vez. ¿Cómo hace una célula para confirmar que inició la replicación en miles de oríge­ nes solo una vez en cada ciclo celular? Para lograr precisión durante la replicación del DNA, el inicio de la replicación se debe dividir en dos pasos distintos. E n el pri­ mer paso se acreditan los orígenes, lo que significa que reciben una aprobación para iniciar la replicación. Este paso se produce en un momento inicial del ciclo celular cuando un factor permi­ sivo de la replicación se une a un origen. En el segundo paso, las proteínas de iniciación producen la separación de las cadenas de DNA y el comienzo de la replicación en cada origen aprobado. La clave es que las proteínas de iniciación solo^actúan en los orí­ genes aprobados. A medida que las horquillas de replicación se alejan del origen, el factor permisivo se desprende y deja al ori­ gen en estado “no aprobado”, por lo que no puede reiniciarse la replicación hasta que se renueve el permiso. Para asegurar que el proceso solo se desan'olle una vez en cada ciclo celular, el factor permisivo solo puede actuar después que la célula completó la mitosis y antes de la activación de las proteínas de iniciación. Desenrollamiento. Se aislaron varias helicasas que separan el DNA de doble cadena de las células eucariontes; además se de­ tectaron proteínas de unión a cadena simple y topoisomerasas (que cumplen una función similar a la DNA girasa de las células bacterianas). Se considera que estas enzimas y proteínas ejercen un papel en el desenrollamiento del DNA de los eucariontes bas­ tante similar a sus contrapartidas bacterianas. DNA polimerasas eucariontes. Hay diferencias significativas entre los procesos de replicación en las bacterias y en los organis­ mos eucariontes, sobre todo en la cantidad y en las funciones de las DNA polimerasas. Las células eucariontes contienen varias DNA polimerasas distintas que actúan en la replicación, en la re-

RepLicadón y recombinación del DNA 33

5Cuadro 12-5 ¡ DNA p o lim erasa íx (alfa)

DNA poLimerasas de Las células eucariontes

A ctividad de poli­ A ctivid ad de exonu- Función c e lu la r 5' m era sa de 5 3 ' c le a sa de 3 Sí

No

Iniciación de la síntesis del DNA nuclear y reparación del DNA; activid ad de primasa

tiene p (beta)

Sí

No

Reparación del DNA y recombinación del DNA nuclear

y (gamma)

Sí

Sí

Replicación y reparación del DNA mitocondrial

S (delta)

Sí

Sí

Síntesis de las cadenas líder y retrasada del DNA nuclear, repara­ ción del DNA y síntesis de DNA con lesiones interpuestas

£ (épsilon)

Sí

Sí

Desconocida; probablemente reparación y replicación del DNA nuclear

C (zeta)

Sí

No

Síntesis de DNA con lesiones interpuestas

n (eta)

Sí

No

Síntesis de DNA con lesiones interpuestas

e (theta)

Sí

No

Reparación del DNA

i (iota)

Sí

No

Síntesis de DNA con lesiones interpuestas

K (kappa)

Sí

No

Síntesis de DNA con lesiones interpuestas

A (lambda)

Sí

No

Reparación del DNA

M (mu)

Sí

No

Reparación del DNA

a (sigma)

Sí

No

Replicación del DNA nuclear (posiblemente), reparación del DNA

y cohesión de las cromátidas hermanas

combinación y en la reparación del DNA (cuadro 12-5). La DNA polimerasa a, que posee actividad de primasa, inicia la síntesis del DNA nuclear a través de la producción de un cebador de RNA seguido por una cadena corta de nucleótidos de DNA. Una vez que la DNA polimerasa a colocó entre 30 y 40 nucleótidos, la DNA polimerasa 6 completa la replicación sobre las cadenas lí­ der y retrasada. Con una estructura y una función similares a las de la DNA polimerasa 5, la DNA polimerasa e también parece participar en la replicación nuclear de las cadenas líder y retrasa­ da, pero su función precisa no está clara. La DNA polimerasa p no forma parte de la replicación sino que se asocia con la repara­ ción y la recombinación del DNA nuclear. La DNA polimerasa Yreplica el DNA mitocondrial; la polimerasa símil-y también re­ plica el DNA de los cloroplastos. Otras DNA polimerasas cum­ plen funciones en la reparación del DNA (véase cuadro 12-5). Como se comentó al principio del capítulo, algunas DNA poli­ merasas son capaces de replicar el DNA a velocidades elevadas y con gran fidelidad (pocos errores). Estas polimerasas son muy eficientes porque tienen sitios activos que solo permiten el ingre­ so estricto de cuatro nucleótidos de DNA normales (adenina, guanina, citosina y timina). Como consecuencia de esta especifi­ cidad, los moldes de DNA distorsionados y las bases anormales no pueden ingresar con facilidad dentro del sitio activo de la en­ zima. Cuando se encuentran estos errores en el molde de DNA, las DNA polimerasas que trabajan con gran fidelidad se detienen y no pueden saltear la lesión. Otras DNA polimerasas tienen menor fidelidad, pero pueden saltear distorsiones en el molde de DNA, Estas DNA polimerasas “translesionales” especializadas suelen tener sitios activos más abiertos y pueden aceptar y copiar moldes con bases anormales, estructuras distorsionadas y lesiones voluminosas. Por ende, es­ tas enzimas especializadas pueden saltear estos errores, pero, co­

mo sus sitios activos son más abiertos y accesibles, tienden a cometer más equivocaciones. Durante la replicación se suelen utihzar enzimas que funcionan muy rápido y con gran fidelidad hasta que aparece un bloqueo en la replicación. En ese punto toman cí mando una o más polimerasas “translesionales” que saltean la lesión y continúan la replicación durante un fragmento corto de DNA. Luego estas polimerasas se separan de la horquilla de re­ plicación y las enzimas que trabajan con gran fidelidad retoman la replicación con mucha precisión y velocidad elevada. Con fre­ cuencia las enzimas que reparan el DNA arreglan errores produ­ cidos por las polimerasas que saltean lesionas, aunque algunos de estos errores pueden escapar a la detección y provocar mutacio­ nes.

CONCEPTOS CLAVE Hay por lo menos 13 DNA polimerasas diferentes en las células eucariontes. Las DNA polimerasas a y 5 se encar­ gan de la replicación en las cadenas líder y retrasada. Las polim erasas especializadas en actuar ante la presencia de lesiones sirven para saltear distorsiones en el m olde de DNA, que, de lo contrario, detendrían la actividad de las DNA polimerasas principales.

Ensamblaje del nucleosoma. El DNA de los eucariontes for*ma complejos con las proteínas histonas para crear estructuras denominadas nucleosomas que contribuyen a mantener la estabi­ lidad y el empaquetamiento de la molécula de DNA (véase fig. 11-6). Es probable que durante la replicación se produzca la de­ sestructuración y el reensamblaje de los nucleosomas en el DNA

336 Capítulo 12

■*

* . ' t'*

Vjf

' i»

’

Fig. 1 2 - 1 7 . Esta microfotografia electrónica del DNA eucarionte en proceso de replicación muestra con claridad que el DNA recién replicado ya e s tá cubierto con nucleosomas (circuios oscuros). (Victoria Foe.) recién sintetizado, pero el mecanismo preciso que permite estos procesos todavía no se ha determinado. El desenrollamiento de la doble cadena de DNA y el ensamblaje de las enzimas encargadas de la replicación sobre los moldes de cadena simple podrían re­ querir desarmar la estructura de los nucleosomas. Las microfotografías electrónicas obtenidas de DNA de células eucariontes, co­ mo la de la figura 12-17, muestra DNA recién replicado que ya está cubierto por nucleosomas, lo que indica que la estructura del nucleosoma se vuelve a formar con rapidez.

Antes de la replicación hay una sola molécula de DNA asocia­ da con proteínas histonas. Después de la replicación y del ensam­ blaje del nucleosoma hay dos moléculas de DNA asociadas con proteínas histonas. ¿Permanecen juntas las histonas originales, unidas a una de las moléculas de DNA nuevas, o se separan y se mezclan con histonas nuevas sobre ambas moléculas de DNA? Se emplearon técnicas similares a las aplicadas por Meselson y Stahl para determinar el modo de replicación del DNA con el fin de responder a esta pregunta. Se cultivaron las células durante va­ rias generaciones en un medio con aminoácidos marca­ dos con un isótopo pesado. Las proteínas histonas incor­ Experimento poraron estos aminoácidos pesados y se tomaron densas Pregunta: ¿qué ocurre con las histonas durante la (fig. 12-18). Luego se transfirieron las células a un medio replicación del DNA eucarionte? de cultivo con aminoácidos marcados con un isótopo li­ viano. Las histonas que se ensamblaron después de la Método H Cultive células durante vanas i I Transfiera las células a un j generaciones en un meaio | medio que contenga transferencia poseían los aminoácidos livianos nuevos y I que contenga aminoácidos I aminoácidos marcados con un eran menos densas. i marcados con un isótopo | isótopo liviano. ^ Después de la replicación, se aislaron los octámeros I pesado. í de histonas y se centrifugaron en función del gradiente .? ..... ........... " jr .... ............. de densidad. Los resultados demostraron que, después de la replicación, los octámeros formaban bandas conti­ Cambio nuas entre las de densidad elevada (que representaban Replicación de medio / octámeros antiguos) y las de densidad baja (que repre­ sentaban octámeros nuevos). Este hallazgo sugiere que los octámeros nuevos están compuestos por una mezcla Aislamiento j á Aísle octámeros de histonas Aislamiento de octámeros ■ antes de la replicación y de octámeros al azar de histonas nuevas y antiguas. I

I después de ésta...

C e n trifu g a c ió n iQ ...y sométalos a centrifugación ^ en gradiente de densidad.

Resultados

B

Centrifugación'

i

^

los octámeros recien sintetizados i son menos densos y se concentran ! en zonas mas altas del tubo.

H

m

Los octámeros antiguos son densos y se desplazan hacia el |! fondo del tubo.

Banda ijnica; octámeros antiguos con aminoácidos pesados

Banda ancha; octámeros compuestos por una mezcla de histonas antiguas y nuevas (aminoácidos pesados y livianos)

Conclusión: después de la replicación del DNA, los octámeros nuevos reensamblados son una mezcla al azar de histonas ^antiguas y nuevas. ______^

Fig, 1 2 - 1 8 . Experimento que permite estudiar el modo de disociación y de reasociación de los nucleosomas durante la replicación.

CONCEPTOS CLAVE Después de la replicación del DNA se vuelve a producir el ensam blaje inmediato de nucleosomas nuevos en la m olécula de DNA. Se cree que los nucleosomas se destruyen durante la replicación y se vuelven a ensam blar a partir de una m ezcla al azar de histonas antiguas y nuevas.

Localización de la replicación dentro del núcleo. Sue­ le considerarse que las DNA polimerasas que llevan a ca­ bo la replicación son elementos que se mueven a través del molde de DNA, en forma bastante similar a una locomo­ tora que viaja a través de las vías del tren. Evidencias re­ cientes sugieren que esta teoría es incorrecta. Una versión más exacta indica que la polimerasa está fija en su sitio, el molde de DNA la atraviesa y las moléculas de DNA nue­ vas aparecen a través del otro extremo. Las técnicas de microscopía de fluorescencia, que son capaces de revelar sitios activos de síntesis de DNA, de-

Replicadón y recombinación del DNA 33' muestran que la mayor parte de la replicación en el núcleo de una célula eucarionte se produce en una cantidad limitada de sitios fi­ jos, con frecuencia denominados fábricas de replicación. Las microfotografías tomadas a intervalos regulares revelan que el DNA recién duplicado sale de estos sitios específicos. En las células bacterianas se obtuvieron resultados similares. Síntesis de DNA en los extremos de los cromosomas. Una di­ ferencia fundamental entre la replicación eucarionte y la procarionte es que los cromosomas eucariontes son lineales y, por en­ de, tienen extremos. Como ya se comentó, el grupo 3’-OH nece­ sario para la replicación realizada por las DNA polimerasas pro­ viene de cebadores de RNA que se encuentran en los orígenes de la replicación y que son sintetizados por primasas. Esta solución es temporaria porque finalmente los cebadores deben eliminarse y sustituirse por nucleótidos de DNA. En una molécula de DNA circular, la elongación alrededor del círculo hace que finalmente aparezca un grupo 3’-OH justo frente al cebador (fig. 12-19a). Una vez eliminado el cebador, los nucleótidos de DNA de repo­ sición pueden unirse a este grupo 3’-0H. En los cromosomas lineales que tienen muchos orígenes, la elongación del DNA en replicones adyacentes también aporta grupos 3’-OH antes de cada cebador (fig. 12-19b). No obstante, en el extremo del cromosoma lineal no hay un fragmento adya­ cente de DNA replicado que aporte este grupo 3’-OH crucial. Una vez eliminado el cebador en el extremo del cromosoma no puede sustituirse por nucleótidos de DNA y determina la apari­ ción de un espacio en el extremo del cromosma, lo que sugiere que ef cromosoma se acorta en forma progresiva con cada ciclo de replicación. El cromosoma sería más corto en cada generación y finalmente en algún momento se eliminaría el telómero por completo, lo que desestabilizana el cromosoma y produciría la muerte de la célula. Pero los cromosomas no se acortan con cada ciclo ni se desestabilizan; entonces, ¿cómo se replican los extre­ mos de los cromosomas lineales? Los extremos de los cromosomas lineales -los telómeros- po­ seen varias características únicas, una de las cuales es la presen­ cia de muchas copias de una secuencia corta repetida. En el protozoo Tetrahymena, esta repetición telomérica es CCCCAA (véa­ se cuadro 11-2) y la cadena rica en G típica sobresale más que la cadena rica en C (fig. 12-20a): Extremo del cromosoma

hacia el 3’ -GGGGTTGGGGTT centrómero

El extremo sobresaliente de la cadena simple que forma el teló­ mero puede extenderse gracias a la acción de la telomerasa, una en­ zima compuesta tanto por una proteína como por RNA (también de­ nominada ribonucleoproteína). La parte de la enzima compuesta por RNA contiene entre 15 y 22 nucleótidos complementarios con la secuencia de la cadena rica en G. Esta secuencia se aparea con el extremo 3’ sobresaliente del DNA (fig. 12-20b) y se convierte en un molde para la síntesis de copias adicionales del DNA de las repeti­ ciones. Los nucleótidos de DNA se agregan al extremo 3’ de la ca­ dena de a uno por vez (fig. 12-20c) y, después del agregado de mu­ chos nucleótidos, el molde de RNA se traslada sobre el DNA en di­ rección 3’ y se agregan más nucleótidos en este extremo (fig. 122 0 (1 ). Por lo general, se agregan entre 14 y 16 nucleótidos al extre­ mo 3’ de la cadena rica en G. De esta manera la telomerasa puede extender el extremo 3’ del cromosoma sin usar un molde de DNA complementario (fig. 1220e). No está clara la manera en que se sintetiza la cadena rica en

La replicación alrededor del círculo proporciona un grupo 3'-0H frente al primer cebador sobre el que pueden añadirse nucleótidos cuando se reemplaza el cebador.

(a) DNA circular C ebador

oh

Replicación alrededor del círculo

(b) DNA lineal

r t En el DNA lineal con mi ' os i i orígenes de replicación:

Telóm eros

■

C ebador n

.... la elongación del DNA en Replicación y replicones adyacentes proporcional desenrollam iento el grupo 3'-0H para el reemplazo de los cebadores.

”

Los cebadores en los extremos de los cromosomas no pueden reemplazarse porque no íiay grupos 3'-0H adyacentes al que puedan unirse los nucleótidos, |

'.. ................ ¥ 3'OH

y

Cebador Ip j Cuando se elimina el cebador i en el extremo del cromosoma

-Km 5' Cebador

M uesca dejada ....no hay un grupo 3'-0H al que puedan unirse los nucleótidos de DNA, lo que produce por la elim inación del ceb ad o r una muesca.

Conclusión; en ausencia de mecanismos especiales, la replicación del DNA deja muescas debido a la eliminación de los cebadores en los extremos de los cromosomas.

Fig. 1 2 - 1 9 . La sín tesis del DNA en los extremos de los cromosomas circulares debe ser diferente de la de los extremos de los cromosomas lineales.

338 Capítulo 12 C complementaria (fig. 12-20f). Ésta podría sintetizarse por me­ dio de replicación convencional, con una DNA polimerasa a que sintetice un cebador de RNA en el extremo 5 ’ del molde extendi­ do (rico en G). La eliminación de este cebador vuelve a dejar un espacio en el extremo 5’ del cromosoma, pero que no es impor­ tante porque el extremo del cromosoma se extiende con cada re­ plicación gracias a la acción de la telomerasa; no se pierde infor­ mación genética y el cromosoma no se acorta. El extremo exten­ dido de la cadena simple puede plegarse sobre sí mismo y formar un bucle terminal por medio de un apareamiento de bases no con­ vencional (fig. 12-21). Este bucle podría aportar un grupo 3 ’-OH para la unión de los nucleótidos de DNA a lo largo de la cadena rica en C. La telomerasa está presente en los organismos unicelulares, en las células germinales, en las primeras células embrionarias y en algunas células somáticas proliferativas (como, por ejemplo, las células de la médula ósea y las células que cubren el intestino) y todas ellas deben dividirse en forma continua. La mayoría de las células somáticas tienen una actividad de telomerasa escasa o nu­ la y los cromosonras presentes en estas células se acortan en for­ ma progresiva con cada división celular. Estas células solo pue­ den dividirse una cantidad de veces limitada; cuando los telómeros se acortaron más allá de un punto crítico el cromosoma se tor­ na inestable, tiende a sufrir reordenamientos y se degrada. Estos eventos conducen a la muerte de la célula. El acortamiento de los telómeros podría contribuir al proceso de envejecimiento. Los telómeros de ratones sometidos a proce­ sos de ingeniería genética que determinaron la falta de un gen funcional que codifique para la telomerasa (y, en consecuencia, la falta de expresión de telomerasa en las células somáticas o en las germinales) sufren acortamientos progresivos con las generacio­ nes sucesivas. Después de varias generaciones estos ratones reve­ lan algunos signos de envejecimiento prematuro, como pelaje de color gris, pérdida del pelaje y retraso de la cicatrización de las heridas. A través de ingeniería genética también se pueden pro­ ducir células somáticas que expresen telomerasa. En estas células los telómeros no se acortan, se inhibe el envejecimiento celular y las células se dividen en forma indefinida. Las telomerasas también parecen cumplir una función en el de­ sarrollo del cáncer. Las células neoplásicas pueden dividirse en forma indefinida y muchas células tumorales ejípresan la enzima telomerasa. Como se comentará en el capítulo 21, el cáncer es un proceso complejo compuesto por muchos pasos y suele requerir mutaciones en por lo menos varios genes. La activación aislada de la telomerasa no produce la proliferación neoplásica en la ma­ yoría de las células, pero parece ser necesaria junto con otras mu­ taciones para el desarrollo de esta enfermedad.

Li relomero tiene un ex:remo sobresaliente con una secuencia rica en repeticiones de !a base G.

(a)

. La parte de la telomerasa compuesta por RNA es complementaria con la cadena rica en G, se aparea con ella y proporciona un molde para la síntesis de I copias de las repeticiones.

Telomerasa

(b) RNA molde

3'í,

be anaden nucleótidos al extremo | j de la cadena rica en G.. I

3 ’

(c) 3' DNA nuevo

Después del agregado de vanos nucleótidos. el molde de RNA se mueve a lo largo de! DNA.

(d)

5'

' 3'

! Se añaden más nucleótidos.

Ce)

..

3'

Se elimina la telomerasa. .

3-

3'[GCCCTTCCCCn

CONCEPTOS CLAVE i Se produce la síntesis en la-cadena complementaria i (véase fig. 12-21), que llena la muesca producida por : la eliminación del cebador de RNA en el extremo. (f)

3' extiende el DN A y llena eliminación del cebador de

Los extrem os de los cromosomas eucariontes se replican gracias a la existencia de una enzima compuesta por pro­ teínas y RNA denom inada telomerasa. Esta enzima ag re ­ ga nucleótidos adicionales a la cadena de DNA rica en G que form a el telómero.

Conclusión: la telom erasa

la muesca

dejada por la

RNA.

Replicación en las arqueobacterias Fig. 1 2-20. La enzima telomerasa es responsable de la replicación de los extremos de los cromosomas.

El proceso de replicación en las arqueobacterias comparte va­ rias características con la replicación en las células eucariontes

RepLicadón y recombinación deL DNA 3 3'

t

CCCCTTCCCCTlCCCCTTCGCCTTGGCG

EI extremo de la cadena simple rica en G extendido por la telomerasa puede plegarse sobre sí mismo...

OGCCTTuCCG OH 3 ' CGGlTr(.(.GrrG(.GGÍ

de moléculas de DNA diferentes, partes de las moléculas se in­ tercambian en forma precisa y luego se unen las piezas de mane­ ra correcta. En esta serie complicada de eventos no se pierde ni se gana información genética. Aunque el mecanismo molecular preciso de la recombinación homóloga solo se concoe en forma imprecisa, es probable que el intercambio se desarrolle a través de pares de bases complementarias. Una molécula de DNA de ca-

5' Si el entrecruzamiento se produjera antes de la síntesis del DNA

/ Apareamiento de /bases no convencional ^ y formar un bucle terminal por I medio de un apareamiento de I bases no convencional... :

,®

;.

El corte en el T plano vertical.

,..,y la reasodación de las cadenas de nucleótidos,...

,,,,y la reasocia­ ción de las cade­ nas de nucleótidos,.

R e c o m b in a n te s no someti­ dos a e n tre c ru z a m ie n to

..

M

B'

V a

CONCEPTOS CLAVE Hay varias proteínas que cumplen funciones en la recom ­ binación, como RecA, RecBCD, RuvA, RuvB, resolvasa, proteínas de unión a cadena simple, ligasa, DNA polimerasas y girasa.

....produce recombinantes no sometidos a entrecruzamiento, compuestos por dos moléculas heterodúplex.

R e co m b in a n te s so m e ti­ d o s a e n tre cru za m ie n to ' /I

V a

| !

í i

b

]

.... produce recombinantes sometidos a entrecruzamiento compuestos por dos moléculas heterodúplex .

Conclusión: el m odelo de Holliday predice la presencia de

■ DNA recom binante sin entrecruzam iento y con él, seg ú n el i corte se produzca en e! plano horizontal o en el p la n o vertical.'

42 Capítulo 12

RELACIÓN DE CONCEPTOS ENTRE CAPÍTULOS

I S e alin e a n d os m o lé cu las de D N A de c a d e n a d o b le de c ro m o s o m a s h o m ó lo g o s.

m S e p ro d u c e un co rte de la c a d e n a d o b le e n un a d e las i

m o lé cu las.

3 'i ■3 '

K Í S e e lim in a n los n u cle ó tid o s 1 d e u n a d e las c a d e n a s por I m e d io de re accio n e s i e n z im áticas y se p ro d u c e una I

c a n tid a d d e te rm in a d a de D N A

— i d e c a d e n a sin ip le a ca d a lado.

• 3' U n e x tre m o libre 3 in va d e y

Q

d esp laz a un a c a d e n a de la m o lé c u la de D N A q u e no su frió cortes.

< Q

L u e g o se a la rg a el e xtrem o 3', lo q u e d esp laz a to d avía i

Q

m ás la c a d e n a o riginal.

La c a d e n a d es p la z a d a fo rm a un b u cle cu yas bases se a p a re a n co n las d e la m o lé c u la d e D N A escin dida.

►3 ' 5 ' » I La síntesis del D N A se inicia en el e x tre m o 3 ' de la c a d e n a in fe rio r y el b u c le d esp laz ad o se utiliza c o m o m olde.

1 1 ^ U n io n e s H o llid a y

Q

La aso c ia ció n d e las ca d e n a s

I

p ro d u c e dos u n io n e s H o llid a y j q u e p u e d e n se p ararse p or ^m edio de co rte s y re aso c ia cio n e s.

i ] |

<

Fig. 12-24. En el m o d elo de co rte de la ca d e n a d o b le , la recom bin a ció n im p lica un corte de la ca d e n a d o b le en un d ú p le x d e DNA, el d e s p la z a m ie n to d e la c a d e n a , la s ín t e s is del DNA y la re so lu c ió n de d o s u n io n e s H o llid ay.

Este capítulo avanzó sobre un concepto central presentado en el capítulo 2 , que indica que la divi­ sión celular se produce después de la replicación del material genético. En el capítulo 2 aprendimos que la replicación del DNA se producía durante la fase S del ciclo celular y que varios pasos impedían la división en ausencia de replicación del DNA. El presente capítulo examinó el proceso de síntesis del DNA. A menudo se considera que el DNA es una molé­ cula que se autorreplica, pero nada podría estar más alejado de la verdad. La replicación reciuiere mucho más que un molde de DNA; también se necesita una gran cantidad de proteínas y enzimas. A pesar de es­ ta complejidad unas pocas reglas resumen el proce­ so; 1) toda la replicación es semiconservativa, 2 ) las moléculas de DNA nuevas siempre se alargan desde el extremo 3’ (la replicación se produce en dirección 5’ ^ 3’), 3) la replicación comienza en secuencias denominadas orígenes y recjuiere cebadores de RN 4 para iniciar el proceso, 4) la síntesis de DNA se desarrolla de manera continua sobre una cadena y discontinua sobre la otra y 5) las cadenas de nucleó­ tidos recién sintetizadas son antiparalelas y comple­ mentarias con sus moldes. La replicación se desarrolla con un nivel elevado de precisión; esta precisión es esencial para mante­ ner la integridad de la información genética a medi­ da que las moléculas de DNA se copian una y otra vez. La precisión de la replicación se mantiene gra­ cias a varios mecanismos diferentes, como, por ejemplo, la exactitud de la selección de los nucleó­ tidos, la capacidad de las DNA polimerasas para co­ rregir durante la lectura y para reparar los errores, y la detección y la reparación de los errores de apa­ reamiento residuales después de la replicación (re­ paración de los errores de apareamiento). El conocimiento del proceso de replicación del DNA aporta las bases de varios temas que se pre­ sentarán en capítulos próximos de este libro. En el capítulo 18 (sobre tecnología de DNA recombinante) se examinará la reacción en cadena de la polimerasa y otras técnicas (análisis y clonación de la se­ cuencia de DNA) que requieren el conocimiento de la síntesis de DNA. En el capítulo 17 (sobre muta­ ciones genéticas y reparación del DNA) aprendere­ mos que, a pesar de la exactitud de la síntesis de DNA, surgen errores que a veces producen mutacio­ nes. Estos errores se enfrentan a mecanismos que reparan el DNA, muchos de los cuales requieren la síntesis de DNA. El movimiento de elementos gené­ ticos transponibles (cap. 11) también requiere la síntesis de DNA.

RepLicadón y recombinación del DNA

RESUMEN

m

• La replicación es semiconservativa: las dos cadenas de nucleótidos de DNA se separan y cada una sirve como molde sobre el que se sintetiza una cadena nueva. • Un replicón es una unidad de replicación que contiene un ori­ gen de replicación. 9 En la replicación tetha del DNA las dos cadenas de nucleótidos de una molécula de DNA circular se desenrollan y produ­ cen una burbuja de replicación; en condiciones normales den­ tro de cada burbuja de replicación el DNA se sintetiza en am­ bas cadenas y en ambas horquillas de replicación y produce moléculas de DNA circulares. • La replicación por círculos rodantes comienza en una muesca presente en una cadena del DNA circular que produce un grupo 3’-0H al que se agregan nucleótidos nuevos, mientras que el extremo 5’ de la cadena escindida se desplaza del cír­ culo. La replicación continúa alrededor del círculo y determi­ na el desarrollo de una molécula de DNA circular y una mo­ lécula lineal de cadena simple. • El DNA lineal de las células eucariontes contiene muchos orí­ genes de replicación. En cada origen el DNA se desenrolla y produce dos cadenas de nucleótidos que sirven como moldes. El desenrollamiento y la replicación se desarrollan en ambos moldes en los dos extremos de la burbuja de replicación hasta que los replicones adyacentes contactan, lo que determina la obtención de dos moléculas de DNA lineales. • La síntesis de DNA requiere un molde de DNA de cadena simple, desoxirribonucleósidos trifosfato y un grupo de enzi­ mas y de proteínas que llevan a cabo la replicación. • Toda la síntesis del DNA se produce en la dirección 5’ 3’. Co­ mo las dos cadenas de nucleótidos del DNA son antiparalelas, la replicación se produce en forma continua en una cadena (la ca­ dena líder) y discontinua en la otra (la cadena retrasada). • La replicación comienza cuando una proteína de iniciación se une a un origen de replicación y desenrolla un fragmento cor­ to de DNA, en el que se fija una DNA helicasa. La DNA helicasa desenrolla el DNA en la horquilla de replicación, las proteínas de unión a cadena simple se unen a cadenas de nu­ cleótidos simples para evitar que se renaturalicen y la DNA girasa (una topoisomerasa) elimina la tensión proximal a la horquilla de replicación producida por el desenrollamiento. • Durante la replicación, la primasa sintetiza cebadores cortos

de nucleótidos de RNA que aportan un grupo 3’-OH al que la DNA polimerasa puede unir nucleótidos de DNA. • La DNA polimerasa agrega nucleótidos nuevos al extremo 3’ de una cadena polinucleotídica proliferativa. Las bacterias tienen dos DNA polimerasas que cumplen sus funciones prin­ cipales en la replicación: la DNA polimerasa IH, que sintetiza DNA nuevo sobre las cadenas líder y retrasada, y la DNA po­ limerasa I, que elimina y reemplaza a los cebadores. • La DNA ligasa sella las muescas que permanecen en las es­ tructuras de azúcar y fosfato cuando los cebadores de RNA son sustituidos por nucleótidos de DNA. • Hay varios mecanismos que aseguran el índice de precisión elevado de la replicación, como la selección exacta de los nu­ cleótidos, la reparación durante la lectura (proofreading) y la reparación de los errores de apareamiento. • La replicación en las células eucariontes es similar a la repli­ cación bacteriana, aunque los eucariontes poseen muchos orí­ genes de replicación y DNA polimerasas distintas. • La rephcación precisa en muchos orígenes es posible gracias a un factor permisivo que debe unirse a un origen para que comience la replicación. El factor pennisivo se elimina después de iniciada la replicación y se renueva después de la división celulai'. • Los nucleosomas eucariontes se ensamblan con rapidez sobre las moléculas de DNA nuevas; los nucleosomas recién en­ samblados están compuestos por una mezcla al azar de pro­ teínas histonas antiguas y nuevas. • La enzima telomerasa replica los extremos de las moléculas lineales del DNA eucarionte. « La replicación en las arqueobacterias comparte varias caracte­ rísticas con la replicación en las células eucariontes. • La recombinación homóloga consiste en el intercambio de material genético entre moléculas de DNA homologas. Puede comenzar con el corte de la cadena simple en las dos molécu­ las de DNA, seguido por el desplazamiento de la cadena, la migración de la rama y la resolución de la unión Holliday. Otra forma comienza con escisiones de doble cadena, que luego se asocian con el desplazamiento de la cadena, la sínte­ sis del DNA y la resolución de las dos uniones Holliday. • La recombinación homóloga en E. coli requiere varias enzi­ mas, como RecA, RecBCD, resolvasa, proteínas de unión de cadena simple, ligasa, DNA polimerasas y girasa.

TERMINOS ¡MPORTáNTES replicación semiconservativa (p. 320) centrifugación en gradiente de densidad (p. 321) replicón (p. 321) origen de replicación (p, 321) replicación theta (p. 321) burbuja de replicación (p. 321) horquilla de replicación (p. 321) replicación bidireccional (p. 322) replicación por círculos rodantes (p, 322)

DNA polimerasa (p. 325) replicación continua (p. 325) cadena líder (p. 325) replicación discontinua (p. 325) cadena retrasada (p. 325) fragmento de Okazaki (p, 325) proteína de iniciación (p. 328) DNA helicasa (p. 328) proteína de unión a cadena simple (SSB) (p. 328)

DNA girasa (p. 328) primasa (p. 329) cebador o prim er (p. 329) DNA polimerasa III (p, 329) DNA polimerasa I (p. 329) DNA ligasa (p. 331) corrección durante la lectura {proof­ reading') (p. 332) reparación de los errores de apareamiento (p. 332)

344 Capítulo 12

secuencia de replicación autónoma (ARS) (p. 334) factor permisivo de la replicación (p. 334) DNA polimerasa a (p. 335)

telomerasa (p. 337) recombinación homóloga (p, 339) heterodúplex de DNA (p. 340) unión Holliday (p. 340)

DNA polimerasa 5 (p. 335) DNA polimerasa e (p. 335) DNA polimerasa P (p. 335) DNA polimerasa y (p. 335)

Problemas 1. El siguiente diagrama representa las cadenas molde de una bur­ buja de replicación en una molécula de DNA. Dibuje las cadenas re­ cién sintetizadas e identifique las cadenas líder y retrasada. Origen

5'-

3'

3 ''

5'

2. Considere el experimento realizado por Meselson y Stahl, en el que usaron y *^N en cultivos de E. coli y centrifugación de equilibrio en gradiente de densidad. Dibuje y represente las ban­ das producidas por el DNA bacteriano en el tubo de acuerdo con el gradiente de densidad antes de introducir el medio con ''^N y después de uno, dos y tres ciclos de replicación posteriores a la introducción del medio con Use varias ilustraciones para mostrar las bandas que aparecerían si la replicación fuera (a) semiconservativa, (b) conservativa y (c) dispersiva.

• Solución Solución Para identificar las cadenas líder y retrasada primero debe deter­ minarse cuál de los extremos de cada molde es 5’ y cuál es 3’. Con un lápiz dibuje las cadenas que se sintetizan sobre estos moldes e identifique sus extremos 5’ y 3’, y recuerde que las cadenas recién sintetizadas deben ser antipai'alelas con respecto a los moldes. Origen

Luego, determine la dirección de la replicación en cada cadena nueva, que debe respetar la dirección 5’ ->?3’. Debe dibujar fle­ chas sobre las cadenas nuevas para indicar la dirección de la re­ plicación. Después de establecer la dirección de la replicación en cada cadena, mire ambas horquillas e indique si la dirección de replicación en cada cadena es la misma que la dirección del de­ senrollamiento. La cadena que mantiene la misma dirección que el desenrollamiento es la cadena líder. La cadena que se dirige en sentido contrario al desenrollamiento es la cadena retrasada. Confirme que tenga una sola cadena líder y una sola cadena re­ trasada en cada horquilla. Origen

El DNA marcado con *^N es más pesado que el marcado con '■^N; por ende, el DNA marcado con ^®N desciende hasta un sec­ tor más bajo en el tubo en función del gradiente de densidad. An­ tes de cambiar al medio que contiene '^N, todo el DNA bacteria­ no posee '-^N y produce una sola banda en la parte inferior del tu­ bo. a. Cuando la replicación es semiconservativa las dos cadenas se separan y cada una sirve como molde sobre el que se sintetiza una cadena nueva. Después de un ciclo de replicación, la cadena molde original de cada molécula posee '^N y la cadena nueva de cada molécula contiene '"'^N, de manera que aparece una sola ban­ da en el gradiente de densidad que se ubica en una posición in­ termedia entre las posiciones esperadas para el DNA con ^^N y para el DNA con '"'^N. Durante el siguiente ciclo de replicación las dos cadenas se vuelven a separar y sirven como moldes para formar cadenas nuevas. Cada cadena nueva solo posee ’"^N, por lo que algvmas moléculas de DNA contienen una cadena con original y una cadena con '"'^N nuevo, mientras que otras molécu­ las poseen dos cadenas con '"'N. Esta marcación produce dos ban­ das, una en posición intermedia y otra en un sitio superior del tu­ bo. Los ciclos adicionales de replicación producirán mayor can­ tidad de DNA solo con ^‘^N; de manera que la banda superior se tornará más oscura.

>

s

Replicación

R eplicación

Replicación

Retrasada Antes del agre­ gado de *''N

Desenrollamiento

Origen

D espués de un ciclo de repli­ cación

Después de dos Después d e tres ciclos de replica- ciclos de rep lica­ ción ción

Desenrol lamiento

J

RepLicación y recombinadón deL DNA b. Cuando la replicación es conservativa, toda la molécula sir­ ve como molde. Después de un ciclo de replicación, algunas mo­ léculas solo poseen y otras solo están compuestas por esto implica la aparición de dos bandas. Los siguientes ciclos de replicación aumentan la fracción de DNA con nuevo; de es­ ta manera, la banda superior se toma más oscura. Sin embargo, el DNA original con ^^N permanece, por lo que persisten las dos bandas.

R eplicación

Antes del agregado

D espués de un ciclo de replicación

de >'*N

Replicación

Antes del agregado de “'N

Replicación

D espués de un ciclo de repli­ cación

R eplicación

D espués de dos ciclos de replicación

Después de tres ciclos de replicación

c. Cuando la replicación es dispersiva, ambas cadenas de nucleótidos se disgregan en fragmentos para servir como mol­ des para la síntesis de DNA nuevo. Luego los fragmentos se vuelven a ensamblar y forman moléculas de DNA. Después de un ciclo de replicación, todo el DNA debe contener aproxima­ damente la mitad de '^N, y la mitad de ''^N, y producir una so­ la banda que se encuentra en una posición intermedia entre la esperada para el DNA marcado con '^N y la esperada para el DNA marcado con ’^^N. Al producirse ciclos de replicación adicionales, la proporción de *^N en cada molécula aumenta y persiste una sola banda híbrida, pero su posición en el gra­ diente de densidad asciende. También se espera que la banda se oscurezca a medida que se incremente la cantidad total de DNA.

> R eplicación

=

Replicación

Después de dos ciclos de replicación

D espués de tres ciclos de replicación

3. El cromosoma de E. coli tiene 4,7 millones de pares de bases de DNA. Si la síntesis en cada horquilla de replicación se realiza a una velocidad de 1 000 nucleótidos por segundo, ¿cuánto tarda la replicación de todo el cromosoma de E. coli mediante replica­ ción theta?

• Solución Los cromosomas bacterianos poseen un solo origen de replica­ ción y la replicación tetha suele emplear dos horquillas de repli­ cación, que avanzan a través del cromosoma en direcciones opuestas. Esto determina una velocidad global de replicación pa­ ra todo el cromosoma de 2000 nucleótidos por segundo. Si hay 4,7 millones de pares de bases de DNA, todo el cromosoma se re­ plicará en: 4 700 000 p b

X

1 seg 2 000 pb

= 2 350 seg X = 39,17 minutos

1 minuto

60 seg

Al comienzo de este capítulo, se dijo que E. coli era capaz de dividirse cada 20 minutos. ¿Cómo es posible esta velocidad si tarda casi el doble en replicar su genoma? La respuesta es que un segundo ciclo de replicación comienza antes que finalice el pri­ mer ciclo. Por lo tanto, cuando una célula de E. coli se divide, los cromosomas que se transmiten a las células hijas ya se replicaron en forma parcial. En cambio, las células eucariontes replican to­ do su genoma una sola vez en cada ciclo celular.

PREGUNTAS DE COMPRENSION 1. ¿Qué es la replicación semiconservativa?

*2. ¿Cómo demostraron Meselson y Stahl que la replicación en E. coli se producía en forma semiconservativa?

rionte lineal. En su ilustración identifique 1) el origen, 2) la polaridad (extremos 5’ y 3’) de todos los moldes y de las cadenas nuevas, 3) las cadenas líderes y las retrasadas, 4) los fragmentos de Okazaki y 5) la localización de los cebadores.

*3. Dibuje una molécula de DNA sujeta a replicación theta.

En su ilustración identifique 1) el origen, 2) la polaridad (extremos 5’ y 3’) de todos los moldes y de las cadenas nuevas, 3) las cadenas líderes y las retrasadas, 4) los frag­ mentos de Okazaki y 5) la localización de los cebadores.

6 . ¿Cuáles son los requisitos principales para la replicación?

*7. ¿Qué sustratos se utilizan para la reacción de síntesis del DNA?

4. Dibuje una molécula de DNA sujeta a replicación por cír­

8 . Enumere las diferentes proteínas y enzimas que partici­

culos rodantes. En su ilustración identifique 1) el origen, 2) la polaridad (extremos 5’ y 3’) de todos los moldes y de las cadenas nuevas, 3) las cadenas líderes y las retrasa­ das, 4) los fragmentos de Okazaki y 5) la localización de los cebadores.

pan en la replicación bacteriana. Comente la función de cada una en el proceso de replicación.

5. Dibuje una molécula de DNA sujeta a replicación euca-

9. Qué similitudes y diferencias pueden destacarse en las ac­

tividades enzimáticas de las DNA polimerasas L II y III? ¿Cuál es la función de cada tipo de DNA polimerasa en las células bacterianas?

346 Capítulo 12 *'10. ¿Por qué se necesita primasa para la replicación?

milar a la replicación bacteriana y en qué aspectos se di­ ferencia?

11. ¿Cuáles son los tres mecanismos que aseguran la preci­

sión de la replicación en las bacterias?

14. Describa con palabras y con figuras la forma en que se

replican los telómeros presentes en los extremos de los cromosomas eucariontes.

12. ¿De qué manera los factores permisivos de la replicación

aseguran que la replicación del DNA solo se produzca una vez por ciclo celular en cada origen?

*15. ¿Cuáles son algunas de las enzimas que participan

en la recombinación de E. coli y qué funciones cumplen?

‘‘13. ¿En qué aspectos la replicación en los eucariontes es si­

PREGUNTAS Y PROBLEMAS DE APLICACION *16. Suponga que en el futuro un científico explora un planeta

distante y descubre una forma original de ácido nucleico de doble cadena. Cuando este ácido nucleico se expone a las DNA polimerasas de E. coli la replicación se produce en forma continua en ambas cadenas. ¿A qué conclusión puede arribar en relación con la estructura de este ácido nucleico diferente?

de este cromosoma circular por medio de replicación por círculos rodantes? Ignore la replicación de la cadena des­ plazada en el modelo por círculos rodantes. 20. Una bacteria sintetiza DNA en cada horquilla de replica­ ción a una velocidad de 1 000 nucleótidos por segundo.

Si esta bacteria replica todo su cromosoma circular por medio de replicación theta en 30 minutos, ¿cuántos pares de bases de DNA tendrá este cromosoma?

*17. Se necesita fósforo para sintetizar los desoxirribonucleó-

sidos trifosfato utilizados en la replicación del DNA. Un genetista cultiva algunas bacterias E. coli en un medio con fósforo radiactivo durante muchas generaciones. Lue­ go transfiere una muestra de la bacteria a un medio con un isótopo radiactivo del fósforo (^^P). Se retiran mues­ tras de las bacterias inmediatamente después de la trans­ ferencia y después de uno y de dos ciclos de replicación. ¿Cuál será la distribución de la radiactividad en el DNA de las bacterias de cada muestra? ¿Se detectará radiactivi­ dad en ninguna, en una o en ambas cadenas de DNA?

*21. El siguiente diagrama representa una molécula de DNA

sujeta a replicación. Dibuje las cadenas de DNA nuevas e identifique los siguientes elementos: a. Polaridad de las cadenas nuevas b. Cadenas líderes y retrasadas c. Fragmentos de Okazaki d. Cebadores de RNA Origen

18. Se cultiva una línea de células de ratón en un medio con

'^N durante muchas generaciones. Luego se toman célu­ las en fase Gj y se cambian a un medio nuevo que contie­ ne ’^^N. Dibuje un par de cromosomas homólogos perte­ necientes a estas células en los siguientes estadios y muestre las dos cadenas de DNA halladas en los cromo­ somas. Use colores distintos para representar las cadenas con ''^N y con ’^N. a. Las células en Gj antes de cambiarlas al medio con b. Las células en G, después de cambiarlas al medio con

3'-

5'

5 '’

3'

Desenrollamiento

Desenrollamiento Origen

14n

c. Las células en anafase de la mitosis después de cambiar­ las al medio con ^"'^N d. Las células en metafase I de la meiosis después de cam­ biarlas al medio con ’"^N e. Las células en anafase II de la meiosis después de cam­ biarlas al medio con '"^N

*22. Qué efecto sobre la replicación del DNA producirían

mutaciones destructoras de cada una de las siguientes ac­ tividades de la DNA polimerasa I? a. actividad de exonucleasa 3’ —> 5’ b. actividad de exonucleasa 5’ ^ 3’ c. actividad de polimerasa 5’ 3’

*19. Una molécula de DNA circular contiene ] miUón de pa­

res de bases. Si la velocidad de síntesis de DNA en una horquilla de replicación es de 100 000 nucleótidos por minuto, ¿cuánto tiempo tardará la replicación theta en re­ plicar la molécula completa, si se asume que la replica­ ción theta es bidireccional? ¿Cuánto tardará la replicación

23. ¿Cómo se afectaría la replicación del DNA en una célula

si careciera de topoisomerasa? *24. Una línea de células de mamífero posee una mutación

que destruye el factor permisivo de la replicación. ¿Qué

RepLicación y recombinadón del DNA 3efecto ejercería esta mutación en las células? ¿Qué efec­ to ejercería si las células poseyeran una mutación que determina que el factor permisivo permanezca unido a los orígenes incluso después de la replicación?

25. Varios científicos que estudian tratamientos para el cáncer

se interesaron en la telomerasa. ¿Por qué podrían estar in­ teresados en la telomerasa? ¿Cómo podrían funcionar los tratamientos para el cáncer dirigidos a la telomerasa?

PREGUNTAS AVANZADAS 26. Una mutación condicional expresa su fenotipo mutante

solo en ciertas situaciones (condiciones restrictivas) y el fenotipo normal en otras circunstancias (condiciones per­ misivas). Un tipo de mutación condicional es una muta­ ción sensible a la temperatura que expresa el fenotipo mutante solo en presencia de ciertas temperaturas. Las cepas aisladas de E. coli contienen mutaciones sensi­ bles a la temperatura en los genes que codifican diversos componentes de la maquinaria encargada de la replica­ ción. En cada una de estas cepas, la proteína producida por el gen mutante no es funcional cuando se presenta la con­ dición restrictiva. Estas cepas se cultivan en condiciones permisivas y luego el medio se modifica en forma abrupta para que se presente la condición restrictiva. Después de un ciclo de replicación con condiciones restrictivas, se aís­ la y se analiza el DNA de cada cadena. ¿Qué mutación sensible a la temperatura esperaría hallar en el DNA aisla­ do de cada cepa de la siguiente lista? a. En el gen que codifica la DNA ligasa b. En el gen que codifica la DNA polimerasa I c. En el gen que codifica la DNA polimerasa III d. En el gen que codifica la primasa e. En el gen que codifica a proteína de iniciación

"'27. La regulación de la replicación es esencial para la estabi­

lidad del genoma y, en condiciones normales, el DNA solo se replica una vez por ciclo celular (durante la fase S). Las células normales producen proteína A, que au­ menta su concentración durante la fase S. Sin embargo, en las células que tienen una copia mutada del gen para la proteína A, la replicación se produce en forma conti­ nua durante todo el ciclo celular y esto determina que las células puedan tener una cantidad de DNA 50 veces ma­ yor que la normal. En condiciones normales, la proteína B está presente en G,, pero desaparece del núcleo celular durante la fase S. En las células con una copia mutada del gen para la proteína A, los niveles de proteína B no desaparecen durante la fase S y, en cambio, permanecen elevados durante todo el ciclo celular. Cuando el gen pa­ ra la proteína B está mutado no se observa replicación. Proponga un mecanismo por medio del cual la proteína A y la proteína B podrían regular la transcripción en condi­ ciones normales para que cada célula adquiera la cantidad apropiada de DNA. Explique cómo las mutaciones de es­ tos genes producen los efectos descritos con anterioridad.

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3

TRANSCRIPCION RNA en el mundo primitivo Moléculas de RNA Estructura del RNA Clases de RNA Transcripción: síntesis del RNA a partir de un molde de DNA El molde El sustrato para la transcripción El aparato de transcripción Proceso de transcripción en las bacterias Iniciación Elongación Terminación Proceso de transcripción en los eucariontes Transcripción y estructura del nucleosoma Iniciación de la transcripción Promotores de la RNA polimerasa II Promotores de las RNA polimerasas I y III Elongación Im ag en m o le cu la r d e la rlb o z im a en ca b e z a de m a rtillo (azul) u n id a a l RNA (a n a ra n ja d o ). Las ribozimas son moléculas catalíticas de RNA que pueden haber

sido los primeros portadores de información genética. (K. Eward/Blografx/Photo Researchers.)

RNA en

Terminación Proceso de transcripción en las arqueobacterias

el mundo primitivo

a vida requiere dos funciones básicas. En primer lugar, los organismos vivos deben ser ca-i paces de almacenar y transmitir información genética durante la reproducción en forma confiable. En segundo lugar, deben tener la capacidad de catalizar las transformaciones quími­ cas para iniciar las reacciones que conducen los procesos vitales. Durante mucho tiempo se creyó que las funciones relacionadas con el almacenamiento de la información y con la trans­ formación química eran responsabilidad de dos tipos completamente distintos de moléculas. La información genética está almacenada en los ácidos nucleicos. Antes se sostenía que la ca­ tálisis de las transformaciones químicas era dominio exclusivo de ciertas proteínas que actua­ ban como catalizadores biológicos o ejizimas que determinaban que las reacciones se produje­ ran con rapidez dentro de las células. Esta dicotomía bioquímica -ácido nucleico para la infor­ mación y proteínas para la catálisis- planteó un dilema en nuestra comprensión de las etapas iniciales de la evolución de la vida. ¿Qué apareció primero, las proteínas o los ácidos nuclei­ cos? Si los ácidos nucleicos son portadores de las instrucciones necesarias para codificar las proteínas, ¿de qué manera se generaron las proteínas sin ellos? Por otra parte, dado que los áci-

Transcripción 34' dos nucleicos son incapaces de copiarse a sí mismos ¿de qué modo pudieron generarse sin proteínas? Si el DNA y las proteínas se necesitan mutuamente, ¿cómo pudo comenzar la vida? Esta aparente paradoja desapareció en 1981, cuando Thomas Cech y col. descubrieron que el RNA puede servir como catalizador biológico. Estos científicos comprobaron que el RNA del protozoo Tetrahymena thermophila puede cortar 400 de sus propios nucleótidos en ausencia de toda proteína. Hasta la fecha se han des­ cubierto otros ejemplos de RNA catalíticos en diferentes tipos de células. Estas moléculas de RNA, llamadas ribozimas, pueden cortar partes de sus propias secuencias, conectar ciertas moléculas de RNA entre sí, re­ plicar otras e incluso catalizar la formación de enlaces peptídicos entre los aminoácidos. El descubrimiento de las ribozimas es otra evidencia que sugiere que el material genético original habría sido el RNA. Es probable que las ribozimas que se autorreplican hayan surgido hace enre 3 500 y 4 000 millones de años y hayan iniciado la evolución de la vida sobre la Tierra. La vida primordial constituía un mundo de RNA, en el que las moléculas de RNA cumplían funciones de portadoras de la información genética también de catalizadoras que conducían las reacciones químicas necesarias para sostener y perpetuar la vida. Estos RNA ca­ talíticos pueden haber adquirido la capacidad de sintetizar enzimas formuladas con proteínas, que son catali­ zadores más eficientes. Es probable que a medida que las enzimas fueron adquiriendo, cada vez más funcio­ nes catalíticas el papel del RNA se haya limitado al almacenamiento y la transferencia de información. El DNA, con su estabilidad química y su replicación confiable, finalmente reemplazó al RNA como portador primario de la información genética. En las células modernas el RNA aún desempeña un papel vital tanto en la replicación del DNA como en la síntesis de proteínas. La transcripción es la síntesis de moléculas de RNA, con el DNA como molde, y es el primer paso en la transferencia de información genética del genotipo al fenotipo. El proceso es complejo y requiere varios com­ ponentes proteicos. A medida que examinemos las etapas de la transcripción trate de tener todos los detalles en perspectiva enfóquese en la comprensión de cómo los detalles contribuyen al propósito general de la trans­ cripción: la síntesis selectiva de una molécula de RNA. Iniciaremos el capítulo con una breve reseña de la estructura del RNA y un análisis de sus diferentes tipos. Luego consideraremos los componentes principales necesarios para la transcripción y por último explorare­ mos el proceso de la transcripción en eubacterias, células eucariontes y arqueobacterias. Nos detendremos en varios puntos del texto para asimilar los principios generales que emerjan de él. [www.whfreeman.com/pierc^

Investigación actual sobre las ribozimas.

