Flores de Bach

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN
Facultad de Medicina




"DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD DEL EXTRACTO ACUOSO DE Erythrina falcata
(PISONAY) EN POLIMORFONUCLEARES"


Plan de Tesis presentado por:


CLAUDIA PAOLA ZAVALA CORNEJO




Arequipa – Perú
Enero - 2004
PROYECTO DE TESIS

1. Título
Determinación de la toxicidad del extracto acuoso de Erythrina falcata
(pisonay) en Polimorfonucleares.


2. Autor
Claudia Paola Zavala Cornejo


3. Asesor
Mg. Jorge Ballón Echegaray M.D.


4. Justificación


La medicina tradicional ha persistido a lo largo del tiempo, siendo
una de las más ricas y fascinantes herencias culturales del Perú. En
la actualidad, a pesar de los avances científicos en el ámbito de la
salud, millones de personas, principalmente en el ámbito rural, acuden
a los "curanderos" o "chamanes" para aliviar sus sufrimientos,
angustias y enfermedades.


Para el prestigioso médico e investigador Fernando Cabieses es
importante, de parte del Estado e instituciones privadas, rescatar y
mantener el legado de esa primigenia alternativa de curación, porque
entre otras bondades, guarda "un prodigioso conocimiento terapéutico
sobre las plantas medicinales de la Costa, Sierra y principalmente de
la Selva del país", que podrían "aliviar y curar a millones de
personas"(18).


Asimismo, hay un gran interés a nivel mundial, por la búsqueda de
nuevas alternativas terapéuticas, basándose muchas investigaciones en
el estudio de diversos recursos que la medicina tradicional ofrece.


Dentro de la gran variedad de plantas medicinales, tenemos al género
Erythrina, el cual viene siendo estudiado en varias de sus especies,
arrojando reportes de diversas potencialidades, como por ejemplo:
actividad "citostática" (12, 13, 14) que podría abrir nuevos
horizontes en el campo de la investigación oncológica (5, 7),
capacidad antiinflamatoria, antimicrobiana (siendo usado en heridas),
analgésica, anticonvulsivante, (2, 3, 5, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 17,
19, 21, 22, 23, 25, 27, 30, 32) entre otras; pese a esto, aún se
desconocen la totalidad de principios activos y sus mecanismos de
acción. En nuestro país, tenemos al pisonay (Erythrina falcata); que
crece en toda la selva amazónica y en los valles de nuestra sierra con
clima templado; su corteza es utilizada por nuestros compatriotas en
la capital Incaica para fines "profilácticos tardíos" (contraceptivos)
(3, 14, 21). Dicho efecto fue estudiado (2, 5, 12, 13, 14),
encontrándose que el pisonay estaría actuando a nivel de ciclo
celular, pero no se ha determinado aún el mecanismo de acción.


Si bien es cierto, los reportes encontrados de las diferentes especies
de este género son exitosos, aún hay muchos estudios por realizar,
pues no se ha determinado el mecanismo de acción, ni sus efectos
adversos. Por ello es necesario realizar estudios que permitan
determinar si los riesgos de la aplicación de estos productos son
menores que los "beneficios" que conllevan su utilización. Así el
presente estudio busca determinar el índice de toxicidad del pisonay
en células eucariontes por lo que utilizaremos un modelo con
Polimorfonucleares (PMNs).