Moléculas de RNA A

ntes de comenzar a estudiar la transcripción revisemos la es­ tructura del RNA y consideremos los diferentes tipos de moléculas de RNA.

Estructura del RNA Al igual que el DNA, el RNA es un polímero compuesto por nu­ cleótidos unidos por enlaces fosfodiéster (en el capítulo 10 se analiza la estructura del RNA). Sin embargo, existen algunas di­ ferencias importantes entre las estructuras del DNA y del RNA. Mientras que los nucleótidos del DNA contienen azúcares desoxirribosa, los nucleótidos del RNA poseen azúcares ribosa (fig. 13-la). Con el grupo hidroxilo libre en el átomo de carbono 2' del azúcar ribosa el RNA se degrada con rapidez en condiciones alcalinas. El azúcar desoxirribosa del DNA carece de este grupo hidroxilo libre, razón por la cual el DNA es una molécula más es­ table. Otra diferencia importante es que la timina, una de las dos pirimidinas presentes en el DNA, es reemplazada por uracilo en el RNA. Una diferencia final entre las estructuras del DNA y del RNA que el RNA es casi siempre es de cadena simple y tiene una úni­

ca cadena polinucleotídica (fig. 1 3 - I b ) , mientras que el DNA suele estar formado por dos cadenas de polinucleótidos unidas por puentes de hidrógeno entre las bases conjplementarias. Algu­ nos virus contienen genomas de RNA de doble cadena, como se explicó en el capítulo 8 . Si bien el RNA suele ser de cadena sim­ ple, dentro de una cadena de nucleótidos pueden aparearse regio­ nes complementarias cortas y formar estructuras secundarias (véase fig. 13-lb). Estas estructuras secundarias de RNA se de­ nominan lazos en forma de horquilla (hairpin-loops) u horquillas (stem-loops). Cuando dos regiones dentro de una misma molécu­ la de RNA se aparean, las cadenas de estas regiones deben ser an­ tiparalelas y el apareamiento se efectuará entre la citosina y la guanina y entre la adenina y el uracilo (si bien en ocasiones la guanina se aparea con el uracilo). La formación de estructuras secundarias desempeña un papel importante en la función del RNA. La estructura secundaria está determinada por la secuencia de bases de la cadena de nucleóti­ dos; así, diferentes moléculas de RNA pueden asumir estructuras distintas. Dado que la estructura determina la función, las molé‘culas de RNA tienen el potencial de una enorme variación de funciones. Dado que sus dos cadenas complementarias forman una hélice, el DNA es mucho más limitado en el espectro de es­ tructuras secundarias que. puede asumir y por ende desempeña menos papeles funcionales dentro de la célúla. En el cuadro 13.1

350 Capítulo 13 se resumen las similitudes y las diferencias en las estructuras del DNA y del RNA.

i Cuadro 13-1

Comparación de [as estructuras del DNA y el RNA

(a) 5' La cadena continúa

Fosfato

i El R N A co n tien e

j

i uracílo en lugar de tim in a ,!

ti R N A tien e un grup o hidroxiio en el áto m o de ca rb o n o 2 ’ de su co m p o n e n te azúcar, m ientras que el D N A tien e un áto m o de hidrógeno. El R N A es más reactivo que el DNA.

C a r a c t e r ís t ic a

DNA

RNA

Compuesto por nucleótidos

Sí

Sí

Tipo de azúcar

Desoxirribosa

Ribosa

Presencia del grupo 2’-0H

No

Sí

Bases

A, G. C, T

N u c le ó tid o s unidos

Sí

Sí

Cadena doble o cadena simple

Habitualmente doble

Habitualmente simple

Estructura secundaria

Doble hélice

Muchos tipos

Estabilidad

Bastante estable

Se degrada con facilidad

=

■A, C, C, U

por enlaces fosfodiéster

Clases de RNA

La cadena continúa

3'

(b) Estructura prim aria

U n a m olécula de R N A se

Plegamientoi

i pliega para fo rm ar i estructuras secundarias...

i

i ...debido a los puentes de hidrógeno entre las bases i co m p lem entarias de la misma ¡ca d e n a.

........-........... X , ; Estructura secu n d aria

v

-

Fig. 13-1. s e c u n d a ria .

El RNA tie n e u na e s t ru c tu r a p rim a ria y una

Las moléculas de RNA desempeñan diversas funciones dentro de la célula. El RNA ribosómico (rRNA), junto con las subunidades proteicas ribosómicas, constituye el ribosoma, el sitio del ensamblaje de las proteínas. El ribosoma se analizará con más de­ talles en el capítulo 14. El RNA mensajero (mRNA) transporta las instrucciones de codificación de las cadenas polipeptídicas desde el DNA hasta el ribosoma. Después de unirse a un riboso­ ma una molécula de mRNA especifica la secuencia de los ami­ noácidos de la cadena polipeptídica y proporciona un molde pa­ ra unirlos. Las moléculas precursoras grandes, que se conoce co­ mo RNA premensajeros (pre-mRNA), son los productos inme­ diatos de la transcripción en las células euc^riontes. Los pre-mRNA son modificados en forma extensa antes de salir del núcleo para ser traducidos a proteínas. Las bacterias no poseen pre-mRNA, en ellas la transcripción ocurre junto con la traducción. El RNA de transferencia (tRNA) sirve como enlace entre la secuencia codificante de nucleótidos del mRNA y la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica. Cada tRNA se une a un tipo particular de aminoácido y ayuda a incorporarlo a una cade­ na polipeptídica (tema que se analiza en el capítulo 15). En el núcleo de las células eucariontes se encuentran otros tipos de moléculas de RNA. Los RNA nucleares pequeños (snRNA) se combinan con subunidades proteicas nucleares pequeñas para formar las ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP, conocidas como “snurps”). Las snRNP son análogas a los ribosomas en su estructura, solo que más pequeñas, y contienen una única molécula de RNA combinada con alrededor de 10 subuni­ dades proteicas nucleares pequeñas. Algunos snRNA participan =en el procesamiento de RNA y convierten el pre-mRNA en mR­ NA. Los RNA nucleolares pequeños (snoRNA) intervienen en el procesamiento del rRNA. También se encuentran moléculas pequeñas de RNA en el citoplasma de las células eucariontes; es­ tas moléculas, que se conocen como RNA citoplasmáticos pe­

Transcripción 3í queños (scRNA), tienen funciones variadas y a menudo descono­ cidas. Por último, en las células eucariontes hay una clase de molécu­ las de RNA muy pequeñas y abundantes llamadas microRNA (miRNA) y RNA interferente pequeño (siRNA) que llevan a ca­ bo la interferencia del RNA (RNAi), proceso en el cual estas pe­ queñas moléculas de RNA ayudan a iniciar la degradación o la inhibición de la traducción de las moléculas de mRNA. En el ca­ pítulo 14 se explica con más detalle la interferencia del RNA. Los diferentes tipos de moléculas de RNA se presentan en el cuadro 13.2.

CONCEPTOS CLAVE El RNA difiere del DNA en que posee un grupo hidroxilo en el átomo de carbono 2’ de su azúcar, contiene uracilo en lugar de timina y suele ser de cadena simple. Existen varias clases de RNA dentro de las bacterias y de las cé­ lulas eucariontes.

todos los nucleótidos del molde de DNA pero durante la trans­ cripción solo pequeñas porciones de la molécula de DNA -casi siempre un gen único o a lo sumo algunos genes- se transcriben a RNA. Dado que no se necesitan todos los productos génicos al mismo tiempo o en la misma célula, sería muy ineficaz que una célula transcribiera en forma constante la totalidad de sus genes. Además, la mayor parte del DNA no codifica un producto funcio­ nal y la transcripción de estas secuencias sería inútil. La trans­ cripción es, de hecho, un proceso altamente selectivo: se transcri­ ben genes individuales solo cuando se requieren sus productos. Esta selectividad implica un problema fundamental para la célu­ la: la identificación de genes individuales y su transcripción en el momento y el lugar adecuados. Al igual que la replicación, la transcripción requiere tres com­ ponentes principales: 1. Un molde de DNA. 2. Los materiales en bruto (sustratos) necesarios para construir

una nueva molécula de RNA. 3. El aparato de transcripción consistente en las proteínas nece­ sarias para catalizar la síntesis del RNA.

Transcripción: síntesis del RNA a partir de un molde de DNA

El molde

Todos los RNA celulares se sintetizan a partir de un molde de DNA mediante el proceso de transcripción (fig. 13-2). En mu­ chos aspectos la transcripción es muy parecida al proceso de rcplicación pero existe una diferencia fundamental relacionada con la longitud del molde empleado. Durante la replicación se copian

Cuadro 13-2

En 1970 Oscar Miller Jr., Barbara Hamkalo y Charles Thomas emplearon el microscopio electrónico para examinar el conteni­ do de las células y demostraron que el RNA se transcribe a partir de un molde de DNA. Los resultados de este estudio revelaron la

Ubicación y funciones de Las diferentes clases de moléculas de RNA

C la s e d e RN A

T i p o c e l u la r

L o c a liz a c ió n d e la f u n c ió n e n l a s c é ­ lu l a s e u c a r io n t e s ^

F u n c ió n

RNA ribosómico (rRNA)

Bacterianas y eucariontes

Citoplasma

Componentes estructurales y funcionales del ribosoma

RNA mensajero (mRNA)

Bacterianas y eucariontes

Núcleo y citoplasma

Es portador del código genético para las proteínas

RNA de transferencia (tRNA)

Bacterianas y eucariontes

Citoplasma

Ayuda a incorporar los aminoácidos a la cadena polipeptídica

RNA nuclear pequeño (snRNA)

Eucariontes

Núcleo

Procesamiento del pre-mRNA

RNA nucleolar pequeño (snoRNA)

Eucariontes

Núcleo

Procesamiento y ensamblaje del rRNA

RNA citoplasmático pequeño (scRNA)

Eucariontes

Citoplasma

Variable

MicroRNA (miRNA)

Eucariontes

Citoplasma

Inhibe la traducción del mRNA

RNA interferente pequeño (SiRNA)

Eucariontes

Citoplasma

Desencadena la degradación de otras moléculas de RNA

■"Todos los RNA eucariontes se transcriben en el núcleo.

352 CapítüLo 13

IA lg u no s

R N A se

transcriben tan to en células procariontes co m o en células eucarlontes... B

...y otros son ! producidos solo en ; i

las eucarlontes.

Fig. 1 3- 2.

¡A lg u n o s virus co p ian el lAINM

RNA premensajero (pre-mRNA) RNA nuclear pequeño (snRNA) RNA nucleolar pequeño (sno-RNA) RNA citoplasmático pequeño (scRNA) MicroRNA (miRNA) RNA interferente pequeño (siRNA)

Replicación del RNA

d irectam ente a partir de RNA

T o d o s lo s tip o s c e lu la r e s d e RNA s e tr a n s c rib e n a p a rtir d e DNA.

presencia de estructuras con forma de árbol navideño en el inte­ rior de la célula; estas estructuras consistían en fibras centrales delgadas (el tronco del árbol) a la que se unían cadenas de gránulos (las ramas) (fig. 13-3). La adición de desoxirribonucleasa (una enzima que degrada el DNA) provocó la desaparición de las fibras centrales, lo que indicó que “los troncos de árbol” eran mo­ léculas de DNA. La ribonucleasa (una enzima que degrada el RNA) eliminaba las cadenas de gránulos, de manera que las ra­ mas eran RNA. La conclusión de estos científicos fue que cada árbol navideño representaba un gen en proceso de transcripción. La transcripción de cada gen comienza en la parte superior del ár­ bol; allí se ha transcripto poco DNA y las ramas de RNA son cor­ tas. A medida que el aparato de transcripción desciende por el ár­ bol, transcribiendo una mayor parte del molde, las moléculas de RNA se alargan y producen las ramas largas de la parte inferior.

m

'■Transcripción

RNA mensajero (mRNA) RNA ribosómico (rRNA) RNA de transferencia (tRNA)

::.

“" i

Fig. 1 3- 3. A l s e r o b s e r v a d a s con el m ic ro sc o p io e le c­ tró n ico la s m o lé c u la s de DNA en p ro c e so de tr a n s c rip c ió n m u e stra n u n a e s tru c tu r a co n fo rm a d e á rb o l n a v id e ñ o . El tronco de cada “árbol de Navidad” (una unidad de transcripción) representa una nnolécula de DNA; las ramas del árbol (cadenas de gránulos unidas al DNA) son las moléculas de RNA que han sido transcriptas a partir del DNA. A medida que el aparato de trans­ cripción se mueve a lo largo del DNA mientras transcribe la ma­ yor parte del molde, las moléculas de RNA se vuelven cada vez más largas. (Dr. Thomas Broker/Pliototal3’, sintetiza una molécula antiparalela fil molde y complementaria de él y utiliza nucleósidos trifosfatos como sus­ trato. Sin embargo, también existen diferencias importantes entre ambos procesos: en forma típica solo se transcribe una cadena, cada gen se transcribe por separado y el proceso está sujeto a nu­ merosos mecanismos de regulación. L.os temas estudiados en este capítulo poseen una relación im­ portante con temas tratados en otros capítulos. La transcripción es el primer paso en la transferencia molecular de la información genética del genotipo al fenotipo y por ende, es el punto de par­ tida para el análisis del procesamiento del RNA en el capítulo 14 y de la traducción en el capítulo 15. El conocimiento de los deta­ lles de la transcripción también es esencial para comprender la regulación genética (capítulo 16), porque la transcripción es un punto importante en el cual se controla la expresión de inuchos genes. Además, dado cjue los factores de transcripción desempe­ ñan un papel destacado en algunos tipos de cáncer, la informa­ ción aportada por este capítulo será de utilidad cuando conside­ remos las bases moleculares del cáncer en el capítulo 21 .

RESUMEN • Las moléculas de RNA pueden funcionar como catalizadores biológicos y muchas de ellas fueron los primeros transporta­ dores de la información genética.

• La unidad de transcripción consiste en un promotor, una re­ gión que codifica el RNA y un terminador. 4

• Los sustratos para la síntesis de RNA son ribonucleósidos tri­

• líl RNA es un polímero formado por nucleótidos que se man­ tienen unidos por enlaces fosfodiéster. Cada nucleótido de RNA consiste en un azúcar ribos a, un fosfato y una base-. El RNA contiene la base uracilo; suele ser de cadena simple, lo que le permite formar estructuras secundarias. • El RNA ribosómieo es un componente del ribosoma, el RNA mensajero lleva instrucciones de codificación para las proteí­ nas y el RNA de transferencia ayuda a incorporar los aminoá­ cidos a una cadena polipeptídica. Otras moléculas de RNA que se encuentran en las células eucariontes incluyen el premRNA, (el precursor del mRNA), los snRNA, (que participan en el procesamiento de los pre-mRNA), los snoRNA, (que procesan el rRNA), los scRNA, (que se encuentran en el cito­ plasma) y los miRNA, (cuyas funciones son la degradación del RNA y la inhibición de la traducción). • El molde para la síntesis de RNA es una cadena simple de DNA. En la transcripción la síntesis de RNA es complemen­ taria de la cadena molde de DNA y antiparalela a ella.

fosfatos. En la transcripción se cortan dos fosfatos de un ribonucleósido trifosfato y el fosfato remanente participa en el enlace fosfodiéster con el grupo 3’-OH del extremo creciente de la molécula de RNA. • La RNA polimerasa de las bacterias consiste en una enzima “core” que cataliza la adición de nucleótidos a una molécula de RNA y otras subunidades que se unen a la enzima “core” para proporcionarle funciones adicionales. El factor sigma controla la unión de la enzima “core” al promotor; el factor rho propor­ ciona ayuda para la terminación de la transcripción. ®Las células eucariontes contienen tres RNA polimerasas: la RNA polimerasa I, (que transcribe el rRNA), la RNA polime­ rasa II, (que transcribe el pre-mRNA y algunos snRNA) y la RNA polimerasa III, (que transcribe los tRNA, el rRNA pe­ queño y algunos snRNA). • El proceso de transcripción consta de tres etapas: iniciación, elongación y terminación.

Transcripción 3 • Los promotores son reconocidos por el aparato de transcrip­ ción y resultan necesarios para el proceso de transcripciíSn. Contienen secuencias consenso cortas incluidas dentro de tra­ mos más largos de DNA.

• Dos clases de secuencias afectan la transcripción en las célu­ las eucariontes: los promotores, que se encuentran cerca de los genes, y los intensificadores, que pueden estar lejos de los genes que afectan.

• La transcripción comienza en el sitio de iniciación, el que es determinado por las secuencias consenso. Se desenrolla un tramo corto de DNA cercano al sitio de iniciación, el RNA se sintetiza a partir de una cadena simple de DNA empleada co­ mo molde y el DNA vuelve a enrollarse en el extremo de la burbuja de transcripción.

• Un promotor para la RNA polimerasa II consta de un promo­ tor mínimo, que resulta necesario para que existan niveles mínimos de transcripción, y un promotor regulativo, que afecta la velocidad de transcripción.

• Los terminadores son secuencias que se encuentran dentro de la región codificadora del RNA; la síntesis de RNA se detiene después de la transcripción del terminador. Las bacterias po­ seen dos tipos de terminadores: los terminadores indepen­ dientes de rho, que pueden reconocer la RNA polimerasa por sí mismos, y los terminadores dependientes de rho, que solo pueden reconocer la RNA polimerasa con ayuda de la proteí­ na rho. • En las células eucariontes el DNA forma un complejo con las histonas que interfiere en la unión de los factores de trans­ cripción y la RNA polimerasa. La cromatina puede ser modi­ ficada por aeetilación, por proteínas que la remodelan y por otros factores, lo que permite que los factores de transcrip­ ción y la RNA polimerasa se unan al DNA.

• Los factores de transcripción general se unen al promotor mí­ nimo y forman parte del aparato de transcripción basal. Las proteínas activadoras de la transcripción se unen a las secuen­ cias presentes en los promotores regulativos y en los intensi­ ficadores e interactúan con el aparato de transcripción basal en el promotor mínimo. • En las células eucariontes existen tres tipos de RNA políme­ ras as que reconocen diferentes tipos de promotores, todos los cuales presentan secuencias consenso que sirven como sitios de unión de los factores de transcripción. • Las tres RNA polimerasas que se encuentran en las células eucariontes emplean diferentes mecanismos de terminación. • La transcripción en las arqueobacterias posee muchas seme­ janzas con la transcripción en los eucariontes.

TÉRMINOS IMPORTANTES ribozima (p. 349) RNA ribosómico (rRNA) (p. 350) RNA mensajero (mRNA) (p. 350) RNA premensajero (pre-mRNA) (p. 350) RNA de transferencia (tRNA) (p. 350) RNA nuclear pequeño (snRNA) (p. 350) ribonucleoproteína nuclear pequeña (snRNP) (p. 350) RNA nucleolar pequeño (snoRNA) (p. 350)

RNA citoplasmático pequeño (scRNA) (pp. 350 - 351) microRNA (miRNA) (p. 351) RNA interferente pequeño (slRNA) (p, 351) cadena molde (p. 352) cadena no molde (p. 352) unidad de transcripción (p. 354) promotor (p. 354) región codificante de RNA (p. 354) terminador (p. 354) ribonucleósido trifosfato (rNTP) (p. 354) RNA polimerasa (p. 355)

enzima “core” (p. 355) factor sigrna (p. 356) holoenzima (p. 356) RNA polimerasa I (p. 356) RNA polimerasa II (p. 356) RNA polimerasa III (p. 356) secuencia consenso (p. 356) secuencia consenso -10 (caja Pribnow) (p. 357) secuencia consenso -35 (p. 357) elemento en dirección 5’ (p. 358) terminador dependiente de rho (p, 359) factor rho (p. 359)

terminador independiente de rho (p. 359) factor de transcripción general (p. 362) aparato de transcripción basal (p. 362) proteína activadora de la trans­ cripción (p. 362) promotor mínimo (p. 362) caja TATA (p. 362) proteína de unión a la caja TATA (TBP) (p, 362) promotor regulativo (p. 363) intensificador (p. 364) silenciador (p. 364) promotor interno (p. 364)

Problemas 1. El siguiente diagrama representa una secuencia de nucleótidos que rodea a una secuencia que codifica RNA.

a. La secuencia que codifica RNA pertenece a una bacteria o a una célula eucarionte? ¿Cómo lo puede decir? b. ¿Qué cadena de DNA servirá como cadena molde durante la transcripción de la secuencia que codifica RNA?

Secuencia 5'-CATGTT.. .TTGATGT- que codifi­ -GACGA.. .TTTATA.. .GGCGCGC-3' -CTGCT... AAATAT.. .CCGCGCG-5' 3'-GTACAA.. .AACTACA- ca RNA

368 Capítulo 13

• Solución a. Las bacterias y las células eucariontes emplean las mismas bases de DNA (A, T, G y C) de modo que las bases propiamen­ te dichas no aportan ninguna pista acerca del origen de la se­ cuencia. La secuencia que codifica RNA debe tener un promo­ tor y las células eucariontes y bacterianas difieren en las se­ cuencias consenso que se encuentran en sus promotores; en consecuencia, debemos examinar las secuencias en busca de se­ cuencias consenso familiares. En la cadena inferior, a la derecha de la secuencia que codifica RNA, hallamos una secuencia AAATAT, que escrita en la forma convencional (5’ a la izquier­ da) sería 5’- TATAAA - 3’. Esta secuencia es la caja TATA pre­ sente en la mayoría de los promotores eucariontes. Sin embar­ go, la secuencia también es muy similar a la secuencia consenso -10 (5’- TATAAT-3’) que se encuentra en los promotores bacte­ rianos. En la misma cadena pero más a la derecha también encontra­ mos la secuencia 5’- GCGCGCC -3’, que es el elemento recono­ cedor de TFIIB (BRE) de los promotores de la RNA polimerasa II de los eucariontes. No se encuentra una secuencia consenso si­ milar de este tipo en los promotores bacterianos, por ende, pode­ mos estar razonablemente seguros de que esta secuencia es un promotor eucarionte y una secuencia que codifica RNA. b. La caja TATA y el BRE de los promotores de la RNA polime­ rasa II se encuentran corriente arriba de las secuencias que codi­ fican el RNA; por consiguiente, la RNA polimerasa debe unirse a estas secuencias y luego seguir en dirección 3’, mientras trans­ cribe la secuencia que codifica el RNA. Por ende, la RNA poli­ merasa debe moverse de derecha (corriente arriba) a izquierda (corriente abajo). La molécula de RNA se sintetiza siempre en di­ rección 5’—>3’ y es antiparalela a la cadena molde de DNA; por consiguiente, la cadena molde debe leerse 3’—>5’. Si la enzima Cadena molde

5'-CATGTT.. .TTGATGT3'-GTACAA.. .AACTACA-

Secuencia que codifica el RNA

avanza de derecha a izquierda y lee el molde en dirección 3’-^5’, la cadena superior debe ser el molde, como se muestra en el dia­ grama que aparece más adelante. 2. Suponga que una secuencia consenso del promotor regulativo de un gen que codifica la enzima A se hubiera suprimido. ¿Cuál de los siguientes efectos sería el resultado de esta deleción? a. La enzima A tendría una secuencia de aminoácidos distinta. b. El mRNA para la enzima A sería anormalmente corto. c. La enzima A tendría algunos aminoácidos menos. d. El mRNA para la enzima A se transcribiría pero no se tradu­

ciría. e. La cantidad de mRNA transcripto se vería afectada.

Explique su razonamiento.

• Solución La respuesta correcta es la e. La proteína reguladora contiene sitios de unión para las proteínas activadoras de la transcripción. Estas secuencias no forman parte de la secuencia que codifica el RNA de la enzima A; por ende, la mutación no tendría efecto al­ guno sobre la longitud o la secuencia de aminoácidos de la enzi­ ma, lo que elimina las respuestas a, b y c. La caja TATA es el si­ tio de unión para el aparato de transcripción basal. Las proteínas activadoras de la transcripción se unen al promotor regulativo y afectan la cantidad de transcripción que se produce durante las interacciones con el aparato de transcripción basal en el promo­ tor mínimo.

RNA polimerasa -GAGGA.. .TTTATA.. .GGCGCGC-3' -CTGCT.. .AAATAT.. .CCGCGGG-5' Dirección de la transcripción

PREGUNTAS DE COMPRENSIÓN 1. Dibuje un nucleótido de RNA y uno de DNA y subraye las diferencias. ¿En qué se parece la estructura del RNA a la del DNA y en qué se diferencia? 2. ¿Cuáles son las principales clases de RNA celular? ¿Dón­

de esperaría encontrar cada clase de RNA dentro de las células eucariontes? *3. ¿Qué partes del DNA constituyen una unidad de trans­

cripción? Dibuje y rotule una unidad de transcripción típi­ ca de una bacteria. 4. ¿Cuál es el sustrato para la síntesis de RNA? ¿De qué ma­

nera se modifica este sustrato y se une para producir una molécula de RNA?

5. Describa la estructura de la RNA polimerasa de las bacterias. * 6 . Nombre las tres RNA polímerasas que se encuentran en las células eucariontes y los tipos de RNA que transcriben. 7. ¿Cuáles son las cuatro etapas básicas de la transcripción? Describa lo que ocurre en cada una de ellas. *8 . Dibuje y rotule un promotor bacteriano típico. Incluya cualquier secuencia consenso común. 9. ¿Cuáles son los dos tipos de terminadores básicos que se en­ cuentran en las bacterias? Describa la estructura de cada tipo. 10. ¿De qué manera el proceso de transcripción de las células

eucariontes difiere del de las bacterias?

Transcripción 3 *11, ¿En qué se parecen los promotores y los intensificadores?

14. ¿Cuáles son algunas de las secuencias consenso comunes

¿En qué difieren?

que se encuentran en los promotores de la RNA polimerasa II?

12. ¿De qué manera un intensificador puede afectar la trans­ cripción de un gen que está a miles de nucleótidos de distancia?

*15. ¿Qué proteína asociada con un factor de transcripción es

común a todos los promotores eucariontes? ¿Cuál es su función en la transcripción?

13. Compare el papel de los factores de transcripción gene­

ral con el de las proteínas activadoras de la transcrip­ ción.

*16. Compare y contraste la transcripción y la replicación. ¿En

qué se parecen estos procesos y en qué difieren?

PREGUNTAS Y PROBLEMAS DE APLICACIÓN 17. La velocidad con la que las RNA polimerasas llevan a ca­

bo la transcripción es mucho menor que la velocidad con la que las DNA polimerasas llevan a cabo la replicación. ¿Por qué la velocidad es más importante en la replicación que en la transcripción? 18. Escriba la secuencia consenso del siguiente conjunto de secuencias de nucleótidos: AGGAGTT AGCTATT TGCAATA ACGAAAA TCCTAAT TGCAATT

24. Escriba una secuencia hipotética de bases que podría en­ contrarse en los primeros 20 nucleótidos de un promotor

de un gen bacteriano. Incluya las dos cadenas de DNA y marque los extremos 5’ y 3’ de ambas. Asegúrese de in­ cluir el sitio de iniciación de la transcripción y cualquier secuencia consenso encontrada en el promotor. 25. El siguiente diagrama representa una unidad de transcrip­ ción de una molécula de DNA hipotética. 5’.. .TTGACA...TATAAT...3 ’ 3 ’... AACTGT...ATATTA...5’ a. Sobre la base de la información dada, ¿este DNA es bacteriano o eucarionte? b. Si se transcribe esta molécula de DNA, ¿qué cadena servirá de molde y cuál no? c. ¿Dónde, en forma aproximada, se encontrará el sitio de la transcripción?

*19. Mencione al menos cinco de las propiedades que las DNA

polimerasas y las RNA polimerasas tienen en común. Cite al menos tres diferencias. 20. Las moléculas de RNA tienen tres fosfatos en su extremo 5’ pero las de DNA nunca tienen estos fosfatos. Explique esta diferencia. 21. Una molécula de RNA posee los siguientes porcentajes de bases: A =: 23%, U = 42%, C = 21% y G = 14%. a. ¿El RNA es de cadena simple o de cadena doble? Justi­ fique su respuesta. b. ¿Cuál sería el porcentaje de bases en la cadena molde del DNA que contiene el gen para este RNA? *22. El siguiente diagrama representa el DNA que'forma parte

de la secuencia que codifica el RNA de una unidad de transcripción. La cadena inferior es la cadena molde. Mencione la secuencia encontrada en la molécula de RNA transcripta a partir de este DNA y marque los extre­ mos 5’ y 3’ del RNA. 5’ - ATAGGCGATGCCA-3’ 3’ - TATCCGCTACGGT-5’ f - cadena molde 23. La siguiente secuencia de nucleótidos se encuentra en un

molde de DNA de cadena simple; ATTGCCAGATCATCCCAATAGAT Suponga que la RNA polimerasa avanza a lo largo de este molde de izquierda a derecha. a. ¿Qué extremo del molde de DNA es 5’ y cuál es 3’? b. Escriba la secuencia y rotule los extremos 5’ y 3’ del RNA copiado a partir de este molde.

Ih

*26. ¿Cuál sería el efecto más probable de una mutación en las

siguientes localizaciones de un gen de E. co lil a. -8 b. -35

c. -20 d. Sitio de iniciación

27. Una cepa de bacteria posee una mutación termosensible

en el gen que codifica el factor sigma. A temperaturas elevadas la bacteria mutante produce un factor sigma in­ capaz de unirse a la RNA polimerasa. ¿Qué efecto tendrá esta mutación sobre el proceso de transcripción cuando las bacterias sean cultivadas a temperaturas elevadas? 28. Programadores de computación que trabajaban juntó con

genetistas moleculares desarrollaron programas que pue­ den identificar genes dentro de largos tramos de secuen­ cias de DNA. Imagine que usted trabaja con un progra­ mador en uno de estos proyectos. Sobre la base de lo que sabe acerca del proceso de transcripción ¿qué secuencias deberían utilizarse para identificar el principio y el final de un gen con este programa de computación? *29. El siguiente diagrama representa una unidad de transcrip­

ción sobre una molécula de DNA. Sitio de iniciación de la transcripción 5'3'-

Cadena molde

370 Capítulo 13 a.'Suponga que esta molécula de DNA pertenece a una bacteria. Dibuje en la localización aproximada el promo­ tor y el terminador de esta unidad de transcripción. b. Suponga que esta molécula de DNA pertenece a una cé­ lula eucarionte. Dibuje la localización aproximada de un promotor de la RNA polimerasa II. 30. Los siguientes nucleótidos de DNA se encuentran cerca

del extremo de una unidad de transcripción bacteriana. Encuentre el terminador en esta secuencia. 3’- AGCATACACiCAGACCGTrGGTCTGAAAAAAGCATACA- 5’

a. Marque el punto en el cual terminará la transcripción. b. ¿Este terminador es independiente o dependiente de rho? c. Dibuje un diagrama del RNA que se transcribirá a partir de este DNA; incluya su secuencia de nucleótidos y cual­ quier estructura secundaria que pudiera formarse. *31. Una cepa de bacteria posee una mutación termosensible

en el gen que codifica la subunidad rho de la RNA poli­ merasa. A altas temperaturas rho no es funcional. Si estas bacterias se cultivaran a alta temperatura, ¿cuál de los si­ guientes efectos esperaría ver? a. No ocurre la transcripción. b. Todas las moléculas de RNA son más cortas que lo nor­ mal.

c. Todas las moléculas de RNA son más largas que lo normal.

d. Algunas moléculas de RNA son más largas que lo nor­ mal. e. El RNA se copia a partir de ambas cadenas de DNA. Explique sus razones para aceptar o rechazar cada una de estas cinco opciones. 32. Suponga que una secuencia de nucleótidos A posterior a

la repetición invertida en un terminador independiente de rho fuera suprimida pero la repetición invertida permane­ ciera intacta. ¿De qué manera esta deleción afectaría la terminación? ¿Qué ocurriría cuando la RNA polimerasa llegara a esta región? *33. Mediante ingeniería genética, un genetista muta el gen que codifica la TBP en células humanas en cultivo. Esta mutación anula la capacidad de la TBP para unirse a la caja TATA. Prediga el efecto de esta mutación sobre las células que la poseen. 34. Elaborados mecanismos de reparación se asocian con la replicación para evitar las mutaciones permanentes en el DNA; en cambio, no existen reparaciones similares aso­ ciadas con la transcripción. ¿Puede mencionar una razón de esta diferencia entre la replicación y la transcripción? (Pista: piense en los efectos relativos de una mutación permanente en una molécula de DNA y compárelos con los de una mutación en una molécula de RNA.)

PREGUNTAS AVANZADAS 35. Los intensificadores son secuencias que afectan la inicia­

ción de la transcripción de genes que están a cientos o a miles de nucleótidos de distancia. Las proteínas que se unen a los intensificadores suelen interactuar en forma di­ recta con los factores de transcripción en los promotores y causar que el DNA que interviene en el proceso forme un bucle. El intensificador del bacteriófago T4 no actúa de esta manera (D.R. Herendeen y col, 1992, Science 256; 1298-1303). Proponga algunos mecanismos adiciona­ les (además de la íbrmación de bucles en el DNA) me­ diante los cuales este intensificador pueda afectar la trans­ cripción de un gen situado a miles de nucleótidos de dis­ tancia. 36. Muchos genes, tanto pertenecientes a bacterias como a células eueariontes, contienen numerosas secuencias que podrían producir, pausas en la transcripción o su finaliza­ ción prematura. No obstante, la transcripción de estos ge­ nes dentro de una célula en condiciones normales produ­ ce múltiples moléculas de RNA de miles de nucleótidos de longitud sin pausas y ni terminaciones prematuras. En cambio, cuando se lleva a cabo una simple ronda de transcripción en un tubo de ensayo, la síntesis de RNA suele ser interrumpida por pausas y terminaciones antici­ padas, lo que reduce la velocidad a la que se realiza la transcripción y con frecuencia acorta la longitud de la molécula de mRNA producida. La mayoría de estas pausas y terminaciones prematuras ocurren cuando la RNA polimerasa retrocede (es decir vuelve atrás) uno o dos nucleótidos sobre el DNA. Los hallazgos experimen­

tales han demostrado que la mayoría de los retrasos en la transcripción y las terminaciones prematuras desaparecen si múltiples RNA polimerasas transcriben la molécula de DNA en forma simultánea. Explique por qué se producen una transcripción más veloz y un mRNA de mayor longi­ tud cuando múltiples RNA polimerasas transcriben la ca­ dena molde. *37. La localización de la caja TATA en dos especies de leva­ duras, Saccharomyces pombe y S. cerevisiae, difiere en

forma notable. La caja TATA de S. pombe está localizada alrededor de 30 nucleótidos corriente arriba del sitio de iniciación, una localización similar a la de la mayor parte de estas cajas en las células eueariontes. En cambio, la caja TATA de S. cerevisiae puede estar hasta 120 nucleó­ tidos corriente arriba del sitio de iniciación. Para com­ prender la manera en que funciona la caja TATA en estas dos especies se llevó a cabo una serie de experimentos con el propósito de determinar qué componentes del apa­ rato de transcripción de ambas serían intercambiables. En estos experimentos se intercambiaron diferentes compo­ nentes del aparato de transcripción en S. pombe y en S. cerevisiae y se observaron los efectos de este intercambio sobre el nivel de síntesis de RNA y sobre el punto de ini­ ciación de la transcripción. El TFIID de S. pombe pudo utilizarse en las células de S. cerevisiae y viceversa sin que se produjera ningún efecto sobre el sitio de iniciación en ninguno de los dos tipos de células. El intercambio del TFIIB, del TFIIE o de la RNA polimerasa alteró el nivel de transcripción. Sin embargo, los siguientes pares de

Transcripción 37 cotfiponentes pudieron ser cambiados de levadura sin que se alterara la transcripción: TFIIE junto con TFIIH y TFIIB junto con RNA polimerasa. El intercambio de TFIIE y TFIIH no alteró el punto de iniciación pero el in­ tercambio de TFIIB y RNA polimerasa lo desplazó. (Y. Li y col., 1994, Science 263:805-807.) Sobre la base de estos resultados, ¿qué conclusiones puede extraer acerca del modo en que interactúan los diferentes componentes del aparato de transcripción y sobre qué com­ ponentes establecen el sitio de iniciación? Proponga un mecanismo para la determinación del sitio de iniciación en los promotores de la RNA polimerasa II de los eucariontes.

de la obtenida con el DNA desnudo (véase el cuadro más adelante). GAL4-VP16 es una proteína que se une al DNA de ciertos genes eucariontes. Cuando GAL4-VP16 se añade al DNA, el nivel de transcripción de la RNA polimerasa II aumenta en forma importante. Aun en presencia de la proteína Hl, GAL4 -VP16 estimula altos niveles de transcripción. Proponga un mecanismo por medio del cual la proteína Hl reprima la transcripción y explique el modo en que GAL4VP16 supera esta represión. Explique la forma en que el mecanismo propuesto por usted produciría los resultados obtenidos en estos experimentos.

38. La relación entre la estructura de la cromatina y la activi­

dad de transcripción ha sido el centro de atención de in­ vestigaciones recientes. En un conjunto de experimentos se estudió el nivel de transcripción in vitro de un gen de Dmsophila por acción de la RNA polimerasa II mediante el uso de DNA y varias combinaciones de histonas.

DNA desnudo

100

DNA -Hoctámeros DNA + octámeros

En primer lugar se midió el nivel de transcripción del DNA desnudo, sin histonas asociadas. A continuación se midió el nivel de transcripción después del agregado de octámeros de nucleosomas (sin Hl) al DNA. La adición de los octámeros provocó una caída del 50% en el nivel de trans­ cripción. Cuando se agregaron tanto octámeros de nucleosoma como proteínas Hl al DNA se produjo una represión importante de la transcripción y una caída a menos del 1%

Cantidad relativa de transcripción

Tratamiento

50 Hl

< 1

DNA -!- GAL4-VP16

1 000

DNA 4- octámeros -i- GAL4-VP16

1 000

DNA + octámeros + Hl + GAL4-VP16

1 000

(Sobre la base de los experimentos informados en un artículo de G. E, Croston y col. 1991, Science 251:643-649.)

MOLECULAS DE RNA Y PROCESAMIENTO DEL RNA

14

El inmenso gen de la distrofina Estructura de los genes O rg an ización de los g enes Intrones Revisión del concepto de gen

RNA mensajero E stru ctura del RNA m ensajero Procesam iento del pre-mRNA A d ición del casquete 5’ A d ición de la cola de poli(A) C o rte y em palm e del RNA V ías de p rocesam iento alternativo Edición del RNA

RNA de transferencia Estru ctu ra del RNA de transferencia Estru ctu ra y p rocesam iento de los g e n e s del RNA

i

m

Muscular Dystpophy Association

de transferencia

RNA ribosómico Estru ctu ra del ribosom a Estru ctu ra y procesam iento de los g e n e s del RNA rib o só m ico

RNA ¡nterferentes pequeños y micro In terferencia por RNA O rg an ism o modelo: el nem atodo

C aenorhabditis elegans

Diafant® caísi «mcMenta años, el actor Jerry Lewis h;i actuado co m o líd e r n acio n al d e la Muscular Dístrophy Association de lo s E s ta d o s U n id o s, un emprendimiento d e c ie n tífic o s y ciu d a ­ d a n o s d e stin a d o a lu c h a r co n tra la s e n fe rm e d a d e s neuromusc u la r e s . (Cortesía de la M u scu la r D ístro p h y A sso cia tio n ).

El Inmenso gen de La distrofina e las distrofias musculares la más común y devastadora es la distrofia muscular de Duchenne, una enfermedad fatal que afecta a casi 1 de cada 3 500 varones. Al nacer, los ni­ ños afectados tienen aspecto normal. El primer síntoma es debilidad muscular leve, que apare­ ce entre los 3 y los 5 años: el niño se cae con frecuencia, tiene dificultad para subir escaleras y es incapaz de ponerse de pie desde la posición sedente. Con el tiempo, los miísculos de los brazos y de las piernas se hacen cada vez más débiles. Alrededor de los 11 años, los afectados suelen estar confinados a una silla dé ruedas, y alrededor de los 20 años, la mayoría de ellos ha muerto. En la actualidad no hay cura para esta enfermedad. La distrofia muscular de Duchenne se descubrió en 1852 y en 1861 Benjamín A. Duchenne, un médico parisino, describió por completo la enfermedad. Aún antes de que se hubieran des­ cubierto las leyes de Mendel, los médicos notaron el patrón de herencia ligado al cromosoma X de esta enfermedad; destacaron que la enfermedad se desarrollaba casi exclusivamente en

D

RNA

Moléculas de RNA y procesamiento del RNA los varones y parecía heredarse de madres -en apariencia- no afectadas. A pesar de haber reconocido precoz­ mente su característica hereditaria, la causa bioquímica de la distrofia muscular de Duchenne siguió siendo un misterio hasta 1987. En 1985, Louis Kunkel y col., de la Harvard Medical School, observaron un niño con distrofia muscular de Duchenne cuyo cromosoma X tenía una deleción visible del brazo corto. Tomando como base de su razo­ namiento el hecho de que la enfermedad de este niño estaba provocada por la ausencia de un gen en la zona de la deleción, reconocieron que ésta señalaba la ubicación del gen responsable de la distrofia muscular de Duchenne en el cromosoma X. Kunkel y col. localizaron y clonaron la porción de DNA causante de la enfer­ medad. Poco después se determinó la secuencia del gen y se aisló la proteína que codifica. Esta proteína gran­ de, denominada distrofina, está formada por casi 4 000 aminoácidos y es un componente integral de las cé­ lulas musculares. Las personas con distrofia muscular de Duchenne carecen de distrofina funcional. El gen de la distrofina está entre los más notables de todos los genes conocidos. Es enorme, ya que com­ prende más de dos millones de nucleótidos de DNA. Sin embíirgo, sólo aproximadamente 12 000 de sus nucleótidos codifican aminoácidos. ¿Por qué es tan grande este gen? ¿Qué hacen todos los demás nucleótidos? Las propiedades inusuales del gen de la distrofina tienen sentido sólo en el contexto del procesamiento del RNA, la alteración del RNA después de que ha sido transcripto. El mRNA de la distrofina, al igual que mu­ chos RNA eucariontes, sufre un extenso procesamiento después de la transcripción, que incluye la elimina­ ción de grandes sectores que no se requieren para la traducción. En el capítulo 13 nos centraremos en la trans­ cripción, el proceso de síntesis de RNA. En éste examinaremos la función y el procesamiento del RNA. Comenzamos con una cuidadosa mirada a la naturaleza del gen. Luego examinamos el RNA mensajero (mRNA), su estructura y la forma en que se modifica en los eucariontes después de la transcripción. También veremos de qué manera, mediante vías alternativas de modificación del RNA, un gen puede producir varias proteínas diferentes. Luego, nos centraremos en el RNA de transferencia (tRNA), la molécula adaptadora que constituye la interfaz entre los aminoácidos y el mRNA en la síntesis proteica. Examinaremos el RNA ribosómico (rRNA), la estructura y organización de los genes del rRNA, y la manera en que se procesan los rRNA. Por líltimo, consideraremos una clase de RNA muy pequeños, recientemente descubiertos, que desem­ peñan funciones importantes en la degradación e inhibición de la traducción del RNA y otras funciones, A medida que exploremos el mundo del RNA y su papel en la función de los genes, veremos evidencia de dos características importantes de este ácido nucleico. En primer lugar, el RNA es extremadamente versátil, tanto desde el punto de vista estructural como bioquímico. Puede adquirir diversas estructuras secundarias, lo que proporciona las bases para su diversidad funcional. En segundo lugar, el procesamiento y la función del RNA suelen incluir interacciones entre dos o más moléculas de RNA. w w w .w hfreem an.com /p ierce]

Más información acerca de la distrofia muscular de Duchenne y del gen de la dis­ trofina.

Estructura de los genes ¿Qué es un gen? En el capítulo 3 notamos que la definición de gen parecería cambiar a medida que se exploran diferentes aspec­

tos de la herencia. Un gen se ha definido como un factor hereda­ do que determina una característica. Esta definición puede pare­ cer vaga porque no dice nada acerca de qué es el gen; sólo expli­ ca qué hace. Sin embargo, esta definición fue apropiada para nuestros propósitos en ese momento, porque nuestro interés esta­ ba centrado en la manera en que los genes influyen en la heren­ cia de las características. No era necesario considerar la natura­ leza física del gen para aprender las reglas de la herencia. Conociendo la estructura química del DNA y el proceso de la transcripción podemos ser más precisos acerca de qué es un gen. En el capítulo 10 describimos cómo la información genética está codificada en las secuencias de bases del DNA; por tanto, un gen consiste en un conjunto de nucleótidos de DNA. Pero, ¿cuántos nucleótidos están comprendidos en un gen y cómo se-organiza la información en estos nucleótidos? En 1902, Archibald Garrod sugirió, adecuadamente, que los genes codifican proteínas (véan-' se pp. 47-48). Las proteínas están formadas por aminoácidos, de modo que un gen contiene los nucleótidos que especifican los aminoácidos de una proteína. Por consiguiente, podemos definir el gen como un conjunto de nucleótidos que especifica la secuen­

cia de aminoácidos de una proteína, la cual fue -de hecho- la de­ finición operativa para un gen durante muchos años. Sin embar­ go, a medida que los genetistas conocierón más acerca de la es­ tructura génica, resultó claro que este concepto era una sobresimplificación.

Organización de los genes El trabajo pionero sobre la estructura de los genes se realizó, en gran medida, mediante el examen de mutaciones en bacterias y virus. Esta investigación llevó a Erancis Crick en 1958 a pro­ poner que los genes y las proteínas son colineales; es decir, que hay una correspondencia directa entre la secuencia de nucleóti­ dos del DNA y la secuencia de aminoácidos de una proteína (fig. 14-1). El concepto de colinealidad sugiere que el número de nu­ cleótidos de un gen debería ser proporcional al número de ami­ noácidos de la proteína codificada por ese gen. En sentido gene­ ral, este concepto es cierto para los genes que se encuentran en las bacterias y en muchos viras, aunque estos genes son ligera­ mente más largos de lo esperado, si la colinealidad se aplicara en sentido estricto (los mRNA codificados por los genes contienen secuencias en sus extremos que no especifican aminoácidos). En un principio también se supuso que los genes y las proteínas de

3 7 4 Capítulo 14

DNA

I'

C C T C C A T A C A C T T TTC C C C T TTC T CCACCTATCTCAAAACCGCAAACA Una secuencia continua de | nucleotidos en el D N A ...

'Transcripción

¡

|: niRNA 5 '

^

;

CodoRes

Traducción

^

...co d ifica una secuencia co n tin u a

i de am ino ácido s en la p ro te ín a . Cadena

C o n c íu ssó n : c o n ;s c o lin e a ü d d d , g

polipeptídica

n ú m e r o c e n u c ig ó tid o s e n e ! a e r ­ es proporcional ai n ú m e r o de

Aminoácidos

Fig,

i

arn in o A c id o s e n ¡ñ p r o t e ín a .

1 4 - 1 . El co n ce p to d e colinealidad sugiere q u e una

s e c u e n c ia co n tin u a de n u c le ó tid o s d el DNA co d ific a u na s e ­ cu e n cia continua de am inoácidos en una. proteína.

/■ E x p e r im e n t o

los eucariontes eran colineales, pero hubo indicaciones de que la estructura del gen eucarionte era fundamentalmente distinta. I.as células eucariontes contienen mucho más DNA que el necesario para codificar proteínas (véase cap. 11). Además, muchas molé­ culas grandes de RNA observadas en el niicleo estaban ausentes en el citoplasma, lo cual sugiere que los RNA nucleares sufren al­ gún tipo de cambio antes de salir hacia el citoplasma. Sin embargo, la mayoría de los genetistas se sorprendieron por el anuncio efectuado en 1970 acerca de que cuatro secuencias co­ dificantes en un gen de un virus de eucariontes se encontraban in­ terrumpidas por nucleótidos que no especificaban aminoácido al­ guno. Esto se descubrió cuando el DNA del virus se hibridó con el mRNA transcripto a partir de él y la estructura hibridada se examinó mediante el microscopio electrónico (fig. 14-2). El DNA era sin duda mucho más largo que el mRNA, dado que las regiones de DNA formaban bucles hacia afuera de la molécula hibridada. Estas regiones contenían nucleótidos en el DNA que estaban ausentes de los nucleótidos codificantes del mRNA. Más tarde se descubrieron muchos otros ejemplos de genes intemimpidos; pronto quedó claro que ¡a mayor parte de los genes euca­ riontes comprenden zonas de nucleótidos codificantes y de no co­ dificantes.

P re g u n ta ; ¿la secuencia codificante de un gen es siempre continua? DNA

M éto d os

Cuando una se cu e n cia co n tin u a de nucleótidos en el D N A codifica una secuencia continua de am inoácidos de una proteína, se dice que ambos son colineales. El descubri­ miento de regiones codificantes y no codificantes dentro de los genes eucariontes muestra que no todos los genes son colineales con las proteínas que co d ifica n .

i M ezclar D N A con f N A co m p lem en tario y calen tar para sepai las cadenas de D N a .

^

i

Enfriar la mezcla. | Las secuencias

.

com plem entarias se aparean.

R e siiltcu lo s

CONCEPTOS CLAVE

RNA

El D N A puede hibridarse con i

... o con RNA.

su cad en a com p lem entaria...;

Las le g io n e s no co d ifican te s del D N A se ven como i bucles.

Fig. 1 4 - 2 . L a no c o lin e a lid a d d e lo s genes e u c a rio n te s fu e d e s c u b ie rta al h ib rid a r D N A co n m R N A . {M icrofotografía electró nica de O.L, Miller, B.R. Beatty, D.W. Faw cett/V lsu als UnÜm ited.)

C o n c lu s ió n : ías secuencias codificantes de un gen pueden estar interrum pidas por secuencias no codificantes.

Moléculas de RNA y procesamiento deL RNA

Intrones Muchos genes eucariontes contienen regiones codificantes lla­ madas exones, y regiones no codificantes llamadas secuencias intervinientes o intrones. Por ejemplo, el gen de la ovoalbúmina tiene ocho exones y siete intrones; el gen del citocromo b tiene cinco exones y cuatro intrones (fig. 14-3). Inicialmente, todos los intrones y exones se transcriben al RNA, pero después de la transcripción los intrones se eliminan por corte y los exones se unen para dar como resultado el RNA maduro. Los intrones son comunes en los genes eucariontes, pero raros en los genes bacterianos. Durante varios años después de su des­ cubrimiento, se pensó que los intrones estaban absolutamente au­ sentes en los genomas procariontes, pero en la actualidad ya han sido observados en arqueobacterias, bacteriófagos e incluso algu­ nas eubacterias. Los intrones están presentes en los genes de las mitocondrias y de los cloroplastos, así como en los genes nuclea­ res. En los genomas eucariontes, el tamaño y el número de intro­ nes parecen estar directamente relacionados con la complejidad creciente del organismo. Los genes de las levaduras contienen só­ lo unos pocos intrones cortos; los intrones de Drosophila son más largos y más numerosos; y la mayoría de los genes de los verte­ brados están interrumpidos por intrones largos. Todas las clases de genes -los que codifican para rRNA, tRNA y proteínas- pue­ den contener intrones. El número y tamaño de los intrones varía ampliamente: algunos genes eucariontes no tienen intrones, mientras que otros pueden tener más de 60; la longitud del intrón varía desde menos de 200 nucleótidos a más de 50 000. Los in­ trones tienden a ser más largos que los exones y la mayor parte de los genes eucariontes contienen más nucleótidos no codifican­ tes que nucleótidos codificantes. Por último, la mayor parte de los intrones no codifican proteínas (un intrón de un gen habitual­ mente no es el exón de otro), aunque hay excepciones. Hay cuatro tipos principales de intrones (cuadro 14.1). Los in­ trones del grupo I, encontrados en algunos genes de rRNA, se autocortan y empalman (pueden catalizar su propia eliminación). Los intrones del grupo II están presentes en algunos genes co­ dificantes de proteínas de las mitocondrias, de los cloroplastos y de algunas eubacterias; también se autocortan y empalman, pero el mecanismo difiere del de los intrones del grupo L Los intro­ nes nucleares del pre-mRNA, los mejor estudiados, incluyen in­ trones localizados en los genes nucleares que codifican proteínas. El mecanismo de corte y empalme por el cual se eliminan estos intrones es semejante al empleado por los intrones del grupo II, pero los intrones nucleares no se autoeliminan, su eliminación re­ Gen d e la o v o a lb ú m in a 1

quiere la acción de los snRNA (que se analizará más adelante) y de varias proteínas. Los intrones del RNA de transferencia, en­ contrados en los genes de tRNA, utilizan incluso otro mecanismo de corte y empalme que requiere enzimas que cortan y vuelven a sellar el RNA. Además de estos grupos principales, hay otros va­ rios tipos de intrones. Veremos en detalle la química y los mecanismos de corte y em­ palme del RNA, más adelante en este capítulo. Por ahora tendre­ mos en cuenta dos características generales del proceso de corte y empalme del RNA: ]) el proceso de corte y empalme de todos los intrones de los pre-raRNA ocurre en el núcleo; y 2) el orden de los exones del DNA suele mantenerse en el RNA que se cor­ tó y se empalmó; las secuencias codificantes de un gen pueden separarse, pero casi nunca se desordenan.

CONCEPTOS CLAVE Muchos genes eucariontes contienen exones e Intrones, ambos transcriptos a RNA, pero los intrones se eliminan luego mediante el procesam iento del RNA. El número y el tam año de los intrones varían de un gen a otro; son co­ munes en muchos genes eucariontes, pero poco comu­ nes en los genes bacterianos.

Revisión del concepto de gen ¿De qué manera la presencia de intrones afecta nuestro concep­ to de gen? No parece apropiado, ahora, definir al gen como una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos de una proteína porque esta definición excluye del gen a los intrones, se­ cuencias que no especifican aminoácidos. Esta definición tam­ bién excluye a los nucleótidos que codifican los extremos 5’ y 3’ de la molécula de mRNA, necesarios para la traducción, pero que no codifican aminoácidos. Por otra parte, definir un gen en estos términos excluye además, las secuencias que codifican rRNA, tRNA y otros RNA que no codifican proteínas. En vista de nues­ tra comprensión actual de la estructura del DNA y de su función, necesitamos una definición más satisfactoria de gen. Muchos genetistas han ampliado el concepto de gen para in­ cluir todas las secuencias del DNA que se transcriben a una úni­ ca molécula de RNA. Definido de este modo, un gen incluye to­ dos los exones, los intrones y aquellas secuencias, en ambos exG en d el cito cro m o

Exones

2

7

1 3' 5'

DNA I '

b

Exones

2'

3

DNA 5'

3' S' intrones

Intrones

Trarscripción'

El D N A se tran scrib e a R N A y los Intrones se eliminan por corte y

mRNA 5'

1 234567

8

W'il///

/

em palm e del RN A,

3'

1 2 3 4 mRNA 5'

Fig. 1 4 - 3 . L a s s e c u e n c ia s c o d ific a n te s de m uchos g e n e s e u c a rio n t e s e stá n in te rru m p id a s por in tro n e s no c o d ific a n te s .

5

376 Capítulo 14

'Cuadro 14-1

Principales tipos de intrones

Tipo de intrén

Localización

Tipo de corte y empalme

Grupo I

Algunos genes de rRNA

Autocorte y empalme

Grupo II

Cenes que codifican proteínas en las mitocondrias y en ¡os

Autocorte y empalme

cloroplastos

Pre^mRNA nuclear Cenes que codifican proteínas en el nú--

Del empaimosoma

cleo

tRNA

Cenes del tRNA

Enzimático

Nota: Tam bién hay vario s tipos de intrones m enores, que incluyen intrones del grupo ili, “tw in tro n e s” e intrones arcaicos.

tremos del RNA, que no se traducen a una proteína. Esta defini­ ción incluye también las secuencias que codifican rRNA, tRNA y otros tipos de RNA no mensajeros. Muchos genetistas han ex­ tendido la definición de gen aún más, para incluir a toda la uni­ dad de transcripción: el promotor, la secuencia que codifica RNA y el terminador.

CONCEPTOS CLA¥E El descubrim iento de los intrones forzó a revaluar la defi­ nición de gen. En la actualidad, un gen suele definirse co­ mo las secuencias de DNA que codifican una m olécula de RNA o la secuencia com pleta de DNA requerida para transcribir y codificar una m olécula de RNA.

RNA mensajero En cuanto se identificó que el DNA era la fuente de informa­ ción genética, resultó claro que no podía codificar proteínas en forma directa. En las células eucariontes, el DNA reside en el nú­ cleo y la mayor parte de la síntesis proteica se produce en el ci­ toplasma. Los genetistas reconocieron que debería haber una mo­ lécula adicional que participara en la transferencia de la informa­ ción genética. Los resultados de los estudios sobre infección por bacteriófa­ gos, llevados a cabo a finales de la década de los cincuenta y prin­ cipios de los sesenta, señalaron al RNA como candidato probable para esta función de transporte. Los bacteriófagos le inyectan su DNA a las bacterias en las que éste se replica y se producen gran­ des cantidades de proteínas del fago en los ribosomas bacteria­ nos. Ya en 1953, Alfred Hershey descubrió un tipo de RNA sin­ tetizado rápidamente después de la infección de los bacteriófa­ gos. Los hallazgos de estudios posteriores mostraron que el bac­ teriófago T2 producía un RNA de vida corta, que tenía una com­ posición de nucleótidos semejantes a la del DNA del fago, pero lo suficientemente distinta de la del RNA bacteriano. Estas obser­

vaciones fueron compatibles con la idea de que el RNA se copia­ ba a partir del DNA y que este RNA era el que dirigía luego la síntesis proteica. En ese entonces se sabía que los ribosomas estaban involucra­ dos de algún modo en la síntesis proteica y que gran parte del RNA de una célula estaba en la forma de ribosomas. Se creía que cada gen dirigía la síntesis de un tipo especial de ribosoma en el núcleo, el cual luego se movía al citoplasma y producía una proteína específica. Utilizando centrifugación de equilibrio en gra­ diente de densidad (véase fig. 12.2), Sydney Brenner, Frangois Jacob y Matthew Meselson demostraron, en 1961, que no se pro­ ducen nuevos ribosomas durante el estallido de síntesis proteica que acompaña a la infección por el fago (fíg. 14-4). La informa­ ción genética necesaria para producir las nuevas proteínas del fa­ go no la portaban los ribosomas. En un experimento relacionado, Fran§ois Gros y col. infectaron bacterias E. coli con bacteriófagos mientras marcaban uracilo ra­ diactivamente (“caliente”) y lo añadían al medio (que entonces se incorporaría al nuevo RNA del fago producido). Después de algu­ nos minutos, transfirieron las células a un medio que contenía ura­ cilo no marcado (“frío”). Este tipo de experimento también se lla­ ma experimento de pulso y caza; las células se exponen a un pulso breve de precursor marcado, que luego se “caza” con un precursor frío, no marcado. Los experimentos de pulso y caza posibilitaron seguir las huellas de la presencia de la radiactividad en productos de eventos bioquímicos de corta duración, como la síntesis de RNA inmediatamente después de la infección por el fago. Gros y col. encontraron que el RNA del fago recién producido era de vida breve, duraba sólo unos pocos minutos y estaba aso­ ciado con los ribosomas, pero era diferente de ellos. Concluyeron que el RNA de vida corta recién sintetizado llevaba la informa­ ción genética de la estructura de las proteínas hasta el ribosoma. Se acuñó el término RNA mensajero para este transportador.

Estructura del RNA mensajero El RNA mensajero funciona como molde para la síntesis pro­ teica; transporta la información genética desde el DNA hasta un ribosoma y ayuda a ensamblar los aminoácidos en el orden co­ rrecto. Cada aminoácido de una proteína está especificado por un conjunto de tres nucleótidos del mRNA llamado codón. Tanto los mRNA procariontes como los eucariontes contienen tres regiones primarias (fig. 14-5). La región 5' no traducida (5’ UTR; en ocasiones llamada la líder) es una secuencia de nucleótidos del extremo 5’ del mRNA, que no codifica la secuencia de aminoáci­ dos de una proteína. En el mRNA bacteriano, esta región contie­ ne una secuencia consenso denominada secuencia Shine-Dalgamo, que sirve como sitio de unión de los ribosomas durante la traducción; se encuentran aproximadamente siete nucleótidos en dirección 5 ’ con respecto al primer codón traducido a aminoáci­ do (llamado codón de iniciación). El mRNA eucarionte no tiene una secuencia consenso equivalente en su región 5’ no traducida. En las células eucariontes los ribosomas se unen a un extremo 5’ modificado de un mRNA, como se verá más adelante en este ca­ pítulo. La siguiente sección de mRNA es la región que codifica pro­ teínas, la cual comprende los codones que especifican la secuen­ cia de aminoácidos de la proteína. La región que codifica proteí­ nas comienza con un codón de iniciación y finaliza con un codón de terminación. La última región del mRNA és la región 3 ’ no traducida (3’ UTR; a veces llamada remolque), una secuencia de

Moléculas de RNA y procesamiento del RNA 3' nucleótidos en el extremo 3’ del mRNA que no se traduce a pro­ teína. La región 3’ no traducida afecta la estabilidad del mRNA y la traducción de la secuencia de mRNA que codifica la proteína.

Secu en cia de Shine-D algarno solo en procariontes III d o I G i i i i i n . i L i o i i

mRNA

5'

3' Región 5 ' no tradu cid a

f-- a g *£•>«?. genética?

¿los ■'ibosornas llevan inform aciór

M éto d os

1

;

i d uran te vanas generaciones,

Región 3 ' no tra d u cid a

Fig. 1 4"5. T r e s re g io n e s p r im a r ia s del mRNA m ad u ro so n la re g ió n 5’ no tra d u c id a , la re g ió n que c o d if ic a proteí­ n a s y la re g ió n 3 ’ no tra d u cid a .

Se desarrollaron £ coli en un

H i

Región que co d ifica proteínas

m edio con isótopos pesados

CONCEPTOS CLAVE

; de m o d o que estos isótopos I pesados se incorporaran a todos i sus ribosomas,

i'^M edio con ' 5|\j y I3 c ^ Cultivo de E. coli H .' i 0

Las bacterias se trasladaron

|

a un m edio q ue co n ten ía

i

isótopos livianos

Las moléculas de mRNA mensajero contienen tres regio­ nes principales: la región 5’ no traducida, la región que codifica proteínas y la región 3’ no traducida. Las regio­ nes 5’ y 3’ no traducidas no codifican los am inoácidos de una proteína.

y I2C)...|

...y se infectaron

¡

i con bacteriófagos.

!

Procesamiento del pre-mRNA

-M edio con

y ] 2q

-C u ltivo de £. coli B

\ í\

/!

/I

Los nuevos ribosomas, I producidos d espués de la

i infección por el fag o , deberían I co n ten e r 14N y 12C y deberían ! ser relativam ente livianos.

H

Después de q ue se produjeron las p roteínas del fag o , los I

ribosom as se separaron por

i i cen trifug ació n en equilibrio de I g rad ien te de qensidad.

Zentrifugaciór

R e s u lta d o s

Densidad creciente O

io io los ribosom as viejos que con ten ían isótopos pesados (15^ y i3 c ) estaban presentes.

C o n c lu s ió n : los ribosomas no se producen durante la reproducción del fago.

Fig. 1 4 - 4 . B ren n er, Ja co b y M eselson d e m o stra ro n q u e . lo s r ib o s o m a s no lle v a n in fo rm a ció n g e n é tica .

En las células bacterianas la transcripción y la traducción ocu­ rren en forma simultánea; mientras se está transcribiendo el ex­ tremo 3’ de un mRNA, los ribosomas se unen a la secuencia de Shine-Dalgarno cerca del extremo 5’ e inician la traducción. Da­ do que la transcripción y la traducción están acopladas, hay po­ cas oportunidades para que el mRNA se modifique antes de la síntesis proteica. Por el contrario, en las células eucariontes la transcripción y la traducción están separadas en forma temporal y espacial. La transcripción curre en el núcleo, mientras que la mayor parte de la traducción se produce en el citoplasma; esta se­ paración proporciona una oportunidad para que el mRNA euca­ rionte se modifique antes de ser traducido. De hecho, el mRNA eucarionte se altera extensamente después de la transcripción. Se hacen cambios en el extremo 5’, en el extremo 3’ y en la sección que codifica proteínas de la molécula de RNA. El transcripto ini­ cial de los genes que codifican proteínas de las células eucarion­ tes se conoce como pre-mRNA, mientras que el transcripto ma­ duro procesado es el mRNA. Reservaremos el vocablo mRNA para las moléculas de RNA que han sido procesadas por comple­ to y están listas para ser traducidas. Los hallazgos de investigaciones recientes han demostrado que parte de la traducción de los organismos eucariontes ocurre en el núcleo. Por lo tanto, parte de la transcripción y de la traducción podría estar acoplada como en los procariontes. La importancia de este acoplamiento para el procesamiento del RNA aún no es­ tá clara.

Adición del casquete 5' Un tipo de modificación de los pre-mRNA eucariontes consis­ te en la adición, en la región 5’, de una estructura denominada casquete 5’. Este proceso de adición del casquete consiste en añadir un nucleótido en el extremo 5’ del mRNA y la metilación

37 8 Capítulo 14 -por la.adición de un grupo metilo (CÍÍ3)- de la base del nucleótido recién añadido, y la adición de un grupo 2’-OH, al azúcar de uno o más nucleótidos presentes en el extremo 5’ (fig. 14-6). El proceso de adición del casquete ocurre rápidamente después de la iniciación de la transcripción y, como se analizará con mayor pro­ fundidad en el capítulo 15, el casquete 5’ ñmciona en la inicia­ ción de la traducción. Las proteínas que se unen al casquete, lo reconocen y se adhieren a él; luego un ribosoma se une a estas proteínas y se mueve en dirección 3’ a lo largo del mRNA, hasta que llega al codón de iniciación y comienza la traducción. La pre­ sencia de un casquete 5’ también aumenta la estabilidad del mR­ NA e influye en la eliminación de los intrones. En el análisis de la transcripción que efectuamos en el capítulo 13, se notó que en el extremo 5’ de todas las moléculas de RNA hay tres fosfatos porque estos grupos no se separan del primer ribonucleósido trifosfato en la reacción de transcripción. En el ex­ tremo 5’ del pre-mRNA puede representarse como 5’ pppNpNpN..., en el cual la letra N representa un ribonucleótido y la p, un fosfato. Poco después de la iniciación de la transcrip­ ción, uno de estos fosfatos se elimina y se añade un nucleótido guanina (véase fig. 14-6). Este nucleótido guanina se une al premRNA por un enlace 5’-5’ único, que es notablemente distinto del enlace fosfodiéster 5’-3’ habitual, que une a todos los otros nucleótidos del RNA: esencialmente, el nucleótido guanina se fi­ ja al revés en el extremo 5’ del pre-RNA. Luego se añaden uno o más gmpos metilo al extremo 5’; el primero de estos grupos se añade a la posición 7 de la base del nucleótido guanina terminal, transformando la base en una 7-metilguanina. Un grupo metilo puede añadirse entonces a la posición 2 ’ del azúcar, que se en­ cuentra en el segundo y en el tercer nucleótido, como se muestra en la figura 14-6. En raras ocasiones, pueden unirse grupos meti­ lo adicionales a las bases del segundo y del tercer nucleótido del pre-mRNA. La adición del casquete 5’ requiere la participación de varias enzimas distintas. El paso inicial lo lleva a cabo una enzima que se asocia con la RNA polimerasa IL Dado que ni la RNA políme­ ras a I ni la RNA polimersa líí tienen asociada esta enzima, las moléculas de RNA transcriptas por estas polimerasas (rRNA, tRNA y algunos snRNA) no tienen casquete.

T ranscripción

— Nucleótido — Fosfato 3' O

U n o de los tres I fo sfato s en el extre­

-

m o 5' del m R N A

Elim inación del fosfato

se elim ina, ...

5'

B

3'

r* P N P N p

.y se añ ad e un nucleotido g uanina (con su to.sfato).

5 ' C P P P N P N P

B

Los grupos m etilo se añ ad en a !

la posicii

í clec

7 cié n base del nu-

M etilación

le uu ariina term inal,,,.

5'

CI I3- C

5> P P N f- ' J P'

M etilación £ i i

.. .y a la posición 2 ' del

B la

n el seg u n d o y

[ tercer nucleótidos.

La

inicial tam bién p ied =

i

estar rnetilada.

CH 3 CHj 5" C H 3 -G

P P F N P

13'

P

Adición de la cola de poli (A) Un segundo tipo de modificación al mRNA eucarionte consis­ te en la adición de entre 50 y 250 nucleótidos de adenina en el ex­ tremo 3’, los que forman una cola de poli(A). Estos nucleótidos no están codificados por el DNA, sino que se añaden después de la transcripción (fig. 14-7) en un proceso conocido como poliadenilación. La mayor parte de los genes eucariontes transcriptos por la RNA polimerasa II se transcriben más allá del extremo de la secuencia codificante (véase cap. 13); el material adicional

del nucí o id )

I

, — Grupo 7-metilo

H c

,CH, !

P P P -C H , Grupo 2 '- m e tilo

/ 7-m etilguanina

Fig. 1 4 - 6 . La m a y o ría d e io s m RNA e u c a rio n te s tienen un c a sq u e te 5’. El casquete co nsiste en un nucleótido con una 7-m etilguanlna unida al pre-mRNA con un enlace S’-S’ único (que se m u estra en detalle en el recuadro inferior). El casq uete se añ a­ de poco d esp u és de la iniciación de la tran scrip ció n . Se agrega un grupo m etilo a la posición 7 de la base g uanina en el n ucleóti­ do recién añadido (ahora, el nucleótido term inal) y a la posición 2 ’ de cada azú ca r de los sig u ien tes dos nucleó tid os.

OCH;

!

Moléculas de RNA y procesamiento del. f^NA 2

DMA

I El pre-rnRNA se corta a u n a posición

S it io cíe in ic ia c ió n d e la t r a n s c r ip c ió n

! entre 11 y 30 nucleótidos h acia el ex-

T 'r a n s c r íp c

I trem o 3 ' de una secuencia consenso S e c u e n c ia

N u c le ó t id o s

consenso

1 1-30

— ---- ,,

P re - rn R N A

IA A U A A A , en I I leg on 3 ' n c

I

1

la.

3'

5'

t

7

S it io de C o rte

c o rte ,............... i La adición dr k ^ n u rle o tid iís

|

i ad enina (poliadenilacion) o cu rre en I 3 '| el extrem o 3 del |)ic m R N A y

|

I genera la cola de poli(A),

i

Po lia d e n iia ^ C o la d e p o ii(A )

hkhhhhhhhhhhkhhkh.

rriR N A

3'

Conciysión. ur ei procesa'rieruo dei pre-p" F liA ■ > £■| añaae una c o h de poí)(A;* a través dei co ;te j de ¡ la poíiaderiiiación. i

O

li

Fig. 14-7.

La m a yo ría de lo s

rn R N A

eH carlon tes tleisen sina cola 3’ p o li(A ).

presente en el extremo 3’ se corta y se añade la cola de poli(A). Sin embargo, para algunas moléculas de pre-mRNA pueden cor­ tarse hasta I 000 nucleótidos del extremo 3’. El procesamiento del extremo 3’ del pre-mRNA requiere se­ cuencias tanto en dirección 5’ como en dirección 3’ con respecto al sitio de corte (fig. 14-8). La secuencia consenso AAUAAA suele encontrarse entre 11 y 30 nucleótidos en la dirección 5’ con respecto al sitio de corte (véase fig. 14-7) y determina el punto en el que ocurrirá el corte. Una secuencia rica en U (o G y U) siem­ pre se encuentra en dirección 3’ con respecto al sitio de corte. En los mamíferos, el corte 3’ y la adición de la cola de poli(A) requieren un complejo formado por varias proteínas: el factor de especificidad para el corte y la poliadenilación (CPSF’); el factor de estimulación del corte (CstF); al menos dos factores de corte (CFI y CPU) y una poliadenilato polimerasa (PAP). El CPSF se une a una secuencia consenso AAUAAA en dirección 5’, mientras que el CstF se une a la secuencia en dirección 3’. El pre-mRNA se corta y el CstF y los factores de corte abandonan eí complejo; el extremo 3’ cortado del pre-mRNA entonces se degrada. El CPSF y la PAP permanecen unidos al pre-mRNA y llevan a cabo la po­ liadenilación. Después de la adición de aproximadamente 10 nu­ cleótidos de adenina, una proteína de unión a poli(A) (PABII) se une a la cola de poli(A) e incrementa la velocidad de la poliadenilación. A medida que se sintetiza mayor longitud de cola, se unen moléculas adicionales de PABII a ella. La cola de poli(A) confiere estabilidad a la mayoría de los mRNA, aumentando el tiempo durante el cual esta molécula perma­ nece intacta y disponible para el proceso de traducción, antes de ser degradada por enzimas celulares. La estabilidad conferida por la cola de poli(A) es dependiente de las proteínas que se .unieron a esta cola. La cola de poli(A) también facilita la unión del ribosoma al mRNA. Los mRNA eucariontes que codifican histonas del core son únicos (véase cap. 11) por el hecho de que carecen de una cola de poli(A) y dependen de un mecanismo diferente para el corte 3’,

que requiere la formación de una estructura en forma de horqui­ lla en el pre-mRNA y de una pequeña partícula ribonucleoproteica (snRNP) llamada U7 (fig. 14-9). La U7 contiene una snRNA con nucleótidos complementarios con una secuencia presente en la molécula de pre-mRNA, justo en dirección 3’ con respecto al sitio de corte, y U7, muy probablemente, se une a esta secuencia. Una proteína que se une a la horquilla se añade entonces a la es­ tructura de horquilla y estabiliza la unión de U7 a la secuencia complementaria presente en la molécula de pre-mRNA. La pro­ teína que se une a la horquilla, además estabiliza al mRNA e in­ crementa su velocidad de traducción.

CONCEPTOS CLAVE Los pre-mRNA eucariontes se procesan en sus extremos 5’ y 3’. Se añade un casquete, consistente en un nucleótido modificado y varios grupos metilo, ai extrem o 5’. El casquete facilita la unión de un ribosoma, increm enta la estabilidad del mRNA y puede afectar la elim inación de los intrones. Ei procesamiento en el extremo 3’ incluye el corte 3’ de una secuencia consenso AAUAAA en dirección 3’ y la adición de una cola de poü(A).

Corte y empalme del RNA El otro tipo principal de modificación que se produce en el premRNA eucarionte es la eliminación de los intrones por el corte y empalme del RNA. Esto ocurre en el nticleo habitualmente des­ pués de la transcripción y de la adición de la cola de poli(A), pe­ ro antes de que el RNA se mueva hacia el citoplasma. Secuencias consenso y el empalmosoma (spliceosom e). El corte y empalme requiere la presencia de tres secuencias en el in-

380 Capítulo 14 Secuencia co nsen so

" Proteína de unión a la horquilla Horquilla —

Pre-mRNA

I Sitio de corte

Un com piejo de proteínas une I

■litio de Secuencia rica en U

la secuencia consenso y una

Pre-mRNA

corte 3

5-

j secuencia rica en U, ubicada !

Secuencia co n se n so

l í s J l í l M

iiacia la dirección 3',

Polim erasa poliadenilada

Factor de i esp ecificid ad de la p oliadenilacióñ y corte

snRNA U7

Sitio de corte Factores de corte

Factor de estim ulación del corte

Secu en cia rica en U

Fig. I 4 - 9 . L o s m R N A e u c a rio n te s q u e c a r e c e n d e la cola d e poM(A) d e p e n d e n d e un m e c a n ism o d ife re n te p a ra e l co rte 3 ’. El corte requiere la p resencia de snRNA U7, q u e tiene

I Se produce el corte. Los factores de corte en el

b ases co m p lem en tarias con una secu e n cia consenso en dirección 3' del sitio de corte 3 ’. El corte depende de la form ación de una e stru ctu ra con form a de horquilla ce rcan a al extrem o 3 ’ del premRNA; el ap aream ien to de bases probablem ente o cu rre entre las regiones co m p lem en tarias del pre-mRNA y el snRNA U 7.

extrem o 3 ' del pre-m RNA se liberan.

5'

Región de apaream iento probable

i m

3'

.C -

3' B

El extrem o

|

3 ' del

¡

pre-mRlMA

!

se degrada. \

y,

D egradación ’

Q la C PSF'

>i

polim erasa de polia-

d en ila d ó n añ ad e nucleói tidos de ad enina al extre-

3'

!

m o 3 ' del nu evo m R N A ...

P A B tl

H

5'

cola de p oli(A ) e •í'

H

...y la proteína de unión a p oli(A ) (PA B II) une la

La poliadenila-

¡

ción y la unión

1

♦'* >

increm enta la velocidad de poliadenilación.

co n tin uad a del j I

PABII elon g an la|

j

cola de poli(A). !

S':

14-8.

Fig. E l p ro ce sam ien to del extrem o 3’ del pre-mRNA re q u ie re u na se c u e n c ia c o n s e n s o y v a r io s fa c t o r e s .

trón. Un extremo del intrón se conoce como sitio de corte y em­ palme 5’ y el otro extremo es el sitio de corte y empalme 3’ (fig. 14-10); estos sitios de corte y empalme poseen secuencias con­ senso cortas. La mayoría de los intrones del pre-mRNA comien­ zan con GU y terminan con AG, lo que sugiere que estas secuen­ cias desempeñan un papel central en el corte y empalme. El cam­ bio de un nucleótido único en cualquiera de estos sitios evita el corte y empalme. Pocos intrones del pre-mRNA comienzan con la secuencia AU y terminan con la secuencia AC. Estos intrones son cortados y empalmados mediante un proceso que resulta si­ milar al que se ve en los intrones GU...AG, pero se utiliza un con­ junto diferente de factores de corte y empalme. Este análisis se centrará en el corte y empalme de los introngs GU...AG más co­ munes. La tercera secuencia importante para el corte y empalme está en el punto de ramificación, que es un nucleótido de adenina que se encuentra entre los nucleótidos 18 a 40 en dirección 5’ con respecto al sitio de corte y empalme 3’ (véase fig. 14-10). La se­ cuencia que rodea al punto de ramificación no tiene un consenso fuerte, pero suele tomar la forma YNYYRAY (Y es una pirimidina, N es cualquier base, R es cualquier purina y A es adenina). La deleción o mutación del nucleótido adenina en el punto de rami­ ficación evita el corte y empalme. El corte y empalme ocurre dentro de un gran complejo conoci­ do como empalmosoma, formado por varias moléculas de RNA y muchas proteínas. Los RNA componentes son RNA nucleares pequeños (cap. 13) cuya longitud oscila de 107 a 210 nucleóti­ dos; estos snRNA se asocian con proteínas para formar partícu­ las ribonucleoproteicas pequeñas (snRNP, que en inglés se pronjincia “snurps”). Cada snRNP contiene una tínica molécula de snRNA y múltiples proteínas. El empalmosoma está compuesto de cinco snRNP que reciben su nombre de los snRNA que con­ tienen (Ul, U2, Lf4, U5 y U6), y algunas proteínas que no están asociadas con un snRNA.

Moléculas de RNA y procesamiento del RNA 2

cu encias co n se n so críticas presentes en el sitio de corte y em palm e 5’, en el punto de ram ificación y en el sitio de corte y em palm e 3 ’. En la secu en cia co nsen so que rodea al punto de ram ificación (YNYYRAY), Y es una pirim idina, R es cualq uier purina, A es adenina y N es cu alq uier base.

Exón 2

Exón

H g . 1 4 - 1 0 . El corte y e m p alm e del premRNA re q u ie re s e c u e n c ia s c o n s e n s o . Hay se ­

,------»-----,

Sitio de corte y em p alm e 5 '

Intrón

5'

ynyym y

iG U 'M íA G Ü .,

S ecu en cia co n se n so 5 '

CONCEPTOS CLAVE Los intrones de los genes nucleares contienen tres se­ cuencias consenso críticas para el corte y empalme: un sitio de corte y empalme 5’, un sitio de corte y empalme 3’ y un punto de ramificación. El corte y em palme del pre-mRNA ocurre dentro de un gran com plejo llamado empalmosoma, que contiene snRNA y proteínas.

El proceso de corte y empalme. Para ilustrar el proceso de cor­ te y empalme del RNA, consideraremos las reacciones químicas que ocurren. Luego, veremos la forma en que estas reacciones de corte y empalme constituyen un conjunto de procesos coordina­ dos dentro del contexto del empalmosoma. Antes de que se produzca el corte y empalme, un exón que es­ tá en dirección 5’ (exón 1) y un exón que está en dirección 3’

Sitio de corte y em palm e 3 '

A

¡r

:

Punto de ram ificación

'. C A G C

(exón 2), se encuentran separados por un intrón (fig. 14-11). El pre-mRNA se corta y empalma en dos pasos distintos. En el pri­ mer paso, el pre-mRNA se corta en el sitio de corte y empalme 5’. Este corte libera al exón 1 del intrón y el extremo 5’ del intrón se une al punto de ramificación; esto implica que el intrón se re­ pliega sobre sí mismo para fonnar una estructura llamada lazo. El nucleótido de guanina de la secuencia consenso que se encuentra en el sitio de corte y empalme 5’ se liga con el nucleótido de ade­ nina que se encuentra en el punto de ramificación. Este enlace se lleva a cabo mediante un proceso de transesterificación, reac­ ción química en la cual el grupo OH del átomo de carbono T del nucleótido de adenina del punto de ramificación ataca el enlace fosfodiéster 5’ del nucleótido de guanina, que se encuentra en el sitio de corte y empalme 5’, lo corta y forma un nuevo enlace 5’2 ’ fosfodiéster entre los nucleótidos de guanina y adeniija. En el segundo paso del proceso de corte y empalme del RNA, se hace un corte en el sitio de corte y empalme 3’, y en forma si­ multánea el extremo 3’ del exón 1 se une en forma covalente (cor­ te y empalme) al extremo 5’ del exón 2. Este enlace se forma.

T

Sitio de corte y em palm e 5 ' Sitio de corte y em p alm e 3/^

\ Transcripción

Pre-mRNA

Intrón

r~~~¡

.............I.......... r t El m R N A se co rta en * el sitio de corte y emp_a,[rne,51.

H

El intrón se lib era' I co m o un lazo, ...

Lazo Q

H i El extremo 5' del in- sQ

Se hace un corte

de ram ificación..

B

i i y e m p a lm e 3'.

.. .y los dos exones se

I

co rtan juntos,,

\

i i

mRNA

El m R N A co rtad o y empal-!

co n fo rm ad o al lazo se rom pe y el intrón lineal

|

trón se une al p u n to i i en el sitio de corte |

El enlace que m antiene '

m ado se dirige al dtoplas- j T r a d u c c ió í

ma y se traduce.

I

se degrada.

Fig. 1 4-1 1 .

3'

Se cu e n cia co n se n so 3 '

El co rte y e m p a lm e d e lo s in tro n e s n u c le a r e s re q u ie re un p ro ce so de d o s p a s o s . En prim er lugar ocurre un corte en el sitio de corte 5’ y se form a un lazo por la unión del extrem o 5’ del intrón al punto de ram ificación. En segundo lugar, ocurre un corte en el sitio de corte 3’ y se em palm an dos exo nes, uno ju n to a otro.

382 Capítulo 14

.Cuadro 14-2

Interacciones RNA-RNA en el corte y empalme del pre-mRNA

interacción

Función

U1 con sitio de corte y empalme 5’

U1 se une al extremo 5’ del intrón; provoca el corte del intrón; no tiene un papel en el corte y empalme

U2 con punto de ramificación

Posiciona el extremo 5’ del iri.trón cerca del punto de ramificación para ia formación

del lazo U2 con U6

Mantiene el extremo 5’ del ¡ntrón cerca dei punto de ramificación

U6 con sitio de corte y empalme 5’

Posiciona el extremo 5’ del intrón cerca del punto de ramificación

LI5 con extremo 3’ del primer exón

Ancla el primer exón al empalmosoma después del corte; yuxtapone los dos extre­ mos del exón para el empalme

U5 con extremo 3’ de un exón y ex­ Yuxtapone los dos extremos del exón para el empalme

tremo 5’ ciel otro U4 con U6

Entrega U6 al intrón; no tiene un papel directo en el corte y empalme

también, mediante una reacción de transesterificación, en la que el grupo 3’-OH unido al extremo del exón 1, ataca el enlace fosfodiéster en el sitio de corte y empalme 3’, lo corta y forma un nuevo enlace fosfodiéster entre el extremo 3’ del exón 1 y el ex­ tremo 5’ del exón 2; el intrón se libera como un lazo. El intrón se hace lineal cuando el enlace se corta en el punto de ramificación y luego se degrada con rapidez por acción de las enzinaas nuclea­ res. El mRNA maduro, formado por los exones que se han corta­ do y empalmado uno junto a otro, sale al citoplasma donde se tra­ duce. Si bien el proceso de corte y empalme se ilustra en la figura 1411 como un proceso de dos pasos, las reacciones están coordina­ das dentro del empalmosoma. Una característica clave del empal­ mosoma es una serie de interacciones que ocurren entre el mR­ NA y los snRNA, y entre diferentes snRNA (resumido en el cua­ dro 14-2). Estas interacciones dependen del apareamiento de ba­ ses en forma complementaria, entre las diferentes moléculas de RNA y lleva a los componentes esenciales del pre-mRNA trans­ cripto y del empalmosoma en íntima proximidad, lo cual hace po­ sible el proceso de corte y empalme. El empalmosoma se ensambla sobre el transcripto de pre-mR­ NA paso a paso (fig. 14-12). En primer lugar el snRNP U1 se une al sitio de corte 5’ y luego U2 se une al sitio de ramificación. Un complejo consistente en U4, U5 y U6 (que forman una liniea snRNP) une el empalmosoma. Esta adición provoca un cambio de conformación en el empalmosoma; el intrón forma un bucle, y el sitio de corte y empalme 5’ se acerca al punto de ramifica­ ción. Ul y U4 se desagregan de la estructura del empalmosoma, con la formación ulterior de pares de bases entre U6 y U2 y en­ tre U6 y el sitio de corte y empalme 5’. El sitio de corte y empal­ me 5’, el sitio de corte y empalme 3’ y el punto de ramificación se encuentran muy cercanos, y se mantienen unidos por el empal­ mosoma. Las dos reacciones de transesterificación se producen uniendo los dos exones y liberando el intrón en forma de lazo. Las secuencias consenso que se encuentran en los extremos 5’ y 3’ de los intrones, son de clara importancia en el corte y empal­ me; sin embargo, en eueariontes más complejos con intrones lar­ gos, estas secuencias pueden no ser suficientes, para que la ma­

quinaria de corte y empalme reconozca adecuadamente el extre­ mo de lo intrones. En estos organismos, el reconocimiento ade­ cuado de los sitios de corte y empalme 5’ y 3’ requiere las secuen­ cias consenso, denominadas intensifícadores del corte y empal­ me exónico (ESE), localizadas en los exones adyacentes. A dife­ rencia de los intensifícadores de la transcripción, considerados en el capítulo 13, un ESE debe encontrarse en una posición particu­ lar con relación al sitio de corte y empalme. En las reacciones de corte y empalme, las proteínas SR (ricas en serina) se unen a los ESE, y participan en reclutar la maquinaria de corte y empalme en los sitios de corte y empalme 5’ y 3’ y en el punto de ramifi­ cación. La mayor parte de los mRNA se producen a partir de una sola molécula de pre-mRNA a partir de la cual los exones se escinden en conjunto. Sin embargo, en algunos organismos, los mRNA pueden ser producidos por el empalme de exones provenientes de dos o más pre-mRNA; a este proceso se lo conoce como corte y empalme trans. Organización nuclear. El proceso de corte y empalme del RNA ocurre en el núcleo y la mayor parte se produce antes de que el RNA pueda moverse al citoplasma. Durante muchos años se consideró al núcleo una sopa bioquímica, en la que los com­ ponentes, como el empalmosoma, se difundían y reaccionaban al azar. En la actualidad, se cree que el núcleo tiene una estructura interna altamente ordenada y que la transcripción y el procesa­ miento del RNA ocurren en ubicaciones particulares dentro de él. Uniendo marcadores fluorescentes al pre-mRNA y utilizando técnicas de imágenes especiales, los investigadores han sido ca­ paces de observar la localización del pre-mRNA, y la forma co­ mo se transcribe y procesa. Los resultados de estos estudios mos­ traron que la eliminación de los intrones y otras reacciones del procesamiento se producen en los mismos sitios que la transcrip­ ción (fig. 14-13), lo que sugiere que estos procesos pueden estar acoplados físicamente. Esta sugerencia tiene el apoyo de la ob­ servación de que parte de la RNA polimerasa II es necesaria pa­ ra el corte y empalme, y también para el procesamiento en 3’ del pre-mRNA.

Moléculas de RNA y procesamiento del RNA 3 í S'

3'

Intión

'

f Punto de ramificación

Í¡1 U1 I

se une al sitio

de corte y em palm e

5'.

|u i

Intrón

IJ'I H

Ü2 se une al pun! to de ramificacicjn.

U2

U1 'J5

U'l

Jn com plejo de U5,

m ...

y l)C

e unen al

em palm o so m a.

ilU Iy U i-

II

n.

Empalmosoma

Fig. 1 4 - 1 3 .

L a e lim in a ció n de io s in tro n e s, el p ro c e ­ tra n s c rip c ió n o cu rre n en el m ism o s itio . Las h u ellas del RNA pueden verse en el núcleo de una cé lu la eucarionte. Se unieron marcadores fluorescentes al DNA (rojo) y al RNA (verde). El RNA transcripto no se disp ersa sin o que se acumula cerca del sitio de sín tesis y sigue una vía d ete rm in a­

sa m ie n to

y la

da d urante el p rocesam iento . (R.W. Dlrks, KC. Daniel y AK. Raap.)

U6

U1

^

U5

El sitio de corte y em p alm e , I

5', el sitio de corte y em-

| U2‘

I palm e 3', y un punto de i

ram ificación se encuen tran ¡

i

m uy cercanos,

^

4 h P

i

...y se m an tien en juntos I por ap aream iento entre el I p re - m R N A y la s n R N P .

I Dos

reacciones de

transesterificación unen los U6

exones y liberan el intrón c o m o un lazo con U2, U5 y U6 unidos.

Fig. 14-1 2 . El co rte y em palm e d el R N A o c u rre d en tro del em p alm osom a.

CONCEPTOS CLAVE El corte

y

e m p alm e de intrones de ios genes nucleares es

un proceso de dos pasos: 1) el extremo 5’ del intrón se corta y se une al punto de ramificación para form ar un lazo, y 2) el extremo 3’ del intrón se corta y los dos ex­ tremos del exón se e m p alm an , uno junto a otro. Estas reacciones se producen dentro del em palmosom a.

Intrones que se autocortan y empalman. Algunos intrones se autocortan y empalman; esto significa que poseen la capacidad

de autoeliminarse de una molécula de RNA. Estos intrones caen en dos categorías principales. Los intrones del grupo I se encuen­ tran en diversos genes, entre los que se incluyen algunos genes de rRNA en los protistas, algunos genes de las mitocondrias de los hongos e incluso algunos genes de los bacteriófagos. Si bien las longitudes de los intrones del grupo I pueden variar, todos ellos se pliegan en una estructura secundaria común con nueve tallos que forman bucles (fig. 14-14a), necesarios para el proceso de corte y empalme. Se requieren reacciones de transesterificación para que se produzca el corte y empalme de los intrones del gru­ po I (fig. 14-14b). Los intrones del grupo II, presentes en algunos genes de las mi­ tocondrias, también tienen la capacidad de autocortarse y empal­ marse. Todos los intrones del grupo II se pliegan en estructuras secundarias similares (fig. 14-15a). El corte y, empalme de los in­ trones del grupo II se lleva a cabo mediante un mecanismo que tiene ciertas similitudes con el corte y empalme de genes nuclea­ res mediado por el empalmosoma; el corte y empalme ocurre me­ diante dos reacciones de transesterificación que generan una es­ tructura con forma de lazo (fig. 1445b). Dadas estas similitudes,

los intrones del grupo II y los intrones del pre-mRNArnuclear, se­ gún se sugiere, poseen relaciones evolutivas, quizá los intrones nucleares evolucionaron del grupo II de intrones que se autocor­ tan y empalman, y posteriormente adoptaron a las proteínas y a los snRNA del empalmosoma para llevar a cabo la reacción de corte y empalme.

CONCEPTOS CLAVE Los intrones que se autocortan y em palman pertenecen a dos tipos: los intrones del grupo I y los del grupo II. Es­

tos intrones tienen estructuras secundarias com plejas que les permiten catalizar su eliminación de m oléculas de RNA sin el auxilio de enzimas u otras proteínas.

384 Capítulo 14 (a)

i

den a bases específicas y |;;

B

i al áto m o de carbono 2 '

I

í de algunas ribosas.

i

i illt

il

II

II

lili

1;

II

I!

li

i I i

Ií

í I

iI

El R N A se corta, form ando varios in term ed iario s..

Interm ediarios III

I

II

II

II

I6 S

I

tRNA

II

III

II

I

II

.................................

5S

23S B

. . . V se recorta.

RNA m aduros

'‘'I’'"'''’'!!'"' i II m rRNA 16S

tRNA

rRNA 23S

rRNA 5S Q

b! resultadc t las m a d i

Fig. 1 4 - 2 4 .

/R N A 1 8S m o lé - 1,':;'=^'' . ,^NA, f"

El RNA ribosóm ico se procesa d esp u és de la tran scrip ció n . Nótese que el rRNA

eucarionte 5S se transcribe en form a sep arad a del gen rRNA eucarionte pequeño.

,nÍ rRNA 5,8S

rR N A 28S

Moléculas de RNA y procesamiento del RNA 3< las secuencias de rRNA donde ocurren las modificaciones. En for­ ma interesante, algunos snoRNA están codificados por secuencias presentes en los intrones de otros genes que codifican proteínas. El procesamiento del rRNA y el ensamble de los ribosomas en los eucariontes se producen en el nucléolo.

CONCEPTOS CLA¥E Un ribosoma es un orgánulo com plejo formado por v a ­ rias moléculas de rRNA y muchas proteínas. Cada riboso­ ma funcional consiste en una subunidad grande y una pequeña. Los RNA ribosómicos, tanto de bacterias como de células eucariontes, se modifican después de la trans­ cripción. En los eucariontes, RNA nucleolares pequeños llevan a cabo el procesam iento del rRNA.

de cadena doble. Estas moléculas de RNA de cadena doble son cortadas en trozos por una enzima que recibe el nombre descrip­ tivo de D icer (picadora), de lo cual resultan pequeñas moléculas de RNA que se desenrollan para producir siRNA y miRNA (véa­ se fig. 14-25). Los RNA interferentes pequeños y los micro RNA comparten varias características, si bien también muestran diferencias (cua­ dro 14-5; véase fig. 14-25). Ambos tienen una longitud típica de entre 21 y 22 nucleótidos, si bien los siRNA surgen por lo común

(a) Micro RNA

(b) RNA in terfentes pequeños

Repetición invertida DNA

RNA de cadena doble

.....I................... , Q La transcripción a T r a n s c r i p c i ó n !.. ¡ través de una repi repeti­

RNA interferentes pequeños y micro RNA

RNA

El R N A d e cadena doble p u e d e surgir

ción invertida del

de virus d e RNA o

D N A ...

de ho rq uillas largas.

3'

En 1998, Andrew Pire, Craig Mello y sus colaboradores, obser­ varon lo que les pareció un fenómeno extraño. Estaban inhibien­ do la expresión de genes del nematodo Caenorhabditis elegans insertando en los animales moléculas de RNA de cadena simple, complementarias a la secuencia de DNA del gen. Estas molécu­ las, llamadas RNA antisentido, inhiben la expresión genética al unirse a las secuencias del mRNA e inhibir la traducción. Eire, Mello y col. encontraron que, cuando se inyectaba RNA de doble cadena a los animales, se gatillaba un silenciamiento aún más po­ tente. Este hallazgo resultó desconcertante, porque no se conocía ningtín mecanismo por el que el RNA de doble cadena pudiera inhibir la traducción. Se halló adicionalmente que otros tipos de silenciamiento génico descritos con anterioridad también se gatillaban por el RNA de doble cadena. Estos estudios condujeron al descubrimiento de una clase de RNA muy pequeños y abundan­ tes denominados RNA interferentes pequeños (siRNA) o microRNA (miRNA), según su origen. En la actualidad sabemos que los siRNA y los miRNA existen en los eucariontes y son res­ ponsables del apagado de la expresión genética, mediante un pro­ ceso llamado interferencia por RNA. Los RNA interferentes pe­ queños y los micro RNA han sido involucrados además en una di­ versidad de procesos; de hecho, en 2002, la revista Science con­ sideró que los RNA pequeños eran el descubrimiento científico del año, como testimonio a la importancia cada vez mayor de es­ tas moléculas.

Interferencia por RNA

Plegam ientosB

...p rod u ce una ! m olécula de R N A

S'

que se pliega para

3'

producir RN A de i doble cadena. H

El R N A de caden a do-

J

ble se escinde por acI ción de la enzim a Dicer.

m iRNAs

□

siRNAs

.. . para producir m iRNA

i

o siRN A

Proteína

P ro te ín a

B

El m iR N A o SiRN A se

U

com bina con proteínas ¡ para form ar un

i

co m p lejo...

A paream iento de base im perfecta

Apaream iento de b ases p erfecto ^

mRNA

mRNA

5'

5'í l á l ...q u e se aparea con mRlMA ; e iníiibe la trad ucción (en el

La interferencia por RNA (RNAi) es un mecanismo podero­ so y preciso por el cual las células eucariontes limitan la invasión de genes extraños (de virus y transposones) y silencian la expre­ sión de los genes propios. La interferencia por RNA se gatilla por moléculas de RNA de cadena doble, que pueden originarse de distintas formas (fig. 14-25): por la transcripción de repeticiones invertidas en una molécula de RNA que luego aparea sus bases con sí misma para formar un RNA de cadena doble; por la trans­ cripción simultánea de dos moléculas de RNA diferentes, com­ plementarias entre sí, que se aparean formando una molécula de RNA de doble cadena o por infecciones virales que generan RNA

i

caso de m iRN A ) o d eg rada

] el m R N A ( en el caso /í! del SiRNA).

^........-.....................-......... In h ib ic ió n d e

D e g ra d a c ió n ;

la t r a d u c c ió n

Fig. 1 4 - 2 5 . L o s RNA Interferentes pequeños y io s mi­ cro RNA se producen a partir de RNA de cadena d o ble y g atillan la degradación del mRNA o la inhibición d e la tra­ ducción.

394 Capítulo 14

^Cuadro 14™5

Diferencias entre los siRNA y los miRNA

Característica

sIRNA

miRNA

Origen

mRNA. transposón o virus

RNA transcripto de un gen distinto

Escindido de

RNA dúplex o RNA de cadena simple que forma horquillas largas

RNA de cadena simple que forma horquillas cortas

Acción

Desencadena la degradación del mRNA

Algunos desencadenan la degradación del mRNA, otros inhi­ ben la traducción

Efector

Genes a partir de los cuales fueron transcriptos

Genes distintos de aquellos a partir de los cuales fueron transcriptos

del corte de moléculas de RNA, transposones de RNA y virus de RNA, mientras que los miRNA habitualmente se escinden de mo­ léculas de RNA transcriptas de secuencias que son diferentes de las de otros genes. Cada miRNA se escinde de un RNA precursor de cadena simple que forma pequeñas horquillas, mientras que pueden producirse múltiples siRNA por el corte de un dúplex de RNA formado por dos moléculas de RNA diferentes o por el cor­ te de horquillas más largas, que surjan dentro de una misma mo­ lécula de RNA. Finalmente, los miRNA habitualmente silencian genes que difieren de aquellos a partir de los cuales se han trans­ cripto, mientras que los siRNA por lo general silencian los genes a partir de los cuales se han transcripto. Tanto los siRNA como los miRNA se combinan con proteínas para formar un complejo silenciador (RISC; véase fig 14-25). El RISC se aparea con una molécula de mRNA que posee una se­ cuencia complementaria a su siRNA o miRNA y corta el mRNA, lo que lleva a su degradación o reprime la traducción del mRNA. Algunos miRNA también sirven como guía para la metilación de secuencias complementarias en el DNA y otros alteran la estruc­ tura de la eromatina; ambos procesos afectan a la transcripción. La RNAi está ampliamente distribuida y abunda en los eucariontes. Por ejemplo, los seres humanos tienen al menos 200 ge­ nes que codifican miRNA. Algunos genetistas especulan que el RNA de interferencia evolucionó como un mecanismo de defen­ sa contra elementos transponibles que se mueven a través de in­ termediarios de RNA (véase cap. 11) y virus de RNA; de hecho, algunos han llamado a la RNAi el sistema inmune del genoma. Sin embargo, la RNAi es también responsable de regular un nú­ mero de procesos genéticos clave, que incluyen a la transcrip­ ción, la traducción y la muerte celular. Los genetistas emplean la maquinaria de la RNAi como una herramienta efectiva para blo­ quear la expresión de genes específicos (véase cap. 18).