5. Marco Teórico


5.1 Erythrina falcata (pisonay).


El género Erythrina (Familia: Fabaceae) (2, 3, 5, 7, 8, 11, 12, 13,
14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32) tiene 108
especies de Erythrinas distribuidas en casi toda América, se les ha
encontrado desde las pampas Argentinas, al sur, hasta los EE.UU, al
norte; siendo las especies que más destacan, E. falcata, E. crista-
galli, E. mulungu.
El nombre de Erythrina proviene del vocablo griego "Erythros" que
significa rojo, atribuyéndole el nombre por las flores que son de un
color rojo escarlata.
En nuestro país, el genero Erythrina se encuentra ampliamente
distribuido en toda la selva amazónica y en los valles de nuestra
sierra con clima templado.
Erythrina falcata es también conocida como "pisonay", "ceibo" o "ceibo
de Jujuy", es un árbol ornamental, que mide aproximadamente entre 10 a
20 m de altura, con un tronco corto y más o menos erecto, con
aproximadamente 150cm de diámetro (19, 21, 27). Presenta una corteza
pardo grisácea, la que se encuentra finamente agrietada en el tronco
pero lisa y con lentécelas horizontales en las ramas. Este árbol posee
una copa muy alta, globosa, irregular, formada por ramas gruesas
extendidas y quebradizas, con hojas caducas o sub-persistentes,
alternas, pinati compuestas, formadas por tres foliolos, anchamente
elipsoidales de 10 a 20 cm. Los foliolos llevan a veces un aguijón
blando que sale desde el nervio medio y dos nectarios en la inserción
de cada foliolo. Flores vistosas, dispuestas en densos y grandes
péndulos arracimados, de color rojo escarlata, sin aroma. El fruto es
una vaina fusiforme y comprimida. Las semillas son aplanadas y
redondeadas, de hasta 2cm de diámetro. (8)
El género Erythrina contiene entre sus componentes una gran gama de
alcaloides entre los que destacan los del grupo curare y los del grupo
erythrina (3, 5, 7, 15, 22, 25, 31, 32) usados como analgésicos, y
miorelajantes.
Este grupo de alcaloides, a la fecha, está dividido en los subgrupos
eritroidina y erisopina, identificándose y clasificándose algunos de
los siguientes compuestos:





































Entre los usos medicinales que se le atribuye al género Erythrina
están: En bálsamo se utiliza como astringente, analgésico, hipnótico
(3, 7, 11, 20); como colutorio, la infusión de semillas; y en nuestro
medio, por los pobladores del Valle Sagrado de los Incas, como
anticonceptivo, ingiriendo el extracto acuoso de la corteza después
del coito (3).
Las hojas son empleadas como antihemorroidal de uso externo; como
antiséptico y astringente, y para afecciones hepáticas, la corteza del
tallo; narcótico, las hojas, flores y corteza del tallo; para teñir la
lana y el algodón; las flores; en esculturas, tarugos, balsas, ruedas.
(3, 19, 21, 23, 27). La decocción de la corteza del ceibo (E. crista-
galli) es utilizada para el lavado de heridas, llagas, hemorroides,
"granos"; limpia las putrefacciones y acelera la restauración de los
tejidos afectados. En forma de colutorios, también se usa dicho
cocimiento para curar las heridas, llagas de la garganta y la boca. En
baños de vapor se utiliza en dolores reumáticos, lumbago, ciática,
artritis, gota. (8, 11, 17, 21, 27).
Se atribuyen a la especie E. variegata var. Orientales incluso acción
antineoplásica contra leucemias linfoides en ratones y a E. suberosa
actividad antineoplásica no especificada (7).
Como vemos, algunas utilidades se superponen en relación a la
estructura utilizada, por ejemplo se utiliza la corteza y las hojas
como antihemorroidales, lo cual hace pensar que los compuestos activos
que permiten tales acciones se encuentran distribuidos en casi todas
las partes de la planta sino en todas.
Entre las especies de Erythrina estudiadas tenemos a E. crista-galli
en la que se han identificado los siguientes compuestos: (7, 15, 22,
25, 32)
En ni (corteza): hipaforina; eritratina, eritralina, eritramina;
un alcaloide no identificado y erisonina.
s (semilla): erisopina, erisodina; erisovina; ácidos cáprico,
láurico, mirístico, palmítico, esteárico, araquidónico, oleico,
linoleico y eicosénico.
fl (flor): cinanidín-3-fosforósido, cianidín-3-glucósido,
pelargonidín-3-glucósido.
h (hoja): n-nororientalina, erybidina, eritrinina, cristamidina,
erisotrina


Otras sustancias reportadas en otras especies como E. verna-vell, E.
coralloides entre otras incluyen: eritracina, eritrina,
eritrocoraloidina, eritrinina, eritralina, 8-oxo-α-eritroidina, α-
eritroidina, β-eritroidina, erisodina, 8-oxo-eritralina y cristamidina
y algunos esteroides. (7, 15, 22, 27)
Inclusive, se llega a la identificación bioquímica de subespecies por
la similitud macroscópica de dichas plantas. (31, 32)
Una vez más, recordamos que la lista anterior no es exclusiva en el
sentido de la localización de uno u otro compuesto, puesto que otros
reportes hallados asignan un compuesto a otra o a varias estructuras.