CONCEPTOS CLAVE Los pequeños RNA interferentes y los micro RNA son mo­ léculas de RNA diminutas que se producen cuando la en­ zima D ic e r (picadora) corta moléculas más grandes de , RNA de doble cadena. Los siRNA y los micro RNA partici­ pan en una variedad de procesos, entre ellos la degrada­ ción del mRNA, la Inhibición de la traducción, la metila­ ción del DNA y el remodelamiento de la eromatina.

■ IB Organismo modelo: el nematodo Caenorhabditis elegans Como vimos, la existencia de la RNAi fue inicialmente demos­ trada en el nematodo C. elegans, cuando los genetistas descubrie­ ron que podían silenciar genes específicos en esta especie inyec­ tando a los animales con DNA de cadena doble, complementario a los genes. Estaban estudiando la expresión genética en C. ele­ gans porque esta especie había probado ser un excelente organis­ mo modelo, particularmente para estudios acerca de la influencia de los genes en el desarrollo. Por razones aún desconocidas, la RNAi es especialmente efectiva en esta especie. Usted puede estar preguntándose ¿qué es un nematodo y por qué es un organismo modelo? Si bien se los ve en raras ocasio­ nes, los nematodos se cuentan entre los organismos más abun­ dantes en nuestro planeta, ya que habitan los suelos de todo el mundo. La mayoría de ellos son de vida libre e inofensivos, pe­ ro unos pocos son importantes parásitos de plantas y animales, entre los que se incluye a los seres humanos. Aunque C. elegans carece de importancia económica, se ha usado extensamente en estudios genéticos a raíz de su cuerpo plano simple, facilidad de cultivarlo y elevada capacidad reproductiva (fig. 14-26). Intro­ ducido inicialmente en los estudios gerféticos por Sydney Brenner, quien planeó en 1962 emplearlo para la disección genética de la conducta, esta especie ha hecho contribuciones importan­ tes al estudio del desarrollo, de la muerte celular, del envejeci­ miento y de la conducta. Ventajas de Caenorhabditis elegans como organismo m o­ delo C. elegans es un organismo genético ideal: es pequeño, fá­ cil de cultivar y produce una progenie numerosa. C, elegans

adulto mide alrededor de 1 mm de largo. La mayoría de los in­ vestigadores lo cultivan en placas de Petri con agar, tapizadas con un césped de bacterias, que los nematodos devoran. Es po­ sible cultivar miles de gusanos fácilmente en un solo laborato­ rio. Comparados con la mayoría de los animales multicelulares, tienen un tiempo de generación corto, alrededor de 3 días a tem­ peratura ambiente. Por otra parte, son prolíficos, ya que una so­ la hembra es capaz de producir entre 250 y 1 000 huevos ferti­ lizados en 3 a 4 días. Otra ventaja de C. elegans, particularmente para los estudios de desarrollo es que es transparente, lo cual permite la observación del desarrollo interno en todas las etapas. Tiene una estructura corporal simple, con un número pequeño e invariable de células

Moléculas de RNA y procesamiento del RNA

El gusano C a e n o r h a b d it is e le g a n s

Taxonomía: Tamaño;

» Tamaño pequeño • Tiempo de generación corto de 3 días

Anatomía:

» Cada hembra puede producir de 200 a 1 000 huevos » Fácil de cultivar en el laboratorio

Hábitat:

» Cuerpo plano simple

Nematodo 1 mm Cuerpo alargado, no segmentado Vive,y se reproduce en la tierra

• Transparente » Capaz de autofertilizarse o aparearse

Ciclo vita!

•v

*

C rom o so m as

Adulto

Cromosomas:

Cantidad de DNA: Número de genes: Porcentaje de genes en común con los seres humanos: L3

Tamaño promedio del gen: 1

Cenoma secuenciado en el año:

CONTRIBUCIONES A LA GENETICA

Fig. 1 4 - 2 6 .

Genética del desarrollo

Envejecimiento

Apoptosis (muerte celular programada)

Control genético de la conducta

5 pares de autosomas más 2 cromosomas X en las hembras (herma­ froditas) 0 1 cromoso­ ma X en los machos 103 millones de pares de bases 20 500

1

2 5% 5 000 pares de bases 1998

i J

El gusano C aenorhabditis elegans es un org anism o modelo.

(inserto: C ortesía de W illiam G oo d yer y M onique Zetka.)

somáticas: 959 células en la hembrá hermafrodita madura y 1 031 células en el macho maduro. Ciclo vital: La mayor parte de los adultos maduros son hermafroditas, con la capacidad de producir óvulos y espermatozoides, y de autofertilizarse. Unos pocos son machos, que producen sólo

espermatozoides y se aparean con los hermafroditas. Los hermafroditas tienen dos cromosomas sexuales (XX); los machos po­ seen un único cromosoma sexual (XO). Así, los hermafroditas que se autofertilizan producen sólo hembras (con la excepción de unos pocos machos que resultan de la no disyunción de los cro­ mosomas X). Cuando los hermafroditas se aparean con los ma­

396 Capítulo 14 chos, la mitad de la progenie es hermafrodita XX y la mitad, ma­ cho XO. Los óvulos se fecundan internamente, ya sea por espermatozoi­ des producidos por la hermafrodita o por los espermatozoides aportados por un macho (véase fig. 14-26). Luego se produce el desove y el desarrollo se completa fuera del animal. Alrededor de 14 horas después de la fecundación, eclosiona el huevo del que surge una larva, que atraviesa los 4 estados larvarios -denomina­ dos Ll, L2, L3 y L4- separados por mudas. La larva L4 sufre una última muda para producir un gusano adulto. En condiciones nor­ males de laboratorio, los gusanos viven entre 2 y 3 semanas. Técnicas genéticas Los genetistas iniciaron los planes para secuenciar el genoma de C elegans hacia 1989 y completaron esta tarea en 1998. Comparado con el genoma de la mayoría de los or­ ganismos multicelulares, el de C. elegans, con 103 millones de pares de bases es pequeño, lo cual facilita el análisis genómico. La disponibilidad de la secuencia genómica completa proporcio­ na gran cantidad de información acerca de las estructura, la fun­ ción y la organización de los genes en la especie. Por ejemplo, el proceso de muerte celular programada (apoptosis, véase cap. 2 ) desempeña un papel importante en el desarrollo y en la supresión del cáncer. La apoptosis de C. elegans es notablemente similar a la de los seres humanos. Una vez completada la secuencia del ge­ noma de C. elegans, y dada la facilidad de su manipulación ge­ nética, los genetistas identificaron genes que participan en la apoptosis, lo cual aumentó nuestros conocimientos de la apopto­ sis en los seres humanos y su papel en el cáncer. Con frecuencia se emplean mutágenos químicos para provocar mutaciones fáciles de identificar y aislar en C. elegans. La capa­ cidad de los hermafroditas de autofertilizarse implica la posibili­ dad de obtener una progenie homocigótica para mutaciones rece­ sivas en una misma generación; la existencia de machos implica que pueden hacerse cruzamientos genéticos. Los estudios de desarrollo se ven facilitados por la transparen­ cia del cuerpo de los gusanos. Como se mencionó antes, C. ele­ gans tiene un número pequeño y exacto de células somáticas. Los investigadores que estudian el desarrollo de este gusano han mapeado meticulosamente todo el linaje celular de la especie, razón

por la cual es posible conocer el' destino evolutivo de cada célula en el organismo adulto, retrocediendo hasta el óvulo fecundado unicelular (fig 14-27). Los biólogos dedicados a la biología del desarrollo, con frecuencia emplean el láser para destruir (ablacionar) células específicas en un gusano en desarrollo y luego estu­ diar sus efectos en la fisiología, en el desarrollo y en la conducta. Como ya se analizó, la interferencia por RNA es una herra­ mienta efectiva para silenciar genes de C. elegans. Los genetistas inyectan copias de RNA de cadena doble complementario con genes específicos; el RNA de doble cadena luego silencia la ex­ presión de estos genes mediante el proceso de RNAi. Además es posible alimentar a los gusanos con bacterias modificadas por in­ geniería genética, para expresar RNA de cadena doble, evitándo­ se así las dificultades de la microinyección. Los gusanos transgénicos se pueden producir inyectando DNA en el ovario, donde se incorpora a los ovocitos. Los genetistas han creado un gen reportero especial que produce una proteína verde fluorescente de medusa (GFP). Cuando este gen reportero se in­ yecta en el ovario y se inserta en el genoma del gusano, su expre­ sión produce la GFP, que fluoresce en el verde, permitiendo que se observe con facilidad la expresión del gen (fig. 14-28). Q

RELACION DE CONCEPTOS

_____________________ ENTRE CAPÍTULOS

« *

El RNA es capaz de asumir distintas estructuras secundarias, da­ do que es de cadena simple y puede formar puentes de hidrógeno entre bases complementarias de la misma cadena. Esta capacidad le da al RNA flexibilidad funcional y desempeña papeles importantes en la transferencia de infonnación dentro de la célula. Un tema central de este capítulo ha sido la naturaleza del gen. El concepto de gen ha cambiado con el tiempo y aún hoy depen­ de de la pregunta particular que se esté formulando. Una defini­ ción moderna empleada por muchos genetistas es: un gen es una secuencia de nucleótidos de DNA que se transcribe a una molé­ cula única de RNA.

Cigoto

Línea germinal

Fig. 14-27. La h isto ria del d e sarro llo de cada célu ­ la de C . elegan s adulto ha sido determ inada. Aquí se m uestran ias d iv isio n e s que lie varón a las células adultas de

C elegans.

Epidermis

Gónada somática

Moléculas de RNA y procesamiento del RNA f■ig. 14-28. Se ha em pleado una secuencia de la proteína flu o re sce n ­ te v e r d e (GFP) para determ inar en form a v isu a l la expresión de l o s ge­ nes in sertad o s en C . elegans (fotografía inferior). El g e n d e la GFP s e in ­ y e c t a en el o v a r lo d e un g u s a n o y se In c o r p o r a al g e n o m a d e l a n im a l. L a e x p r e ­ s ió n d e e s t e t r a n s g é n p r o d u c e GFP q u e f lu o r e s c e n e n el v e r d e (fotografía superior). (Huaqi Jian g , Rong Cuo, y Jo Anne Poweil-Coffm an: The C a en or h a b d itis elegans hif-1 gene encocles a bHLH-PAS protein that is required for adaptatlon to hypoxia. PNAS 2001 98: 7916-7921 © 2001 N ational A ca d e m y o f Sciences, U.S.A.)

Los detalles de la función y del procesamiento del RNA abor­ dados en este capítulo son importantes para comprender el proce­ so de síntesis de proteínas, que es el tema del capítulo 15. El co­ nocimiento de la estructura del ribosoma y de los tRNA es impor­ tante para comprender cómo se ensamblan los aminoácidos en una proteína. En las células eucariontes, las características, como

el casquete 5’ y la cola de poli (A) que se añaden al pre-mRNA y las que se eliminan (intrones) de él son esenciales para que la tra­ ducción avance de manera adecuada. Estas características del mRNA procesado también desempeñan un papel importante en la regulación de los genes eucariontes, tema que se analiza en el ca­ pítulo 16.

RESUMEN • El descubrimiento de intrones en los genes eucariontes forzó la redefinición de gen en el nivel molecular. Hoy en día el gen suele definirse como una secuencia de nucleótidos de DNA que se transcribe a una molécula única de RNA. • Los intrones son secuencias no codificantes que interrumpen las secuencias codificantes (exones) de los genes. Comunes en las células eucariontes, pero raros en las bacterias, los in­ trones existen en todos los tipos de genes y varían de tamaño y número. Comprenden cuatro tipos principales: intrones del grupo I, intrones del grupo II, intrones del pre-mRNA nuclear e intrones del tRNA. • Los resultados de los experimentos efectuados a finales de la década de 1950 y comienzos de la de 1960 sugieren que la información genética es transportada del DNA a los ribosomas por moléculas de RNA de vida corta, conocidas como RNA mensajero. Una molécula de mRNA tiene tres partes primarias: una región 5’ no traducida, una secuencia que co­ difica proteínas y una región 3’ no traducida. • El mRNA bacteriano se traduce inmediatamente después de la transcripción y sufre escaso procesamiento. • El transcripto primario (pre-mRNA) de un gen que codifica pro­ teínas eucariontes sufre un procesamiento extenso: se añaden un nucleótido modificado y grupos metilo, conocidos colectivamen­ te como casquete, al extremo 5’ del pre-mRNA; el extremo 3’ se ' corta y se añade una cola de poli(A); los intrones se eliminan. ®El proceso de corte y empalme de RNA ocurre dentro de una es­ tructura denominada empalmosoma compuesta de varios RNA

nucleares pequeños y de proteínas. El corte y empalme del RNA ocurre en un proceso de dos pasos y comprende interacciones RNA-RNA, entre snRNA del empalmosoma y el pre-mRNA. • Algunos intrones que se encuentran en los genes de rRNA y genes de las mitocondrias se autocortan y empalman. • Algunos pre-mRNA sufren corte y empalme alternativo, en el que diferentes combinaciones de exones se cortan y se em­ palman juntas o se emplean diferentes sitios de corte 3’. • Los RNA mensajeros también pueden alterarse por la adición, la deleción o la modificación de nucleótidos en la secuencia codificante por el proceso conocido como edición del RNA. • El RNA de transferencia sirve como puente entre los aminoá­ cidos y la información genética transportada por el mRNA. Los RNA de transferencia son moléculas relativamente cortas que asumen una estructura secundaria común y contienen ba­ ses modificadas. La mayoría de los organismos tienen múlti­ ples copias de genes de tRNA; los tRNA transcriptos a partir de estos genes se procesan extensamente, tanto en las bacte­ rias como en las células eucariontes. • Los ribosomas son los sitios de síntesis proteica en las célu­ las. Cada ribosoma se compone de varias moléculas de rRNA y varias proteínas que forman una subunidad grande y una pequeña. Los genes para rRNA existen en múltiples copias; los transcriptos primarios para estos genes se modifican ex­ tensamente después de la transcripción, tanto en las bacterias como en las células eucariontes. En estas últimas, el procesa­ miento del rRNA lo realizan RNA nucleolares pequeños.

398 Capítulo 14 ^Los RNA interferentes pequeños y los micro RNA son pro­ ductos del corte de RNA de doble cadena, que desempeñan papeles importantes en el si lenciamiento de genes y en otra diversidad de fenómenos.

• Caenorhabditis elegans es un nematodo extensamente em­ pleado como organismo modelo dados su pequeño tamaño, su reproducción rápida y prolífica, y su cuerpo plano simple.

TERMINOS IMPORTANTES

colinealidad (p. 373) exón (p. 375) intrón (p. 375) intrón del grupo I (p. 375) intrón del grupo II (p. 375) intrón nuclear del pre-mRNA (p. 375) del RNA de transferencia (375) codón (p. 376) región 5’ no traducida (p. 376) secuencia de Shine-Dalgarno (p. 376)

'

región que codifica proteínas (p. 376) región 3’ no traducida (p. 376) casquete 5’ (p. 377) cola de poli(A) (p. 378) corte y empalme del RNA (p. 379) sitio de corte y empalme 5’ (p. 380) sitio de corte y empalme 3’ (p. 380) punto de ramificación (p. 380) empalmosoma (p. 380)

lazo (p. 381) transesterificación (p. 381) intensifícador del corte y em­ palme exónico (p. 382) corte y empalme trans (p. 382) vía de procesamiento alternati­ va (p. 385) corte y empalme alternativo (p. 385) múltiple sitio de corte 3’ (p. 385) edición del RNA (p. 386) RNA guía (p. 387)

base modificada (p. 389) enzima que modifica el tRNA (p. 389) estructura en hoja de trébol (p. 390) anticodón (p. 390) subunidad ribosómica grande (p. 392) subunidad ribosómica pequeña (p. 392) interferencia por RNA (RNAi) (p. 393)

^ é le n ic

1. El DNA de un gen eucarionte se aisló, se desnaturalizó y se hibridó al mRNA transcripto a partir del gen; la estructura hibridada se observó luego mediante un microscopio electrónico. Se observó la siguiente estructura.

2. Dibuje un mRNA bacteriano típico y el gen a partir del cual se transcribió. Marque los extremos 5’ y 3’ délas moléculas de RNA y DNA e identifique las siguientes regiones o secuencias:

a. ¿Cuántos intrones y exones hay en este gen? Explique su res­ puesta. b. Identifique los exones e intrones en esta estructura hibridada.

• Solución a. Cada uno de los bucles representa una región en la cual las se­ cuencias del DNA no tienen secuencias correspondientes en el RNA; estas regiones son los intrones. Hay cinco bucles en la es­ tructura hibridada, por tanto, debe haber cinco intrones en el DNA.

a. Promotor

b. Región 5’ no traducida c. Región 3’ no traducida d. Secuencia codificante de proteínas e. Sitio de iniciación de la transcripción f. Terminador g. Secuencia de Shine-Dalgamo h. Codones de iniciación y de terminación

Moléculas de RNA y procesamiento deL RNA mutaciones, ¿qué productos intermediarios de las reacciones de corte y empalme se acumularán? Explique su respuesta.

Solución

Iniciación de la transcripción Promotor

Terminación de la transcripción

a. Hay una deleción de GT en el corte y empalme en 5’ b. Hay una deleción de A en el punto de ramificación c. Hay una deleción de AG en el sitio de corte y empalme 3’

DNA 5'3'Secuencia de Shine-Dalgarno

Codón de iniciación

Codón de detención Terminador

Secuencia que codifica proteínas

RNA 5 'c Región 5’ no traducida

:3'

Región 3’ no traducida

3. Se ha desarrollado un sistema de corte y empalme en un tubo de ensayo que contiene todos los componentes (snRNA, proteí­ nas, factores de corte y empalme) necesarios para el corte y em­ palme de los genes nucleares. Cuando se añade al sistema un tro­ zo de DNA que contiene un intrón y dos exones, el intrón se eli­ mina como un lazo y los exones se empalman uno junto al otro. Si la molécula de RNA añadida al sistema tiene las siguientes

• Solución a. La secuencia GT en el sitio de corte y empalme 5 ’ es necesa­ ria para la unión del U1 snRNP y la primera reacción de corte. Si esta secuencia está mutada no ocurrirá el corte. Así, se acumula­ rá el pre-mRNA original que contiene el intrón. b. Después del corte, en el sitio de corte y empalme 5’, el extremo 5’ del intrón se une a la A en el punto de ramificación, en una reacción de transesterificación. Si la A en el punto de ramifica­ ción se ha delecionado, no se forma estructura de lazo. El primer exón separado y el intrón unido al segundo exón se acumularán como productos intermediarios. c. La secuencia AG en el sitio de corte y empalme 3’ es necesa­ ria para el corte, en el sitio de corte y empalme 3’. Si esta secuen­ cia está mutada, los productos intermediarios acumulados serán: 1) el primer exón separado y 2 ) el intrón unido al segundo exón, con el extremo 5’ del intrón unido al punto de ramificación para formar una estructura de lazo.

PREGUNTAS DE COMPRENSION *1. ¿Cuál es el concepto de colinealidad? ¿De qué manera este con­ cepto se cumple en las bacterias y en las células eucariontes?

10. Describa dos tipos de vías de procesamiento alternativo.

¿De qué manera conducen a la producción de múltiples pro­ teínas a partir de un único gen?

2. ¿Cuáles son algunas de las características de los intrones? *11. ¿Qué es la edición del RNA? Explique el papel de los RNA *3. Cuáles son los cuatro tipos básicos de intrones? ¿En qué ge­

guías en la edición del RNA.

nes se los encuentra? *12. Resuma los diferentes tipos de procesamiento que pueden

*4. ¿Cuáles son los tres elementos principales en las secuencias de mRNA de las bacterias?

ocurrir en el pre-mRNA. *13. ¿Cuáles son algunas de las modificaciones en el procesa­

5. ¿Cuál es la función de la secuencia consenso de Shine-Dal-

miento del tRNA?

garno? 14. Describa la estructura básica de los ribosomas en las bacte­

*6, (a) ¿Qué es el casquete 5’? (b) ¿De qué manera se añade al premRNA eucarionte? (c) ¿Cuál es la función del casquete 5’?

rias y en las células eucariontes. *15. Explique de qué manera se procesa el rRNA.

7. ¿De que manera se añade la cola de poli(A) al pre-mRNA? ¿Cuál es el propósito de la cola de poli(A)?

16. ¿Cuál es el origen de los siRNA y de los micro RNA? ¿Qué

hacen estas moléculas en la célula? * 8 . ¿Qué partes constituyen un empalmosoma? ¿Cuál es la fun­

ción del empalmosoma?

17. Mencione algunas semejanzas entre los siRNA y los

miRNA. 9. Explique el proceso de corte y empalme del pre-mRNA en los genes nucleares.

400 CapítuLo 14

PREGUNTAS Y PROBLEMAS DE APLICACIÓN *18. Al comienzo del capítulo, consideramos la distrofia mus­

*25. Un genetista hace mutar un gen para proteínas que se une

cular de Duchenne y el gen de la distrofina. Aprendimos que el gen que provoca la distrofia muscular de Duchenne comprende más de dos millones de nucleótidos, pero que menos del 1% del gen codifica la proteína distrofina. So­ bre la base de lo que sabe ahora acerca de la estructura de los genes y del procesamiento del RNA en las células eucariontes, proporcione una posible explicación para el gran tamaño del gen de la distrofina.

a la cola de poli(A) en una línea de células cultivadas en el laboratorio. ¿Cuál sería el efecto inmediato de esta mu­ tación en las células en cultivo?

19. ¿De qué manera difieren el mRNA de las bacterias y el

pre-mRNA de los eucariontes?¿En qué difieren los mR­ NA maduros de las bacterias y de las células eucariontes? *20. Dibuje un gen eucarionte típico y el pre-mRNA y el

mRNA que derivan de él. Suponga que el gen contiene tres exones. Identifique los siguientes ítems y describa en forma breve la función de cada uno de ellos: a. Región 5’ no traducida b. Promotor

c. Secuencia consenso AAUAAA d. Sitio de iniciación de la transcripción

e. Región 3’ no traducida f. Intrones

*26. Ha sido desarrollado un sistema de corte y empalme in vitro (dentro de un tubo de ensayo). Este sistema contiene todos los componentes, snRNA, proteínas, factores de corte y empalme, necesarios para el corte y empalme de los genes nucleares de pre-mRNA. Cuando un trozo de RNA que contiene un intrón y dos exones se añade al sis­ tema, el intrón se elimina como un lazo y los exones se empalman uno al lado del otro. ¿Qué productos interme­ dios de la reacción de corte y empalme se acumularían si se omitieran los siguientes componentes del sistema de corte y empalme? Explique su razonamiento. a. U1 b. U2 c. U 6 d. U5 e. U4

27. El sistema de corte y empalme presentado en el Problema

26 se emplea para cortar y empalmar una molécula de RNA que contiene dos exones y un intrón. Sin embargo, en esta ocasión el snRNA U2 empleado en la reacción de corte y empalme contiene varias mutaciones en la secuen­ cia que no se aparea con el snRNA U 6 . ¿Cuál sería el efecto de estas mutaciones en el proceso de corte y em­ palme?

g. Exones 28. Un genetista aísla un gen que contiene cinco exones. Lue­ h. Cola de poli(A)

i. Casquete 5’ 21. ¿De qué manera la deleción de la secuencia de Shine-Dal-

garno afecta a un mRNA bacteriano? *22. ¿De qué manera la deleción de las siguientes secuencias o

go, aísla el mRNA maduro producido por este gen. Des­ pués de transformar al DNA en una molécula de cadena simple, mezcla el DNA de cadena simple con el R N A . Parte del DNA de cadena simple se hibrida (se aparea) con el mRNA complementario. Dibuje la imagen del as­ pecto que tendrían los híbridos de DNA-RNA vistos con el microscopio electrónico. 29. Un genetista descubre que un mismo gen codifica dos

rasgos afectaría más probablemente a un pre-mRNA eu­ carionte? a. Secuencia consenso AAUAAA b. Casquete 5’ c. Cola de poli(A)

30. ¿Cuáles serían los efectos probables de deleeionar un in-

23. ¿Cuál sería el efecto más probable sobre la secuencia de

tensificador del corte y empalme exónico del exón de un gen?

aminoácidos de una proteína de una mutación que ocu­ rriera en un intrón de un gen que codificara la proteína? Explique su respuesta, 24. Un genetista induce una mutación en el gen que codifica

el factor de corte y especificidad de la poliadenilación (CPSF) en una línea de células crecidas en el laboratorio. ¿Cuál sería el efecto inmediato de esta mutación sobre las moléculas de RNA en las células en cultivo?

proteínas diferentes. Una de ellas tiene 56 aminoácidos y la otra 82. Dé una explicación posible de cómo un mismo gen puede codificar a ambas proteínas.

31. El reactivo químico psoraleno puede emplearse para dis­ cernir cuál es la estructura de un ácido nucleico. Esta sus­ tancia química se une a los ácidos nucleicos y al ser ex­ puesta a la luz UV forma enlaces covalentes entre secuen­ cias de nucleótidos íntimamente asociadas. Estos entrecruzamientos proporcionan información acerca de la pro­ ximidad de las moléculas de RNA entre sí en estructuras complejas.

I

Moléculas de RNA y procesamiento del RNA El entrecruzamiento con psoraleno se empleó para exami­ nar la estructura del empalmosoma. En un estudio se obtu­ vieron las siguientes estructuras entrecruzadas durante el corte y empalme. Ul, U2, U5 y U6 se entrecruzaron al premRNA. U2 se entrecruzó con U6 y con el pre-mRNA. Ul, U5 y U6 se entrecruzaron con el pre-mRNA y la localiza­ ción de los entrecruzamientos se mapeó a secuencias cer­ canas al sitio de corte y empalme 5’, mientras que el snRNA U2 se entrecruza con el pre-mRNA en el sitio de rami­ ficación. Después del corte y empalme, U2, U5 y U6 , que­ daron entrecruzados con el lazo cortado. Explique estos resultados con relación a lo que se sabe

acerca de la estructura del empalmosoma y del modo en que éste funciona en el corte y empalme del RNA. (Sobre la base de D.A. Wassarman y J.A. Steitz, 1992, Interactions of small nuclear RNAs with precursor messenger RNA during in vitro splicing, Science 257:1918-1925.) 32. Explique de qué manera cada uno de los siguientes proce­

sos complican el concepto de colinealidad: a. Corte y empalme trans b. Corte y empalme alternativo.

c. Edición del RNA

PREGUNTAS AVANZADAS 33. Además de los snRNA, el empalmosoma contiene varias

proteínas. Parte de estas proteínas están asociadas con los snRNA para formar snRNR Otras proteínas están asocia­ das con el empalmosoma, pero no están asociadas con ningún snRNA específico. Un grupo de proteínas del empalmosoma comprende las proteínas precursoras del procesamiento del RNA (PRP). PRP2, PRP 16 y PRP22 son tres proteínas PRP que toman parte directamente en el proceso de corte y empalme. Los resultados de los estudios han mostrado que el PRP2 se ne­ cesita para el primer paso de la reacción de corte y empal­ me, PRP 16 actúa en el segundo paso y PRP22 es necesaria para la liberación del mRNA desde el empalmosoma. Otros estudios han encontrado que estas proteínas PRP tienen se­ cuencias de aminoácidos semejantes a las secuencias en­ contradas en las enzimas helicasas de RNA, enzimas capa­ ces de desenrollar dos moléculas de RNA apareadas. Sobre la base de esta información proponga un papel funcional para PRP2, PRP 16 y PRP22 en el corte y empalme del RNA. 34. En las células eucariontes, la cola de poli(A) normalmente

se añade a las moléculas de pre-mRNA, pero no a las de rRNA o a las de tRNA. Con el uso de las técnicas de DNA recombinante, un gen que codifica una proteína (normalmente transcripto por la RNA polimerasa II) pue­

de conectarse a un promotor para la RNA polimerasa I. Este gen híbrido, luego es transcripto por la RNA polime­ rasa I y se produce el pre-mRNA adecuado, pero no sus­ ceptible al corte en el extremo 3 ’ y sin la adición de la co­ la de poli (A). Proponga un mecanismo para explicar de qué modo el tipo de promotor encontrado en el extremo 5’ del gen puede afectar la adición de la cola de poli (A) en el extremo 3’. 35. Las proteínas SR son esenciales para el ensamble adecua­

do del empalmosoma y se conoce su participación en la regulación del corte y empalme alternativo. Resulta sor­ prendente que el papel de las proteínas SR en el sitio de corte y empalme se vea afectado por el promotor que se emplea para la transcripción del pre-mRNA. Por ejemplo, mediante ingeniería genética es posible crear promotores de a RNA polimerasa II que tengan algunas secuencias di­ ferentes. Cuando se transcriben pre-mRNA con exacta­ mente las mismas secuencias a partir de dos promotores diferentes de RNA polimerasa II, que difieren levemente en su secuencia, el empleo de uno u otro promotor puede afectar el modo en que se corta y etapalma el pre-mRNA. Proponga un mecanismo por el cual la secuencia de DNA de un promotor de la RNA polimerasa II podría afectar el corte y empalme alternativo que se produce en el mRNA.

15

EL CODIGO GENETICO Y LA TRADUCCIÓN

L a t o x i n a d i f t é r i c a le ta l L a r e la c ió n

m o le c u la r e n tr e e l

g e n o t ip o y el fe n o t ip o L a h ip ó t e s is un g e n , u n a e n z i m a L a e s t r u c t u r a y la f u n c ió n d e la s p r o t e ín a s El c ó d ig o g e n é t ic o In t e r p r e t a c ió n d e l c ó d ig o g e n é t i c o L a d e g e n e r a c ió n d e l c ó d ig o El m a r c o d e l e c t u r a y los c o d o n e s d e in ic ia c ió n C o d o n e s d e t e r m in a c ió n L a u n iv e r s a lid a d d e l c ó d ig o El p r o c e s o d e t r a d u c c ió n L a u n ió n d e lo s a m in o á c id o s a lo s 'R N A d e t r a n s f e r e n c ia L a in ic ia c ió n d e la t r a d u c c ió n E lo n g a c ió n T e r m in a c ió n C o n s id e r a c io n e s a d ic io n a le s

so b re

la s í n t e s i s d e p r o t e í n a s La e s t r u c t u r a t r id im e n s io n a l d e l r ib o s o m a La

b a cte ria C o r y n e b a c te r íu m d ip h t h e r i a e c a u s a la d ifte ria .

L a t o x in a d e la d i f ­

t e r ia q u e p r o d u c e lo s s ín t o m a s d e la e n f e r m e d a d e s t á c o d if ic a d a p o r un g e n p r e s e n ­ t e e n un b a c t e r ió f a g o q u e in f e c t a a lg u n a s c e p a s d e

C. d iphtheriae.

(G ary Gaugler/Vi-

suals Unlimited.)

In t e r a c c io n e s R N A - R N A en la tr a d u c c ió n P o lir r ib o s o m a s V ig ila n c ia p o r R N A m e n s a je r o M o d if ic a c io n e s p o s t r a d u c c io n a le s d e la s p r o t e ín a s T r a d u c c ió n y a n t ib ió t ic o s

La toxina diftérica letal a d ifte ria - d e s c r ita p o r v ez p rim e ra p o r H ip ó c ra te s en el sig lo V a.C - t i e n e u n ini~ in sid io so , c o n sín to m as in ic ia le s se m e ja n te s a los del re sfrío c o m ú n , d o lo r d e g arg an ta, p é rd id a del a p e tito y a u m en to m o d e ra d o d e la te m p eratu ra . U n a in fe c c ió n lo ­ cal de la n ariz, las a m íg d a la s o la g a rg a n ta p ro d u c e la to x in a d e la d ifteria, la q u e se a c u ­ m u la y d is e m in a m e d ia n te la c irc u la c ió n d e la san g re. E n el la p so d e 6 a 10 d ía s se e n ­ c u en tran a fe c ta d o s lo s ó rg an o s cen tra le s, lo q u e c o n d u c e a p o stra c ió n , a c e le ra c ió n del p u lso , p a rá lisis, estu p o r, c o m a y, en o c a sio n e s, d eceso . H ace no m u c h o tie m p o la d ifte ria e ra la p rin c ip a l c a u sa d e fa lle c im ie n to en lo s n iñ o s d e clim as cálid o s. E n el sig lo X V ÍI E u ro p a se v io a so la d a p o r u n a g rav e e p id e m ia ; en E s ­ p a ñ a se la co n o c ió c o m o “E l g a rro tillo ” , e l e stra n g u la d o r. L a d ifte ria se p ro p a g ó a las c o ­ lo n ias de A m é ric a en el sig lo X V III, a fe c ta n d o c o n fre c u e n c ia a fam ilias c o m p le ta s . A un en lo s tie m p o s m o d e rn o s la d ifte ria h a sid o u n a d e la s p rin c ip a le s cau sas d e m o rta lid a d in fan til. E n lo s E sta d o s U n id o s so la m e n te se in fo rm a n u n o s 100 0 0 0 -2 0 0 0 0 0 ca so s p o r añ o en la d é c a d a d e 1920; e n tre 13 0 0 0 y 15 0 0 0 d e e sto s e n fe rm o s - e n su m a y o ría niñ o s - m o rían a c a u sa d e la e n fe rm e d a d . L a e p id e m ia q u e o c u n ió p rim a ria m e n te e n tre los m e se s de in v iern o y p rim a v e ra p ro v o có p á n ic o e n tre lo s p a d res d e n iñ o s p e q u e ñ o s. E l c o n tro l d e la d ifte ria es u n a d e las h is to ria s e x ito sa s de la m e d ic in a m o d e rn a . C o n la ap lic a c ió n g e n e ra liz a d a d e la v ac u n ac ió n y d e l tra ta m ie n to a n tib ió tic o , la e n fe rm e d a d h a d e ja d o d e ser u n a a m e n a z a p a ra la sa lu d p ú b lic a . D e h e c h o , e n lo s E sta d o s U n id o s en - J c ío

S ín t e s is d e p ro te ín a s * no e s t á n d a r

EL código genético y La traducción 4( la a c tu a lid a d se in fo rm a u n ca so p o r añ o en to d o el p aís. Si b ien aún e x is te n e p id e m ia s y m u e rte s d e b id a s a la d ifte ria en a lg u n a s á reas d el m u n d o , e sta e n fe rm e d a d e stá d e sa p a re c ie n d o c o n ra p id e z c o m o e n tid a d in ­ fec c io sa grave. L a d ifte ria tie n e u n a p a to g e n ia in te re sa n te . S u c a u sa in m e d ia ta es la in fe c c ió n p o r la b a c te ria Corynebacterium diphtheriae, p e ro la b a c te ria en sí n o p ro d u c e la to x in a le tal q u e p ro v o c a la e n fe rm e d a d . L a to x in a e s ­ tá c o d ific a d a p o r u n g en p e rte n e c ie n te a u n b a c te rió fa g o q u e in fec ta a la b a c te ria . L a to x in a , sin te tiz a d a de acu erd o c o n las in stru c c io n e s g e n é tic a s d e l D N A d el fag o , in g re sa al to rre n te sa n g u ín e o d e l in d iv id u o in fe c ­ tado, d istrib u y é n d o se a to d o el cu e rp o , m o m e n to en el cu al c a u sa los sín to m a s d e la en fe rm e d a d . ¿P o r q u é la to x in a d ifté ric a es tan le ta l? L a re s p u e sta ra d ic a en su m o d o tín ic o d e a c c ió n : la to x in a d ifté ri­ c a tie n e c o m o b la n c o u n a p ro te ín a a la q u e in h ib e y se c o n o c e co m o fa c to r d e e lo n g a c ió n 2 (e lo n g a tio n fa c ­ to r 2 E F 2 ), u n c o m p o n e n te e se n c ial d e la m a q u in a ria d e sín tesis p ro te ic a d e lo s e u c a rio n te s. D u ran te la tra ­ d u c c ió n un R N A d e tra n sfe re n c ia q u e lle v a u n a m in o á c id o esp e c ifica d o p o r u n c o d ó n d e l m R N A , e n tra al rib o so m a y d o n a su a m in o á c id o a la c a d e n a p o lip e p tíd ic a crec ie n te. P ara p o d e r le e r el s ig u ie n te c o d ó n el rib o so m a d e b e d e sp la z a rse a lo larg o del m R N A , p ro c e so q u e re q u ie re E F 2. S in u n E F 2 fu n c io n a l el rib o so m a n o p u e d e re c o rre r el m R N A y n o se e n sa m b la n in g ú n p o lip é p tid o . Se d e tie n e la sín te sis p ro te ic a , se p ro d u c e la en fe rm e d a d y - s i el p a c ie n te n o se tr a ta - so b rev ien e la m u erte. L a d ifteria, p ro v o c a d a p o r el e fec to in h ib ito rio d e su to x in a so b re el E F 2 , ilu stra la im p o rta n c ia c e n tra l de la sín tesis d e p ro te ín a s en el fu n c io n a m ie n to c e lu la r n o rm al. L a in te rru p c ió n d e e ste p ro c e s o p o r solo u n o s p o co s d ías p u e d e re s u lta r m o rtal. Iró n ic a m e n te , a m e n u d o c o m b a tim o s la d ifte ria y o tra s e n fe rm e d a d e s in fe c ­ cio sas u san d o la m ism a e stra te g ia e m p le a d a p o r la to x in a d e la d ifteria, es d e c ir in h ib ie n d o la m a q u in a ria d e la sín tesis p ro te ic a d el a g e n te in fec c io so , en e ste ca so u san d o an tib ió tico s. E n este c a p ítu lo e x a m in a re m o s el p ro c e s o d e tra d u c c ió n , el m e c a n ism o p o r e l cu al la se c u e n c ia de n u c le ó tid o s del m R N A esp e c ific a la se c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e u n a p ro teín a. C o m e n z a re m o s p o r e x a m in a r la r e ­ lació n m o le c u la r e n tre el g e n o tip o y el fe n o tip o . E stu d ia re m o s lu eg o el c ó d ig o g e n é tic o , la s in stru c c io n e s q u e e sp e c ific a n la secu e n c ia d e a m in o á c id o s d e u n a p ro te ín a y d e sp u és e x a m in a re m o s el m e c a n ism o d e la s ín te ­ sis de p ro te ín a s. N u e stro in te ré s c e n tra l se rá la sín te sis d e p ro te ín a s en las b a c te ria s, p e ro e x a m in a re m o s a l­ g u n as de las d ife re n c ia s c o n las c é lu la s eu c a rio n te s. P o r ú ltim o , c o n sid e ra re m o s a lg u n o s a sp e c to s a d ic io n a ­ les d e la sín tesis de p ro te ín as. jwww.whfreeman.com/piercel

M á s in fo rm a c ió n so b re la d ifte ria y su to x in a.

La relación molecular entre el genotipo y el fenotipo a p rim e ra p e rs o n a q u e su g irió la e x iste n c ia d e u n a re la c ió n e n tre el g en o tip o y las p ro te ín a s fu e A rc h ib a ld G arro d (pp. 4 7 -4 8 ). E n 1908 G a rro d p ro p u so , c o rre c ta m e n te , q u e los g en es co d ific a n e n zim as p ero , la m e n ta b le m e n te , su te o ría tu v o p o c o im p acto e n sus co n te m p o rá n e o s. N o fu e sin o h a s ta la d é c ad a de 1940, e n la q u e G eo rg e B e a d le y E d w a rd T atu m ex a m in a ro n las b ases g en é tic a s de las v ías b io q u ím ic a s d e N eurospora, el m o ­ m e n to en el q u e la re la c ió n e n tre los g e n e s y las p ro te ín a s fu e a m ­ p lia m e n te acep tad a.

L

La hipótesis un gen, una enzima B e a d le y T atum u sa ro n el m o h o d el p an N eurospora p a ra e stu ­ d ia r el re su lta d o b io q u ím ic o d e las m u ta c io n e s. N eurospora es fácil de c u ltiv ar en el la b o ra to rio , y p p rq u e la p rin c ip a l p a rte v e ­ getativ a d el h o n g o es h a p lo id e , el e sta d o h a p lo id e p e rm ite q u e los efecto s de las m u ta c io n e s recesiv as se o b se rv en co n fac ilid ad ( f i g . 15-1). L a N eurospora d e tip o salv aje c re c e en u n m e d io m ín im o , q u e c o n tie n e so lo sales in o rg á n ic as, n itró g e n o , u n a fu e n te de c a rb o n o

c o m o la sac a ro sa , y la v ita m in a b io tin a . E l h ongo p u e d e sinteti­ z a r to d a s la s m o lé c u la s b io ló g ic as q u e re q u ie re , a p a r tir de estos c o m p u e s to s b ásico s. S in em b arg o , a v e c e s se p ro d u c e n m utacio­ nes q u e in te rru m p e n el c re c im ie n to d e l h o n g o y d e s tru y e n su ca­ p a c id a d p a ra s in te tiz a r u n a o m ás m o lé c u la s b io ló g ic a s esencia­ les. E s ta s m u ta n te s, d e fic ie n te s n u tric io n a le s, d e n o m in a d a s aux ó tr o fo s , n o c re c e rá n en m ed io m ín im o , p ero p u ed e n crecer en u n m e d io q u e c o n te n g a la su sta n cia q u e y a no tie n e n la capaci­ d ad d e sin te tiz a r p e r se. B e a d le y T atu m irra d ia ro n , en p rim e r lu g ar, esp o ras d e Neuros­ p o ra p a ra in d u c ir m u ta c io n e s (fig. 1 5-2). D espués d e la irradia­ ció n c a d a e sp o ra se u b ic ó en u n tu b o d e cu ltivo d is tin to con m e­ d io c o m p le to (m e d io q u e co n te n ía to d a s las su stan cias biológicas re q u e rid a s p a ra el c rec im ien to ). L u eg o , lo s in v e stig a d o re s trans­ firie ro n la s e sp o ra s d e c a d a cu ltiv o a tu b o s q ue c o n te n ía n medio m ín im o . L o s h o n g o s q u e c o n te n ía n la s m u tacio n es auxótrofas c re c ie ro n e n m e d io c o m p le to p e ro n o c re c e ría n en e l m e d io m í­ n im o , lo q u e p e rm itió a B e ad le y T atu m id en tificar lo s cultivos qu e c o n te n ía n las m u ta c io n es. D e sp u é s de q u e h a b ía n d e te rm in a d o q u e un cu ltiv o particular te n ía u n a m u ta c ió n a u x ó tro fa B e a d le y T atu m se p ro p u s ie ro n de­ te r m i n a r e l efecto e sp e c ífic o de e sta m u ta c ió n . T ra n sfirie ro n las e sp o ra s d e c ad a c e p a m u ta n te co n m e d io c o m p leto a u n a serie de tuí)os (v é a se fig. 1 5-2), c a d a uno d e lo s c u ales p o s e ía el medio m ín im o m á s u n a v a rie d a d de m o lé c u la b io ló g ic a e s e n c ia l, como un a m in o á c id o . S i la s esp o ra s del tu b o c re c ía n , B e a d le y Tatum

404 Capítulo 15 t ó ti micelio haploide vegeta- I ^ Estas esporas pueden germinar y j tivo produce esporas haploi-i | producir una micelia genéticamenj des a través de la mitosis. i te idéntica (reproducción asexual)... Micelio haploide (n) de tipo A

.Reproducción sexual

'le p r o d u c c ió t^ asexual .í

n

Dentro del cuerpo I fructificante los nú-

j cíeos de tipos opues: tos se fusionan 1 para formar un i meiocito diploide.

1 5 - 1 . B ea d le y Ta tu m e m p le a ro n el hongo Neurosq u e tie n e un c ic lo de v id a co m p le jo p ara d e s e n t r a ­ ñ ar la re la c ió n e n tre lo s g e n e s y la s p ro te ín a s.

M icelio h a p Io H t ^ ii de tipo A

Esporas haploides

H I I I I i

Fig.

pora,

...o pueden permanecer en el cuerpo fructificante de un tipo diferente y reproducirse sexuaímente.

v estig ar lo s g e n e s q u e c o n tro la n la sín tesis d e la a rg in in a (fig . 153). A isla ro n , e n p rim e r lu g ar, u n a serie d e m u la n tes au x ó tro fas cuy o c re c im ie n to re q u e ría arg in in a. L u eg o , p ro b aro n e s ta s m u­ lan tes e n su c a p a c id a d d e d e sa rro lla rse e n m e d io m ín im o suplem e n ta d o c o n tres c o m p u e sto s: o m itin a , c itru lin a y a rg in in a . A p a rtir d e e sto s re s u lta d o s p u d ie ro n u b ic a r la s m u tan tes e n tres g ru p o s (c u a d ro 1 5 - 1 ) so b re la b a se de c u á l d e las su s ta n c ia s per­ m itía el d e sa rro llo . L a s m u ta n te s d el g ru p o I cre c iero n e n m edio m ín im o su p le m e n ta d o c o n o rn itin a, c itru lin a o arginina. L a s m u­ tan tes d e l g ru p o II c re c ie ro n e n m ed io m ín im o su p le m e n ta d o con a rg in in a o c itru lin a , p e ro n o c re c ie ro n en el m e d io su p lem en tad o solo co n o rn itin a . P o r ú ltim o , las m u ta n te s d e l g ru p o III cre c ie ro n sólo en m e d io su p le m e n ta d o co n arg in in a. Srb y H o ro w itz p ro p u sie ro n p o r co n sigu ien te que la v ía b io q u í­ m ica q u e llev ab a al am in o ácid o arginina tenía, al m enos, tres pasos:

o rn itin a

Cuerpo fructificante

Germ inación y crecim iento B

Meiocito

Germ inación y crecim iento

Diploide 2M

El meiocito I sufre meiosis I (ahora es i haploide) y II ! y una ! mitosis... Ascospora de tipo A

Ascospora de tipo a

Ascus

\

Cuatro ascosporas de tipo A D

■■•para producir un ascus que contiene ocho ascosporas haploi­ des, cuatro de cada uno de los dos tipos parentales apareados^

Paso 2

Paso 1

Cuatro ascosporas de tipo a

Paso 3

c itru lin a ■

C o n c lu y e ro n q u e las m u ta c io n e s en el g ru p o I a fe c ta b a n e l p a­ so 1 d e e s ta v ía, las m u ta c io n e s en el g ru p o II a fectab an e l paso 2 y las m u ta c io n e s en el g ru p o III a fe c ta b a n el p aso 3. P e ro , ¿có­ m o sab ía n q u e el o rd e n d e lo s co m p u e sto s, en la v ía b io q u ím ic a , era el c o rre c to ? N ó te se q u e si el p a so 1 e stá b lo q u e a d o p o r u n a m u ta c ió n , lue­ go la a d ic ió n d e se a o rn itin a o c itru lin a p e rm ite el d e sa rro llo , p e­ ro esto s c o m p u e s to s p u e d e n c o n v ertirse en arg in in a (v é a s e fig, 15-3). E n fo rm a se m e ja n te , si se b lo q u e ó el p a so 2 la a d ic ió n de c itru lin a p e rm ite el c re c im ie n to , p ero la ad ic ió n de o rn itin a no tien e efe c to . S i se b lo q u e a el p a so 3, la s e sp o ra s crecerán so lo si se añ a d e a rg in in a al m e d io . E l p rin c ip io su b y a c e n te es q u e una m u ta n te a u x ó tro fa n o p u e d e sin te tiz a r c u a lq u ie r c o m p u e s to que a p a re z c a d e sp u é s del p a s o b lo q u e a d o p o r u n a m u tación. A l e m p le a r e ste ra z o n a m ie n to co n la in fo rm a c ió n que p ro v e e el cu ad ro 15-1 p o d e m o s v e r q u e la ad ició n d e a rg in in a al m e d io p e r­ m ite q u e lo s tre s g ru p o s d e m u tan te s se d esa rro lle n . P o r ta n to , los p a so s b io q u ím ic o s a fe c ta d o s p o r to d as la s m u ta n te s p re c e d e n el p aso q u e d a c o m o re s u lta d o la arg in in a. L a ad ic ió n d e c itru lin a

m Las esporas se liberan del ascus y germinan para formar un nuevo micelio.

p o d ía n id e n tific a r la su sta n c ia a d ic io n a d a c o m o la m o lé c u la b io ­ ló g ic a c u y a sín tesis h a b ía sid o afec ta d a p o r la m u tac ió n . P o r e je m p lo , u n a m u ta n te a u x ó tro fa q u e solo c re c ía en u n m e d io m í­ n im o al c u al se h a b ía a ñ a d id o a rg in in a d e b ía h a b e r te n id o u n a m u ta c ió n q u e in te rru m p ie ra el p ro c e so d e sín te sis d e la arginina. L a ap lic a c ió n d e este p ro c e d im ie n to a lo s p a c ie n te s p e rm itió la d ise c c ió n g e n é tic a d e vías b io q u ím ic a s d e m iíltip le s p aso s. A d riá n S rb y N o rm a n H . H o ro w itz u sa ro n e ste m é to d o p a ra in-

I Cuadro 15-1

Núm ero de la cepa m u t a n t e

Crecimiento de las mutantes auxótrofas de arginina en medio mínimo con varios suplementos O rn itin a

C itru lin a

A rg in in a

Grupo I

■+

Grupo 11 Grupo III

+

Nota: + indica crecim iento: - indica ausencia de crecim iento.

+

EL código genético y la traducción 40 p erm ite q u e las m u la n te s d el g ru p o I y d e l g ru p o II crezcan , n o a sí las d el g ru p o III; p o r en d e, las m u ta c io n e s en el g ru p o III d e ­ b e n afe c ta r u n p aso b io q u ím ic o cjue o c u rre d e sp u é s d e la p ro d u c ­ ció n d e la citru lin a, p e ro a n tes d e la p ro d u c c ió n d e arginina.

Mutaciones en el grupo III

c itru lin a ■

L a a d ic ió n d e o rn itin a p e rm ite el c re c im ie n to d e la s m ulantes d el g ru p o I, p e ro n o d el g ru p o II o d e l g ru p o III; p o r ta n to , las m u­ ta c io n e s e n lo s g ru p o s II y III a fec ta n lo s p a so s p o s te rio re s a la p ro d u c c ió n d e o rn itin a . Ya h e m o s e s ta b le c id o que las m u tacio n es d el g ru p o II a fe c ta n el p a so anterior a la p ro d u c c ió n d e la citru­ lin a, d e m o d o q u e la s m u ta c io n e s d e l g ra p o II d eb en b lo q u e a r la c o n v e rsió n d e o rn itin a e n c itru lin a.

Fig. 15-2. Beadle y Tatum desarrollaron un método para aislar mulantes auxótrofas de Neurosporm.

É t Un cultivo de Neurospora \ fue irradiado para inducir mutaciones. |

— > a rg m m a

Rayos\

.......

^

'Neurospora

M utaciones

M utaciones

en el grupo II

en el grupo III

o rn itin a —

c itru lin a

arg in in a

'M e d i o

P É Las esporas individuales I se transfirieron a tubos j con medio completo que i contenía todos los ! sustratos requeridos [ para el crecimiento.

D a d o q u e las m u ta c io n e s del g ru p o I a fe c ta n algiín p a s o antes d e la p ro d u c c ió n d e la o rn itin a p o d e m o s c o n c lu ir q ue d e b e n afec­ tar la c o n v e rsió n d e a lg ú n p re c u rso r a o rn itin a. A h o ra podem os d e lin e a r la v ía b io q u ím ic a q u e co n d u c e a la ornitina, la citrulina y la arg in in a. M utaciones

M utaciones

en el grupo I

en el grupo II

p re c u rs o r — — — > o r n itin a -----------> M utaciones

M e d io

en el grupo III

c o m p le t o

c itr u lin a -------— > arginina Las esporas de cada cultivo se transfirieron a tubos que contenían medio mínimo.

\ I

E s im p o rta n te n o ta r q u e este p ro c e d im ie n to no d e te c ta , nece­ sa ria m e n te , to d o s lo s p a so s en u n a vía; en lu g a r de eso d e te c ta so­ lo lo s p a so s q u e p ro d u c e n lo s c o m p u e sto s p u esto s a p ru e b a .

; j

i

D Los hongos con mu-l taciones auxótrofas \ no pudieron crecer r en medio mínimo. I M e d io

i

_

m ín im o

...mientras que los hongos que crecían en medio mínimo i no tuvieron mutaciones auxótrofas.

m Las esporas de los cul­ tivos mutantes fueron transferidas a tubos, cada uno de los cuales contenía medio mínimo más un aminoácido.

! La mutante de Neurospora creció solo cuando se suplementaba con arginina, lo que indica que la mutante era defec­ tuosa en la síntesis de arginina.

Conclusión; la mutación pudo identificarse por la capacidad de las esporas de crecer en ^ .A * ^

íW-.'

_—,*f

l

.

*

.

í

^

____

i_ _ _________

Is ri sí

406 Capítulo 15

P r e g u n ta : ¿por qué los efectos de una mutación genética en una vía bioquím ica nos inform an acerca de la r e la c ió n g e n - p r o t e in a ?

S u p le m e n t o s a i racsisc sníísiim»

Métodos

N in g u n o

O r n it i n a

C i ir u i in a

A r g in in a

Grupo Las esporas de las mulantes auxótrofas cuyo crecimiento requiere arginina se colo­ can en medio mínimo y en medio mínimo con un suplemento.

T ip o s a lv a je

Rcsiiltciclos I Las mutantes en el grupo I pueden crecer I en medio mínimo suplementado con ornitiI na, citrulina o arginina. La mutación bloI quea un paso previo a la síntesis de I ornitina, citrulina y arginina.

Las mutantes en el grupo il crecen en me­ dio suplementado con arginina o citrulina I pero no ornitina. La mutación bloquea i un paso previo a la síntesis de citrulina y I arginina.

! Las mutantes en el grupo iii crecen solo en i meaio suplementado con arginina. La muI tadón bloquea un paso previo a la síntesis i de arginina.

=l!l

I El grupo I se bloI quea en este paso.i

In te r p r e ta c ió n

C o m p u e s t o _ Enzim a A

de los datos

p recu rso r

Fig. 15-3.

► O rn itin a

-

El grupo II! se blo- i quea en,este paso, i

E n z i m a B - ► C it r u lin a — E n z im a C - ► A r g in in a

^ G en 4

Conclusión;

i El grupo II se bloi quea en este paso.

í

Gen 6

t

Gen C

c a d a g e n c o d if ic a u n a p r o t e ín a s e p a ra d a , e n e s t e caso , u n a enzinn a.

Método usado para determinar la relación entre los genes y las enzimas en Neurospora.

c o n d u c e a la s ín t e s is d e a r g in in a e n la

N eurospora.

E s ta v í a b io q u ím ic a

L o s p a s o s d e la v í a s o n c a t a liz a d o s p o r e n z im a s a f e c t a d a s p o r m u t a n t e s .

E m p le a n d o m u ta c io n e s y este tip o d e ra z o n a m ie n to B e a d le y T atu m p u d ie ro n id e n tific a r lo s g e n es q u e c o n tro la n varias v ías b io s in té tic a s de N eurospora. E sta b le c ie ro n q u e c a d a p aso , e n u n a v ía, es c o n tro la d o p o r u n a e n z im a d ife re n te , c o m o se m u e s tra en la fig u ra 15-3 p a ra la v ía d e la arg in in a. L o s re s u lta d o s d e la s c ru ­

zas g e n é tic a s y lo s e stu d io s de m a p e o re v e laro n q u e la s m utacio­ n e s q u e afec ta n c u a lq u ie r p a so d e u n a v ía siem pre s e m apean en la m is m a lo c a c ió n e ro m o só m ic a . B e a d le y T atum ra z o n a ro n que las m u ta c io n e s q u e a fe c ta b a n u n p a so b io q u ím ico p a rtic u la r ocu­ rría n e n u n lo cu s ú n ic o , q u e c o d ific a b a u n a e n zim a p a rticu lar. E s-

EL código genético y la traducción 40 ta id e a se d ifu n d ió c o m o la hipótesis un gen, iiiia enzima: los g enes fu n c io n a n c o d ific a n d o en z im a s, y c a d a g e n co d ific a u n a e n z im a sep arad a. C u a n d o la in v e stig a c ió n m o s tró q u e alg u n as p ro te ín a s e stá n co m p u e sta s p o r m ás d e u n a c a d e n a p o lip e p tíd ic a , y q u e d iferen tes cad e n a s p o lip e p tíd ic a s e stá n c o d ific a d a s p o r g e ­ nes sep arad o s, este m o d e lo se m o d ific ó p a ra tra n sfo rm a rs e en la

hipótesis de un gen, un polipéptido.

CONCEPTOS CLAVE Los estudios de Beadle y Tatum acerca de las vías bioquí­ micas del hongo Neurospora ayudaron a definir la rela­ ción entre el genotipo y el fenotipo al establecer la hipó­ tesis de un gen, una enzima, la idea de que cada gen co­ difica una enzima separada. Esta hipótesis se modificó, posteriormente, para transformarse en la hipótesis de un gen, un polipéptido.

La estructura y la fundón de las proteínas L as p ro te ín a s so n c e n tra le s p a ra to d o s lo s p ro c e s o s v iv ien tes

(fig. 15-4). M u c h a s p ro te ín a s so n e n z im a s, c a ta liz a d o re s b io ló g i­ cos q u e c o n d u cen las re a c c io n e s q u ím ic a s d e la s célu la s; o tras so n co m p o n e n te s e stru c tu ra le s q u e p ro v e e n el an d a m io y el so ­ p o rte p a ra las m e m b ra n a s, fila m en to s, h u e so y p elo . A lg u n a s p ro ­ teín as ay u d a n p a ra tra n sp o rta r su stan c ia s, o tras tie n e n fu n cio n e s d e re g u la c ió n , c o m u n ic a c ió n o d efen sa. T odas las p ro te ín a s e stá n c o m p u e sta s p o r aminoácidos, lig a ­ d o s u n o ju n to a otro. E x iste n v e in te a m in o á c id o s c o m u n e s q u e se e n c u e n tra n en las p ro te ín a s; esto s a m in o á c id o s se m u e stra n en la figura 15-5, tan to c o n su s a b re v ia tu ra s d e tre s le tra s co m o c o n su ab re v ia tu ra d e u n a so la letra. (O tro s a m in o á c id o s q u e en o c a sio ­ n es se en c u e n tra n en las p ro te ín a s so n fo rm a s m o d ific a d a s d e los am in o á c id o s co m u n e s.) L o s v e in te a m in o á c id o s c o m u n e s son se ­ m eja n te s en estru ctu ra : c a d a u n o d e e llo s c o n tie n e u n carb o n o c e n tra l u n id o a un g ru p o am in o , u n á to m o de h id ró g e n o , u n g ru ­ p o c a rb o x ilo y u n g ru p o R (ra d ic a l) q u e es d ife re n te e n c ad a a m i­ n o á c id o y d ifiere n so lo en la e stru c tu ra d e lo s g ru p o s R (ra d ic a ­ les). L o s am in o á c id o s p re se n te s en la s p ro te ín a s se e n c u en tra n u n id o s p o r enlaces peptídicos (fig. 15-6) p a ra fo rm a r ca d en a s polipeptídicas, y u n a p ro te ín a c o n siste en u n a o m á s ca d e n a s p o ­ lip e p tíd ic a s. A l ig u a l q u e lo s ác id o s n u c le ic o s, lo s p o lip ép tid o s tien en p o la rid a d , en u n e x tre m o tie n e n u n g ru p o am in o lib re (N H '^j) y en el o tro p o se e n u n g ru p o c a rb o x ilo lib re (C O O ). A lg u n a s p ro te ín a s c o n siste n d e u n o s p o c o s a m in o á c i­ d o s m ie n tra s q u e otra s p u e d e n te n e r m iles. A l ig u a l q u e lo s á c id o s n u c le ic o s, la e s tru c tu ra m o le c u la r d e las p ro te ín a s tie n e v a rio s n iv e le s d e o rg a n iz a c ió n . L a estru ctu ­ ra p rim a ria d e u n a p ro te ín a es su se c u e n c ia d e a m in o á c id o s (fig. 15-7a). A tra v é s d e las in te ra c c io n e s e n tre lo s a m in o á c id o s v e c in o s , u n a c a d e n a p o lip e p tíd ic a se p lie g a y se e n ro s c a p a ra fo rm a r u n a estructura secundaria (fig. 15-7b); d o s e stru c tu ra s se c u n d a ria s c o m u n e s q u e se e n c u e n tra n en la s p ro te ín a s so n la h o ja b e ta (p ) p le g a d a y la a lfa ( a ) h é lic e . L a s e s tru c tu ra s s e c u n ­ d a ria s in te ra c ttia n y se p lie g a n a d ic io n a lm e n te p a ra fo rm a r u n a estructura terciaria (fig. 1 5 -7 c ), q u e es la fo rm a c o m p le ta , tr i­ d im e n s io n a l d e la p ro te ín a . L a s e s tru c tu ra s se c u n d a ria y te r c ia ­ r ia d e u n a p ro te ín a so n d e te rm in a d a s, e n ú ltim a in s ta n c ia , p o r la e s tru c tu ra p rim a ria - l a se c u e n c ia d e a m in o á c id o s - d e la p ro te í­ n a. F in a lm e n te , a lg u n a s p ro te ín a s c o n s is te n en d o s o m á s c a d e -

Fig. 15-4. Las proteínas cumplen varias funciones bio­ lógicas y son centrales para todos los procesos vitales. (a) L a lu z p r o d u c id a p o r la s lu c ié r n a g a s e s r e s u lt a d o d e u n a reac­ c ió n p r o d u c t o r a d e lu z e n t r e la lu c if e r in a y el ATP, c a t a l i z a d a por ’la e n z i m a l u c if e r a s a .

(b)

L a p r o t e ín a f i b r o í n a e s el p r in c i p a l c o m ­

p o n e n t e e s t r u c t u r a l d e la s t e la r a ñ a s ,

(c)

L a s s e m illa s d e c a s t o r

c o n t ie n e n u n a p r o t e ín a m u y t ó x ic a c o n o c i d a c o m o r ic i n a . (Partea:

Gregory K. Scott/Photo Researchers. Parte b: Rosemary Caivert/lmagestate. Parte c: Gerald & Buff Corsi/Visuals Unlimited.)

408 CápítuLo 15 Fig. 1 5 - 5 . L o s a m in o á c id o s c o m u n e s tien en e s tru c tu ra s s e m e ja n te s . C a d a a m i n o á c id o c o n s is t e e n un á t o m o d e c a rb o n o

Hidrógeno H

c e n t r a l ( a ) u n id o a: 1) un g r u p o a m in o ( N H 3+), 2) un g r u p o c a rb o ­ x ilo ( C O O ); 3 ) un á t o m o d e h id r ó g e n o (H ) y 4 ) un g r u p o ra d ica l,

Grupo

Grupo

a m in o + H 3N -

c a rb o x ilo COO-

C-

d e s ig n a d o p o r R. En las e s t r u c t u r a s d e lo s v e in t e a m in o á c id o s c o ­ m u n e s , la s p a r t e s e n n e g r o so n c o m u n e s a t o d o s lo s a m i n o á c i ­ d o s y la s p a r t e s e n r o jo s o n los g r u p o s R.

R

Grupo radical (cadena lateral)

Grupos R alifáticos, n o polares H

Grupos R aromáticos

H

H

+ H ¿,N — I C — C O O ^ + H 3,N — CI — C O O - + H :),N — CI — C O Q H

CH \

CH3 / H 3C

G licina (G ly, G) H

H

H

/

+ H ,N " ^

CH \

CH3

'^ C H ,

1

L eu cin a (L eu, L)

C=CH

F e n ila la n in a (P h e , F)

T iro sin a (Try, Y)

H

1

H

Iso le u c in a (lie, I)

H

P ro lin a (P ro , P)

f H jN — C — C 0 0 - - + H 3 N — C — C O O - + H 3 N — C — C O O CH2 CHj

H

CH,

CH,

1

1

H — C — OH

CH, I1 ■SH

CH3 T re o n in a (T h r, T)

H

C isteín a (Cys, C)

H

H

1

1

CH2 /

H^N

CH,

I N H 3+

CH,

I NH

I NH2 L isin a (Lys, K)

A rg in in a (Arg, R)

H

H

C

CHj

CH2

CH,

C

COO-

CH,

\

H2 N

CH3 A sp a ra g in a (A sn , N )

\

f H j N - - C — C O O ^ + H 3 N — C — COO--

0

G lu ta m in a (G ln , Q )

C — NH+ H

I

CHj

0

C ^N H

C=N H,

CH,

/

M e tio n in a (M et, M )

I

Grupos R cargados negativamente

+ H 3 N — C — C O O ' + H 3N — C — C O O ^ + H 3 N — C — C O O CH2

CH,

CH,

I

H

+ H ,N — C — C O O ^ +H3 N— c — co o - + H 3 N — C — C O O ^

S

H

CH3

Grupos R no cargados, polares

S erina (Ser, S)

T rip tó fa n o (T rp , W )

Grupos R cargados positivamente

I

CHpH

CH,

1

H ^ C --------- C H 2

CH, CH3

CH,

0 9

c

+ H 3 N — C — C O O '^ + H 3 N — C — C O O '-

1

I

+ H 3N — C — C O O ^ + H 3 N — C — C O O - + H 3 N — C — C O O -

NH

^ co o -

1

1

H — C — CH,

H

I

CH3

V alin a (V al, V)

1

H

I CH,

A la n in a (Ala, A)

CH2

H

A sp a rta to (A sp, D )

COOG lu ta m a to (G lu, E)

H is tid in a (H is, H )

EL código genético y La traducción 4 R'

H

R2

I

I

I

+ H 3N — C H - - C — O O

R‘

I + H 3N

EL código genético

+H — N — C H — C O O " H

H

R2

I I '

CH — C — N — CH — C O O O E nlace p e p tíd ic o

Fig. 15"6. peptídicos.

Los aminoácidos están unidos por enlaces

En un e n la c e p e p t íd ic o el g r u p o c a r b o x ilo d e un

a m in o á c id o e s t á u n id o e n f o r m a c o v a le n t e c o n el g r u p o a m in o d e o t r o a m in o á c id o .

ñ as p o lip e p tíd ic a s q u e se a so c ia n p a ra p ro d u c ir u n a estructura cuaternaria (fig. 1 5 -7 d ).

CONCEPTOS CLAVE El producto de muchos genes es una proteína cuya ac­ ción produce la característica codificada por ese gen. Las proteínas son polímeros que consisten en am inoácidos li­ gados mediante enlaces peptídicos. La secuencia de am i­ noácidos de una proteína es su estructura primaria. Esta estructura se pliega para crear las estructuras secundaria y terciaria; dos o más cadenas polipeptídicas pueden asociarse para crear una estructura cuaternaria.

I La estructura primaria de I una proteína es su seI cuencia de aminoácidos.

i Las interacciones entre

E n 1953 W atso n y C rick reso lv iero n la estructura del DNA e id en tificaro n la sec u e n c ia de bases c o m o la p o rtadora d e la inform a­ ció n genética. S in em b arg o , la fo rm a en la cual la secu e n c ia de ba­ ses d e D N A e sp ecificab a la secu en cia d e am in oácidos d e su proteí­ n a (el c ó d ig o g en ético ) n o fue o bvia d e inm ediato y p erm an eció di­ fícil d e d escifrar d u ra n te otros 1 0 años. U n a d e las p rim eras preguntas acerca d el código g en ético que de­ b ía resp o n d erse era: ¿Cuántos nucleótidos se requieren pa ra especi­ fic a r un único aminoácido'? E sta u n id ad b ásica en el c ó d ig o genéti­ co --el conjunto d e b ases que codifica u n am inoácido ú n ic o - es un codón (véase p. 3 7 6 cap. 14). M u ch as investigaciones iniciales reco­ n o ciero n q u e los co d o n es debían co n ten e r u n m ínim o d e tres nucleó­ tidos. C ad a p o sició n d e nucleótidos en el m l ^ A p u ed e se r ocupada p o r u n a de cuatro b ases: A , G, C o U . Si u n codón co n sistía en un n u cleó tid o único, entonces, serían p o sib les solo cuatro codones dife­ rentes (A , G, C y U ), lo que no es suficiente para co d ific a r los vein­ te am inoácidos distintos que se en cu en tran p or lo c o m ú n en las pro­ teínas. Si los co d o n es estuvieran h ech o s p o r dos n ucleótidos cada u n o (p. ej., G U , A C , etc.) h abría 4 x 4 = 16 codones p o sib les; aún no resu lta suficiente p a ra codificar p a ra los veinte am inoácidos. C on tres n ucleótidos p o r cad a codón, h ay 4 x 4 x 4 = 64 co d o n es posi­ bles, lo q u e es m ás q u e suficiente p a ra especificar los v e in te aminoá­ cidos. P o r tanto, u n código de tripletes q u e requiriera tre s nucleóti­ dos p o r codón s e n a la fo rm a m ás eficien te de codificar la totalidad de los v einte am inoácidos. M ediante el em pleo de las m utaciones de los b acteriófagos F ran cis C rick y col. confirm aron en 1961 que el có­ dig o g enético es, d e hecho, un código de tripletes.

CONCEPTOS CLAVE El código genético es un código de tripletes, en el cual tres nucleótidos codifican cada aminoácido de una proteína.

los aminoácidos gene­ ran que la estructura primaria se pliegue en una estructura secundaria, como esta alfa hélice.

La estructura secundaria | se pliega, adicionaimeme, | en una estructur; !

Do? o más cadenas polipeptídi­ cas pueden asociarse para crear una estructura cuaternaria.

................... ...i/... .....................

(a) Estructura primaria

(b) Estructura secundaria

(c) Estructura terciaria

(d) Estructura cuaternaria

A m in o á c id o ¡

R¡ «

A m in o ­ á c id o 2

A m in o ­ á c id o 3|

A m in o

•

Rj

#

R,

R ]m

á c id o 4

Fig. 15"7.

Las proteínas tienen vario s niveles de organización estructural.

41Ú Capítulo 15 Interpretación del código genético C uando se había establecido con firm eza que el có ­ digo genético es un conjunto de codones que tienen tres nucleótidos de longitud, el siguiente paso consistió en determ inar cuáles grupos de tres nucleótidos especi­ fican cuáles am inoácidos. L ógicam ente, la fo rm a m ás sencilla de descifrar el código h ubiera sido determ inar la secuencia de bases de u n trozo de R N A , añadirlo a un sistem a de síntesis proteica libre d e células y p erm i­ tir que dirigiera la síntesis de u n a proteína. L a secuen­ cia de am inoácidos d e la proteína recién sintetizada se determ inaría, y esta secuencia se com pai'aría c o n la presente en el RNA . L am entablem ente, no existía en ese m om ento la posib ih d ad de determ inar la secuencia de nucleótidos de u n trozo de R N A , d e m o d o q u e de­ bieron em plearse m étodos indirectos p a ra descifrar el código. L as prim eras pistas acerca del có d ig o g enético p ro ­ vienen de 1961, del trabajo realizado p o r M arsh all N irenberg y Johan n H einrich M atthaei. E stos investiga­ dores crearon R N A sintético em p lean d o una en zim a llam ad a polinucleó tid o fosforilasa. A d iferencia d e la R N A polim erasa, la p o linucleótido fo sfo rilasa n o re ­ quiere un m olde; u n e al azar cu alq u ier nucleó tid o de R N A que esté disponible. L os prim ero s R N A sintéti­ cos em pleados p o r N irenberg y M atth aei fu ero n hom opolím eros, m oléculas de R N A q u e consistían d e un único tipo de nucleótido. P o r ejem plo, al añadir la p o ­ linucleótido fosforilasa a u n a solución d e nucleótidos de uracilo se generaban m oléculas d e R N A q u e c o n ­ sistían com pletam ente en nucleótidos de uracilo, de esta m anera solo co ntenían codones del tipo U U U (fig. 15-8). E stos R N A p oli(U ) se añadieron luego a veinte tubos, cad a uno de los cuales co n ten ía u n sistem a de síntesis proteica libre d e células y los v einte am in o áci­ dos distintos, uno d e los cuales estab a m arcad o ra ­ dioactivam ente. L a traducción procedió en los veinte tubos pero la proteína radioactiva apareció solo en uno de ellos - e l q ue co n ten ía fenilalan in a m a rc a d a (fig. 158). E se resultado m ostró que el co d ó n U U U especifi­ ca el am inoácido fenilalanina. L os resultados de ex p e­ rim entos sim ilares en los q u e se em pleó R N A poli(C ) y poli(A ) m ostraron que C C C codifica p ara p ro lin a y A A A codifica p ara Usina; p o r razones técnicas, los re ­ sultados p ara poli(G ) fueron im posibles de interpretar. P a ra o b te n e r in fo rm a c ió n a c e rc a d e c o d o n e s a d i­ c io n ales N ire n b e rg y col. c re a ro n R N A sin té tic o s q u e c o n te n ía n d o s o tres b ase s d ife re n te s. D a d o q u e la p o lin u c le ó tid o fo s fo rila sa in c o rp o ra n u c le ó tid o s al a z a r esto s R N A c o n te n ía n m e z c las al a z ar d e las b ase s y p o r tan to se lo s lla m ó co p o lím e ro s al azar. P o r e jem p lo , cu a n d o lo s n u c le ó tid o s ad e n in a y cito sin a se m e z c la ra n c o n la p o lin u c le ó tid o fo sfo rila sa , las m o lé c u la s d e R N A p ro d u c id a s tu v ie ro n o c h o c o d o n es d iferen tes: A A A , A A C , A G C , A C A , C A A , C C A , C A C y C C C . E n lo s siste m a s d e sín te sis d e p ro te ín a s lib re d e c é lu la s esto s R N A p o li(A C ) p ro ­ d u je ro n p ro te ín a s q u e c o n te n ía n seis a m in o á c id o s d istin to s: a sp arg in a , g lu ta m in a , h istid in a , l i s i n a , , p ro lin a y treo n in a.

Exp erim en to Préguntáí ¿qué^amínoácidos son especificados por Jos codones compuestos por'Sülo'UBtipo de^base?'";

Mutodos

¿ D e q u é m a n e ra el p ro c e so d e in ic ia c ió n d ifiere e n las bac­ te ria s y las c é lu la s eu c a rio n te s? * 1 0 . N o m b re lo s fa c to re s d e e lo n g a c ió n q u e se e m p le a n en la tra d u c c ió n b a c te ria n a y e x p liq u e el p ap e l que d ese m p e ñ a c a d a fa c to r en e ste p ro ceso .

3t ¿ Q u é so n los tR N A iso a e e p to re s? 1 1 . ¿ Q u é su ceso s p ro v o c a n la te rm in a c ió n de la tra d u c c ió n ? * 4 . ¿C u ál es la im p o rta n c ia d el h e c h o d e q u e m u c h o s co d o n es sin ó n im o s d ifie ra n so lo en el n u c le ó tid o d e la te rc e ra p o s i­ ció n ? * 5 . D e fin a lo s sig u ie n te s v o c a b lo s d e n tro d el có d ig o gen ético : a . M a rc o d e le c tu ra

f. C o d ó n co n se n tid o

b. C ó d ig o su p e rp u esto

g. C o d ó n sin sen tid o

c. C ó d ig o n o su p e rp u e sto

h . C ó d ig o u n iv e rsal

d . C o d ó n d e in ic ia c ió n

i. C o d o n e s n o u n iv e rsale s

12.

P ro p o rc io n e v a rio s eje m p lo s d e in te ra c c io n e s R N A -R N A q u e o c u rre n e n la sín tesis p ro te ica .

1 3 . ¿ D e q u é m a n e ra su p e ra n las c é lu la s p ro c a rio n te s e l proble­ m a d e un rib o s o m a atasc ad o so b re u n m R N A q u e n o tiene c o d ó n d e te rm in a c ió n ? ¿D e q u é m a n e ra lo h a c e n la s célu­ la s e u c a rio n te s ? 1 4 . ¿ C u á le s so n alg u n o s de los tip o s d e m o d ific a c ió n postrad u c c io n a l d e la s p ro te ín a s?

e. C o d ó n de te rm in a c ió n 6 . ¿D e q u é m a n e ra se e sta b le c e el m a rc o d e le c tu ra d e u n a se ­ c u e n c ia de n u c le ó tid o s?

* 7, ¿D e q u é m a n e ra los tR N A se u n e n a su a m in o á c id o c o rre s­ p o n d ie n te ?

* 1 5 . E x p liq u e d e q u é m a n e ra o p eran a lg u n o s a n tib ió tic o s al a fe c ta r el p ro c e s o d e sín tesis p ro te ic a . 1 6 . C o m p a re y c o n tra ste el p ro c e so d e sín tesis p ro te ic a en bac­ te ria s y célu las e u c a rio n te s y p ro p o rc io n e las sim ilitu d e s y d ife re n c ia s en e l p ro c e so d e tra d u c c ió n de esto s d o s tipos d e célu las.

PREGUNTAS Y PROBLEMAS DE APLICACION

*17.

S y d n ey B re n n e r aisló m u ta n te s d e Salm onella typhim urium q u e se v ie ro n im p lic a d o s en la b io sín te sis d el trip tó fan o y n o cre c ía n en m e d io m ín im o . C u a n d o e sta s m u ta n ­ tes se p ro b a ro n en m e d io m ín im o , al q u e se a ñ ad ió un o d e lo s cu atro sig u ie n te s c o m p u e sto s (in d o l g lic e ro l fo sfa ­ to, in d o l ác id o a n tra n ílic o y trip tó fa n o ), la s re sp u e sta s de cre c im ie n to o b te n id a s fu e ro n las q u e se m u e stra n en el si­ g u ie n te cu ad ro .

M o t a n te

trp -l trp-1

Medio Ácido Indol mínimo antranílico glicerol fosfato -

-

-

-

+

-

+

+

frp-6

trp-1 ír p -i trp-9 trp-lO tr p -n

Triptófano

-I-

+ -h -i+ +

p re c u rso r■

c o m p u e sto I enzima

enzim a

A

B

c o m p u e sto II -

-K

?rp-3

trp-A

Indol

18.

P ro p o rc io n e el o rd e n d e in d o l g lic e ro l fosfato, in d o l, ácido a n tra n ílic o y trip tó fa n o en la v ía b io q u ím ic a q u e co n d u c e a la sín te sis d e l trip tó fa n o . In d iq u e c u á l p aso d e la v ía se ve a fe c ta d o p o r c a d a u n a d e las m u ta c io n e s. L a a d ic ió n d e u n a se rie d e c o m p u e s to s p ro d u c id o s e n la si­ g u ie n te v ía b io q u ím ic a :

-H

+ + + -h

c o m p u e s to III enzima C

L a m u ta c ió n a in a c tiv a la e n z im a A , la m u ta c ió n b inacti­ v a la B y la m u ta c ió n c in a c tiv a la e n z im a C. L a s m u tan ­ te s, c a d a u n a d e las cu ales tien e u n o d e estos d e fe c to s , se p ro b a ro n en m e d io m ín im o al c u al se añadió c o m p u e s to I, II o III. C o m p le te lo s re su lta d o s e sp e ra d o s de e s ta s prue­ b a s, u b ic an d o u n sig n o m ás (-I-) p a ra el c re c im ie n to o un sig n o m en o s (-) p a ra a u se n c ia d e c re c im ie n to e n el si­ g u ie n te c u ad ro :

EL código genético y La traducción A-'.

M e d io m ín im o al c u a l se añ ad e C epa co n m u tació n

C o m p u e sto I

C o m p u e sto II

C o m p u e sto III

2 6 . U n antico d ó n sobre un tR N A tien e la secuencia 5 ’-G C A -3’.

a. ¿ Q u é a m in o á c id o es tra n sp o rta d o p o r este tR N A ? b. ¿C uál sería el efecto si el G en el codón m u tase p o r una U?

a b

a. L e u —> G ln

* 1 9 . S u p o n g a q u e el n ú m e ro d e tip o s d ife re n te s d e b a se s d el R N A fu e ra c u a tro .¿ C u á l se ría el ta m a ñ o m ín im o d e c o d ó n (niím ero de n u c le ó tid o s) n e c e sa rio si el n ú m e ro de tip o s de am in o á c id o s d istin to s fu era: (a) 2, (b) 8, (c) 17, (d) 45, (e) 7 5? 2 0 . ¿C u á n to s c o d o n e s se ría n p o sib le s en u n có d ig o d e trip leto s de solo tres b ase s (A , C y U )?

b. P h e

Ser

c. P h e —> lie d. P ro -> A la e. A sn —> L ys f. lie —> A sn

* 2 1 . E m p lean d o el c ó d ig o g en ético q u e se p ro p o rc io n a en la fi­ g u ra 15-10 in d iq u e los am in o ácid o s esp ecificad o s p o r las siguientes secu en cias d e m R N A b a cte rian o e in d iq u e los extrem os am in o y carb o x ilo d el p o lip é p tid o pro d u cid o . a . 5 ’- A U G U U U A A A U U U A A A U U U U G A -3 ’ b . 5 ’-A U G U A U A U A U A U A U A U G A -3 ’

c. 5 ’-A U G G A U G A A A G A U U U C U C G C U U G A -3 ’ d. 5 ’-A U G G G U U A G G G G A C A U C A U U U U G A -3 ’ 2 2 . U n a c a d e n a n o m o ld e d el D N A tie n e la sig u ie n te se c u e n ­ c ia de b ase. ¿ Q u é se c u e n c ia d e a m in o á c id o se rá c o d ific a d a p o r e sta secu e n c ia ?

2 8 . A rre g le los sig u ie n te s c o m p o n e n te s d e la tra d u c c ió n en el o rd e n a p ro x im a d o en el c u a l a p a re c e ría n o se u sa ría n en la sín te sis d e p ro te ín a s: c o m p le jo d e in ic ia c ió n 70S fa c to r d e lib e ra c ió n 1 p e p tid il tra n sfe ra sa fa c to r de e lo n g a c ió n G c o m p le jo d e in ic ia c ió n 30S fa c to r de e lo n g a c ió n Tu fa c to r de in ic ia c ió n 3 fM et-tR N A f“ "‘

2 9 . E l d ia g ra m a sig u ie n te ilu stra u n p a so en el p ro c e s o de tra­ d u cció n .

5 ’ - A T G A T A C T A A G G C C C -3 ’ * 2 3 . L a sig u ie n te se c u e n c ia d e a m in o á c id o se e n c u e n tra en u n trip ép tid o : M et-T rp -H is. P ro v e a to d a s las se c u e n cia s de n u c le ó tid o s p o sib le s en el m R N A , en la c a d e n a m o ld e de D N A , y en la c a d e n a n o m o ld e d e D N A , q u e c o d ific a ría n e ste trip ép tid o . eob"

2 4 . ¿ C u á n ta s secu e n c ia s d e m R N A d istin ta s p u e d e n c o d ific a r u n a c a d e n a p o lip e p tíd ic a co n la se c u e n c ia d e am in o ác id o s M e t-L e u -A rg ? (A se g ú re se de in c lu ir el c o d ó n de te rm in a ­ c ió n .) * 2 5 . U n a serie de tR N A tie n e los sig u ie n te s an tic o d o n e s. C o n ­ sid ere las re g la s d e l ta m b a le o p ro v ista s e n el cu a d ro 15-1 y p ro p o rc io n e to d o s lo s c o d o n es p o sib le s c o n los c u ale s p o d ría ap a re a rse c ad a tR N A .

m RNA

H a g a u n b o sq u e jo d el d ia g ra m a e id en tifiq u e e n él los si­ g u ie n te s e le m e n to s

a. E x tre m o s 5 ’ y 3 ’ d el m R N A . b. S itio s A , P y E. c. C o d ó n d e in ic ia c ió n .

a. 5 ’-G G C -3 ’ b. 5 ’-A A G -3 ’

d. C o d ó n d e term in a c ió n . e. E x tre m o s a m in o y c a rb o x ilo d e la cad en a p o lip etíd ica re c ié n sin te tiz a d a .

c. 5 ’-IA A -3 ’ d. 5 ’-U G G -3 ’ e. 5 ’-C A G -3 ’

f. L o c a liz a c ió n a p ro x im a d a d e l sig u ie n te e n la c e peptídico q u e se fo rm ará.

g. L u g ar del rib o so m a al que se u n irá el factor d e liberación 1.

432 Capitulo 15 3 0 . .R efiérase al d ia g ra m a d e l p ro b le m a 2 9 p a ra re sp o n d e r las sig u ien tes p re g u n ta s,

cu en cia. E lija so lo u n p ro c e so p o r cada u n a d e las secuen­ cia s (es d ecir, u n so lo tild e p o r c a d a se c u e n c ia ).

a . ¿C u ál se ría el a n tico d ó n d el sig u ie n te tR N A añ a d id o al sitio A del rib o so m a ? b . ¿C u ál se ría e l sig u ie n te a m in o á c id o a ñ a d id o a la cad e n a p o lip e tíd ic a cre c ie n te ? * 3 1 . U n m R N A sin té tic o añ a d id o a u n siste m a d e sín tesis p ro ­ te ic a lib re d e c é lu la s p ro d u c e u n p é p tid o co n la sig u ie n te se c u e n c ia d e am in o á cid o s; M e t-P ro -Ile -S e r-A la . ¿C u ál se ­ ría el efecto so b re la tra d u c c ió n si se o m itie ra n los si­ g u ie n te s c o m p o n e n te s en el siste m a d e sín tesis p ro te ic a li­ b re d e c é lu la s? ¿ Q u é tip o d e p ro teín a, si es q u e a lg u n a, se p ro d u c iría ? E x p liq u e su ra z o n a m ie n to .

Proceso afectad o en fo rm a m ás in m ediata p o r la deleción S ecuencia RNA delecionada R eplicación T ran scrip ció n P ro cesam ien to Traducción a. Sitio ori

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b. Sitio consenso de corte y empalme 3’

a . F a c to r d e in ic ia c ió n b . A c to r d e in ic ia c ió n 2

c. Cola de poli(A)

c. F a c to r de e lo n g a c ió n T u d. Terminador d . F a c to r d e e lo n g a c ió n G e. F acto re s d e lib e ra c ió n R j, R^ y R^

e. Codón de iniciación

f.A T P g. G T P

f. Consenso

-10 3 2 . P a ra c ad a u n a d e las sig u ie n te s se c u e n c ia s c o lo q u e un til­ de en el e sp a c io a p ro p ia d o p a ra id e n tific a r el p ro c e so a fe c ­ tad o de m anera m ás inm ediata p o r la d e le c ió n d e la se ­

g. ShineDalgarno

PREGUNTAS AVANZADAS 3 3 . ¿D e q u é m a n e ra lo s e m p a lm o so m a s y lo s rib o so m a s son

sim ilares? ¿ E n q u é d ifie re n ? ¿ P u e d e s u g e rir alg u n as ra z o ­ n es p o sib le s d e su s sim ilitu d e s? * 3 4 . S e efe c tu a ro n v ario s ex p e rim e n to s c o n el p ro p ó sito d e o b ­

te n e r in fo rm a c ió n a c e rc a d el m o d o en q u e el rib o so m a e u c a rio n te re c o n o c e el co d ó n d e in ic ia c ió n A U G . E n un ex p e rim e n to el g en q u e c o d ific a el tR N A in ic ia d o r d e m etio n in a (tR N A ¡’^®‘) se lo calizó y m o d ific ó . L o s n u c leó tid o s q u e e sp e c ific a n el a n tic o d ó n en el tRNAj^®* se m u taro n , de m o d o , q u e el a n tic o d ó n en el tR N A fu e se 5 ’C C A -3 ’ en lu g a r d e 5 ’-C A U -3 ’. C u a n d o e ste gen m u ta d o se u b ic ó en u n a c é lu la e u c a rio n te la sín te sis p ro te ic a se llev ó a ca b o p e ro las p ro te ín a s p ro d u c id a s fu ero n a n o rm a ­ les. A lg u n a s de la s p ro te ín a s p ro d u c id a s c o n te n ía n a m i­ n o á c id o s a d ic io n a le s, y otras, m e n o r c a n tid a d de a m in o á ­ cidos. a . ¿Q u é in d ic a n e sto s re su lta d o s ac e rc a d el m o d o e n q u e el

rib o so m a re c o n o c e el p u n to d e in iciació n p a r a la traduc­ ció n en las c é lu la s e u c a rio n te s? E x p liq u e su razo n am ien to . b . Si el m ism o e x p e rim e n to h u b ie s e sido re a liz a d o en bac­ terias, ¿ q u é re su lta d o s e sp e ra ría? 3 5 . L a re d u n d a n c ia d el c ó d ig o g e n é tic o sig n ifica q u e algunos

a m in o á c id o s so n esp e cific a d o s p o r m ás d e u n codón. Por e jem p lo , el a m in o á c id o le u c in a es co d ificad o p o r seis co~ d o n e s d istin to s. D e n tro del g e n o m a los c o d o n e s sinónim os n o están p re s e n te s en el m ism o n ú m ero ; a lg u n o s codones sin ó n im o s a p a re c e n con u n a fre c u e n c ia m u c h o m ayor que o tro s, y lo s c o d o n e s p re fe rid o s d ifieren en tre la s especies. P o r e je m p lo , en u n a esp e cie el c o d ó n U U A p u e d e em plear­ se co n m a y o r fre c u e n c ia p a ra co d ific a r le u c in a , m ientras q u e en o tra e sp e c ie el u sad o m á s a m enudo e s e l CUU , E s­ p e c u le a c e rc a d e la ra zó n p o r la c u a l existe e s t a tendencia a l u so d e c o d o n e s y p o r q u é lo s co d o n es p re f e rid o s no son lo s m ism o s e n to d o s los o rg a n ism o s.

CONTROL DE LA EXPRESION GÉNICA La creación de ratones gigantes mediante regulación génica Principios generales de la regulación génica ‘ N iv e le s d e c o n t r o l g é n i c o C e n e s y e le m e n t o s r e g u la d o r e s P r o t e ín a s q u e se u n e n a l D N A

Regulación génica en las bacterias E s t r u c t u r a d e l o p e ró n C o n t r o l n e g a t iv o y p o s i t i v o : opero-

■ P"

n e s in d u c ib le s y r e p r im ib le s El o p e r ó n

lac d e lac

£

coli

M u t a c io n e s

C o n t r o l p o s it iv o y r e p r e s ió n p or c a t a b o lit o s El o p e r ó n

trp

de f.

coli

A t e n u a c ió n : la t e r m i n a c ió n p re m a ­ t u r a d e la t r a n s c r ip c ió n El R N A a n t is e n t id o e n la r e g u la c ió n g é n ic a R e p r e s ió n m e d ia d a p o r R N A e in t e r r u p t o r e s r ib o s ó m ic o s C o n t r o l d e la t r a n s c r i p c i ó n en el b a c t e r ió f a g o la m b d a

Regulación génica en los eucariontes tra n s g é n ic o g ig a n te d e la iz q u ie rd a s e p ro d u jo m e d ia n te l a in y e cció n de un gen d e rata de h o rm o n a de cre cim ie n to a un em b rió n de ratón ; el ra tó n d e la d e re ch a e s el d e tam a ñ o n o rm al. P a r a a s e g u r a r la e x p r e s ió n el g e n d e r a t a s e lig ó a u n a El ra tó n

E s t r u c t u r a d e la c r o m a t i n a y la r e g u la c ió n g é n ic a

s e c u e n c ia d e D N A q u e e s t im u la la t r a n s c r ip c ió n d e l D N A d e r a tó n en p r e s e n c ia d e m e t a le s

C o n t r o l t r a n s c r ip c io n a l e n las

p e s a d o s . S e p r o p o r c io n ó c in c e n el a lim e n t o d e l r a tó n t r a n s g é n ic o ; a lg u n o s r a t o n e s tra n s g é -

c é lu la s e u c a r io n t e s

n ic o s p r o d u je r o n h a s t a 8 0 0 v e c e s lo s n iv e le s n o r m a le s d e h o r m o n a d e c r e c im ie n t o . (C ortesía

C o n t r o l g e n é t ic o a t r a v é s d e l p ro c e ­

de Ralph L. Brinster, School o f Veterinary Medicine, U n iversity o f Pennsylvania.)

s a m ie n t o d e l R N A m e n s a je r o C o n t r o l g é n i c o a t r a v é s d e la e s ta b i­ lid a d d e l R N A

La creación de ratones gigantes medíante regulación gém'ca

S ile n c ia m ie n t o d el R N A C o n t r o l t r a d u c c io n a l y p o s tra d u c c io n a l O r g a n is m o m o d e lo :

thaliana

E

n 1982 u n g ru p o d e g e n e tista s m o le c u la re s lid e ra d o s p o r R ic h a rd P a lm ite r en la U n iv e rsity

J o f W ash in g to n p ro d u jo ra to n e s g ig a n te s q u e c re c ía n casi al d o b le d el ta m a ñ o de u n ra tó n

no rm al. P a lm ite r y col. c re a ro n e sto s ra to n e s g ra n d e s m e d ia n te in g e n ie ría g e n é tic a , al in y e c ta r el g en d e ra ta de h o rm o n a d e c re c im ie n to a lo s n ú c le o s d e ra tó n fe rtiliz a d o s e im p la n ta r lu e g o e s ­ tos em b rio n e s en rato n a s m a d re s su stitu ías. E n u n o s p o c o s e m b rio n e s el g e n d e ra ta se in c o rp o ­ ró al c ro m o so m a d e rató n , y d e sp u és d el n a c im ie n to , esto s rato n e s transgénicos p ro d u je ro n h o r­ m o n a de cre c im ie n to c o d ific a d a p o r el g e n d e rata. P a rte d e lo s rato n es tra n sg é n ic o s p ro d u je ro n e n tre 100 y 800 v eces la ca n tid a d d e h o rm o n a d e c re c im ie n to e n c o n tra d a en lo s ra to n e s n o rm a ­ les, lo q u e p ro v o có q u e c re cie ra n con ra p id e z y se tra n sfo rm a ra n en g ig an tes. L a in se rc ió n de g en e s fo rán e o s en b a c te ria s , p la n ta s, rato n es e in c lu so se res h u m a n o s es a c tu a l­ m e n te un p ro c e d im ie n to h a b itu a l p a ra lo s g e n e tista s m o le c u la re s (v éase c a p . 18). S in em b a rg o .

A rabidopsis

434 Capítulo 16

el sim p le h e c h o de p o n e r u n g en en u n a c é lu la n o g a ra n tiz a q u e este g en se tra n sc rib irá o p ro ­ d u c irá u n a p ro te ín a ; c ie rta m e n te , la m a y o r p a rte d e lo s g en es e x trañ o s n u n c a se tra n sc rib e n ni se trad u cen , lo q u e no es so rp ren d e n te . L o s o rg a n ism o s h an d esa rro lla d o al e v o lu c io n a r sis te ­ m as co m p le jo s p a ra a se g u ra r q u e lo s g en e s se e x p re se n en el m o m en to a d e c u a d o y en las c a n ­ tid ad es a p ro p iad as, y se re q u ie re n se c u e n c ia s d istin ta s d el p ro p io g en p a ra a se g u ra r la tra n s ­ c rip c ió n y la tra d u cció n . E n este c a p ítu lo a p re n d e re m o s m ás ac e rc a de e sta s se c u e n c ia s y de o tro s m e c a n ism o s q u e c o n tro la n la e x p re sió n g én ica . S i lo s g en es e x trañ o s se e x p re san en ra ra s o c a sio n e s, ¿ p o r q u é ra z ó n el ra tó n tra n sg é n ic o co n el g en de h o rm o n a de c re c im ie n to d e la ra ta se d e sa rro lló o n u n tam añ o ta n g ra n d e ? P a lm ite r y co l., a le rtad o s ac e rc a d e la n e c e sid a d d e p ro p o rc io n a r se c u e n c ia s q u e c o n tro le n la e x p re sió n d e l gen, lig a ro n el g en d e ra ta c o n la se c u e n c ia p ro m o to ra d e m e ta lo tio n e ín a I d e l rató n , u n a se ­ cu e n c ia d e D N A q u e se e n c u e n tra n o rm a lm e n te en d ire c c ió n 5 ’ c o n re sp e c to al g e n d e m e ta lo ­ tio n e ín a I de rató n . C u a n d o e stá n p re se n te s m e ta le s p e sa d o s c o m o el cinc, ac tiv a n la se c u e n c ia p ro m o to ra d e m e ta lo tio n e ín a y d e este m o d o e stim u la n la tra n sc rip c ió n d e l g e n d e m e ta lo tio ­ n e ín a I. A l c o n e c ta r el g e n d e la h o rm o n a d e c re c im ie n to d e ra ta c o n este p ro m o to r P a lm ite r y col. p ro p o rc io n a ro n u n m e d io p a ra a ctiv a r la tra n sc rip c ió n d el g en , se n c illa m e n te al p o n e r c a n ­ tid ad es ad ic io n a le s d e cin c en el alim e n to d e l ra tó n tran sg é n ic o . E ste ca p ítu lo tra ta so b re la regulación génica, lo s m e c a n ism o s y siste m as q u e c o n tro la n la ex p re sió n d e lo s g en es. C o m e n z a re m o s p o r a n a liz a r p o r q u é es n e c e sa ria la re g u la c ió n g én ica ; lo s niv eles a lo s cu ales e stá c o n tro la d a y la s d ife re n c ia s e n tre lo s g en es y lo s e le m e n to s d e r e ­ g u lació n . L u eg o , e x a m in a re m o s la re g u la c ió n g é n ic a en las b ac te ria s. E n la se g u n d a m ita d d e este c a p ítu lo n o s o c u p a re m o s d e la re g u la c ió n g é n ic a en las célu la s e u c a rio n te s, q u e c o n fre ­ cu e n c ia es m ás c o m p le ja q u e en las b a cte rias.

[www.whfreeman.com/pierce] In fo rm a c ió n a d ic io n a l so b re in g e n ie ría g e n é tic a en rato n es.

Principios generales de la regulación génica no d e los tem as p rin c ip a le s de la g e n é tic a m o le c u la r es el d o g m a cen tral, q u e e sta b le c ió q u e la in fo rm a c ió n g e n é tic a flu y e del D N A al R N A , y d e a llí a las p ro te ín a s (fig. 10-16). Si b ie n el d o g m a e n tral p ro v e y ó u n a b a se m o le c u la r p a ra la c o n e ­ x ió n e n tre g en o tip o y fe n o tip o , frac a só p a ra re s p o n d e r u n te m a crítico : ¿d e q u é m a n e ra e ste flu jo d e in fo rm a c ió n p ro c e d e en la v ía m o le c u la r regulada! C o n sid e re a E. coli, u n a b a c te ria q u e re s id e en su in testin o g ru eso . Sus h á b ito s a lim e n ta rio s d e te rm in a n en fo rm a a b so lu ta lo s n u trie n te s d isp o n ib le s p a ra e sta b ac te ria : n o p u e d e b u sc a r n u ­ trie n te s c u a n d o ésto s esc a se a n , n i p u e d e c a m b ia rs e d e sitio c u a n ­ do se co n fro n ta co n c a m b io s d e sa g ra d a b le s. E. coli re sp o n d e a e sta in c a p a c id a d p a ra a lte ra r el a m b ie n te ex tern o c o n la fle x ib ili­ d ad d e su a m b ie n te in te rn o . P o r ejem p lo , si h ay g lu c o s a p re s e n ­ te, E. coli la e m p le a p a ra g e n e ra r A TP; si n o la hay, u tiliz a la c to ­ sa, a rab in o sa, m alto sa , x ilo sa o c u a lq u ie ra d e u n a d iv e rsid ad d e o tro s azú cares. C u a n d o h a y a m in o á c id o s d isp o n ib le s E. coli los e m p le a p a ra sin te tiz a r p ro te ín a s, p e ro si u n a m in o á c id o en p a rti­ c u la r e stá au sen te, p ro d u c e las e n z im as re q u e rid a s p a ra sin te ti­ zarlo. A sí, E. coli re sp o n d e a lo s ca m b io s d e l a m b ie n te alte ra n d o con ra p id e z su b io q u ím ic a . E sta fle x ib ilid a d b io q u ím ic a , sin e m ­ b arg o , tie n e u n co sto elev a d o . P ro d u c ir to d a s las e n z im a s n e c e sa ­ rias p a ra c a d a situ ació n a m b ie n ta l se ría e n e rg é tic a m e n te caro. P o r tan to , ¿ c ó m o h ace E. coli p a ra m a n te n e r su fle x ib ilid a d b io ­ q u ím ic a al tie m p o q u e o p tim iz a la e fic ie n c ia e n erg é tic a ? L a re s p u e sta es m e d ia n te la re g u la c ió n g én ica . L a s b a c te ria s llev an la in fo rm a c ió n g e n é tic a p a ra m u c h a s p ro te ín a s, p e ro solo u n su b c o n ju n to de e sta in fo rm a c ió n g e n é tic a se e x p re s a en c a d a m o m en to . C u a n d o el a m b ie n te cam b ia, se e x p re sa n n u ev o s g en es y se sin te tiz a n las p ro te ín a s a p ro p iad a s p a ra el n u e v o am b ien te. P o r eje m p lo , si u n a fu e n te d e c a rb o n o a p a re c e en el a m b ie n te , los

U

g en es q u e c o d ific a n p a ra las en z im as q u e c ap ta n y m etab o lizan esta fu e n te d e c a rb o n o se tra n sc rib e n y tra d u cen ráp id am en te. C u a n d o e s ta fu e n te d e c a rb o n o d e sa p a re c e , lo s genes q u e codifi­ can p a ra e llas se sile n c ia n . E ste tip o d e re sp u e sta, la sín te sis de u n a e n z im a e stim u la d a p o r u n su strato esp ecífic o , se c o n o c e co­ m o inducción. L o s o rg a n ism o s e u c a rio n te s m u ltic e lu la re s e n fren tan u n dilem a d istin to . L a s célu la s in d iv id u a le s d e u n o rg an ism o m u ltic e lu la r se e sp e c ia liz a n en ta re a s e sp ecíficas. L as p ro te ín a s p ro d u c id a s por u n a c é lu la n e rv io sa , p o r ejem p lo , son b a sta n te d is tin ta s de las p ro d u c id a s p o r un g ló b u lo b lan co . E l p ro b le m a que e n fr e n ta una c é lu la e u c a rio n te es el m o d o en el q u e se esp ecializa. A u n q u e son b a sta n te s d istin ta s e n fo rm a y fu n ció n , u n a c é lu la n e rv io s a y una c é lu la sa n g u ín e a p o rta n la s m ism as in stru c c io n e s g e n é tic a s. E l d e sa fío de u n o rg a n ism o m u ltic e lu la r es llevai' a c a b o la esp e c ia liz a c ió n d e la s c é lu la s q u e tie n e n e n co m ú n un c o n ju n to de in stru c c io n e s g e n é tic a s. E ste d esafío se sa tisfa c e m e d ia n te la re­ g u la ció n g én ic a . T o d as la s célu las de u n o rg a n ism o p o rta n la mis­ m a in fo rm a c ió n g e n é tic a , p ero solo se e x p re sa n un su b co n ju n to de g e n e s e n c a d a tip o celu lar. L o s g en e s n ec e sa rio s p a ra o tro s ti­ pos c e lu la re s n o se ex p re sa n . P o r tan to , la reg u la ció n g é n ic a es la clav e ta n to d e la fle x ib ilid a d u n ic e lu la r c o m o de la esp ecializació n m u ltic e lu la r y e s c rític a p a ra el é x ito d e todos lo s o rganis­ m os v ivos.