5.2 Citotoxicidad (9, 24, 28)

La citotoxicidad conocida como la causante de la muerte celular y/o de
daño, que se traduce en una alteración, disminución o inhabilidad de
seguir realizando en forma adecuada las funciones primarias para las
que está diseñada la célula y por lo tanto expresada en la
modificación de patrones bioquímicos-biofísicos y/o morfológicos (33).
La viabilidad celular, proliferación celular y muchas funciones
importantes de células vivas incluyendo apoptosis, adhesión celular,
quimiotaxis, resistencia a drogas, secreción y transducción de
señales; pueden ser estimuladas o monitorizadas con varios reactivos
químicos y biológicos; muchos de estos procesos llevan a cambios en
radicales intracelulares, concentración de iones libres o potenciales
de membrana que pueden ser seguidos con indicadores apropiados. A
continuación mencionamos algunos métodos para determinación de la
citotoxicidad:

a. Determinación de Viabilidad por Azul de Tripan:

El azul de tripan es un colorante vital, su reactividad se basa en
el hecho de que está cargado negativamente y no interactúa con la
célula a menos que la membrana esté dañada; así todas las células
que excluyan el colorante, están viables; mientras que las pintadas
están muertas. El azul de tripan tiene afinidad mayor por las
proteínas séricas que por las celulares.
Así el índice de viabilidad, está determinado por:



b. Determinación de Funcionalidad:

La determinación de ingestión y muerte intracelular de levaduras
por leucocitos PMN tiene por finalidad medir la capacidad funcional
fagocítica de estas últimas.
Esta determinación requiere la incubación de PMN, adheridos a
láminas de vidrio, con levaduras vivas (en proporciones adecuadas)
en presencia de factores opsónicos termoestables (IgG específica) y
termolábiles (C3b) del plasma del paciente que facilitan la
adherencia e ingestión de las levaduras por los leucocitos PMN.
Posteriormente se observa al microscopio de luz contando un total
de 100 células que hayan fagocitado, anotando por separado las
levaduras azules (muertas) y las refringentes (vivas) en cada
célula fagocítica, previa coloración con azul de metileno.
Determinando de esa manera el índice fagocítico y el porcentaje de
muerte, de la siguiente manera:










c. Estudio de la citotoxicidad en linfocitos humanos
Este método mide el flujo del ADN y de la LDH de los linfocitos en
su medio circundante como un indicador de citotoxicidad. Este
método también incluye un análisis de diaforesis intracelular
(mitocondrial) como medida de la actividad celular (test MTT).


d. Uso de la permeabilidad de membrana como una medida de
citotoxicidad en cultivo de células perfundidas.
La permeabilidad de la membrana de cultivos de células perfundidas
determinada por el flujo de [3H]-2 deoxi D glucosa 6 Fosfato es
usada como un indicador del efecto citotóxico de los químicos.


e. Test de citotoxicidad en HEL-30
La capacidad de los cultivos celulares para sintetizar proteínas es
usado para evaluar el efecto del compuesto estudiado sobre la
competencia anabólica celular.


f. Test de citotoxicidad con azul renacido
El efecto citotóxico de las sustancias químicas sobre las células
en cultivo es medida mediante el cambio en el incremento de
proteínas en las células derivado de la inhibición de la
proliferación celular.


g. Citotoxicidad y genotoxicidad en cultivos primarios de
hepatocitos humanos.
Este test determina el efecto citotóxico, genotóxico de los
compuestos en cultivos de hepatocitos humanos, mediante la medida
de la viabilidad celular, daño en el ADN y de la síntesis no
programada de ADN.


h. Test MTT
Este método esboza un simple análisis para determinar la
viabilidad/número de células en cultivo a través de la formación de
una sustancia colorante (en una reacción mitocondria dependiente)
hacia la cual la membrana celular es impermeable.


i. Alteraciones en el citoesqueleto como un parámetro en el estudio
de citotoxicidad.
Los cambios en el balance de las proteínas del citoesqueleto luego
de la exposición a los compuestos estudiados pueden ser detectados
por microscopía inmunofluorescente indirecta y por métodos
bioquímicos cuantitativos.