CONCEPTOS CLAVE En las bacterias la regulación génica mantiene la flexibili­ dad interna al encender y apagar genes en respuesta a los cam bios del am biente. En los organismos eucariontes m ulticelulares la regulación génica lleva a cabo la diferen­ ciación celular.

Control de La expresión génica 435 Niveles de control génico U n g en p u e d e ser re g u la d o e n d ife re n te s p u n to s a lo larg o de la v ía d e flu jo d e in fo rm a c ió n d e l g e n o tip o al fe n o tip o (fig. 16-1). E n p rim e r lugar, la re g u la c ió n p u e d e a c tu a r a trav és d e la a lte ra ­ ció n d e la e stru c tu ra d e l g en . L as m o d ific a c io n e s d el D N A o su e m p a q u e ta m ie n to p u e d e n e je rc e r in flu e n c ia s so b re las secu e n c ia s q u e e sté n d isp o n ib le s p a ra se r tra n sc rip ta s o so b re la v elo c id a d a la cu al las se cu en cias se tra n sc rib irá n . L a m e tila c ió n d el D N A y lo s ca m b io s en la c ro m a tin a so n d o s p ro c e so s q u e d e se m p e ñ a n u n p a p e l c e n tra l en la re g u la c ió n g én ica . U n seg u n d o p u n to en el c u al u n g en p u e d e ser re g u la d o es a n i­ v el de la tra n scrip ció n . P o r ra zo n e s d e e c o n o m ía ce lu la r tie n e sen tid o lim ita r la p ro d u c c ió n d e p ro te ín a s e n fo rm a te m p ra n a , en la tra n sfe re n c ia de in fo rm a c ió n d esd e el D N A a p ro te ín a , y la tra n sc rip c ió n es u n p u n to im p o rta n te d e re g u la c ió n g én ica , tan to en las b a c te ria s c o m o e n las célu la s e u c a rio n tes. U n te rc e r p u n to p o te n c ia l de re g u la c ió n g é n ic a es el p ro c e sa m ie n to d e l m R N A . E l m R N A e u c a rio n te se m o d ific a e x te n sa m e n te an tes d e su trad u c-

D N A c o m p a c to

N iv e le s d e co n tro l g én ico

A lt e r a c ió n d e la e s t r u c t u r a

ción; se a ñ a d e u n ca p 5 ’, y el e x trem o 3 ’ se c o rta y se p o lia d e n ila, y a d e m á s se re m u e v e n lo s in tro n es (v é a se cap. 14). E s ta s m o­ d ific a c io n e s d e te rm in a n la e sta b ilid a d d e l m R N A , si e l m R N A p u e d e tra d u c irse , a d e m á s d e la v e lo c id a d d e la tra d u c c ió n , y la se­ c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la p ro te ín a p ro d u c id a . H a y can tid ad c re c ie n te d e e v id e n c ia q u e se ñ a la q u e o p e ra n u n a d iv e rs id a d de m e c a n ism o s d e re g u la c ió n en las c é lu la s e u c ario n tes e n la etapa del p ro c e s a m ie n to d e l m R N A . U n c u a rto p u n to p a ra el c o n tro l d e la e x p re sió n g é n ic a es la re­ g u la c ió n d e la e sta b ilid a d d e l R N A . L a c a n tid a d de p ro te ín a pro­ d u c id a d e p e n d e n o so lo d e la c a n tid a d d e m R N A s in te tiz a d o sino d e la v e lo c id a d a la c u a l se d e g ra d a el m e n sa je ro ; de m o d o qu e la e sta b ilid a d d e l R N A d e se m p e ñ a u n p a p e l im p o rta n te e n la expre­ sión g é n ic a . U n q u in to p u n to d e re g u la c ió n g én ica se en c u e n tra en la e ta p a d e la tra d u c c ió n , p ro c e so c o m p le jo que r e q u ie re un g ran n ú m e ro d e e n z im a s, fa c to re s p ro te ic o s y m o lécu las d e RNA (cap. 15). T o d o s e sto s fa c to re s, así c o m o la d is p o n ib ilid a d de am in o á c id o s y se c u e n c ia s en el m R N A , in flu y e n en la v elo c id a d a la c u a l se p ro d u c e n la s p ro teín a s y - p o r ta n to - p ro p o rc io n a n p u n to s e n lo s q u e p u e d e c o n tro la rse la e x p re s ió n g én ica . F in a lm e n te , m u c h a s p ro te ín a s se m o d ific a n después d e la tra­ d u c c ió n (ca p . 15), y e sta s m o d ific a c io n e s a fe c ta n el h e c h o de que las p ro te ín a s se tra n sfo rm e n o n o en activ a s; p o r tanto, lo s genes p u e d e n re g u la rse a tra v é s d e p ro c eso s q u e in c id en en la m o d ifi­ c a ció n p o stra n sc rip c io n a l. L a e x p re sió n g é n ic a p u ed e v e r s e afec­ tad a p o r ac tiv id a d e s re g u la d o ra s en c u a lq u ie ra de estos p u n to s.

CONCEPTOS CLAVE

D N A r e la ja d o

La expresión génica puede ser controlada en cualquiera de varios puntos de la vía molecular que lleva de! DNA a la proteína, incluidos la estructura génica, la transcrip ­ ción, el procesam iento del mRNA, la estabilidad del RNA, la traducción y la modificación postraduccional.

P r o c e s a m ie n t o d e l m R N A

Genes y elementos reguladores m R N A p ro sesa d o

E s t a b ilid a d d e l R N A T r a d u c c ió n

P r o t e ín a ( in a c t iv a )

M o d if ic a c ió n p o s t r a d u c c io n a l

P r o t e ín a m o d if ic a d a ( a c t iv a )

Fig. 16-1 . La e x p re sió n g é n ica p u ed e c o n t r o la rs e en m ú ltip le s n iv e le s .

E n n u e s tra c o n sid e ra c ió n d e la re g u la c ió n g én ica s e rá n ecesa­ rio d is tin g u ir e n tre la s se c u e n cia s d e D N A q u e se tra n s c rib e n y las se c u e n c ia s de D N A q u e re g u lan la e x p re s ió n de o tra s secu en ­ cias. S e g ú n se d e fin ió en la p á g in a 375 u n gen es c u a lq u ie r se­ c u e n c ia d e D N A q u e se tra n sc rib a a u n a m o lé c u la d e R N A . Los g en es in c lu y e n las se c u e n c ia s de D N A q u e co d ifican p ro te ín a s, así c o m o se c u e n c ia s q u e co d ific an rR N A , tR N A , sn R N A y otros tipos d e R N A . L o s genes estructurales c o d ific an p ro te ín a s que se e m p le a n en el m e ta b o lism o o en la b io sín te sis, o q u e d esem ­ p eñ a n u n p a p e l e stru c tu ra l en las célu la s. L o s genes reguladores son g e n e s cu y o s p ro d u c to s, sean R N A o p ro teín as, in te ra c tú a n con o tra s sec u e n c ia s y afe c ta n su tra n sc rip c ió n o tra d u c c ió n . En m u ch o s c a so s los p ro d u c to s d e los g en e s reg u lad o res s o n p ro teí­ n as q u e se u n e n al D N A . T am b ién e n c o n tra re m o s secu e n c ias d e D N A q ue no se tra n sc ri­ ben en a b so lu to , p e ro d ese m p e ñ a n , au n así, u n papel e n la regu­ lac ió n d e o tra s se c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s. E sto s e le m e n to s regu­ ladores a fe c ta n la e x p re s ió n d e las se c u e n c ia s a las c u a le s están físic a m e n te lig a d o s. G ra n p arte d e la re g u la c ió n g é n ic a ocurre m e d ia n te la a c ció n d e p ro te ín a s p ro d u c id a s p o r g enes re g u la d o ­ res q u e re c o n o c e n y se u n e n a elem en to s d e reg u lació n .

436 Capítulo 16 CONCEPTOS CLAVE Los genes son secuencias de DNA que se transcriben a RNA. Los elementos de regulación son secuencias de DNA que no se transcriben pero afectan la expresión de los genes.

Proteínas que se unen al DNA G ran p a rte de la re g u la c ió n g é n ic a es re a liz a d a p o r p ro te ín a s q u e se u n e n a se cu e n c ia s d e D N A y a fe c ta n su e x p resió n . E sta s p ro te ín a s re g u la d o ra s p o r lo g e n e ra l tie n e n p a rte s fu n c io n a le s d isc re ta s -d e n o m in a d a s d o m in io s , q u e c o n siste n típ ic a m e n te en en tre 60 y 90 a m in o á c id o s - y se e n c a rg a n d e la u n ió n al D N A . D en tro d e un d o m in io so lo u n o s p o c o s a m in o á c id o s esta b le ce n co n tac to con el D N A . E sto s a m in o á c id o s (p o r lo g e n e ra l asp aragina, g lu ta m in a , g lic in a . U sina y a rg in in a) a m e n u d o fo rm a n p u en tes d e h id ró g e n o co n la s b a se s o in te ra c tú a n c o n el e sq u e le ­ to d e aziicar-fo sfato del D N A . M u c h a s p ro te ín a s re g u la d o ra s tie ­ n en d o m in io s a d icio n a le s, q u e p u e d e n u n ir o tra s m o lé c u la s c o m o otras p ro te ín a s re g u la d o ra s. L as p ro te ín a s q u e se u n e n al D N A p u e d e n a g ru p a rse en v ario s tip o s d istin to s, d e a cu e rd o c o n su e stru c tu ra ca ra c te rístic a , lla m a ­ d a m o tiv o , q u e se e n c u e n tra d e n tro d e l d o m in io d e u n ió n . L o s m o tiv o s so n estru c tu ra s sim p les, c o m o alfa h é lic e s, q u e p u e d e n en c a ja r e n el surco p rin c ip a l d el D N A . A lg u n o s m o tiv o s c o m u n e s qu e u n e n D N A se ilu stra n en la f i g u r a 1 6 -2 y se re s u m e n en el cu a d ro 16-1.

(a) H é lice -g iro -h é lice

H é lic e

C ir o

R egyladón génlca en las bacterias L o s m eca n ism o s d e reg u lació n g én ic a se in vestigaron en primer lu g a r e n las b a cterias, e n las cuales la disp o n ib ilidad d e m utantes y la facilid ad d e m a n ip u lac ió n en el lab o rato rio p o sib ilitaro n desen­ trañar' esto s p ro ceso s. C u an d o co m en z ó el estudio de e sto s mecanis­ m os en las células eucariontes, p areció c laro que los g e n e s de bac­ terias y de eu cario n tes eran bastante d istin to s en cuan to a la regula­ ción. A m e d id a q u e se acum uló m a y o r cantidad d e inform ación acerca d e la reg u la c ió n génica, sin em b arg o , han su rg id o una serie d e características en com ún, y en la ac tu alid ad m uch o s aspectos de la re g u lació n g én ic a d e bacterias y célu las eucariontes se conside­ ra n sim ilares. Si b ie n an alizarem os la reg u lació n gén ica d e estos dos tipos celu lares p o r separado, h arem o s h in c ap ié en los aspectos co­ m u n es q u e se a p lican a to d as las células.

Estructura del operón U n a d iferen cia significativa en el co n tro l d e los g enes bacterianos y eu cario n tes ra d ic a en la organización d e genes funcionalm ente re­ lacio n ad o s. M u c h o s g en es b acterian o s q u e tienen fu n c io n e s relacio­ n adas se e n c u en tran ag ru p ad o s y están b a jo el control d e un único p ro m o to r. E stos g en es co n frecu en cia se transcriben ju n to s a un úni­ co m R N A . P o r el co n trario , los genes eucariontes están dispersos y, típ icam en te, cad a u n o de ellos se tran scrib e en un m R N A separado. U n g ru p o d e genes b acte rian o s estru ctu rales que se tran scrib en jun­ tos (ju n to con su p ro m o to r y las secu en cias adicionales q u e contro­ lan la tran scrip ció n ) se d en o m in a o p e ró n . L a o rg an izació n d e un o perón típ ico se ilu stra en la f i g u r a 16-3. E n un ex trem o del o p eró n se en cuen tra u n conjunto de g e n e s estruc-

(b) D e d o s d e c in c

(c) C r e m a lle r a d e le u c in a

H é lic e

L e u c in a —

r

/ ,

> ■

f ' I

H é lic e q u e s e u n e al D N A

G ir o

H é lic e d e u n ió n al d ím e r o

i D edo

io n e s c in c

Fig.

I 6 - 2 . L a s p ro te ín a s q u e u n e n DNA p u ed en a g ru p a rs e en v a r io s tip o s d e a cu e rd o con su e s t ru c tu r a o m o tivo , (a) El m o t iv o d e D N A h é lic e - g iro - h é lic e c o n s is t e d o s a lf a h é lic e s c o n e c t a d a s p o r un g iro , (b) El m o t iv o d e d o s d e c in c c o n s is t e e n un b u c le

en de

a m in o á c id o s q u e c o n t ie n e n un ú n ic o io n c in c . L a m a y o r p a rte d e las p r o t e ín a s q u e c o n t ie n e n d e d o s d e c in c t ie n e n v a r i a s r e p e t ic io n e s d e e s e m o t iv o . C a d a u n o d e e s t o s d e d o s d e c in c c a l ­ z a e n u n s u r c o m a y o r d e l D N A y f o r m a p u e n t e s d e h id r ó g e n o c o n las b a s e s d e e s t a m o lé c u la ,

(c)

El m o t iv o c r e m a lle r a d e le u c in a c o n s is t e e n u n a h é lic e d e a m in o á c id o s le u c in a y un b r a z o

d e a m in o á c id o s b á s ic o s . L a s p r o t e ín a s q u e s e u n e n al D N A c o n e s t e m o t iv o h a b it u a lm e n t e t ie n e n d o s p o lip é p t id o s ; lo s a m in o á c id o s le u c in a y lo s d o s p o lip é p t id o s se e n f r e n t a n , m i e n ­ tr a s q u e lo s a m in o á c id o s b á s ic o s se u n e n al D N A .

Control de la expresión génica

Cuadro 16-1

Motivos comunes de unión al DNA

M o tivo

Localización

C aracterísticas

Sitio de unión en el DNA

Hélice-giro-hélice

Proteínas reguladoras de las bacterias; motivos relacionados en proteínas eucariontes

Dos alfa hélices

Surco principal

Dedos de cinc

Proteínas reguladoras en eucariontes y otras

Bucle de aminoácidos con cinc en la base

Surco principal

Receptor esteroide

Proteínas eucariontes

Dos alfa hélices perpendiculares con cinc rodeadas por cuatro residuos de cisterna

Surco principal y esqueleto del DNA

Cremallera-leucina

Factores de transcripción eucariontes

Hélice de residuos de leucina y brazo básico; dos residuos de leucina que se interdigitan

Dos surcos principales adyacentes

Hélice-bucle-hélice

Proteínas eucariontes

Dos hélices alfa separadas por un bucle de aminoácidos

Surco principal

Homeodominio

Proteínas reguladoras euca­ riontes

Tres alfa hélices

Surco principal

turales q ue se m u estran en la figura 16-3, c o m o gen a, g en b y gen c. E stos genes estru ctu rales se tran scrib en a u n m R N A único, qu e se traduce p ara p ro d u cir las en zim as A , B y C. E stas enzim as llevan adelante u n a serie d e reaccio n es b io q u ím icas que convierten a la m o lécu la p re cu rso ra X en el p ro d u cto Y. L a transcrip ció n d e los genes estructurales a , b y c está b ajo el control d e un p rom otor, que se en cu en tra h acia el ex trem o 5 ’ term in al con re sp ecto al p rim er gen estructural. L a R N A p o lim erasa se u n e al p ro m o to r y luego se m u e­ ve h acia el extrem o 3 ’ term in al y tran scrib e los g en es estructurales. U n g e n re g u la d o r ay u d a a reg u lar la tran scrip ció n de los genes estructurales del operón. E l gen reg u lad o r n o se co n sid era p arte del o perón, si b ien afecta la fu n ció n de éste. E l gen reg u lad o r tiene su p ro pio p ro m o to r y se tran scrib e a u n m R N A relativam ente corto,

qu e se trad u ce a u n a p ro teín a peq u eñ a. E sta proteína reguladora p u e d e u n irse a u n a reg ió n de D N A d en o m in ad a el operador y p u e­ d e red e term in a r si h a b rá o no tran scrip ció n . E l o p e ra d o r habitual­ m e n te se su p erp o n e con el extrem o 3 ’ d el prom otor, y en ocasiones co n el ex trem o 5 ’ del p rim e r gen estru ctu ral (véase tig . 16-3).

CONCEPTOS CLAVE Los genes funcionalmente relacionados de las bacterias con frecuencia se agrupan como una única unidad de transcrip­ ción llamada operón. Un operón típico incluye varios genes estructurales, un promotor para los genes estructurales y un sitio operador donde se une el producto del gen regulador.

H Un operon es un grupo de i genes estructurales más secuen; aas que controlan la transcripción.

Operón Cenes estructurales

RNA itimerasa

Promotor

Transcripción

Q Un gen regulador separado -con su propio promotorcodifica una proteína reguladora...

Prom

H ...que puede unirse al sitio i del operador para regular '! la transcripción del mRNA.

m RNA

m RNA

Traducción

T rad u cció n

Proteina reguladora

*

i

,

Proteínas (enzimas)

Ú

Fig. 16-3.

Transcripción

Un o p eró n e s una u n id a d d e tr a n s c rip c ió n ú n ica q u e in clu y e una s e r ie de g e n e s e s t r u c t u r a le s , un p ro m o to r y un o p erad o r.

Los productos del mRNA catalizan reacciones en una vía bioquímica. Via bioquímica ^ ----

Precursor X

Productos intermedios

Producto Y

438 Capítulo 16 Control negativo y positivo; operones Inducíbles y reprimibles H ay dos tipos de co n tro l d e la tran scrip ció n : el control n e g a tiv o , en el cual u n a p ro teín a reg u lad o ra actú a c o m o represora, al u nirse al D N A e in h ib ir la tran scrip ció n , y u n control positivo, en el cual u n a p ro teín a reg u lad o ra actú a co m o activadora, al e stim u lar la transcripción. E n las siguientes secciones co n sid erarem o s diversas variedades de estos dos m ecan ism o s d e con tro l básicos.

Operones inducibles negativos. E n u n o p eró n co n control n eg a­ tivo en el sitio del o p erad o r la p ro teín a re g u lad o ra es u n rep reso r; la u n ió n de la p ro teín a reg u lad o ra al o p erad o r in h ib e la transcripción. E n un operón inducible negativo la tran scrip c ió n y la trad u cció n del g en reg u lad o r p ro d u c e u n represor activo, q u e ráp id am en te se

une al o p e rad o r (fíg. 16-4a). D ad o q u e el sitio o p erad o r se superpo­ n e c o n el sitio p ro m o to r la unión de e sta proteína al op erad o r blo­ q u e a físicam en te la u n ió n d e la R N A poH m erasa al p ro m o to r y evi­ ta la tran scrip ció n . P a ra que ocu rra la tran scrip ción d e b e ocurrir al­ g o q u e evite la u n ió n d el rep reso r al sitio operador. E s te tipo de sis­ te m a se d en o m in a in d u c ib le dado q u e la tran scripción norm alm en­ te está a p a g ad a (in h ib id a) y debe e n cen d erse (inducirse). L a tra n sc rip c ió n se “e n cie n d e” c u a n d o u n a m o lé c u la pequeña, u n inductor, se u n e al represor. L a figura 16-4b m u e s tra que cuan­ d o el p re c u rso r V (q u e actú a co m o in d u cto r) se une al represor, és­ te y a n o p u e d e u n irse al operador. L as p roteínas reg u lad o ras, con fre c u en c ia , tien en d o s sitios d e u n ió n , u n o que se u n e al DNA y o tro q u e se u n e a u n a m o léc u la p e q u e ñ a com d u n inductor. La u n ió n d el in d u c to r a ltera la fo rm a d el rep re so r y ev ita q u e éste se u n a al D N A . L as p ro te ín a s d e e ste tip o q u e cam b ian d e forma al u n irse a o tra m o lé c u la se d en o m in an proteínas alostéricas.

Operón inducible negativo! RNA

poMmerasa \

(a)

Cenes estructurales Promotor

en r

p e í c ic lo i

Transcripción y traducción

No hay transcripción I La proteína reguladora es un represor

Proteína reguladora activa

J que se une al operador y evita la transI cripción de los genes estructurales.

RNA

poiimerasa ib )

Con induLtoi El precursor actúa como inductor

Operador

I

Transcripción y traducción Proteína reguladora activa

I

I

Transcripción y traducción

i

i

i '

i

Cuando hay inductor se une al regulador y éste no puede unirse al operador. Se produce la transcripción.

Vía bioquímica % Precursor Productos Producto V intermediarios W

Fig. 16 - 4 .

A lg u n o s o p e ro n e s so n in d u c ib le s .

Control de La expresión génica 43'

C u a n d o fcl in d u c to r e stá a u se n te , el re p re so r se u n e al o p erad o r, los g en es estru c tu ra le s n o se tra n sc rib e n y las e n z im a s D , E y F (que m e ta b o liz a n al p re c u rso r V ) y a n o se sin te tiz a n (v éase fig. 16-4a). É ste es u n m e c a n ism o d e a d ap ta c ió n : d a d o q u e n o h a y p re c u rso r V d isp o n ib le se ría un d e sp e rd ic io q u e las célu la s s in te ­ tiz a ra n las e n zim as c u a n d o n o tie n e n su stra to p a ra m etab o lizar. Tan p ro n to c o m o h ay p re c u rso r V d isp o n ib le , p a rte d e él se u n e al re p re so r y lo in activ a, y d e te rm in a q u e é ste n o p u e d a u n irse al sitio o perador. E n ese m o m e n to la R N A p o lim e ra sa se p u e d e u n ir al p ro m o to r y tra n sc rib ir lo s g en es e stru c tu rale s. E l m R N A re s u l­ tan te, en to n ce s, se tra d u c e a la s e n z im a s D , E y F, q u e co n v ie rte n el su strato V e n el p ro d u c to W (v éa se fig. 16-4b). P o r tan to , u n o p e ra d o r c o n c o n tro l in d u c ib le n eg a tiv o re g u la la sín te sis d e las en zim as en fo rm a ec o n ó m ic a: las e n z im a s se sin te tiz a n solo cu an d o sus su strato s (V ) e stá n d isp o n ib le s.

O perones reprim ibles negativos. A lg u n o s o p e ro n e s co n c o n ­ tro l n eg ativ o son r e p r im ib le s , lo q u e sig n ific a q u e la tra n sc rip ­ ció n o cu rre norm alm ente y d eb e a p a g a rse o re p rim irse . L a p ro ­ te ín a re g u la d o ra en e ste tip o d e o p eró n ta m b ié n es u n rep reso r, p e ro se sin te tiz a en u n a fo rm a in ac tiv a q u e n o p u e d e p o r sí m is ­ m a u n irse al operado r. D a d o q u e n o h a y re p re so r u n id o al o p e ra ­

d o r la R N A p o lim e ra sa se u n e al p ro m o to r rá p id a m e n te y ocurre la tra n sc rip c ió n del g e n estru ctu ra] (fig. 1 6 -5 a ). P a ra a p a g a r la tra n sc rip c ió n d e b e o c u rrir alg o q ue a c tiv e el re­ presor. Lfna p e q u e ñ a m o lé c u la lla m a d a c o r r e p r e s o r se u n e al re­ p re s o r y lo v u elv e c a p a z d e u n irse al o p erad o r. E n el e je m p lo ilus­ tra d o (fig. 1 6 -5 a) el p ro d u c to (U ) d e la re a c c ió n m e ta b ó lic a es el c o rre p reso r. E n ta n to el n iv e l d el p ro d u c to U es ele v a d o e stá dis­ p o n ib le p a ra u n irse y a c tiv a r al rep re so r, lo q u e evita la tran scrip ­ ció n (fig. 1 6 -5 b ). C o n e l o p e ró n re p rim id o la s e n z im a s G , H e I n o se sin te tiz a n y y a n o se p ro d u c e m á s U a p artir d e l precu rso r T. S in e m b a rg o , c u a n d o se u sa to d o el p ro d u c to U el re p re s o r ya n o se a c tiv a p o r U y n o p u e d e u n irse al o p erad o r. L a in activ ació n d el re p re s o r p e rm ite la tra n sc rip c ió n d e lo s genes' e stru c tu ra le s y la sín te sis d e las e n z im a s G , H e L lo q u e re s u lta en la co n v ersió n d el p re c u rs o r T e n el p ro d u c to U. C o m o o c u rre c o n lo s o p ero n e s in d u c ib le s, los o p e ro n e s repri­ m ib le s so n e c o n ó m ic o s: la s e n zim a s se sin te tiz an so lo cu a n d o es n e c e sa rio . N ó te se q u e ta n to los siste m a s in d u c ib les c o m o los re­ p rim ib le s q u e h e m o s c o n sid e ra d o so n fo rm a s de c o n tr o l negati­ vo, en la s c u a le s la p ro te ín a re g u la d o ra e s u n rep reso r. C o n sid e­ ra re m o s a h o ra el c o n tro l p o sitiv o , e n el c u a l la p ro te ín a reg u lad o ­ ra e stim u la la tra n sc rip c ió n .

Operón reprimible negativo RNA polimerasa

(a)

Cenes estructurales

Sin p io d iicto U

''■* Gen h

P ro m

Gen i

I

Transcripción I ; y traducción i

Transcripción y traducción I La proteína reguladora es i un represor inactivo, inca- j paz de unirse al operador, i

Proteína reguladora inactiva (represor)

Se produce la transcripción de los genes estructurales.

Enzimas

i

i

Vía bioquím ica 0 Precursor Productos Producto U T intermediarios (correpresor)

/

[13B C on p io d u cto U

RNA polimerasa

Ó Los niveles de!

i

1 producto U se elevan.|

Producto U

♦

Transcripción y traducción Proteína reguladora inactiva (represor)

F ig .

H

1 6 - 5 . A lg u n o s o p e ro n e s so n r e p r im ib le s .

El producto U se une a i B . . . i a activa y permite que la proteína reguladora... I | se una al operador

...evitando así la transcripción.

440 Capítulo 16 C ontról positivo. C o n el c o n tro l p o sitiv o u n a p ro te ín a re g u la ­ d o ra se u n e al D N A (h a b itu a lm e n te en u n sitio d istin to d el o p e ­ rad o r) y estim u la la tra n sc rip c ió n . T e ó ric a m e n te el c o n tro l p o s iti­ vo p o d ría ser in d u c ib le o re p rim ib le . E n un o p eró n p o sitiv o inducible la tra n sc rip c ió n n o rm a lm e n te e sta ría ap a g a d a p o rq u e la p ro te ín a re g u la d o ra (un activ ad o r) se p ro d u c iría en fo rm a in activ a. L a tra n sc rip c ió n o c u rriría c u an d o u n in d u c to r se u n ie ra a la p ro te ín a re g u la d o ra y tra n sfo rm a ra al re g u la d o r en activo. L ó g ic a m e n te el in d u c to r d e b e ría ser el p re ­ c u rs o r de la re a cció n c o n tro la d a p o r el o p e ró n , d e m o d o q u e las e n zim as re q u e rid a s se sin te tiz a ría n so lo cu a n d o e stu v ie ra p re s e n ­ te el su strato p a ra su reac ció n .

Fig.

U n o p e ró n p o sitiv o tam b ién p o d ría ser rep rim ible; la transcrip­ ció n o c u rriría n o rm a lm e n te y d eb ería ser reprim ida. E n e ste caso la p ro te ín a reg u la d o ra se p ro d u ciría en u n a fo rm a que se u n iera rápi­ d a m e n te al D N A y estim u laría la tran scrip ció n . L a transcripción se v e n a in h ib id a c u an d o u n a su stan cia se u n ie ra al activ ad o r y lo vol­ viera in cap a z de u n irse al D N A , d e m o d o q u e la tran scrip ció n ya no fu ese estim u lad a. A q u í, el p roducto (P) d e la reacció n controlada p o r el o p eró n , ló g icam en te, sería la su stan c ia rep reso ra p o rq u e po­ dría ser eco n ó m ico p a ra la célula ev itar la tran scrip ció n d e los ge­ nes q u e perm iten la síntesis de P c u an d o y a h ubiese m u c h o P dis­ ponible. L as características d el co n tro l positivo y n e g a tiv o en los o p ero n es in d u cib les y reprim ibles se re su m e n en la f i g u r a 16-6.

1 6-6. R e su m e n d e la s c a r a c te r ís tic a s d el co n tro l p o sitiv o y n e g a tiv o en o p e ro n e s in d u c ib le s y r e p rim ib le s .

Control de la expresión génica 44:

CONCEPTOS CLAVE Existen dos tipos básicos de control de la transcripción: negativo y positivo. En el control negativo, cuando una proteína reguladora (represor) se une al DNA, la trans­ cripción se inhibe; en el control positivo, cuando una proteína reguladora (activador) se une al DNA, la trans­ cripción se ve estimulada. Algunos operones son inducibles; la transcripción normalmente está apagada y debe encenderse. Otros operones son reprimibles; la transcripción normal­ mente está encendida y debe apagarse.

El operón lac de £ coli E n 1961 F ran g o is Ja c o b y Ja c q u e s M o n o d d e sc rib ie ro n el “m o ­ d elo del o p e ró n ” p a ra el c o n tro l g e n é tic o d el m e ta b o lism o d e la la cto sa en E. coli. E ste tra b a jo y la in v e stig a c ió n p o ste rio r so b re la g e n é tic a del m e ta b o lism o d e la la c to sa e sta b le c ie ro n al o p e ró n co m o la u n id a d b á sic a d e c o n tro l de la tra n sc rip c ió n en las b a c ­ terias. A p e sa r de! h e ch o d e q u e en e se m o m e n to n o se c o n ta b a co n m é to d o s p a ra d e te rm in a r la s sec u e n c ia s d e n u c le ó tid o s Ja c o b y M o n o d d e d u je ro n la e stru c tu ra del o p e ró n genéticam ente, al an a liz a r las in te ra c c io n e s d e las m u ta c io n e s q u e in te rfe ría n co n la re g u la c ió n n o rm al del m e ta b o lism o d e la lacto sa . E x am in ai'em o s lo s e fecto s de a lg u n as d e esta s m u ta c io n e s d e sp u é s d e v e r d e q u é m a n e ra el o p e ró n lac re g u la el m e ta b o lism o d e la lacto sa. L a lacto sa es u n o d e los p rin cip ales h id rato s de carb o n o p re se n ­ tes en la leche; p u ed e ser m eta b o liz a d a p o r las b acte rias E. coli que residen en el in testin o d e los m am ífero s. L a lac to sa n o se difu n d e con facilid ad a través d e la m e m b ra n a c e lu lar d e E. coli y debe tran sp o rtarse en f o m a activa al in terio r d e la c é lu la p o r u n a e n zi­ m a perm easa. (fig. 16-7). P a ra u tilizar la la c to sa c o m o fu en te de en ergía E. coli deb e p rim e ro d e g rad arla a g lu co sa y galactosa, u n a reacció n q ue es cata lizad a p o r la e n z im a p -g alacto sid asa. E sta e n ­ zim a tam b ién p u ed e co n v ertir la lacto sa en alo lacto sa, u n c o m p u e s­ to q ue d esem p eñ a un p a p el im p o rtan te en la reg u la ció n del m e ta ­ b o lism o d e la lactosa. U n a tercera en zim a, la tio g alactó sid o tran sa-

Q

cetilasa, ta m b ié n es p ro d u c id a p o r el o p e ró n lac, p ero su función en el m e ta b o lism o d e la lacto sa aún se desco n o ce. E l o p e ró n lac es u n e jem p lo de un o p e ró n inducible n eg ativo. Las en zim as |3-galactosidasa, p erm easa y tran sacetilasa e stá n codifica­ das p o r g enes e stru ctu rales adyacentes en el operón lac d e E. coli. L a p -g a lac to sid a sa e stá co d ificad a p o r el g e n lacZ, la p e rm e a sa por el gen la cY y la tran sa c etila sa p o r el g en lacA. C uando la lacto sa es­ tá au sen te del m ed io en el cual crece E. coli, solo se p ro d u c e n unas pocas m o lécu las d e c a d a en zim a (fig. 1 6 -8 a). Si se añ ad e lactosa al m ed io y n o h ay glu co sa, la velocid ad de síntesis de las tre s enzim as se in c re m e n ta en fo rm a sim ultánea, ce rc a d e m il veces e n 2 o 3 m i­ nutos. E ste estallid o d e síntesis p ro teica re su lta de la transcripción de lacZ, lac Y y lacA y ejem p lifica la in d u c c ió n c o o r d in a d a , la sín­ tesis sim u ltán ea d e varias enzim as, estim u lad a p or una m o lé c u la es­ p ecífica, el in d u cto r (fig. 16-8b). S i b ie n la la c to sa p a re c e se r el in d u c to r aq u í, la a lo la c to s a es la v e rd a d e ra re s p o n sa b le d e la in d u c c ió n . L o s genes la cZ , lacY y lacA tie n e n u n p ro m o to r c o m ú n {lacP en fig . 16-8a) y se transcri­ ben ju n to s . E n d ire c c ió n al e x trem o 5 ’, c o n re sp ecto a l p ro m o to r h ay u n g e n re g u la d o r lacl, q u e tie n e su p ro p io p ro m o to r {P^. El gen la c l se tra n sc rib e e n u n m R N A c o rto q u e se tra d u c e e n un re­ presor. C a d a re p re so r c o n siste en c u a tro p o lip é p tid o s id é n tic o s y tie n e d o s sitio s d e u n ió n ; u n sitio se u n e a la a lo la c to sa y el otro al D N A . E n a u se n c ia d e la c to sa (y p o r ta n to de a lo la c to s a ) el re­ p re s o r se u n e al sitio d e l o p e ra d o r lac, lacO (fig. 1 6 -8 a). Jacob y M o n o d m a p e a ro n e l o p e ra d o r en u n a p o sic ió n a d y a c e n te al gen lacZ\ la se c u e n c ia c ió n d e n u c le ó tid o s e fe c tu a d a en fo r m a m ás re­ c ie n te re v e ló q u e el o p erad o r, en re a lid a d , se su p e rp o n e c o n el ex­ trem o 3 ’ d e l p ro m o to r y el ex trem o 5 ’ d el lacZ (fig. 1 6 -9 ). In m e d ia ta m e n te e n d ire c c ió n al e x tre m o 5 ’ con r e s p e c to a los g en es e stru c tu ra le s se e n c u e n tra el p ro m o to r lac. L a R N A polim e ra sa se u n e al p ro m o to r y se m u ev e a lo largo de la m olécula de D N A , p a ra tra n s c rib ir lo s g en es estru c tu ra les. C u a n d o el re­ p re s o r se u n e al o p e ra d o r, la u n ió n d e la R N A p o lim e ra s a se blo­ q u e a y se ev ita la tra n sc rip c ió n . C u an d o h a y lac to sa p re s e n te , par­ te d e e lla se c o n v ie rte a alo la c to sa , la q u e se u n e al re p r e s o r y de­ te rm in a q u e éste se lib e re d e l D N A . E n p re se n c ia de la c to s a , en­ to n c e s, el re p re so r e stá in activ ad o , la u n ió n d e la R N A p o lim era­ sa y a n o e stá b lo q u e a d a , o cu rre la tra n sc rip c ió n de la cZ , lacY y lacA, y se p ro d u c e n las en z im a s lac.

L a c to s a

La permeasa

I transporta activa­

e x t r a c e lu la r

mente lactosa I a la célula...

Pe rm e a s a

M e m b r a n a c e lu la r

Q ...donde la enzima í P-galactosidasa la degrada I a galactosa y glucosa. p - g a la c t ó s id a s a L a c to sa

1 ^ La p-galactosidasa i i también convi ! lactosa en el corn- i i puesto relacionado] i alolactosa... i

I p - g a la c to s id a s a

-IC a la c t o s a

A lo la c t o s a

G lu c o s a

p - g a la c t o s id a s a

I ...y convierte alolactosa en galactosa y glucosa.

Fig. 16-7. La la c t o s a , un h id ra to d e carb o n o c e n tr a l q u e s e p re se n ta en la lech e, e s tá fo rm a d a por d o s a zú ca ­ re s d e s e i s c a rb o n o s u n id o s.

442 Capítulo 16 O p e ró n O p e ra d o r

RNA (a )

Ausencia ele Irictosii

G e n r e g u la d o r

lacO

p o lim e r a s a

(lacl)

C e n e s e s t r u c t u r a le s

lacY

lacZ ^ = 1

lacP

lacA

;No hay transcripción I

T r a n s c r ip c ió n y t r a d u c c ió n

En ausencia de lactosa la proteína reguladora (un represor) se une al operador e inhibe la transcripción.

P r o t e ín a r e g u la d o r a a c t iv a (r e p r e s o r )

O p e ra d o r RNA

(b) Prcscncia de lartosd

lacO

.

p o lim e r a s a

T r á n s c r ip c ló n

T r a n s c r ip c ió n

y traducción

y t r a d u c c ió n

.K ...que luego se une a la proteína reguladora y la vuelve inactiva.

P r o t e ín a r e g u la d o r a a c t iv a

D La proteína regula- ¡ I dora no puede ¡ unirse al operador... j

H

...y los genes estruc- i turales se transcriben y traducen. I

P r o t e ín a r e g u la d o r a in a c t iv a (r e p r e s o r )

E n z im a s

...I

p - g a la c t o s id a s a

Pe rm e a sa

L

T r a n s a c e t ila s a

_J G lu c o s a

l i c u a n d o hay lactosa, parte de ella se convier­ te en alolactosa ...

H

L a c to s a

^ ^ a T ^ s id a s a

F ¡9 ■ ¿ H a p e rd id o la p is ta en la e x p lic a c ió n re c ié n d a d a p a ra la in ­ d u c c ió n d e las e n zim as l a c l R e c u e rd e q u e la p e rm e a sa se re q u ie ­ re p a ra tra n sp o rta r la c to sa a la c élu la. S i e l o p e ró n la c e stá re p ri­ m id o y y a no se p ro d u c e p erm e a sa , ¿d e q u é m a n e ra la la c to sa e n ­ tra ría en la c é lu la p a ra in a c tiv a r el re p re so r y e n c e n d e r la tra n s ­ c rip c ió n ? M ás aún, el in d u c to r es re a lm e n te la a lo la cto sa, q u e d e ­ b e p ro d u c irse a p a rtir d e la c to sa p o r la p -g a la c to sid a sa . Si la p ro ­ d u c c ió n de la p -g a la c to s id a sa e stu v ie ra re p rim id a , ¿ d e q u é m a n e ­ ra p o d ría in d u c irse el m e ta b o lism o de la la cto sa?

^

16 "8 .

G a la c to s a

'

El

operón ta c regula el metabolismo de la lactosa.

L a re s p u e s ta es q u e la re p re sió n n u n c a a p a g a p o r c o m p le to la tra n sc rip c ió n del o p e ró n lac. A u n co n el re p re so r a ctiv o u n id o al o p e ra d o r h a y u n b a jo n iv e l d e tra n sc rip c ió n y se s in te tiz a n pocas m o lé c u la s d e p -g a la c to s id a sa , p e rm e a sa y tra n sa c e tila sa . C uando la la c to sa a p a re c e e n el m e d io , la p e rm e a s a que e s tá presente tra n sp o rta u n a p e q u e ñ a c a n tid a d de la c to sa al in terio r d e la s célu­ las. A llí, u n a s p o c a s m o lé c u la s de P -g a la c to sid a sa q u e e s tá n pre­ sen tes, c o n v ie rte n p a rte d e la lac to sa en alo la cto sa. L u e g o , la alola c to sa se u n e al re p re s o r y a ltera su fo rm a , d e m o d o q u e el re-

íacZ

Gen

A R N A p o lim e r a s a

Cadena—

5' 3'

tac

R e p re so r

TACGCACCCCAGCCTTTACACTTTATGCTTCCCCCTCCTATCTTGTCTCCAATTCTCACCCCATAACAATTTCAC

n o m o ld e

\

del D N A R e g ió n - 3 5

R e g ió n -1 O

S it io d e

O p e r a d o r u n id o

(s e c u e n c ia

( s e c u e n c ia

in ic ia c ió n d e

p o r el r e p r e s o r toe

consenso)

co n senso)

la t r a n s c r ip c ió n

F ig . 1 6 -9. En el operón lac, el operador se superpone con el promotor y el extremo 5’ del primer gen estructural.

3' S'

Control de La expresión gém’ca 443

p re s o r y a n o se u n e al o p erad o r. C u an d o el sitio d e l o p e ra d o r e s­ tá d eso cu p ad o , la R N A p o lim e ra sa p u e d e u n irse y tra n sc rib ir los g en es estru c tu ra le s del o p e ró n lac. Varios c o m p u e sto s re la c io n a d o s c o n la a lo la c to sa ta m b ié n p u e ­ d en u n irse al re p re so r lac e in d u c ir la tra n sc rip c ió n d e este o p e ­ rón. U n o d e ello s es el iso p ro p iltio g a la c tó sid o (IP T G ). S i b ie n el IP T G in activ a al re p re so r y p e rm ite la tra n sc rip c ió n d e lacZ, lacY y lac A , el IP T G n o se m e ta b o liz a p o r a c ció n d e la p -g a la c to sid a sa; p o r e sta ra z ó n co n fre c u e n c ia se u sa en in v e stig a c ió n p a ra e x a­ m in a r los e fecto s d e la in d u c c ió n , in d e p e n d ie n te m e n te d el m e ta ­ b o lism o .

CONCEPTOS CLAVE El operón ¡ac de E. coli controla la transcripción de tres genes necesarios en el metabolismo de la lactosa: el gen lacZ, que codifica la p-galactosidasa, el gen lacY que co­ difica la permeasa, y el gen lacA que codifica la tiogalactósido transacetilasa. El operón laces inducible en forma negativa: un gen regulador produce un represor que se une al sitio operador y evita la transcripción de los genes estructurales. La presencia de alolactosa inactiva al repre­ sor y permite la transcripción del operón lac.

Mutaciones lac Jacob y M o n o d trab ajaro n en la e stru ctu ra y la fu n c ió n del o p e ­ ró n lac an alizan d o las m u tacio n es q u e a fectab an el m etab o lism o de la lactosa. P a ra ay u d ar a d efin ir los p ap eles d e los d iferen tes co m ­ p o n en tes del o p eró n em p learo n cep as q u e eran diploides p a r c i a ­ les d e E. coli. L as bacterias d e estas cepas p o seían dos m o lécu las de D N A distintas: el c ro m o so m a b acte rian o co m p leto y una p o r­ ción ad icio n al d e D N A . Jaco b y M o n o d crearo n estas cep as p e rm i­ tien d o qu e o cu rriera la co n ju g ac ió n entre dos b acterias (véase cap. 8). E n la co n ju g ació n u n a p e q u e ñ a p o rció n d e D N A c ircu lar (plásm id o ) se tran sfiere de u n a b a c te ria a otra. E l p lásm id o em p lead o p o r Jacob y M o n o d co n te n ía el o p eró n lac; p o r tanto, la ba cte ria re ­ cep to ra se tran sfo rm ó en u n a d ip lo id e p arcial, al p o se e r dos copias del operón lac. M ed ian te el em p leo de d iferen tes co m b in acio n es de m u tacio n es en el D N A b acte rian o y d el p lásm id o Jaco b y M o ­ n o d d eterm in aro n las p a ite s del o p eró n lac q ue actu ab an en fo rm a cis (eran cap aces d e co n tro la r la ex p resió n d e genes, solo en la m is­ m a p o rció n de D N A ) o tran s (eran cap aces d e co n tro la r la ex p re­ sión de g en es en otras m o lécu las d e D N A ).

Mutaciones de los genes estructurales. Ja c o b y M o n o d d e sc u ­ b rie ro n a lg u n as cep as m u ta n te s q u e h a b ía n p e rd id o su c a p a cid a d d e sin te tiz a r la p -g a la c to s id a sa o la p e rm e a sa . (N o e stu d ia ro n en d e ta lle lo s e fecto s d e las m u ta c io n e s so b re la e n z im a tra n sa c e ti­ lasa, p o r e n d e n o la c o n sid e ra re m o s a q u í.) E sta s m u ta c io n e s se m a p e a ro n en los g en es e stru c tu ra le s lacZ o lacY y a lte ra b a n las se cu en cias d e am in o á c id o s d e la s e n z im a s c o d ific a d a s p o r los g e ­ nes. E llas afe c ta b a n c la ra m e n te la estructura d e las e n z im a s y n o la re g u la c ió n de su síntesis. M e d ia n te el em p le o d e d ip lo id e s p a rc ia le s Ja c o b y M o n o d fu e ­ ro n c ap aces d e e sta b le c e r q u e las m u ta c io n e s en lo s g e n es lacZ y la cY e ra n in d e p e n d ie n te s y h a b itu a lm e n te se v e ía a fe c ta d o solo el p ro d u c to d el g en en el c u al o cu rría n . L o s d ip lo id e s p a rc ia le s co n lacZ^ lacY^ e n el c ro m o so m a b a c te ria n o , p e ro lacZ^ lacY* en el p lá sm id o , fu n c io n a b a n n o rm a lm e n te y p ro d u c ía n p -g a la c to sid a sa

y p e rm e a sa en p re s e n c ia d e lacto sa. (E l g e n o tip o de un d ip lo id e p a rc ia l se e sc rib e se p a ra n d o los g en es d e c a d a m o lé c u la d e D N A co n u n a b a rra in c lin a d a : lacZ* lacY~ / lacZ^ lacY^.) E n e s te di­ p lo id e p a rc ia l es su fic ie n te u n ú n ic o g en d e P -g a la c to sid a sa fu n ­ c io n al (lacZ^) p a ra p ro d u c ir la p -g a la c to sid a sa , n o hay d ife re n c ia en tre el h e c h o d e q u e e l g e n fu n c io n a l p a ra P -g a la c to sid a sa esté aco p la d o c o n u n g e n p a ra p e rm e a sa fu n c io n a l {lacY'^) o u n gen d e fe ctu o so (lacY~). L o m ism o es v á lid o p a ra e l g en lacY^.

Mutaciones de los genes reguladores. Ja c o b y M o n o d a isla ro n tam b ién m u ta c io n e s q u e afe c ta b a n la regulación de la p ro d u c c ió n en z in iá tic a . E sta s m u ta c io n e s a fe cta ro n la p ro d u c c ió n ta n to d é la P -g a la c to sid a sa c o m o d e la p e rm e a sa p o rq u e lo s genes p a r a am ­ bas e n z im a s se e n c u e n tra n e n el m ism o o p e ró n y se re g u la n en fo rm a co o rd in a d a . P arte d e e sta s m u ta c io n e s era n constitutivas y c a u s a b a n que las e n z im a s lac se p ro d u je ra n to d o el tie m p o , in d e p e n d ie n te m e n ­ te de la p re s e n c ia o la a u se n c ia d e lacto sa . E sta s m u ta c io n e s o cu­ rrían e n el g en re g u la d o r y se d e sig n a ro n l a c t . L a c o n stru c c ió n de d ip lo id e s p a rc ia le s re v e ló q u e el g en lacl'^ e ra d o m in a n te con re sp e cto al g e n lacl''\ u n a ú n ic a c o p ia d e /a c /^ (g e n o tip o lacl^i l a c t) e ra su fic ie n te p a ra lle v a r a cab o la re g u la c ió n n o rm a l d e la p ro d u c c ió n e n z im á tic a . M á s aún, lacl^ re s ta b le c ió el c o n tr o l n o r­ m al a u n o p e ró n , au n c u a n d o é ste se lo c a liz a b a en u n a m o lé c u la de D N A d is tin ta , lo q u e m o stró q u e la c F e ra c ap az d e a c tu a r, en trans. Lfn d ip lo id e p a rc ia l c o n el g e n o tip o lacl^ lacZ^I la c l^ lacZ^ fu n c io n ó n o rm a lm e n te sin te tiz a n d o p -g a la c to s id a sa so lo cu an d o h a b ía la c to s a (fig. 16-10). E n e sta c e p a el g e n /ac/'*'del c ro m o s o ­ m a b a c te ria n o e ra fu n c io n a l, p e ro el gen lacZ^ e ra d e fe c tu o so ; en el p lá s m id o el g en l a c t e ra d e fe c tu o so , p e ro e l g en lacZ^ e r a fu n ­ cional. E l h e c h o d e q u e el g e n lacl"^ p u d ie ra re g u la r al g e n lacZ* lo c a liz a d o e n u n a m o lé c u la d e D N A d ife re n te in dicó a J a c o b y M o n o d q u e el p ro d u c to d el g en laci* e ra c a p a z de d ifu n d irs e ya fu era al p lá s m id o o al c ro m o so m a. A lg u n a s m u ta c io n e s la c i a islad as p o r Ja c o b y M o n o d ev ita ro n la tra n sc rip c ió n au n en p re s e n c ia d e la c to sa y d e otros in d u c to re s c o m o el IP T G . E sta s m u ta c io n e s se d e n o m in a ro n su p e rre p re so ra s { l a c f ) p o rq u e p ro d u c ía n rep re so re s q u e n o p o d ía n ser in a c tiv a dos p o r u n in d u cto r. R e c u é rd e se q u e el re p re s o r tiene d o s sitios de u n ió n , u n o p a ra el in d u c to r y u n o p a ra el D N A . L as m u ta c io ­ nes en la c f ’ p ro d u je ro n u n rep re so r con u n sitio de u n ió n al in­ d u c to r a lte ra d o , lo q u e d e te rm in a b a q u e el in d u c to r fu e ra in c a p a z de u n irse al re p re so r; e n c o n se cu e n cia , el re p re s o r sie m p re e r a ca­ p a z d e u n irse al sitio o p e ra d o r y ev itar la tra n sc rip c ió n d e lo s ge­ nes lac. L a s m u ta c io n e s su p e rre p reso ra s fu e ro n d o m in a n te s sobre /ac/+ ; lo s d ip lo id e s p a rc ia le s co n el g e n o tip o lacP la c Z ^ H a c t lacZ'^ fu e ro n in c a p a c e s d e sin te tiz a r 6 -g a la c to s id a sa o p e rm e a sa , h u b ie se o n o la c to sa (fig. 16-11). Mutaciones del operador. Ja c o b y M o n o d m ap ea ro n e l o tro ti­ p o d e m u ta n te s co n stitu tiv a s en u n sitio a d y a c e n te a lacZ. E stas m u ta c io n e s o c u rrie ro n en el sitio del o p e ra d o r y se r o tu la ro n co­ m o lacO'^ (O sig n ific a o p e ra d o r y e c o n stitu tiv o ). Las m u ta c io n e s lacO'^ a lte ra ro n la se c u e n c ia d el D N A en el operador, d e m odo q u e la p ro te ín a re p re so ra y a n o e ra c a p a z d e u n irse. U n d ip lo id e p arcial, c o n g e n o tip o l a c t lacO'^ lacZ'^llacl* lacO* lacZ^ ex h ib ió sín tesis c o n stitu tiv a d e p -g a la c to sid a sa , lo q u e in dicó q u e lacO'^ e ra ’d o m in a n te so b re lacO^. E l a n á lisis d e o tro s d ip lo id e s p a rciales m o s tró que el g e n lacO a c tu a b a e n cis, al a fe c ta r so lo a los g e n e s d e la m ism a m o lé c u la d e D N A . P o r e je m p lo , u n d ip lo id e p a rc ia l c o n g enotipo la c l^ lacO'^ lacZ'~UacI'^ lacO'^ lacZ* e ra c o n stitu tiv o y p ro d u cía p -g a la e to -

444 Capítulo 16

RNA

(a) Ausencia de lactosa

R e p re so r a c t iv o

p o lim e r a s a ^

A-

T r a n s c r ip c ió n

El gen laci* es dominante en trans: el represor producido por laci* puede unirse a ambos I operadores e inhibe la transcripción i cuando no hay lactosa.

Ó

R e p re so r m u la n t e

t (b) Pi esencia de lactosa

inhibida

RNA p o lim e r a s a

lacZ~

Cuando hay lactosa inactiva al represor y se produce p-galactosidasa funcional a partir del gen la cZ * .

Transcripción | y traducción !

R e p re so r a c t iv o

I p - g a la c t o s id a s a

R e p re so r

^ n o f u n c io n a l ■

m u ta n t e

Transcripción j y traducción |

Fig. 16-10. El diploide parcial l a c t lacZ-/!act-lacZ* produce p-galactosidasa solo en presencia de lactosa porque el gen laci es dominante en trans.

p-galactosidasa

RNA polimerasa . D

J

Super

^

El gen ¡acP produce un superrepresor que no une lactosa.

lacP

re p res o r

RNA

R e p re so r

polimerasa

a c t iv o

t

El gen ¡acP es dominante en trans: el superrepresor une a ambos operadores y evita la transcripción en presencia y en ausencia de lactosa.

R e p re so r L a c to sa

i n a c t iv o

Fig. 16-1 1. El diploide parcial lacP lacZ* /lacl* ImcZ* no produce p-galactosidasa en presencia y ausencia de lacto­ sa porque el gen lacF codifica un super represor.

Control de La expresión génica 44í

sidasa en p resen cia o au se n c ia d e lac to sa (fig. 1 6 -1 2 a), p ero u n dip lo id e p arcial co n gen o tip o laci* lacO'^ lacZ '^/lact lacO^^ lacZ" p ro ­ d u c ía (3-galactosidasa solo en p re se n cia de la c to sa ( f i g . 16-12b). E n el diploide parcial constitutivo {lacl^ lacO^ lacZ^/lacI^ lacC f lacZ ^ ; fig. 16-12a), la m u tac ió n lacO ‘^ y el g en fu n cio n al /acZ+ están p re ­ sentes en la m ism a m o lé c u la de D N A , p ero en lacl^ lacO"^ lacZ''/lacl^ la c 0 ‘^ lacZ^ (fig. 1 6 -12b) la m u tació n lacO'^ y el g en fu n cio n al /acZ+ están en m o lécu las diferen tes. L a m u ta ció n lacO afecta solo a los g enes a los q u e e stá co n e c ta d a físicam en te, c o m o resu lta c ie r­ to p ara to d as las m u tacio n es d e operador. E v itan la u n ió n de u n a p ro teín a rep reso ra al operador, y p o r tan to p erm iten q u e la R N A p o lim erasa tran scrib a genes d e la m ism a m o lé c u la d e D N A . Sin em bargo, no p u ed en ev itar q u e un re p re so r se u n a a los op erad o res norm ales de otras m o lécu las d e D N A .

(a) Diploide parcial lacl^ lacO^ lacZ /lacI^ lacC^ lacZ^

m

ñ

,

:

M u ta c io n e s d e l p ro m o to r. L as m u ta c io n e s q u e a fe c ta n el m e ta b o lis m o d e la la c to s a ta m b ié n h a n sid o a isla d a s e n el sitio p ro m o to r; e sta s m u ta c io n e s se d e s ig n a n lacP~ e in te rfie re n en la u n ió n d e la R N A p o lim e ra s a al p ro m o to r. D a d o q u e esta u n ió n e s e s e n c ia l p a ra la tra n s c rip c ió n d e lo s g en es e s tru c tu ra ­ les la s c e p a s d e E. co li c o n la s m u ta c io n e s lacP^ n o p ro d u c e n e n z im a s la c , se a e n p re s e n c ia d e la c to s a o en a u s e n c ia de ella. A l ig u a l q u e la s m u ta c io n e s d el o p e ra d o r, las m u ta c io n e s lacP~ a c tú a n e n cis y a fe c ta n so lo a lo s g e n e s d e la m is m a m o lé c u la d e D N A . E l d ip lo id e p a rc ia l la c P la cP ^ la c Z * /la cl^ lacP^ lacZ'^ e x h ib e s ín te s is n o rm a l d e P -g a la c to sid a sa , m ie n tr a s que la c P lacF^ la c Z ^ /la c l^ lacP ^ lacZ^ n o p u e d e p ro d u c ir P -g alac­ to s id a s a in d e p e n d ie n te m e n te d e la p re s e n c ia oj)crador Q El represor trp normalmente está

I ^ ________

Transcripción 1 y traducción |

,

.'na?:'™:....... , ..... : ftraducdórt ¡

^

...y ocurre la i transcripción. í

P ro te ín a re g u la d o r a in a c tiv a (re p re s o r)

E n z im a s

A . ___ - J -

T

C o r is m a ta

T r ip t ó f a n o

No hay transcripción'

...... JL.. P ro te ín a re g u la d o r a in a c tiv a (re p re s o r)

El triptófano se une al represor y lo activa,

ñ

El represor trp se une luego al operador y apaga la transcripción.

Fig.

1 6 - 1 5 . El o perón trp con­ tro la la b io s ín t e s is del a m in o á cid o trip tó fa n o en E. coli.

q ue p oseían delecion es en la reg ió n tran scrip ta del o perón. Parte de estas m ulantes exhibían niveles au m en tad o s d e transcripción, si b ien el co n tro l en el sitio del op erad o r n o se veía afectado. M ás aún, observaron que dos m R N A d e d iferente tam añ o se tran scrib ían a p artir del operón trp: u n m R N A largo q u e co n ten ía secuencias p a ra los genes estructurales y u n m R N A m u ch o m ás corto, de solo 140 n ucleótidos. E stas ob serv acio nes ond u jero n a Y anofsky a p ro p o n er otro m ecan ism o - u n o que c au sab a la term in ació n p rem atu ra d e la tra n sc rip c ió n - que tam b ién reg u la la tran scrip ció n del o perón trp. E l ex a m e n cu id a d o so d el o p e ró n trp m u e s tra u n a reg ió n d e 162 n u c le ó tid o s, q u e c o rre sp o n d e a la U T R 5 ’ la rg a d el m R N A (m e n ­ cio n a d a p rev ia m e n te ) tra n sc rip ta a p a rtir d e l o p e ró n trp (fig. 1616a). L a U T R 5 ’ (ta m b ié n lla m a d a u n líd e r) c o n tie n e c u atro r e ­ g iones: la reg ió n 1 es c o m p le m e n ta ria c o n la re g ió n 2', la re g ió n 2 es c o m p le m e n ta ria c o n la re g ió n 3 y la re g ió n 3 es c o m p le m e n ­ ta ria c o n la reg ió n 4. E sta s c o m p le m e n ta rie d a d e s p e rm ite n q u e la 5 ’ U T R se p lie g u e en d o s e stru ctu ra s se c u n d a ria s d istin tas (fig. 16-16b). N o m ás q u e u n a d e ésta s c a u sa a ten u a c ió n . U na de las estru c tu ra s se c u n d a ria s c o n tie n e u n a h o rq u illa p ro ­ d u c id a p o r el a p a re a m ie n to d e b ase s d e la s re g io n e s 1 y 2, y o tra h o rq u illa p ro d u c id a p o r el a p a re a m ie n to d e b a se s d e las reg io n es 3 y 4. N ó te se q u e u n a se c u e n c ia d e n u c le ó tid o s u ra c ilo sig u e a la h o rq u illa 3+4. N o re s u lta u n a c o in c id e n c ia el h e c h o d e q u e la e s ­ tru c tu ra d e un te rm in a d o r in trín se c o b a c te ria n o (cap . 13) in c lu y a u n a h o rq u illa se g u id a p o r u n a se c u e n c ia d e n u c le ó tid o s u rac ilo ; esta e stru c tu ra se c u n d a ria en la U T R 5 ’- d el o p e ró n trp es - d e h e ­ c h o - u n te rm in a d o r d e n o m in a d o atenuador. C u a n d o los n iv eles celu la re s d el trip tó fa n o so n alto s, las re g io n e s 3 y 4 d e la U T R 5 ’ ap a re a n las b a se s p a ra p ro d u c ir la e stru c tu ra a te n u a d o r; este a p a ­ re a m ie n to d e b ases d e te rm in a q u e la tra n sc rip c ió n fin a lic e a n tes de q u e p u e d a n tra n sc rib irse lo s g en es e stru c tu ra le s d e trp.

L a e stru c tu ra se c u n d a ria a ltern ativ a d e la U T R 5 ’ s e produce p o r el a p a re a m ie n to d e b a se s 2 y 3 (v é ase fig. 1 6 -16b), E s te apa­ re a m ie n to d e b a se s ta m b ié n p ro d u c e u n a h o rq u illa, p e ro e sta hor­ q u illa n o es se g u id a d e u n a se c u e n c ia de n u c leó tid o s u ra c ilo ; de m o d o q u e e sta e stru c tu ra no fu n c io n a c o m o term in ad o r. Cuando los n iv e le s c e lu la re s d e trip tó fa n o so n b a jo s, las re g io n e s 2 y 3 a p a re a n la s b ase s y n o se te rm in a la tra n sc rip c ió n de lo s g en es es­ tru c tu ra le s d e l trp. L a R N A p o lim e ra sa c o n tin ú a m á s a llá de la U T R 5 ’ d e n tro de la se c c ió n c o d ific a n te d e los g enes estru c tu ra ­ les y se p ro d u c e n la s e n z im a s q u e sin te tiz a n "el trip tó fa n o . Dado q u e e v ita la te rm in a c ió n d e la tra n sc rip c ió n la e s tru c tu ra 2+3 se d e n o m in a antiterminador. P a ra resu m ir, la U T R 5 ’ del o p eró n trp p u e d e p le g a rs e en una de d o s e stru c tu ra s. C u a n d o el trip tó fa n o e s alto, se f o r m a la,es­ tru c tu ra 3 + 4 , se te rm in a la tra n sc rip c ió n d e n tro de la U T R 5 ’ y no se sin te tiz a trip tó fa n o ad icio n a l. C u a n d o e l trip tó fan o e s bajo, se fo rm a la e stru c tu ra 2 + 3 , la tra n sc rip c ió n c o n tin ú a a tr a v é s de los g en es e stru c tu ra le s y se sin te tiz a trip tó fa n o . L a p re g u n ta crítica es, ¿ p o r q u é su rg e la e stru c tu ra 3 + 4 c u a n d o el trip tó fa n o es alto y la 2 + 3 c u a n d o el trip tó fa n o es b ajo ? P a ra re s p o n d e r e s ta p re g u n ta d e b e m o s m ira r m ás d e c e rc a , a la se c u e n c ia d e n u c le ó tid o s de la U T R 5 ’. E n el e x trem o 5 ’, la re­ gió n m á s c e rc a n a al 5 ’ te rm in a l q u e la re g ió n 1, h ay u n sitio de u n ió n al rib o so m a (v é a se fig. 16-16a). L a reg ió n 1, de h e c h o , co­ d ific a u n a p ro te ín a p e q u e ñ a . D e n tro d e la sec u en cia co d ifican te p a ra e s ta p ro te ín a h a y d o s co d o n es U G G , q u e e s p e c ific a n el ami­ n o á c id o trip tó fa n o ; p o r tan to , se re q u ie re trip tó fan o p a r a la tra­ d u c c ió n d e e sta s e c u e n c ia U T R 5 ’. L a p ro te ín a c o d ific a d a por la reg ió n U T R 5 ’ n o h a sid o aisla d a y se su p o n e que es in e s ta b le ; su ú n ic a fu n c ió n a p a re n te es c o n tro la r la a ten u a ció n . S i b ie n se es­ ta b le c ió en el c a p ítu lo 14 q u e la U T R 5 ’ n o se trad u ce a u n a pro-

Control de La expresión génica A (a) Operón

trp 5'UTR A

Gen

R e g io n e s :

,J

trp E

^ 3'

l

uuuuuuu

V Codones T rp

H

C o d o n e s trp

Cuando el triptófano está alto la región 3 se aparea con la región 4. Esta estructura termina la transcripción.

Cuando el triptófano está bajo la re­ gión 2 se aparea con la región 3. Esta estructura no termina la transcripción.

m il

A t e n u a c ió n p o r la

A n t it e r m in a c ió n

e s t r u c t u r a s e c u n d a r ia

p o r la e s t r u c t u r a

1+2 y 3+4 (s e t e r m in a

s e c u n d a r ia 2+3

la t r a n s c r ip c ió n )

teína, lo s o p ero n e s d e la 5 ’ U T R su je to s a a te n u a c ió n son la s e x ­ cep c io n e s a e sta regla. L a fo rm a c ió n d e h o rq u illa s en la U T R 5 ’ d el o p e ró n trp, es c o n ­ tro la d a p o r el in te rju e g o d e la tra n sc rip c ió n y d e la tra d u c c ió n que o cu rre ce rc a del e x tre m o 5 ’ del m R N A . R e c u é rd e se q u e en las c é ­ lu las p ro c a rio n te s la tra n sc rip c ió n y la tra d u c c ió n están a c o p la ­ das: m ien tras q ue la tra n sc rip c ió n o c u rre en el e x tre m o 3 ’ del m R N A , se in ic ia la tra d u c c ió n en su e x tre m o 5 ’. E l m o m e n to p re ­ ciso y la in te ra c c ió n d e e sto s d o s p ro c e so s en la U T R 5 ’ d e te rm i­ n an si h ay aten u a ció n .

Transcripción cuando los niveles de triptófano son eleva­ dos. C o n sid e re m o s e n p rim e r lu g a r lo q u e o c u rre c u a n d o lo s n i­ v e le s in tra c e lu la re s d e trip tó fa n o so n a lto s. L a R N A p o lim e ra sa c o m ie n z a p o r tra n s c rib ir el D N A y p ro d u c e la re g ió n 1 d e la U T R 5 ’ (fig. 16-17a). S ig u ie n d o a la R N A p o lim e ra s a d e c e rc a se u n e un rib o s o m a a la U T R 5 ’ (en la s e c u e n c ia d e S h in e -D a lg a rn o , v é a s e el c a p ítu lo 14) y c o m ie n z a a tra d u c irs e la re g ió n c o d ific a n te . M ie n tra s ta n to , la R N A p o lim e ra s a tra n s c rib e la r e ­ g ió n 2 (fig 16-17b). L a re g ió n 2 es c o m p le m e n ta ria c o n la r e ­ g ió n 1 p e ro d a d o q u e el rib o s o m a e s tá tra d u c ie n d o la re g ió n 1, lo s n u c le ó tid o s de las re g io n e s 1 y 2 n o p u e d e n a p a re a r su s b a ­ ses. A m e d id a q u e la R N A p o lim e ra s a c o m ie n z a a tra n s c rib ir la re g ió n 3 el rib o s o m a c o n tin iía tra d u c ie n d o la re g ió n 1 (fig. 1617c). C u a n d o el rib o s o m a a lc a n z a lo s d o s c o d o n e s U G G del trip tó fa n o , n o se to rn a m á s le n to n i se d e tie n e d a d o q u e el tr ip ­ tó fa n o a b u n d a y lo s tR N A c a rg a d o s co n trip tó fa n o so n f á c il­ m e n te a c c e sib le s . E ste p u n to es c rític o p a ra te n e r en c u e n ta : d e ­ b id o a q u e el trip tó fa n o a b u n d a la tra d u c c ió n p u e d e c o n tin u a r c o n la tra n sc rip c ió n . A m e d id a q u e av a n z a m ás a llá d e la re g ió n 1 h a c ia el c o d ó n d e te rm in a c ió n el rib o so m a c u b re p a rc ia lm e n te la reg ió n 2 (fig 1617d); m ie n tra s tan to , la R N A p o lim e ra sa c o m p le ta la tra n sc rip ­

Fig. 16-16. D os e s t r u c t u r a s se ­ c u n d a ria s d is t in t a s p u e d e n fo rm ar­ s e por la 5’ U T R del tr a n s c r ip to de m RNA en el o p eró n trp.

c ió n d e la re g ió n 3. S i b ie n las re g io n e s 2 y 3 sqn co m p le m e n ta ­ ria s, la re g ió n 2 e stá p a rc ia lm e n te c u b ie rta por el rib o so m a, de m o d o q u e n o p u e d e a p a re a r sus b a se s c o n la reg ió n 3. L a R N A p o lim e ra sa co n tin iía m o v ié n d o se so b re e l DNA y tra n sc rib e p o r ú ltim o la reg ió n 4 d e la U T R 5 ’. L a reg ió n 4 es c o m p le m e n ta ria c o n la re g ió n 3 y, d a d o q u e la re g ió n 3 no puede a p a re a r las b a se s c o n la reg ió n 2 la s a p a re a con la 4 . E l aparea­ m ie n to de las re g io n e s 3 y 4 (v é a se fig. I6 -1 7 d ) p ro d u c e el aten u a d o r (u n a h o rq u illa seg u id a p o r u n a secu en cia d e nucleótidos u ra c ilo ) y la tra n sc rip c ió n te rm in a ju s to al fin a liz a r la región 4. L o s g e n e s e stru c tu ra le s n o se tra n sc rib e n , n o se tr a d u c e n enzim as p ro d u c to ra s d e trip tó fa n o y n o se s in te tiz a 4 rip tó fa n o adicional.

Transcripción cuando los niveles de triptófano son bajos. ¿ Q u é o c u rre c u a n d o lo s niv eles d e trip tó fa n o son b a jo s ? N ueva­ m e n te , la R N A p o lim e ra sa c o m ie n z a a tra n sc rib ir la región 1 de la U T R 5 ’ (fig. 16-17e) y el rib o so m a se u n e al e x tre m o 5 ’ de la U T R 5 ’ y c o m ie n z a a tra d u c ir la re g ió n 1, m ien tras la R N A p o li­ m e ra sa c o n tin ú a tra n sc rib ie n d o la re g ió n 2 (fig. 16-17f). Cuando el rib o so m a a lc a n z a lo s co d o n e s U G G d el trip tó fa n o , se detiene (fig. 16-17g) d a d o q u e el nivel d e trip tó fa n o y los tR N A cargados c o n trip tó fa n o so n e scaso s, o n o e stá n d isp o n ib les. E l ribosom a se u b ic a en lo s c o d o n e s d e trip tó fan o , a la espera d e l a llegada del tR N A c a rg a d o c o n e ste a m in o ácid o . S in em bargo, e s t a detención d el rib o so m a n o e v ita la tra n sc rip c ió n ; la R N A p o lim e ra s a conti­ n ú a m o v ié n d o se so b re el D N A y la tra n scrip ció n p re c e d e a la tra ­ d u c c ió n . D e b id o a q u e e l rib o so m a está d e te n id o en los c o d o n e s de trip ­ tó fa n o d e la re g ió n 1, la reg ió n 2 no e stá c u b ierta p o r e l ribosom a c u a n d o la reg ió n 3 se h a tran sc rip to . P o r tan to , los n u c leó tid o s de la s re g io n e s 2 y 3 a p a re a n sus b ases, p a ra fo rm ar la h o rq u illa 2+3 (fig. 16-17h). E s ta h o rq u illa n o p ro v o c a la te rm in a c ió n , por tanto la tra n sc rip c ió n c o n tin ú a . D ad o q u e la re g ió n 3 y a s e h a aparea-

450 Capítulo 16

Cuando el triptófano está alto

m RNA

(a)

R N A p o lim e r a s a C o d o n e s trp

f.

La RNA polimerasa comienza a transcriDir j el DNA y produce la región i ae la b' u i R. i

(b)

DNA

R ib o s o m a

Un ribosoma se une ai extremo 5' de la \ 5' UTR y traduce la región 1, mientras | que la región 2 se esté transcribiendo. !

■

1

(c) La RNA polimerasa transcribe la región 3, El ribosoma no se detiene en los codones Trp porque el triptófano abunda.

(d) El ribosoma cubre parte de la región 2, lo que evita que se aparee con la región 3. La región 4 se transcribe y se aparea con la región 3, lo que produce el atenuador que termina la transcripción.

Cuando el triptófano está bajo (6) i La RNA polimerasa comienza a transcribir el DNA y produce la región 1 de la 5' UTR.

(f)

Un ribosoma se une ai extremo 5' de la ! 5' UTR y traduce la región 1 mientras que | la región 2 se transcribe. í

(g) El ribosoma se detiene en ios codones Trp de la región 1 porque el triptófano está bajo. Dado que el ribosoma está detenido la región 2 no está cubierta por él cuando se transcribe la región 3.

C o d o n e s tr p i

| | | |

-< 'í ....N A \ Apaream iento de bases distintas de las de Watson y Crick

H Timina (forma común) H \ H N— H ••••

\

/

H—

C

/ ..\ /

Adenina (forma común)

• • • • q>

N'

••H-N

rs .

/ >• H-N \

Citosina (forma común)

N, / H G

\

"

H—N

H Guanina (forma común)

Modos de apaream ientos de bases anóm alos H \ H—N H N

'

H

'

N~ H • ••

NA

O

H

Citosina (forma rara)

HjC \ H

r

H

C N

/

O.........

/

I \

''

Adenina (forma común) H—o

Tam baleo entre timina y guanina

H

\

/

N— H

C N.

>H —N

O ................................

A H

Tam baleo entre citosina y adenina

..

r

I \

T N-H H~N

Timina (forma común)

H3C

\

Guanina (forma rara)

A F ig . 1 7 - 1 2 . Los apareamientos de bases no estándar pueden o cu rrir gracias a la flexibilidad de la estructura del DNA. La timina y la guanina pueden aparearse a través del tambaleo entre bases normales. La citosina y la adenina pueden aparearse a través del tambaleo cuando la adenina está protona­ da (posee un hidrógeno extra).

486 Capítulo 17

^

ILa tim ina

Las cadenas de D N A se separan para la replicación.

de la cad en a m olde original se ap area con la gua-|

nina por tam b ale o y co n ducen a un error Incorp orado.

i

Tipo salvaje

DNA

Mulante

Tipo salvaje Tipo salvaje

n

En la ronda de replicación siguiente, el n u d e ó tld o guanina se a p a re a con la

Fig. 17-1 3.

El apaream iento de bases por tambaleo lleva a un error replicado.

que generará una molécula de DNA con una inserción y otra con una deleción (fig. 17-15). Algunas secuencias de DNA son más propensas que otras a sufrir deslizamiento de las cadenas o entrecruzamiento desigual. Los tramos de secuencias repetidas, como las repeticiones de trinucleótidos o las repeticiones de homopolímeros (más de cinco repeticiones de una misma base en una hi­ lera), son propensas al deslizamiento de las cadenas. Los tramos con más repeticiones tienen mayor probabilidad de sufrir ese des­ lizamiento. Las secuencias replicadas o repetitivas pueden ali­ nearse en forma incorrecta durante el apareamiento, lo que con­ duce a un entrecruzamiento desigual. El deslizamiento de ambas cadenas y el entrecruzamiento desigual producen copias duplica­ das de secuencias, las que a su vez promueven más deslizamien­ to de las cadenas y entrecruzamiento desigual. Esta cadena de eventos puede explicar el fenómeno de anticipación que suele ob­ servarse para la expansión de repeticiones de trinucleótidos.

CONCEPTOS CLAVE Los errores espontáneos de la replicación surgen de es­ tructuras de bases alteradas y del apaream iento de bases por tambaleo. Las inserciones y deleciones pequeñas pueden producirse por deslizam iento de las cadenas du­ rante la replicación y por entrecruzam iento desigual.

Cambios químicos espontáneos Además de las mutaciones espontáneas que aparecen durante Cadena recién sintetizada 5' Cadena molde 3'

5' B

i

r t i La cad en a recién

La cad en a m olde

sintetizada se enrula!

i se enrula hacia

hacia a fu e ra ,...

I

j

citosina y g en era una m u ta ció n de transición.

la replicación, también surgen mutaciones por cambios químicos espoiitáneos en el DNA. Uno de estos cambios es la despurinación, la pérdida de una base purínica de un nucleótido. La despurinación se produce cuando se rompe la unión covalente que co­ necta la purina con el átomo de carbono 1’ del azúcar desoxirribosa (fig. 17-16a), y produce un sitio apurínico (un nucleótido que carece de su base purínica). Un sitio apurínico no puede ha­ cer de molde para una base complementaria durante la replica­ ción. En ausencia de la restricción del apareamiento de bases, en­ frente del sitio apurínico se incorpora un nucleótido incorrecto (con mayor frecuencia la adenina) a la cadena de DNA recién sin­ tetizada (fig. 17-16b), lo que lleva casi siempre a la incorporación de un error. El error incorporado se transforma luego en un error replicado en la siguiente ronda. La despurinación es una causa frecuente de mutación espontánea. Una célula de mamífero en cultivo pierde cerca de 10 000 purinas por día. Otro cambio químico espontáneo que tiene lugar en el DNA es la desaminación, la pérdida de un grupo amino (NHj) de una ba­ se. La desaminación puede producirse en forma espontánea o ser inducida por sustancias químicas mutagénicas. La desaminación puede alterar las propiedades de apareamien­ to de una base: la desaminación de la citosina, por ejemplo, pro­ duce un uracilo (fig. 17-17a), que se aparea con la adenina duran­ te la replicación. Después de otra ronda de replicación, la adenina se aparea con la timina y crea un par T*A en lugar del par ori­ ginal C*G (C»G^U*A—>T*A); este cambio químico es una mu­ tación de transición. Este tipo de mutación suele repararse por en­ zimas que eliminan el uracilo cada vez que se halla en el DNA. La capacidad para reconocer el producto de desaminación de la AATTAATT TTAATTAA

i 3 ¡ Si los crom o so m as h o m ólog os se alinean e n fo rm a

a fu e ra ,...

Incorrecta duran te • i el entrecruzam iento,.

íL ia u

3'

3'

5' I

...y genera la adi-

5' 3'

...y genera la

T

clón de un nucleótl- i

5 'í 3 'í

i

nueva.

1

=Entrecruzamiento desigual | ^

|

do en la caden a

33'

om isión de un nucleó tid o en la

5' 3'

mlento c o n tie n e una

"AATT TTAÁTTAA

ca d e n a nueva.

Í3 ' j 5'

... uno de los produc­ tos del entrecruza-

3' 5'

Fig. 1 7 - 1 4 . Las inserciones y las deleciones pueden generarse por deslizam iento de las cadenas.

inserción...

m

...y el o tro

posee!

una d eleció n.

Fig. 17-1 5. El entrecruzam iento desigual produce inserciones y deleciones.

Mutaciones génicas y reparación del DNA 487 (a)

(b)

Esqueleto de azúcar-fosfato del DNA

jOurante la repiicación, el sitio apurínico no sirve como molde para ia base complementaria de la cadena recién sintetizada.

^ LlíTnucleótido con la base incorrecta (más a menudo ia A) se incorpora a la cadena recién sintetizada.

^ l^ ñ irro m T a siguiente de re ^ lÚ T .p a ra generai plicación, esta base incoruna mutación porada en forma incorrecta permanente, se utiliza como molde,,,.

Cadenas molde

Mulante

i

► 'S i

Pirimidina

Separación de las cadenas

Sitio í i apurínico

DNA

J.

Purina

Replicación,'i

Repiicación i

ti

Despurinacipi^

Molécula de DNA normal (sin mutación)

OH 3'

incorpora un nucleótido en la cadena recién sintetizada frente al sitio apurínico.

Fig. 17-1 6. La despurinación, pérdida de una base purínica de un nucleótido, produce un sitio apurínico. citosina puede explicar por qué en el DNA se encuentra la timina y no el uracilo. Algunas bases citosinas del DNA se metilan en forma natural y existen en la forma 5-metilcitosina (5mC; véan­ se p. 282 en cap. 10 y fig. 10-18), la que al ser desaminada se convierte en una timina (Fig. 17-17b). Como la ti mina se aparea con la adenina durante la repiicación, la desaminación de la 5metilcitosina cambia un par original C*G por uno T*A (C*G ~>5mC»A ^T»A). Este cambio no puede detectarse por los sis­ temas de reparación del DNA porque produce una base normal. En consecuencia, la transición C*G-^T*A se produce a menudo en las células eucariontes.

CONCEPTOS CLAVE Algunas mutaciones provienen de m odificaciones espon­ táneas en la estructura del DNA, como la despurinación y la desaminación, que pueden alterar las propiedades de apaream iento de las bases y causar errores en las si­ guientes rondas de repiicación.

Mutaciones inducidas químicamente Aunque muchas mutaciones aparecen de manera espontánea, numerosos agentes ambientales pueden dañar el DNA, incluidas A®T. Por eso se dice que la polimerasa y] es una polime­ rasa promotora de errores.

CONCEPTOS CLAVE La radiación ionizante, como los rayos X y los rayos gam ­ ma, dañan el DNA mediante el desplazamiento de e le c ­ trones de los átomos; luego estos electrones rompen uniones fosfodiéster y alteran la estructura de las bases. La luz ultravioleta provoca mutaciones sobre todo m e ­ diante la producción de dímeros de pirimidina que in te­ rrumpen la replicación y la transcripción. El sistem a SOS permite a las bacterias superar los bloqueos de la replica­ ción, pero introduce errores en la síntesis de DNA.

Estudio de las mutaciones Las mutaciones han sido objeto de intenso estudio entre los ge­ netistas, porque tienen casi siempre efectos perjudiciales. Estos estudios incluyeron el análisis de las mutaciones inversas, las que a menudo dan una idea acerca de cómo las mutaciones causan da­ ño al DNA; el desarrollo de pruebas para determinar las propie­ dades mutagénicas de los compuestos químicos e investigaciones de las poblaciones humanas trágicamente expuestas a niveles al­ tos de radiación.

Análisis de las mutaciones inversas El estudio de las mutaciones inversas (inversiones) puede apor­ tar información útil acerca de cómo los mutágenos alteran la es­ tructura del DNA. Por ejemplo, cualquier mutágeno que produz­ ca tanto una transición A*T—>G*C como una G»C-4 A»T debería ser* capaz de invertir sus propias mutaciones. Sin embargo, si el mutágeno sólo produce transiciones G*C->A*T; no es posible realizar inversiones con el mismo mutágeno. La hidroxilamina (véase fig. 17-20c) muestra este tipo de actividad mutagénica unidireccional: provoca transiciones G*C->A«T, pero es incapaz

492 Capítulo 17 de invertir las mutaciones que produce. Entonces, sabemos que no produce transiciones AoT-^^G^C. Por otro lado, el etilmetansulfonato (véase fig. 17-20a) produce transiciones G»C—>A®T e invierte sus propias mutaciones. Por tanto, sabemos que también produce transiciones T*A—>C*G. El análisis de la capacidad de los diferentes mutágenos para cau­ sar mutaciones inversas permite estudiar la naturaleza molecular de las mutaciones. Podemos utilizar mutaciones inversas pai'a determi­ nar si una mutación proviene de una sustitución de una base o de un cambio del marco de lectura. Los análogos de las bases como la 2-aminopurina provocan transiciones, y los agentes intercalantes como la naranja de acridina (véase fig. 17-22) producen cambios del marco de lectura. Si una sustancia química invierte mutaciones producidas por la 2-aminopurina, pero no las producidas por la na­ ranja de acridina, podemos concluir que esa sustancia produce tran­ siciones, pero no cambios del mai'co de lectura. Si el ácido nitroso (que produce tanto transiciones G®C-^A*T como A“T-^G»C) in­ vierte las mutaciones producidas por la sustancia química, pero la hidroxilamina (que causa solo transiciones G»C-^A®T) no lo hace, sabemos que, al igual que la hidroxilamina, la sustancia química produce sólo transiciones G*C^A»T. En el cuadro 17-4 se mues­ tran mutaciones inversas que son posibles desde un punto de vista teórico entre varios agentes mutagénicos. La verdadera capacidad de los mutágenos para producir inversiones es más compleja que la sugerida por este cuadro y depende de las condiciones ambientales y del organismo estudiado.

ficial: hoy en día más de 50 000 sustancias químicas diferentes se encuentran en uso comercial e industrial, y se agregan de 500 a 1 000 sustancias químicas nuevas cada año. Algunas de estas sus­ tancias son carcinógenos potenciales y podrían causar daño a las personas. ¿Cómo podemos determinar cuáles son peligrosas? En algunos casos, se correlaciona la exposición previa de seres hu­ manos a una sustancia química determinada con un aumento en la incidencia de cáncer, lo que provee buena evidencia de que esa sustancia es un carcinógeno. Pero, idealmente, se quisiera saber qué sustancias químicas son peligrosas antes de exponerse a ellas. Un método para probar el potencial que tienen las sustan­ cias para causar cáncer es administrarlas a animales de laborato­ rio (ratas o ratones) y comparar la incidencia de cáncer en los ani­ males tratados con la de los animales controles. Lamentablemen­ te estas pruebas llevan mucho tiempo y son muy caras. Además, la capacidad de una sustancia para causar cáncer en los roedores no siempre es indicativa de sus efectos en los seres humanos. Después de todo, ¡no somos ratas! En 1974, Bruce Ames creó una prueba simple para evaluar el potencial de las sustancias de provocar cáncer. La prueba de Ames se basa en el principio de que tanto el cáncer como las mu­ taciones son provocados por daños en el DNA y los resultados de los experimentos han demostrado que el 90% de los carcinógenos conocidos también son mutágenos. Ames propuso que la mutagénesis en las bacterias podría servir como un indicador de cárcinogénesis en los seres humanos. La prueba de Ames utiliza cuatro cepas de la bacteria Salmonella typhimurium que posee defectos en la cubierta de lipopolisacáridos, la que normalmente protege a la bacteria de las sustan­ cias químicas del medio ambiente. Además, su sistema de repa­ ración del DNA ha sido inactivado, lo que aumenta su suscepti­ bilidad a los mutágenos. Una de las cuatro cepas utilizadas en la prueba de Ames detec­ ta sustituciones de pares de bases; las otras tres detectan diferen­ tes tipos de mutaciones de cambio del marco de lectura. Cada ce­ pa porta una mutación que la incapacita para sintetizar el aminoá­ cido histidina {his') y las bacterias se siembran en un medio sin histidina (fig. 17-25). Solo las bacterias que hayan sufrido una mutación inversa del gen de la histidina {his~-^his^) serán capa­ ces de sintetizar este aminoácido y crecer en el medio. Se agre-

CONCEPTOS CLAVE El estudio de la capacidad de los agentes mutagénicos para producir mutaciones inversas provee información impor­ tante acerca de cómo los mutágenos alteran al DNA.

Detección de mutaciones mediante ia prueba de Ames Los seres humanos en las zonas fabriles están rodeados por gran cantidad de sustancias químicas producidas de manera arti­

Coadro 17-4

Mutaciones inversas teóricas posibles por varios agentes mutagénicos I n v e r s ió n d e la s m u ta c io n e s p o r

T ip o d e m u tació n

M u tació n

5-brom o u ra c ilo

2 -a m s n O "

purána

Á cid o n itro s o

Hidroxiia m in a

N a ra n ja de a c rid in a

+

+ /-

-

+

-(-

+ /-

-

E t ilm e ta n s u l­ fo n a to

5-bromouracilo

C-C ^ T-A

4-

+

2 -aminopurina

C-C

T-A

+

+

Ácido nitroso

C-C

T-A

+

+

-f

+ /-

-

Etilmetansulfonato

C-C « T-A

+

+

+

+ /-

-

Hidroxilamina

C-C ^ T-A

+

+

+

-

-

-

-

-

-

+

Naranja de acridina

Cambio de marco de lectura

-

Nota: + indica que las m utaciones se invierten, - indica que las m utaciones no se invierten, y +/- indica que solo se invierten alg un as m utaciones. No to­ das las m utaciones son iguainnente probables.

Mutaciones génicas y reparación del DNA 49 gan diferentes diluciones de la sustancia química que se va a analizar en las placas inoculadas con las bacterias, y se com­ para el número de colonias de bacterias matantes que apare­ cen en cada placa con el de las placas control, sin la sustan­ cia (colonias que surgieron por mutación espontánea). Toda sustancia química que aumente en forma significativa el nú­ mero de colonias que aparecen en la placa tratada es muta­ génica y probablemente también sea carcinogénica. Algunos compuestos no son carcinógenos activos, pero pue­ den convertirse en componentes causantes de cáncer dentro del cuerpo. Para hacer que la prueba de Ames sea sensible a este tipo de carcinógenos potenciales, primero se incuba el com­ puesto que se analizará con un extracto de hígado de mamífe­ ro que contiene las enzimas metabólieas. La prueba ha sido aplicada a miles de sustancias químicas y productos comercia­ les. Una demostración de su utilidad fue el descubrimiento, ya en 1975, de que la mayoría de las tinturas para el cabello co­ mercializadas en los Estados Unidos contenían compuestos que eran mutagénicos en las bacterias y que fueron luego eli­ minados de la mayoría de esas tinturas.

Experimento Pregunta: ¿cómo se puede realizar una detección

sistemática rápida de las sustancias químicas para determinar su capacidad para producir cáncer?

Bacterias h is Métodos

O

¡A lg u n a s de las cepas Se m ezclan cepas de |

b acterianas tam bién

bacterias h is ~ c o n en

se m ezclan con las

zimas liep áticas (que

sustancias químicas

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para ser probadas en

de convertir los co m ­

cu an to a su actividad

puestos en mutáge-

m utagénica.

nos potenciales).

CONCEPTOS CLAVE

H

Luego se siei

■

las bacterias placa con m eato ' 1 sin nistiaina,

i,

La prueba de Ames utiliza cepas de bacterias his^ a fin de analizar la capacidad de las sustancias quími­ cas para producir mutaciones his-->his^. C om o hay una correlación estrecha entre la actividad m utagéni­ ca y el potencial carcinogénico, esta prueba es muy utilizada para investigar el potencial de las sustancias para causar cáncer.

|...

Exposición a radiaciones en los seres humanos

Incubación,!

Resultados

Placa control (sin la \ sustancia química) ^

Placa con el tratamiento (con la sustancia química)

Las colonias b acterianas

|

que aparecen en las placas ! han sufrido una m utación

I

his~— *~his+

1

cualquier sustancia química que aumente en forma significativa el número de colonias que apare­ cen en la placa con tratamiento es mutagénica y, por tanto, probablemente también sea carcinogénica.

Conclusión;

Fig. 17-2 5. La prueba de Ames se utiliza para Identificar m utágenos químicos.

Las personas con frecuencia están expuestas a niveles ba­ jos de radiaciones provenientes de fuentes cósmicas, médi­ cas y ambientales, pero además han sucedido hechos trági­ cos que produjeron exposiciones a niveles mucho más altos. El 6 de agosto de 1945, un bombardero norteamericano arrojó una sola bomba atómica sobre la ciudad de Hiroshima, Japón. La explosión arrasó con alrededor de 12 kilómetros cuadrados de la ciudad, mató entre 90 000 y 140 000 personas e hirió casi a otro tanto (fig. 17-26). Tres días más tarde, los Estados Unidos arrojaron otra bomba atómica sobre la ciudad de Nagasaki; esta vez destruyó 4 kilómetros cuadrados de la ciudad y mató entre 60 000 y 80 000 personas. Durante estas explosiones se liberaron enormes cantidades de radiaciones y muchas personas estuvieron expuestas a ellas. Después de la guerra, se realizó un esfuerzo conjunto ja­ ponés-estadounidense para estudiar los efectos biológicos de la exposición a las radiaciones sobre los sobrevivientes de las explosiones atómicas y sus hijos. Se examinaron las mu­ taciones somáticas mediante el estudio de la enfermedad por radiaciones y el cáncer entre los sobrevivientes; en los hijos de personas expuestas a la radiación se evaluaron las muta­ ciones de la línea germinal mediante el estudio de las mal­ formaciones congénitas, las alteraciones cromosómicas y las mutaciones génicas. El genetista James Neel junto con sus colaboradores exa­ minaron alrededor de 19 000 niños cuyos padres estuvieron

494 Capítulo 17

Fig. 17-26. Una bomba atóm ica des­ tru yó Hiroshim a el 6 de agosto de 1945. La explosión atómica produjo muchas mutacio­ nes somáticas entre los sobrevivientes. (Stanley Troutman/AP.)

■■ « r ,

- i

dentro de los 2 000 metros ( 1,2 millas) del centro de la explosión atómica de Hiroshima o de Nagasaki, junto con un número similar de niños cuyos padres no estuvieron expuestos a las radiaciones. Se estimaron las dosis de las radiaciones para los padres de los niños sobre la base de una evaluación cuidadosa de la ubicación de los pa­ dres, la postura y la posición en el momento de la explosión. Se to­ mó una muestra de sangre de cada niño y se realizó una electroforesis en gel para investigar sustituciones de aminoácidos en 28 pro­ teínas. Cuando se detectaron variantes raras, también se analizaron muestras de sangre de los padres para determinar si la variante ha­ bía sido heredada o correspondía a una nueva mutación. De un total de 289 868 genes examinados por Neel y col, solo se encontró una mutación en los hijos de padres expuestos; no se hallaron mutaciones en el grupo control. A partir de estas obser­ vaciones, se estimó una tasa de mutación de 3,4 x 10^® para los niños cuyos padres estuvieron expuestos a la explosión, lo cual está en el espectro de la tasa de mutaciones espontáneas observa­ da en otros eucariontes. Neel y col. también examinaron la fre­ cuencia de mutaciones cromosómicas, las proporciones del sexo de los niños nacidos de padres expuestos y las frecuencias de aneuploidías cromosómicas. En ninguno de estos ensayos hubo evidencia de aumento de mutaciones entre los hijos de las perso­ nas expuestas, lo que sugiere que las mutaciones de la línea ger­ minal no fueron muchas. Los estudios con animales muestran con claridad que la radia­ ción causa mutaciones en la línea germinal; entonces, ¿por qué no hubo un aumento claro en las mutaciones de la línea germinal entre los habitantes de Hiroshima y de Nagasaki? Los padres ex­ puestos sí exhibieron un aumento en la incidencia de leucemia y otros tipos de cánceres, lo que evidencia que se indujeron muta­ ciones somáticas. No se conoce la respuesta a esta pregunta, pe­ ro la ausencia de mutaciones en la línea germinal pudo deberse a que las personas que recibieron las radiaciones más altas murie­ ron inmediatamente después de la explosión. El río Techa en el sur de Rusia es otro de los lugares en los cua­ les la población fue trágicamente expuesta a niveles altos de ra­ diaciones. El centro nuclear de Mayak, localizado alrededor de 100 kilómetros de la ciudad de Cheliabinsk, producía plutonio

para ojivas nucleares en los comienzos de la Guerra Fría. Entre 1949 y 1956, esta planta vertió unos 76 millones de metros cúbi­ cos de lodo radiactivo en el río Techa. Las personas que vivían aguas abajo utilizaban el agua del río para beber y regar los cul­ tivos. Algunos recibieron una dosis de radiactividad equivalente a 1 700 veces la dosis anual considerada segura por los estánda­ res actuales. Varios accidentes nucleares aumentaron aún más la radiación en el área de la planta de Mayak. El peor fue una ex­ plosión de un tanque de almacenamiento de líquido radiactivo en 1957, que esparció la radiación sobre un área de 27 000 kilóme­ tros cuadrados (10 425 millas cuadradas). Aunque las autoridades soviéticas ocultaron información acer­ ca de los problemas de la radiación a lo largo del Techa hasta la década de los noventa, los médicos rusos liderados por Mira Kossenko comenzaron a estudiar en forma silenciosa el cáncer y otras enfermedades relacionadas con la radiación entre los habi­ tantes en la década de 1960. Encontraron que la incidencia glo­ bal de cáncer estaba aumentada en la población que vivía sobre las orillas del río Techa. La mayoría de los datos sobre la exposición a radiaciones en los seres humanos provienen de los estudios profundos de los su­ pervivientes del bombardeo atómico de Hiroshima y de Nagasa­ ki. Sin embargo, los habitantes de estos lugares estuvieron ex­ puestos a un solo pulso intenso de radiación, y estos datos pue­ den no ser apropiados para comprender los efectos de dosis bajas de radiación durante un período prolongado. Hoy en día, los cien­ tíficos norteamericanos y rusos están estudiando a las personas de la región del río Techa, como a las expuestas a la radiación del accidente de Chernobyl (véase la historia al comienzo del capítu­ lo). El objetivo es comprender mejor los efectos de la exposición crónica a las radiaciones sobre las poblaciones humanas.

Reparación del DNA La integridad del DNA está bajo agresión constante por la ra­ diación, los mutágenos químicos y los cambios espontáneos. A pesar de este ataque de agentes nocivos, la tasa de mutación per­

Mutaciones génicas y reparación del DNA 495 manece notablemente baja gracias a la eficiencia con la cual se repara el DNA. Se ha estimado que menos de una de cada mil le­ siones del DNA se convierte en mutación. El resto, se corrigen. Hay muchas vías complejas de reparación del DNA, pero pue­ den enumerarse varios principios acerca de ellas. En primer lu­ gar, la mayoría de los mecanismos de reparación del DNA nece­ sitan la presencia de dos cadenas nucleotídicas porque reempla­ zan los nucleótidos completos para lo cual se requiere una cade­ na molde que especifique la secuencia de bases. La naturaleza complementaria de la doble cadena de DNA no sólo provee esta­ bilidad y eficiencia en la replicación, sino que también permite que cualquiera de las dos cadenas aporte la información necesa­ ria para corregir a la otra. Un segundo aspecto general de la reparación del DNA es la re­ dundancia; es decir, que muchos tipos de daño al DNA pueden ser corregidos por más de una vía de reparación. Esta redundan­ cia certifica la gran importancia de la reparación del DNA para la supervivencia de la célula: asegura que se corrijan casi todos los errores. Si uno escapa a un sistema de reparación, es muy proba­ ble que sea corregido por otro sistema. Consideraremos cuatro mecanismos generales de reparación del DNA; reparación de los errores de apareamiento, reparación directa, reparación por escisión de bases y reparación por esci­ sión de nucleótidos (cuadro 17-5).

Xuadro 17-5

Resumen de los mecanismos de reparación del DNA comur 2 ¿

S is te m a d e re p a ra c ió n

T ip o d e d añ o re p a ra d o

Error de apareamiento

Errores de la replicación, entre ellos las bases mal apareadas y el deslizamiento de las cadenas

Directo

Dímeros de pirimidina; otros tipos específicos de alteraciones

Escisión de bases

Bases anormales, bases modificadas y dímeros de pirimidinas

Escisión de nucleótidos

Daño del DNA que distor­ siona la doble hélice, en­ tre ellos las bases anor­ males, las bases modifica­ das y los dímeros de piri­ midina

Reparador! de los errores de apareamiento La replicación es extremadamente precisa: cada copia nueva los errores de apareamiento debe tener una manera de recono­ de DNA posee sólo un error cada mil millones de nucleótidos. cer entre la cadena vieja y la cadena nueva del DNA, de modo Sin embargo, en ese proceso se incorporan bases mal apareadas que se elimine el error incorporado y no parte de la cadena ori­ al DNA nuevo con una frecuencia de alrededor de 10"^ a 10'^. ginal. Las proteínas que llevan a cabo la reparación de los errores de Por tanto, se corrigen la mayoría de los errores que aparecieron inicialmente de modo que jamás se transforman en mutaciones apareamiento en E. coli diferencian entre las cadenas vieja y permanentes. Algunas de estas correcciones se realizan durante nueva por la presencia de grupos metilos en secuencias especia­ la corrección durante la lectura (proofreading', véase p. 332 en les de la cadena vieja. Después de la replicación, los nucleóti­ cap. 12). La DNA polimerasa tiene la capacidad de reconocer y dos de adenina en la secuencia GATC son metilados por una en­ coiTegir los nucleótidos apareados en forma incorrecta. Cuando zima llamada Dam metilasa. El proceso de metilación está re­ se agrega un nucleótido apareado en forma incorrecta a una ca­ trasado y entonces, inmediatamente después de la replicación, dena de DNA recién sintetizada, la polimerasa se detiene. Lue­ la cadena vieja está metilada y la cadena nueva, no (fig. 17go utiliza su actividad 3’^ 5 ’ exonucleasa para retroceder y ex­ 27a). En E. coli, se necesitan las proteínas MutS, MutL y MutH traer el nucleótido insertado en forma incorrecta antes de conti­ para la reparación de los errores de apareamiento. MutS se une a las bases mal apareadas y forma un complejo con MutL y nuar con la polimerización 5’—>3’. Muchos de los nucleótidos agregados en forma incorrecta que MutH. Se cree que este complejo acerca una secuencia GATC escapan a la detección de la corrección durante la lectura se co­ no metilada muy próximo a las bases mal apareadas. MutH cor­ rrigen por reparación de los errores de apareamiento (véase p. ta la cadena no metilada en el sitio GATC (fig. 17-27b) y las 332 en cap. 12). Las bases apareadas en forma incorrecta distor­ exonucleasas degradan la cadena no metilada desde la muesca sionan la estructura tridimensional del DNA y las enzimas de la hasta las bases mal apareadas (fig. 17-27c). La DNA polimera­ reparación de los errores de apareamiento detectan estas distor­ sa y la DNA ligasa llenan la brecha de la cadena no metilada siones. Además de detectar bases apareadas en forma incorrec­ con nucleótidos que se aparean correctamente (fig. 17-27d). La reparación de los errores de apareamiento en las células ta, este sistema de reparación corrige bucles pequeños de DNA no apareados, como los producidos por deslizamiento de las ca­ eucariontes es similar a la de E. coli, excepto que algunas pro­ denas durante la replicación (véase fig. 17-14). Algunas repeti­ teínas están relacionadas con MutS y otras con MutL. Estas ciones de trinucleótidos pueden formar estructuras secundarias proteínas funcionan juntas en diversas combinaciones para de­ sobre la cadena no apareada (véase fig. 17-6d), permitiéndoles tectar diferentes tipos de errores incorporados, como bases mal escapar a la detección por el sistema de reparación de los erro­ apareadas y bucles pequeños no apareados. Las células euca­ riontes no poseen proteínas relacionadas con MutH de E. coli. res de apareamiento. Una vez reconocido el error incorporado, las enzimas de re­ . No está claro cuál es la enzima que produce la muesca en las cé­ paración de los errores de apareamiento cortan la sección dis­ lulas eucariontes. No se conoce cómo se identifican las cadenas torsionada de la cadena recién sintetizada y rellenan la brecha vieja y nueva en estas células, ya que en algunos eucariontes, con nucleótidos nuevos, utilizando la cadena de DNA original como las levaduras y las moscas de la fruta, no se detecta meti­ como molde. Para que esta estrategia funcione, la reparación de lación del DNA.