j. Test del rango de crecimiento de levaduras.
El efecto citotóxico de sustancias químicas sobre células
levaduriformes (Saccharomyces cerevisiae) en cultivos es
determinado por la inhibición de la proliferación celular así como
por la medida de la densidad celular.


k. Test de citotoxicidad H+ ATPasa en la membrana plasmática de
levaduras.
El efecto de sustancias químicas en la actividad de la membrana
plasmática ligada al H+ ATPasa, aislada de células levaduriformes
(Saccharomyces cerevisiae) es usada como medida de su toxicidad.


l. Test de Na+-K+-ATPasa sobre células ováricas de Hamsters Chinos.
El efecto de sustancias químicas en la actividad de la membrana
plasmática unida al Na+-K+-ATPasa aislada de células ováricas de
Hamsters chinos (CHO), es usado como una medida de su toxicidad.


m. Test LS-L929 de citotoxicidad.
El test de citotoxicidad basado en el cultivo simple de células (en
el cual la viabilidad de las células es determinada mediante el uso
de los colorantes (bromuro de ethidium y acetato de fluoresceína)
han sido desarrollados como un test general de citotoxicidad aguda.


n. Test de citotoxicidad V79 para daño de membrana.
El efecto citotóxico de las pruebas químicas en cultivos de células
V79 pueden ser determinadas por la evolución del daño a la membrana
plasmática así como por la determinación por el análisis de flujo
del ácido nucleico.




o. Test de citotoxicidad en células BALB/c 3T3
El efecto citotóxico de sustancias químicas sobre células BALB/c
3T3 en cultivo es medido por la viabilidad celular (Neutral Red
Uptake) y proteínas totales celulares (método de unión mediante el
colorante Azul Kenácido R).


p. Videomicroscopía cuantitativa del movimiento intracelular y la
fluorescencia específica de la mitocondria.
La microscopía AVEC-DIC en combinación con la fluorescencia
específica de la mitocondria permite un análisis cuantitativo de la
dinámica de los organelos celulares y de la estructura fina en
cultivos celulares expuestos a los compuestos en estudio.

q. Absorción Ultra Violeta como una aproximación del número
celular:
La absorción UV a 260 nanómetros en un volumen definido de células
solubilizadas es proporcional al número de células y por lo tanto
puede ser usado como un simple medio de obtención de conteo
celular. El conteo celular obtenido por esta vía puede ser
combinada con medidas de la inhibición de síntesis de DNA (3H –
incorporación de timidina) por test, combinados para producir un
índice de citotoxicidad.

r. Predicción in vitro de la dosis máxima tolerada:
El resultado del test de citotoxicidad en cultivos primarios, de
hepatocitos de rata, en células MDCK y en células McCoy, pueden ser
usadas para predecir in vivo la 4w-k dosis máxima de tolerancia en
ratas y perros. Una correlación entre citotoxicidad in vitro, como
medida de este sistema, y valores de LD50 en ratas y ratones ha
sido también establecida.

s. Dos compartimentos de tejido humano, en test de citoxicidad.
El sistema de activación (microsoma de hígado humano) es separado
por una membrana semipermeable de las células blanco (leucocitos
mononucleares humanos o eritrocitos) con la intención de
identificar metabolitos citotóxicos, estos son capaces de difundir
lejos de su sitio de producción.

t. Ensayo de tretrahymena para la actividad estabilizadora de
membrana:
El efecto de los componentes del test sobre la estructura lipídica
y de proteínas de canales iónicos en membranas biológicas, puede
ser determinado usando una imagen de video para el análisis que
evalúa este efecto, en la velocidad de nado del protozoo ciliado.




u. Test CYP1A1 (enzima de metabolización de hidrocarburos
policíclicos aromáticos) induciendo potencia y citotoxicidad en
el HEPA-1 de ratón, de línea celular de hepatoma:
Este bioensayo utiliza cultivos de hepa-lclc7 (hepa-1) de ratón con
células de hematoma, evalúa, en CYP1A1, la inducción de potencia de
la citotoxicidad de pruebas químicas puras o muestras ambientales.
En la prueba de inducción HePA1, la inducción de potencia de CYP1A1
de la muestra de prueba es detectada como actividades aumentadas de
aril hidrocarburo hidroxilasa y 7- ethoxyresorufin-O-deethylase. En
la prueba de citotoxicidad HEPA 1 se mide el efecto de la muestra
en la viabilidad celular.