496 Capítulo 17 (a)

D

DNA nuevo

I La m etüación

D urante la replicación del i j

en las secuencias G A T C perm ite la diferenciación e n tre

D N A, se ag reg ó una base i

la caden a vieja y la recién sintetizada: in m ed iatam en te después de la re­

mal ap aread a a la c a d e n a .

plicación, la cad en a vieja será m etllada m ientras q u e la nueva c a d e n a no.

nueva.

ca:c

/

DNA viejo (molde)

.........................

Fig. 17-27. Muchos nucleótidos insertados en form a incorrecta que escapan a la corrección durante la lectura son corregidos por repara­ ción de los errores de apaream iento.

Grupo metilo'^ MutL, MutS, MutH (proteínas — reparadoras de los errores de apareamiento) Muesca

^MutH

\

(b)

Grupo metilo

-GATC I La proteína M u tS se un e a las bases m al apareadas i

MutL

sitio del error de ap are am ie n to a la secu encia GATC i

Reparación directa Los mecanismos de reparación directa no reem­ plazan los nucleótidos alterados sino que les devuel­ ven sus estructuras originales (correctas). Uno de los mecanismos de reparación directa mejor caracteriza­ do es la fotorreactivación de los dímeros de pirimidina inducidos por la UV. E. coU y algunas células eucariontes poseen una enzima denominada fotoliasa, que utiliza energía tomada de la luz para romper las uniones covalentes que conectan las pirimidinas en un dímero. La reparación directa también corrige la 0®-metüguanina, un producto de alquilación de la guanina que se aparea con la adenina y produce transversiones G-C-^T-A. Lfna enzima llamada C>®-metilguaninaDNA metiltransferasa elimina el grupo metilo de la 0 ®-metilguanina y restaura la base a una guanina (fig.

y fo rm a un com p lejo con M utH y ÍViutL; se acerca e l :

Muís

m etilada y se identifica la cadena n u e va.

(c)

GATC

Grupo mclilo'

s exonucleasas elim inan los nu cle ó tid o s de ! la caden a nueva q ue se encuentran e n tre la I secuencia G A T C y el sitio de error de apaream iento.

(d)

Bases de DNA GATC

17-28).

i Grupo metilo'

B

Reparación por escisión de bases

Luego la D N A polim erasa reemplaza los nucleótidos, corrigiendo el error de ap aream iento y la D N A ligasa ’ esqueleto de azúcar-fosfato.

En la reparación por escisión de bases, primero se escinden las bases modificadas y luego se reemplaza el nucleótido completo. La escisión de bases modifi­ cadas se cataliza por un grupo de enzimas denomina­ das DNA glucosilasas, cada una de las cuales recono­ ce y extrae un tipo específico de base modificada mediante la ruptura de la conexión que une esa base con el átomo de carbono 1' de la desoxirribosa (fig. 17-29a). La uracil glucosilasa, por ejemplo, reconoce y quita el uracilo producido por la desaminación de la citosina. Otras glucosilasas reconocen a la hipoxantina, la 3-metiladenina, la 7-metilguanina y otras bases modifica­ das. Después de que se ha extraído la base, una enzima llamada endonucleasa AP (apurínica o apirimidínica) corta el enlace fosfodiéster y otras enzimas eliminan a la desoxirribosa (fig. 17-29b). Luego, la DNA polimerasa agrega nucleótidos nuevos al grupo 3^-OH expuesto (fig. 17-29c) y reemplaza una sección de nucleó­ tidos en la cadena dañada. La DNA ligasa sella la muesca en el esqueleto fosfodiéster (fig. 17-29d) y de este modo se restaura la ‘ secuencia intacta original (fig 17-29e). Las bacterias utilizan la DNA polimerasa I en la reparación por escisión, pero los eucariontes utilizan DNA polimerasa (3, que no tiene ninguna capacidad de corrección durante la lectura y tiende

a cometer errores. En promedio, la DNA polimerasa p comete un error por cada 4 000 nucleótidos insertados. Se reparan aproxi­ madamente 20 000 a 40 000 modificaciones de bases por día me­ diante la escisión de bases, de modo que la DNA polimerasa (3 puede introducir hasta 10 mutaciones por día en el genoma hu­ mano. ¿Cómo se corrigen estos errores? Los resultados de la in-

G ------

0^-metiiguanina

Metiltransferasa

G u a n in a

Fig. 17-28. La reparación directa cambia lo s nucleóti­ dos nuevam ente a sus estructuras originales.

Mutaciones génicas y reparación del DNA 49 vestigacióh reciente muestran que algunas endonucleasas AP tie­ nen la capacidad de corrección durante la lectura; la endonucleasa AP 1 (APEl) posee actividad de exonucleasa 3’-^5’ y es ca­ paz de detectar un DNA bicatenario con muesca y un aparea­ miento de forma incorrecta entre las bases. Cuando la DNA polimerasa p inserta un nucleótido con la base incorrecta en el DNA, la DNA ligasa no puede sellar la muesca en el esqueleto de azúcar-fosfato, porque 3’ OH y 5’ P no están en la orientación correc­ ta. En este caso, la APEl detecta el apareamiento incorrecto y uti­ liza su actividad de exonucleasa 3’-^5’ para escindir la base apa­ reada de forma incorrecta. La DNA polimerasa (3 utiliza luego su actividad de polimerasa para llenar el nucleótido fallante. De es­ ta forma, se mantiene la fidelidad de la reparación por escisión de bases.

(a)

Base dañada

DNA

5' o

6

La última vía de reparación que consideraremos será la repa­ ración por escisión de nucleótidos, que elimina lesiones del DNA voluminosas que distorsionan la doble hélice, como los dímeros de pirimidina o hidrocarburos grandes unidos al DNA. La reparación por escisión de nucleótidos es bastante versátil y pue­ de reparar muchos tipos de daños diferentes del DNA. Se encuen­ tra en células de todos los organismos, desde bacterias hasta se­ res humanos y es uno de los mecanismos de reparación más im­ portante. El proceso de escisión del nucleótido es complejo. En los seres humanos, participan gran número de genes. Primero, un comple­ jo de enzimas examina al DNA en busca de distorsiones de su configuración tridimensional (fíg. 17-30a y b). Cuando se detec­ ta una distorsión, otras enzimas separan las dos cadenas nucleotídicas en la región dañada y las proteínas de unión a cadenas simples estabilizan las cadenas separadas (fig. 17-30c). Después, se corta el esqueleto de azúcar-fosfato de la cadena dañada a am­ bos lados de la lesión. Un corte se hace 5 nucleótidos en direc­ ción proximal (en el lado 3') del daño y el otro, 8 nucleótidos (en los procariontes) o desde 21 a 23 nucleótidos (en los eucariontes) en dirección distal (en el lado 5") de la lesión (fig. 17-30d). Se .quita una parte de la cadena dañada (fig. 17-30e) y la DNA poli­ merasa rellena la brecha y la ligasa la sella (fig. 17-30f).

6

p

p

3'

5' É l C ad a enzim a D N A glucosilasa

DNA glucosilasa

reco n o ce y elimina un u p o espe, cífico de base d añad a y genera

o

(b)

i

un sitio apurínico o apirim idínico

I

(sitio AP).

O '-" o

Reparación por escisión de nucleótidos

^

^

3'

3'

:5 s it io A P O

5

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o

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o

^p

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p

AP endonucleasa

p

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La enzim a A P en d o n u cleasa ro m pe la unión fo sfo d ie ste r del lado 5 ' del sitio A P ...

(c)

I

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5' 'NTPs

DNA polimerasa

Desoxirribosa fosfato -h dNMP

-

I p l La D N A polimerasa a g re g a | i p

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Otros tipos de reparación del DNA DNA ligasa

Las vías de reparación del DNA descritas hasta ahora corres­ ponden al daño limitado a una de las cadenas de una molécula de DNA, dejando que la otra cadena se utilice como molde para la síntesis de DNA nuevo durante el proceso de reparación. Sin em­ bargo, algunos tipos de daño del DNA afectan ambas cadenas de la molécula y, por tanto, presentan un desafío mayor para la ma­ quinaria de reparación del DNA. La radiación ionizante produce a menudo la ruptura de la doble cadena de DNA. La reparación de las rupturas de las cadenas dobles suele hacerse por recombi­ nación homologa. Los modelos de recombinación homóloga se describieron en el capítulo 12. Otro tipo de daño que afecta ambas cadenas es la unión cruza­ da intercatenaria, que surge cuando las dos cadenas de un dúplex están conectadas por enlaces covalentes. Las uniones cruzadas intercatenarias son muy tóxicas pai'a las células porque frenan la replicación. Varios fármacos utilizados en quimioterapia, inclui­ dos el cisplatino, la mitomicina C, el psoraleno y la mostaza ni-

i S El e s p a d o en el e s q u e le to de i azúcar-fosfato es se lla d o por la i

D N A lig asa,.......

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0 ' " ' ^ N A nuevo

m

5' D

,y restaura la s e c u e n ­ cia intacta original.

Fig. 17-29. La reparación por escisión de b ase s quita las bases m odificadas y luego las reemplaza por el nu­ cleótido completo.

498 Capítulo 17

K i El d añ o al D N A distorsio-

j

na la con fig u ració n de la

(a)

m olécula.

catenarias. Hay un modelo que propone que se producen rupturas de la cadena doble a cada lado de la unión cruzada y luego son remediadas por las vías que reparan esas rupturas.

DNA dañado

INTEGRACION DE CONCEPTOS

, m

| U n com p lejo enzlm ático recon oce la distorsión que surgió por el daño.

(b)

^

El D N A se separa y las proteínas de unión a las cadenas simples estabili­

(c)

zan la cad en a dañada.

Vía básica de la reparación del DNA Hasta ahora hemos examinado algunos mecanismos diferentes de reparación del DNA. ¿Qué tienen estos métodos en común? ¿En qué se diferencian? La mayoría depende de la presencia de dos cadenas, porque los nucleótidos de la zona dañada se quitan y se reemplazan. Los nucleótidos son reemplazados en los meca­ nismos de reparación de los errores de aparamiento, de repara­ ción por escisión de bases y de reparación por escisión de nucleó­ tidos, pero no en el de reparación directa. Los mecanismos de reparación que incluyen la eliminación de nucleótidos tienen una vía común de cuatro pasos: 1. Detección: reconocimiento de la sección de DNA dañada. 2. Escisión: las endonucleasas de reparación del DNA cortan

I U n a enzim a corta la caden a a am bos lados del daño..

(d)

.. ................\í... ..........

el esqueleto de uniones fosfodiéster a uno o a ambos lados del DNA dañado. 3. Polimerización: la DNA polimerasa agrega nucleótidos al

grupo 3 "-OH recientemente expuesto mediante la utiliza­ ción de la otra cadena como molde y el reemplazo de los nu­ cleótidos dañados (y muchas veces algunos no dañados). 4. Ligamiento: la DNA ligasa sella las muescas en el esque­

leto de azúcar-fosfato.

Una parte de la caden a d añada se e lim in a...

4 -8 2 4 6 Colonias bacterianas en la placa principal

Filtro de nitrocelulosa*

iá i El exceso de la sonda se elimina s por lavado y la membrana se > cubre con una placa radiográfica...!

Sonda marcada con Filtro réplica

K

Membrana ij Placa radiográfica

/ ............. /f...

I Un

disco de nitrocelu­ B Unas pocas células losa u otra membrana ! de cada colonia se se apoya sobre la parte i adhieren a la í nitrocelulosa. superior de las colonias bacterianas.

E l Las células se rompen y su DNA se desnaturaliza v fila al filtro. B

secuencia relacionada. La temperatura y la concentración salina de la reacción de hibridación pueden ajustarse para regular el grado de complementariedad requerido para que tenga lugar el apareamien­ to. De manera alternativa, si ya se aisló la proteína producida por el gen y determinada su secuencia de aminoácidos, pueden crearse sondas sintéticas. Con el uso del código genético y la secuencia de aminoácidos de la proteína pueden deducirse posibles secuencias de nucleótidos de una región pequeña del gen. Si bien solo una se­ cuencia en el gen codifica una proteína particular, la presencia de codones sinónimos implica que la misma proteína podría producir­ se por varias secuencias diferentes de DNA y es imposible saber cuál es la correcta, Para superar este problema se utiliza como son­ da una mezcla de todas las secuencias posibles de DNA. Para re­ ducir al mínimo el número de secuencias requeridas en la mezcla se selecciona una región de la proteína con degeneración relativa­ mente pequeña en sus codones (fig. 18-17). Cuando se ha determinado parte de la secuencia de DNA del gen puede sintetizarse de modo químico un conjunto de sondas de DNA utilizando una máquina automatizada conocida como sintetizador de oligonucleótidos. Las sondas resultantes pueden utilizarse para seleccionar una genoteca para un gen de interés. Otro método de selección de una genoteca consiste en buscar el producto proteico de un gen. Este método requiere que la genoteca sea clonada en un vector de expresión. Los clones pueden probarse para la presencia de la proteína mediante el uso de un anticuerpo que reconoce la proteína o por el empleo de una prueba química pa­ ra evaluar la proteína producida. Este método depende de la existen­ cia de una prueba para la proteína producida por el gen. Casi todos los métodos utilizados en la selección de una genoteca identificarán diversos clones, algunos de los cuales serán po­ sitivos falsos, que no contienen el gen de interés; pueden reque­ rirse varios métodos de selección para determinar cuál de los clo­ nes contiene en realidad el gen.

CONCEPTOS CLAVE Una genoteca puede seleccionarse para un gen específico mediante el empleo de sondas com plementarias que for­ man híbridos con el gen. De manera alternativa, ia genoteca puede clonarse en un vector de expresión y el gen puede localizarse mediante el examen de los clones por la formación de la proteína producto deJ gen.

0

Una sonda marcada se híbrida con cualquier I DNA complementario, i

i

Fig. 18-16. Las genotecas genómica y de cDNA pueden estudiarse con una sonda para encontrar el gen de interés.

/ ..que detecta la H I presencia de la I sonda. I I

La comparación de la membrana'con la placa principal revela las colonías bacterianas que i tienen el DNA de interés.

Paseo cromosómico. Hay muchos genes con funciones impor­ tantes en los que aún no se conoce el producto proteico asociado. Por ejemplo, todavía se desconocen las bases bioquímicas de mu­ chas enfermedades genéticas humanas. ¿Cómo podrían aislarse estos genes? Un enfoque es detenninar primero la localización general del gen en el cromosoma utilizando frecuencias de récombinación derivadas de cruces o pedrigíes (véanse pp. 174-180 en cap. 7). Después de que el gen se ha ubicado en un mapa cro­ mosómico pueden identificarse genes vecinos que ya se han clo­ nado. Con el uso de una técnica denominada paseo cromosómi­ co (fig. 18-18) es posible moverse desde estos genes vecinos al nuevo gen de interés. La base del paseo cromosómico es el hecho de que una genoteca genómica consiste en un conjunto de fragmentos de DNA superpuestos (véase fig. 18-14). Comenzamos con un gen o se­ cuencia de DNA clonados que están próximos al nuevo gen de in­ terés de modo que el “paseo” será tan corto como sea posible. Se utiliza un extremo del clon de un gen vecino (clon A en la fig. 1818) para hacer una sonda complementaria. Esta sonda se utiliza a fin de seleccionar la genoteca genómica para encontrar un segun­ do clon (clon B) que se superpone con el primerp y se extiende en la dirección del gen de interés. Este segundo clon se aísla y pu­ rifica y se prepara una sonda desde su extremo. La segunda son­ da se utiliza para seleccionar la genoteca para un tercer clon (clon C) que se superpone con el segundo. Así, se puede pasear de ma­ nera sistemática hacia el gen de interés un clon a la vez. De este modo se han encontrado cierta cantidad de genes humanos y de otros organismos importantes.

CONCEPTOS CLAVE En el paseo crom osóm ico primero se mapea un gen en relación con un gen clonado con anterioridad. Se utiliza una sonda formada a partir de un extremo del gen c lo n a ­ do para encontrar un clon superpuesto, que luego se u ti­ liza para encontrar otro clon superpuesto. De esta m a n e­ ra es posible que el crom osom a realice un paseo hacia al gen de interés.

Descubrimiento de genes “in silico”. Cada año se logran más y más secuencias de genomas completos (véase cap. 19) y secuencias parciales de muchos organismos se agregan continuamente a las ba-

528 Capítulo 18 Parte conocida de la secuencia del aminoácido

I Codones posibles

CCA GCC CCC CCU

1 GUA GUC GUC CUU

I

TTT i 1

i

í

I

I

I

ACA AUC GAC UGG AAC UAC CAA CCA UUA ACC ACC CAU AAU UAU GAC CCC UUC AGU CCA CCG CUA UCA GGC GCU GUC UCG GUC UCG CCG CUU UGU CCU

i

i ¡V

i

]

I

I í

ACA UGG CAA AUC AAC CAA UCG UUC GUA A C A ACC CAG AAÜ CAG UUU GUC ACC ACC GUC CCA AGU GUU CCC CCC CCU

I CCA CCC GCG GCU

~Y~

Y

Esta secuencia formaría una sonda mejor debido a que ^ UCCCA g AUCAA u GA c UGC■j hay menos degeneración que I I en la secuencia de la izquierda.

i AUCGAuUCCAAuUAuGAc

S

( 2 x 2 x 2 x 2 = I 6 secuencias posibles)

(2

X

2

X

2

= 8 secuencias posibles)

Fig. 18-17. Una sonda sintética puede diseñarse sobre la base del código genético y la se­ cuencia de am inoácidos conocida de la proteína codificada por el gen de interés. Debido a la ambi­ güedad en el código la misma proteína puede ser codificada por varias secuencias diferentes de DNA y de­ ben sintetizarse sondas con todas las secuencias posibles de DNA. Para reducir el número de secuencias que deben sintetizarse se escoge una región del gen con degeneración mínima.

ses de datos de DNA. Con este crecimiento en la información de se­ cuencias la tarea de encontrar genes en la actualidad se realiza no por la clonación génica sino con computadoras de alta velocidad que analizan y buscan bases de datos de DNA. Estos métodos de lo­ calización y caracterización de genes, algunas veces denominados “in silico” se basan en la identificación de secuencias características

asociadas con genes y en la comparación con secuencias de genes conocidos en las bases de datos de DNA. Estos métodos se tratarán con más profundidad en el capítulo 19.

INTEGRACIÓN DE CONCEPTOS Estrategias de clonación

t t S e utiliza una sonda complementaria! i al extremo del don A para encontrar i i la superposición de un don B. |

Clon A

B

Clon B

Se utiliza una sonda comple­ mentaria al extremo del clon B para encontrar la superposición de un don C, ;

t (~Iq ^ (-

I * " I

Se utiliza una sonda comI plementana al extremo ! del clon C para encontrar la superposición de un I clon D que contiene el : gen de interés.

Clon D

Gen clonadocon anterioridad

Dirección del paseo

■Gen de interés

Conclusión: mediante la fabricación de sondas comple­

mentarias a las áreas de superposición entre fragmentos clonados en una genoteca genómica es posible conectar un gen de interés con un gen relacionado mapeado con anterioridad.

Fig. 18-1 8. En el paseo cromosómico se utilizan genes vecinos para localizar un gen de interés.

Todos los experimentos de clonación génica tienen cuatro pa­ sos básicos: 1. Aislamiento de un fragmento de DNA. 2 . Unión del fragmento a un vector de clonación.

3. Introducción del vector de clonación, junto con el fragmen­ to de DNA insertado, dentro de las células del huésped. 4. Identificación de células que contienen la molécula de DNA recombinante. Hemos considerado diversos métodos para llevar a cabo estos cuatro pasos. No hay un procedimiento único para la clonación de un gen sino una variedad de métodos, cada uno con virtudes y defectos. La combinación particular de métodos escogidos para un experimento de clonación se denomina estrategia de clona­ ción (véase cuadro 18-4). Cuando se desarrolla una estrategia de clonación deben tomar­ se en consideración ciertos factores. Éstos incluyen cuánto se co­ noce acerca del gen por ser clonado, el tamaño y la naturaleza del gen y el propósito final del experimento de clonación. El proce­ dimiento para la clonación de un fragmento de DNA pequeño, bien caracterizado por secuenciación, sería muy diferente del de la clonación de un gen grande, mal conocido, para la producción comercial de una proteína. El primer paso en la clonación génica es encontrar el gen o el fragmento de DNA de interés. Hay dos enfoques básicos. En uno

Tecnología de DNA recombinante 529

Cuadro 18-4

Consideraciones en el desarrollo de una estrategia de clonación

Pasos en la clonación génica

Consideraciones

1. A islam iento del frag ­ m ento de DNA

a. b. c. d. e.

2. Unión del fragm ento de DNA al vecto r

a. Tipo del vector de clonación utilizado i. El tamaño del gen ii. El organismo dentro del cual se clonará el gen ii. La necesidad de un mecanismo de selección iv. Si se requiere la expresión v. Eficacia de la transferencia a la célula transferida requerida vi. El propósito de la clonación b. Método de unión del gen al vector i. La simplicidad del método ii. La disponibilidad de los sitios de restricción iii. La necesidad de recuperar el fragmento del vector iv. Si se requiere la expresión V . El propósito de la clonación

3. Transferencia del vec­ tor recombinante a la célula huésped

a. Tipo de! vector de clonación utilizado

4. Identificación de las células que portan la molécula recombinante

a. b. c. d.

El propósito de la clonación, ¿es la expresión requerida? ¿Es necesaria la secuencia completa? ¿Qué se sabe acerca del gen y la proteína (si existe) que codifica? El tamaño del gen ¿Se conoce la localización cromosómica del gen? Tamaño del genoma a partir del cual se aísla el gen

Información conocida acerca del gen Tipo de vector de clonación utilizado Eficacia de la transferencia Propósito de la clonación

puede construirse una genoteca de DNA a partir del genoma o cDNA, y se la puede seleccionar para encontrar el gen de interés. En el otro enfoque primero puede aislarse el gen y luego ser clo­ nado. El enfoque por utilizar depende en gran parte de lo que ya se conoce acerca del gen. ¿Ya fue mapeado? ¿Se dispone de una sonda para la selección? ¿Se conoce la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por el gen? Si se decide hacer y seleccionar una genoteca, el problema si­ guiente es seleccionar la fuente mejor de DNA. ¿Será uná genoteca genómica o una genoteca de cDNA? Si el propósito es clo­ nar el gen en un vector de expresión y producir una proteína, en­ tonces es ideal una genoteca de cDNA. Utilizar una genoteca de cDNA significa que deben excluirse los intrones (que las bacte­ rias no pueden eliminar) y se requerirá menor cantidad de colo­ nias para seleccionar. Por otra parte, si el propósito es examinar las secuencias o los intrones reguladores dentro de un gen, enton­ ces se requiere una genoteca genómica. La próxima decisión importante en el desarrollo de una estra­ tegia de clonación es seleccionar el vector de clonación. La op­ ción depende de ciertos factores:

• La necesidad de la eficacia de la transferencia a las células huésped. Si pueden utilizarse métodos de selección para estu­ diar un número grande de células, entonces puede ser adecua­ da una tasa baja de transferencia; pero si la selección es me­ nos potente o es costosa, puede ser deseable una tasa más alta de transferencia.

• La longitud de la secuencia p or ser clonada. Para una se­ cuencia de solo unos pocos miles de pares de bases de longi­ tud la mejor opción puede ser un plásmido; si se quiere clo­ nar un gen de 35 kb o mucho más largo, se requerirá un cós­ mido.

Una estrategia de clonación también debe tener en cuenta el mejor método para unir el fragmento de DNA y el vector de clo­ nación. Los puntos importantes incluyen aquí la simplicidad y la facilidad del método, la necesidad de retener los sitios de restric­ ción para que el gen extraño pueda recuperarse’a partir del vec­

• El organismo en el cual se clonará el gen. Algunos vectores son específicos para E. coli, mientras que otros son específi­ cos para otras bacterias o para células eucariontes, • Los métodos de selección utilizados para encontrar células que contienen un plásmido con el gen insertado. Se puede re­ querir un vector con marcadores seleccionables para poder identificar las células que contienen el gen. • La necesidad de que se exprese el gen insertado. Si se desea el producto proteico, puede ser necesario utilizar un vector de expresión que contenga un promotor y otras secuencias que aseguren la transcripción y la traducción del gen insertado.

530 Capítulo 18 tor y si 1.a secuencia génica debe unirse a un promotor y otras se­ cuencias reguladoras para asegurar la transcripción. El método escogido para movilizar el vector dentro de la célu­ la huésped suele ser determinado por el tipo de vector; los plásmidos se transfieren a las células bacterianas por transformación, mientras que los fagos y los cósmidos se transfieren mediante la infección viral. El procedimiento para estudiar las células a fin de encontrar las que poseen moléculas recombinantes depende de cuánto se conoce acerca del fragmento clonado, la eficacia de la transferencia y el vector de clonación utilizado. En el cuadro 184 se resumen las consideraciones utilizadas en el desarrollo de una estrategia de clonación.

Utilización de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el DNA Un problema fundamental cuando se trabaja en el nivel mole­ cular es que cada gen es un fragmento diminuto del DNA celular total. Debido a que cada gen es poco común antes de poder estu­ diarlo debe ser aislado y amplificado. Antes de mediados de la década de 1980 el tínico procedimiento disponible para amplifi­ car el DNA era la clonación génica, es decir, la colocación del gen en una célula bacteriana y la multiplicación de las bacterias. La clonación es muy laboriosa y requiere al menos varios días pa­ ra el crecimiento de las bacterias. En 1983 Kary Mullís de Cetus Corporation conceptuó una nueva técnica para amplificar el DNA en un tubo de ensayo. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite amplificar los fragmentos de DNA miles de millo­ nes de veces en el transcurso de unas pocas horas. Puede utilizar-

Cuadro 18-51 Número de copias del fragmen­ to de DN.A en la ampufícadón por PCR N ú m e ro d e cic lo s de PC R (m)

N ú m ero d e c o p ia s b ic a te n a ria s d el DNA o r ig in a l (2 n )

0

1

1

2

2

4

3

8

4

16

5

32

6

64

7

128

8

256

9

512

10

1 024

20

1 048 576

30

I 073 741 824

se con cantidades pequeñísimas de DNA original, incluso una so­ la molécula. La reacción en cadena de la polimerasa ha revolu­ cionado la biología molecular y es hoy una de las técnicas mole­ culares más utilizada. La base de la PCR es la replicación catalizada por una enzima DNA polimerasa que tiene dos requisitos esenciales: 1) un mol­ de de DNA monocatenario a partir del cual puede copiarse una nueva cadena de DNA y 2) un cebador con un grupo 3’-OH al que pueden agregarse los nuevos nucleótidos. Debido a que una molécula de DNA consta de dos cadenas de nucleótidos cada una puede servir como molde para producir una nueva molécula de DNA, la cantidad de DNA se duplica con ca­ da replicación. El punto de partida de la síntesis de DNA en el molde es determinado por la elección de los cebadores. Los ce­ badores utilizados en la PCR son los fragmentos cortos de DNA, de manera típica de 17 a 25 nucleótidos de longitud, que son complementarios a las secuencias conocidas en el molde. Para cada cadena se utiliza un cebador diferente. Para llevar a cabo la PCR se comienza con una solución que in­ cluye el DNA blanco (DNA por ser amplificado), la DNA poli­ merasa, los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatos (dNTP: los sustratos para la DNA polimerasa), los cebadores que son com­ plementarios a las secuencias cortas en cada cadena del DNA blanco y los iones magnesio y otras sales necesarios para que se produzca la reacción. Una reacción en cadena de la polimerasa tí­ pica incluye tres pasos (fig. 18-19). En el paso I una solución de comienzo de DNA se calienta entre 90°C y 100°C para romper los puentes de hidrógeno entre las dos cadenas de nucleótidos y producir así los moldes monocatenarios necesarios. La mezcla la reacción se mantiene a esta temperatura durante sólo uno o dos minutos. En el paso 2, la solución de DNA se enfría con rapidez a una temperatura entre 30 y 65°C y se mantiene así durante un minuto o menos. Si bien durante este intervalo corto las cadenas de DNA no tendrán posibilidad de renaturalizarse, los cebadores podrán adherirse a sus secuencias complementarias en las cade­ nas molde. En el paso 3 la solución se calienta entre 60°C y 70°C, temperatura a la cual la DNA polimerasa puede sintetizar cade­ nas nuevas de DNA mediante el agregado de nucleótidos a los ce­ badores. En el transcurso de unos pocos minutos se producen dos moléculas nuevas de DNA bicatenario por cada molécula origi­ nal de DNA objetivo. " Luego se repite el ciclo completo. Con cada ciclo, la cantidad de DNA objetivo se duplica; de modo que éste aumenta en forma geométrica. Una molécula de DNA aumenta a más de 1 000 mo­ léculas en 10 ciclos de PCR, a más de un millón de moléculas en 20 ciclos y a más de mil millones de moléculas en 30 ciclos (cua­ dro 18-5). Cada ciclo se completa en el término de unos pocos minutos; por tanto, en unas pocas horas se obtiene una amplifica­ ción grande de DNA. Dos innovaciones importantes facilitaron el uso de la PCR en el laboratorio. La primera fue el descubrimiento de una DNA po­ limerasa que es estable a las temperaturas elevadas utilizadas en el paso 1 de la PCR. La DNA polimerasa proveniente de E. coli, utilizada en la PCR original, se desnaturaliza a 90°C. Por esta ra­ zón, en cada ciclo debía agregarse enzima nueva a la mezcla de reacción, lo que produce un retraso considerable en el proceso. Este obstáculo se superó cuando la DNA polimerasa se aisló de la bacteria Thermus aquaticus, que vive en los manantiales de aguas calientes en el Yellowstone National Park (véase fig. 1819). Esta enzima, apodada polimerasa Taq, tiene una notable es­ tabilidad a temperaturas elevadas y no se desnaturaliza durante el paso de separación de la cadena de la PCR; por esto puede agre-

Tecnología de DNA re combinante 531

El DNA se’ calienta a 90“C-100°C i para separar | i las dos cadenas.

I El DNA se enfría rápidamente a 30“C-65°C para permitir que los cebadores monocatenarios cortos se hibriden con sus secuencias complementarias.

Ó j I

La solución se calienta! a 60 °C-70 “C; la | DNA polimerasa i sintetiza cadenas j nuevas de DNA y i que crean dos molé- i culas bicatenarias | nuevas de DNA.

i Se repite el ciclo completo. Cada vez que se repite

el ciclo se duplica la cantidad de DNA diana.

V

[35-

Cebador

DNA nuevo

DNA viejo

Fig. 18-1 9 . La reacción en cadena de la polim erasa se utiliza para am plificar incluso m uestras muy p eq ue­ ñas de DNA. La fotografía representa los manantiales calien­ __ garse a la mezcla al principio del proceso de la PCR y continúa activa durante muchos ciclos. La segunda innovación importante fue el desarrollo de cicladores térmicos automatizados, es decir, máquinas que provocan los cambios de temperatura rápidos requeridos para los diferentes pasos de la PCR. En un comienzo los tubos que contenían la mez­ cla de reacción se trasladaban en forma manual entre baños de agua a temperaturas diferentes, necesarios para los tres pasos de cada ciclo. En los cicladores térmicos automatizados los tubos de reacción se colocan en un bloque metálico que cambia la tempe­ ratura con rapidez según un programa computarizado. En la actualidad la reacción en cadena de la polimerasa se uti­ liza con frecuencia en lugar de la clonación génica, pero tiene va­ rias limitaciones. Primero, el uso de la PCR requiere el conoci­ miento previo de por lo menos parte de la secuencia del DNA ob­ jetivo para permitir la construcción de cebadores. Por consiguien­ te, la PCR no puede utilizarse para amplificar un gen que no ha sido secuenciado, al menos en parte. Segundo, la capacidad de la PCR de amplificar cantidades de DNA sumamente pequeñas de­ termina que la contaminación sea un problema importante. Las cantidades diminutas de DNA provenientes de la piel del perso­ nal del laboratorio e incluso en las partículas pequeñas presentes en el aire pueden ingresar en un tubo de reacción y amplificarse

tes en el Yellowstone National Park, el hábitat de Thermus aquaticus, la fuente de la enzima Taq utilizada en la PCR. (Fo­ tografía: Corbis.)

junto con el DNA objetivo. Para sortear este inconveniente se re­ quiere una técnica de laboratorio cuidadosa y al uso de controles. Una tercera limitación de la PCR es la exactitud. A diferencia de otras DNA polímeras as, la polimerasa Taq no tiene capacidad de corrección (véase p. 332 en cap. 12) y, en las condiciones de PCR estándares, incorpora un nucleótido incon'ecto cerca de una vez cada 20 000 pb. Las DNA polimerasas con capacidad de co­ rrección suelen incorporar un nucleótido incorrecto cerca de una vez cada mil millones de pares de bases. Para muchas aplicacio­ nes la tasa de error producida por la PCR no constituye un pro­ blema porque solo unas pocas moléculas de DNA de los miles de millones producidas contendrán un error. Sin embargo, para otras aplicaciones como la clonación de productos de PCR la tasa de error relativamente elevada de PCR puede plantear problemas significativos. Se han aislado DNA polimerasa nuevas termoestables con capacidad de corrección que brindan resultados de PCR más precisos. Una cuarta limitación de la PCR es que el tamaño de los fragnlentos que pueden amplificarse por la polimerasa Taq estándar suele ser menor de 2 000 pb. Mediante el empleo de una combi­ nación de la polimerasa Taq y una DNA polimerasa con capaci­ dad de corrección y la modificación de las condiciones de la reac­ ción, los investigadores lograron extender lá amplificación por

532 Capítulo 18 (a )

Análisis de las secuencias de DNA Además de la clonación y la amplificación del DNA las técni­ cas moleculares se utilizan para analizar las moléculas de DNA mediante la determinación de sus secuencias y una investigación de sus funciones. Secuenciación del DNA. Una técnica poderosa que surge de la tecnología de DNA recombinante es la capacidad de secuenciar con rapidez las moléculas de DNA. La secuenciación del DNA consiste en determinar la secuencia de bases en el DNA; permite leer la información genética en el DNA, lo que proporciona una información enorme acerca de la estructura y la función del gen. Los detalles de la secuenciación del DNA se describen en el ca­ pítulo 19.

Fig. 18-20. Con la hibridación in situ, las sondas de DNA se utilizan para determ inar la localización celular o cromosóm ica de un gen o su producto, (a) Una sonda con fluorescencia verde es específica del cromosoma X, una sonda con fluorescencia roja es específica para el cromosoma Y y una sonda con fluorescencia azul es específica del cromosoma I 8. Las sondas indican que esta célula tiene cromosomas sexuales XXXY y dos copias del cromosoma 18. (b) En la hibridación in si­ tu se utilizan para detectar la presencia de mRNA a partir del gen tailless en un embrión de Drosophila. El mRNA tailless se concen­ tra en ambos extremos del embrión y se requiere para el desarro­ llo adecuado. (Parte a, cortesía de Patrick Daniel Storto. Department of Pediatrics and Human Development, Michigan State University; parte b,

Hibridación in situ. Las sondas de DNA pueden utilizarse pa­ ra determinar la ubicación cromosómica de un gen o la localiza­ ción celular de un mRNA en un proceso denominado hibrida­ ción in situ. El nombre deriva del hecho de que el DNA o el RNA se visualizan mientras se encuentran en la célula (in situ). Esta técnica requiere que las células estén fijas y los cromosomas es­ parcidos en un portaobjetos. Así, los cromosomas se exponen du­ rante un corto período a una solución con pH elevado, que rom­ pe el apareamiento de las bases de DNA y permite el acceso a las sondas. Se agrega una sonda marcada que se fija a todas las se­ cuencias complementarias de DNA. El exceso de la sonda se eli­ mina por lavado y se detecta la ubicación de la sonda fijada. En un principio las sondas se marcaban en forma radiactiva y se de­ tectaban por autorradiografía, pero en la actualidad muchas son­ das están adheridas a colorantes fluorescentes que pueden obser­ varse en forma directa por microscopia (fig. 18-20a). Es posible utilizar de modo simultáneo varias sondas con colorantes que emiten fluorescencias de colores distintos para investigar secuen­ cias o cromosomas diferentes. La hibridación in situ también puede utilizarse para determinar la distribución en los tejidos de moléculas de mRNA específicas, lo que sirve como fuente de conocimiento acerca de cómo la ex­ presión del gen diñere entre los tipos celulares (fig. 18-20b). Una sonda de DNA o RNA marcado complementaria de una molécu­ la de mRNA específica se agrega al tejido y la localización de la sonda se determina mediante autoiradiografía o marcación fluo­ rescente.

cortesía de L. Tsuda.)

PCR a fragmentos más grandes. A pesar de sus limitaciones la PCR se utiliza de manera habitual en una amplia gama de aplicaciones moleculares.

CONCEPTOS CLAVE La reacción en cadena de la polim erasa es un método enzimático, in vi tro, destinado a am plificar el DNA con rapi­ dez. En este proceso el DNA se calienta para separar las dos cadenas, los cebadores cortos se adhieren al DNA objetivo y la DNA polimerasa sintetiza cadenas de DNA nuevas a partir de los cebadores. Cada ciclo de PCR du­ plica la cantidad de DNA.

Footprinting del DNA. Muchas secuencias de DNA importan­ tes actiian como sitios de fijación para las proteínas; por ejemplo, las secuencias consenso en los promotores son a menudo los si­ tios de fijación para los factores de transcripción (véase cap. 13). Una técnica denominada footprinting del DNA puede utilizarse para determinar las secuencias de DNA fijadas a estas proteínas. En un experimento típico de footprinting del DNA los frag­ mentos de DNA purificados están marcados en un extremo con un isótopo de fósforo radiactivo, Se utiliza una enzima o sus­ tancia química que realiza cortes en el DNA para escindir el DNA al azar en subfragmentos, que luego se desnaturalizan y separan por electroforesis en gel. Las posiciones de los subfragmentos se visualizan por autorradiografía. Este procedimiento se lleva a ca­ bo tanto en presencia como en ausencia de una pro teína de fija­ ción al DNA particular. Cuando la proteína está ausente, la esci­ sión es aleatoria a lo largo del DNA, lo que produce una escale­ ra “continua” de bandas en la autorradiográfía (fig. 18-21). Cuan-

Tecnología de DNA recombinante 533

Experimento secuencias de DNA unidas por una proteína?'

Métodos

CONCEPTOS CLAVE

Un fragmento de DNA purificado marcado en un extremo con ^^P..

La hibridación in situ puede utilizarse para visualizar la localización crom osóm lca de un gen o para determ inar la distribución tisular de un mRNA transcripto de un gen es­ pecífico. E| footprinting del DNA se utiliza para d eterm i­ nar las secuencias a las que se adhieren las proteínas de fijación al DNA.

32p

Q

.. .está unido con firme-! za por una proteína de i ! fijación al DNA. ;

K 1 El DNA se corta en i localizaciones al azar B

Los fragmentos son- Ausencia de escisión i separados por elec-i en el área protegida troforesis en gel. I por la proteína de

fijación al DNA 32p

^

32p 32p 32p 32p 32p 32p 32p 32p 32p 32p 32p

Resultados

I Las posiciones de los fragmen­ tos con en el gel se revelan por autorradiografía.

Parte superior del gel

.A Q

lla) en la escalera de las bandas (véase fig. 18-21) y la posición del “footprint” identifica los nucleótidos fijados de modo intenso por la proteína.

Debido a que no hay escisión en el área protegida por la proteína aparece una brecha en la escalera de bandas.

« : el “ footprint" íbrecha) en la bandas revda unieron por la proteína.

Fig. 18-2 1. Footprinting de DNA para determ inar las secuencias de DNA que están unidas por proteínas. do la proteína está presente, se fija a nucleótidos específicos y protege sus enlaces fosfodiéster de la escisión. Por consiguiente, no hay cortes en el área protegida por la proteína y no aparecen fragmentos de terminación marcados en el sitio de fijación en la autorradiografía. Su omisión deja un intervalo o “footprint” (hue­

Mutagénesis. Una manera eficaz de estudiar la función del gen es crear mutaciones en localizaciones específicas en un proceso denominado mutagénesis dirigida y estudiar entonces los efec­ tos de estas mutaciones en el organismo. Se han desarrollado varias estrategias para la mutagénesis diri­ gida. Una de ellas consiste en recortar una secuencia corta de nu­ cleótidos con enzimas de restricción y reemplazarla con un oligonucleótido sintético corto que contiene la secuencia matada de­ seada (fig. 18-22). El éxito de este método depende de la dispo­ nibilidad de sitios de restricción que flanquean la secuencia por ser alterada. Si no se dispone de sitios de restricción adecuados, puede uti­ lizarse la mutagénesis dirigida por un oligonucleótido (fig. 1823). En este método se produce un oligonucleótido monocatenario que difiere de la secuencia blanco en una o algunas bases. Por esto, el DNA blanco y el oligonucleótido se aparearán en condi­ ciones adecuadas. Cuando se aparea en forma exitosa con el DNA blanco el oligonucleótido puede actuar como un cebador para comenzar la síntesis de DNA, que produce una molécula bicatenaria con un error de apareamiento en la región del cebador. Cuando este DNA se transfiere a células bacterianas las bases apareadas en forma errónea serán reparadas por las enzimas bac­ terianas. Cerca de la mitad de las veces las bases normales serán cambiadas por bases mutantes y más de la mitad de las bases mutantes serán trocadas por bases normales. Luego, se realiza una selección bacteriana para detectar la presencia del gen mutante.

CONCEPTOS CLAVE Es posible introducir mutaciones particulares en sitios es­ pecíficos dentro de un gen por medio de m utagénesis di­ rigida y mutagénesis dirigida por un oligonucleótido.

Animales transgénicos. Los ovocitos de los ratones y otros mamíferos son lo bastante grandes como para que el DNA pue­ da inyectarse en ellos en forma directa. Enseguida después de la penetración por el espermatozoide un óvulo de ratón fertilizado contiene dos pronúcleos, uno del espermatozoide y uno del óvuló; más tarde estos pronúcleos se fusionan para formar el núcleo del embrión. Los dispositivos mecánicos pueden manipular agu­ jas de vidrio huecas, muy finas, para inyectar el DNA directa­ mente en uno de los pronúcleos de un óvulo fertilizado (fig. 1824). De manera típica se inyectan unos pocos cientos de copias

534 Capítulo 18 Fig. 18-22. En la m utagénesis dirigida la s enzimas de restric­ ción cortan y separan una secuencia corta de nucleótidos que e s reemplazada por una secuencia de DNA mu­ lada sintética.

Una corta de nucleótidos es cortada y separada...

por una secuencia [ sinsintética que contiene bases mutadas.j

CT^j. Cen^' i Endonucleasas ‘ de restricción DNA de! plásmido recombinante

de DNA lineal clonado en un pronúcleo y, en algunos de los óvulos inyectados, las copias del DNA clonado se integran al azar en uno de los cromosomas mediante un proceso denomina­ do recombinación no homologa. Después de la inyección los ..'Secuencia diana |Se crea un oligonucleótido que difiere deja secuencia diana en un solo nucleótido.

- CCfiCA S'

3'

Bases mal apareadas f l S e aparean el oligo­ nucleótido y la ! secuencia de DNA ! diana.

a

H El oligonucleótido esj ¡ un cebador para la i ( síntesis de DNA... i

S:: c% :3 § l

Q ...que produce una mole;:-J cula con un solo par apa­ reado de manera err

El DNA se transfiere a las células bacterianas y las bases mal apareadas se reparan por enzimas bacterianas.

c-

Plásmido con la secuencia original

y reemplazada Hyre

I Cerca de la mitad de los piásmidos tendrá la secuencia original y la otra mitad tendrá la secuencia alterada.

B Las bacterias son luego Plásmido con la secuenciai i seleccionadas por la presencia del gen alterado. alterada

Fig. 18-23. La mutagénesis dirigida por oligonucleóti­ do se utiliza para estudiar la función del gen cuando no están disponibles los sitios de restricción adecuados.

:0NAHgasa

El plásmido contiene el gen con la secuencia mulada

embriones se implantan en una hembra seudopreñada; una ma­ dre sustituta preparada en forma fisiológica para el embarazo por apareamiento con un macho vasectomizado. Solo alrededor del 10 al 30% de los óvulos sobreviven y, de és­ tos, solo algunos tienen una copia del DNA clonado integrado en forma estable en un cromosoma. No obstante, si se inyectan e im­ plantan varios cientos de embriones hay buena posibilidad de que nazcan uno o más ratones cuyos cromosomas contienen el DNA extraño. Además, debido a que el DNA fue inyectado en estadio unicelular del embrión, estos ratones suelen portar el DNA clo­ nado en todas las células de su cuerpo, incluso en sus gélulas re­ productoras y, por consiguiente, pasará el DNA extraño a su pro­ genie. A través del intercruzamiento puede crearse una cepa de ratones homocigóticos para el gen extraño. Se dice que los ani­ males alterados en forma permanente de esta manera son iransgénicos y el DNA extraño que portan se denomina transgén. Se ha demostrado que los ratones transgénicos son útiles en el estudio de la función del gen. Por ejemplo, la. prueba de que el gen SRY (véase cap. 4) es el gen determinante del macho en los ratones se obtuvo mediante la inyección de una copia del gen SRY en embriones XX y por la observación de que estos ratones se de­ sarrollaron como machos. Además, se crearon cepas de ratones transgénicos que sirven como modelos experimentales para las enfermedades genéticas humanas mediante la inyección de co­ pias mutadas de genes en los embriones de ratón. Ratones con desactivación génica (“knockout”). Una varian­ te muy útil del enfoque transgénico consiste en producir ratones en los cuales se ha desactivado un gen normal. Los fenotipos de estos animales, denominados ratones con desactivación génica o “knockout”, ayudan a los genetistas a determinar la función de un gen. La creación de estos ratones comienza cuando se clona un gen normal en las bacterias y luego se lo “noquea” o desacti­ va. Existen ciertas maneras de desactivar un gen, pero un método común es insertar un gen denominado neo, que confiere resisten­ cia al antibiótico G418, en el medio del gen objetivo (fig. 18-25). La inserción de neo rompe (noquea) el gen blanco y proporciona un marcador conveniente para el encuentro de copias del gen de­ sactivado. Además, se clona un segundo gen, por lo general el gen timidinacinasa {tk) viral del herpes simple, adyacente al gen deteriorado. Luego, el gen desactivado se transfiere a cultivos de células embrionarias de ratón donde puede intercambiar' los luga­ res con la copia cromosómica normal por medio de recombina­ ción homóloga. Después de transferir el gen desactivado a las células embrio­ narias las células se seleccionan mediante el agregado al medio de cultivo del antibiótico G418. Solo sobrevivirán las células con el gen desactivado que contenga la inserción neo. Dado que la

Tecnología de DNA recombinante 535 Fig. 18 - 2 5 . Los ratones con desactivación génica (knockout) poseen un genom a en el cual se elim inó la funcionalidad de un gen. ^ Experimento

Pregunta: ¿cómo puede determinarse una función de un gen determinado?

Métodos Gen objetivo

X

neo^ r t i Los ratones se aparean y los óvulos fertilizados son extraídos de los ovi­ ductos del ratón hembra)

f/c+

neo+

a

Óvulo fertilizado

Células madre embrionarias proven ientes/\^ dei ratón I negro

Pronúcleos I El DNA extraño se inyecta en uno de los pronucleos.

Aguja de inyección Pipeta para la aspiración

tados en una hembra seudopreñada.

Se desactiva la tuncionalidad de un gen normal mediante la inserción ! del gen neo+. El gen f/í+ es clonado adyacente al gen diana y...

\

Secuencia transferida

I Los embriones son implan­

D

weo+

Q ... el gen no funcional es trans' ferido a las células madre de i embrión de ratón...

X Cromosoma del ratón

Gen diana

...donde la copia desactivada se recombina con el gen normal i en el cromosoma del ratón.

I

Recombinactónj homologa ! ^ neo+

Descendencia

-

'- r /

v v

Células de ratón neo^,

Ú

Las crías se estudian para j detectar la presencia del | =¡ transgén introducido. j

Embrión de ratónblanco

f

D Las células crecen en un medio j que contiene el antibiótico G418 y ganciclovir; no sobrevii ven las células que recibieron el i gen neo+ por recombinación í homologa. E l Las células que contienen un gen i neo+ desactivado son luego inyectadas en los estadios emono! narios tempranos deI raton... H ...que son implantados en un . ratón hembra seudopreñada. B

X

B

La progenie multicolor contiene una mezcla de células normales y células con gen desactivado.

c

Se cruzan ratones que portan el gen para producir una cepa homocigótica de ratones para el gen extraño.

A Fig. 18-24.

l o s anim ales transgénicos tienen genomas que han sido alterados en form a perm anente por tec­ nología de DNA recombinante. En la fotografía se observa la

inyección de un embrión de ratón (rojo y azul) con DNA. (Fotogra­ fía: Chad Davis/PhotoDisc.)

Luego, se entrecruzan ratones multicolores y producen alguna progenie homocigota para el gen activado.

Conclusión: a través de este procedimiento se producen ratones que no contienen ninguna copia funcional del gen, es decir, el gen es desactivado. El fenotipo de los ratones con desactivación génica (knockout) revela la función del gen.

¡

536 Capítulo 18 frecuencia de recombinación no homologa es más alta que la de la recombinación homologa y porque el gen blanco intacto sólo es reemplazado por la copia desactivada a través de la recombinación homologa se requiere una manera para seleccionar los recombinantes homólogos más raros. La presencia del gen tk viral torna a las células sensibles al ganciclovir. Así, las células transfectadas que crecen en el medio con G418 y ganciclovir contendrán el gen neo (el gen blanco desactivado) pero no el gen tk adyacente. Estas células contienen los recombinantes homólogos deseados. Los recombinantes no homólogos (inserciones aleatorias) contendrán tanto los genes neo como tk y estas células transfectadas morirán en el medio de selección debido a la presencia del ganciclovir. Las células supervivientes se inyectan en un embrión de estadio tem­ prano de ratón que es implantado entonces en una hembra de ra­ tón seudopreñada. Las células en el embrión que portan el gen de­ sactivado y las células embrionarias normales que portan el gen de tipo silvestre se desarrollan juntas y producen una quimera, un ra­ tón que es una mezcla genética de los dos tipos celulares. Los ra­ tones quiméricos pueden identificarse con facilidad si las células embrionarias inyectadas provienen de un ratón negro y los em­ briones en los cuales se inyectan provienen de un ratón blanco; las quimeras resultantes tendrán un pelaje multicolor negro y blanco. Las quimeras pueden entonces ser intercruzadas para producir al­ guna descendencia que es homocigótica para el gen desactivado. En estos ratones homocigóticos pueden observarse los efectos de la desactivación de un gen particular.

CONCEPTOS CLAVE Los ratones transgénicos son producidos por inyección de DNA clonado en el pronúcleo de un óvulo fertilizado, seguido por la implantación de éste en un ratón hembra. En los ratones con desactivación génica (l