v. Estimación de Niveles de ATP:
La muerte celular (especialmente por apoptosis) es un proceso
dependiente de energía de ATP. Así los niveles de ATP caen a un
punto en que la célula no puede realizar las funciones metabólicas
básicas, por lo que la célula morirá. Una célula apoptótica típica
exhibe una disminución significativa del nivel de ATP. Así la
disminución del nivel de ATP de una célula ha sido utilizada como
indicador de muerte celular. En contraste la proliferación celular
se reconoce por los niveles altos de ATP.
El método utiliza la detección bioluminicente de ATP, para detectar
rápida y simultáneamente apoptosis y proliferación celular. Se
utiliza Luciferasa para catalizar la formación de luz desde ATP y
luceferina; la luz puede ser medida utilizando un luminómero o
contador β.


5.3 Polimorfonucleares (1, 6, 10, 16)


a. Generalidades (1,16)
Los leucocitos polimorfonucleares (PMN, se llaman así por su
núcleo multilobulado y de diferentes formas), son los más
numerosos. Estos son esenciales para la defensa innata del huésped
contra microorganismos invasores, eliminando patógenos por el
proceso conocido como fagocitosis.
Los PMN se acumulan rápidamente en los sitios de infección con lo
que potencialmente pueden causar destrucción tisular tras
liberación de sus gránulos y de especies reactivas de oxígeno
(ROS) en tejidos del huésped.
Los PMN son reclutados de la circulación y de las reservas de la
médula ósea, hacia los sitios de invasión microbiana por estímulos
liberados por el patógeno y el huésped. Este reclutamiento provoca
inflamación y eliminación de los microbios invasores.
Además los PMN están equipados para reconocer directamente
moléculas en la superficie de los microorganismos invasores (Ej
PGLYRP, CD14 y receptores Toll-like que interactúan con los
péptidoglucanos de los gram positivos y con el LPS de los gram
negativos; además pueden reconocer directamente las superficies
microbianas. Esta ingestión es mejorada por la opsonización de
los microbios con proteínas del huésped como complemento y
anticuerpos.


b. Fagocitosis (6, 10)
Los fagocitos profesionales, son los neutrófilos polimorfonucleares
y monocitos/macrófagos; juegan un importante rol en la defensa del
huésped. La respuesta funcional de los fagocitos hacia las
infecciones bacterianas y fúngicas incluyen quimiotaxis, ensamble
de actina, migración, adhesión, agregación, fagocitosis,
degranulación, y producción de ROS.


Además los fagocitos participan en reacciones inflamatorias y
ejecutan actividad tumoricida. En adición a su tarea principal de
eliminar bacterias, ellas se encargan de remover células dañadas,
senescentes y apoptóticas.
Numerosos factores, como enfermedad y condiciones estresantes,
afectan la actividad "engullidora" de los fagocitos profesionales.
Para la fagocitosis las células se unen por sus receptores de
membrana a moléculas específicas (ligandos), localizados en la
superficie de la partícula a ser engullida. El paso siguiente,
mediado por el complejo ligando-receptor, es la modificación del
citoesqueleto de actina que llevará a la formación de los
pseudópodos y la internalización de la particula. Esta
internalización provoca la activación de la cascada oxidativa;
además los gránulos de los PMN se fusionan con los fagosomas, lo
que provee a las vesículas fagocíticas de enzimas y péptidos
microbicidas. Para este logro se requieren mecanismos dependientes
e independientes de oxígeno. (C albicans y S aureus no pueden ser
eliminados solamente por mecanismos dependientes de oxígeno).
Luego de esto se produce una autorregulación con la subsecuente
muerte apoptótica de la célula PMN, ya que si la cascada
inflamatoria continúa produce daño tisular.


c. Purificación de macrófagos por métodos basados en la adherencia:
(1, 16)


i. Propiedades de adhesión de los macrófagos:
La adherencia de los macrófagos a sustratos sólidos es un
proceso dependiente de energía y del pH. Este proceso es
mejorado con altas concentraciones de suero y pH bajo. Esta
propiedad de los fagocitos mononucleares ha sido largamente
usada para extraer monocitos/macrófagos de suspensiones de
células linfoides y preparar cultivos de macrófagos de
diferentes sitios anatómicos.
Estos métodos de adherencia generalmente usan Ficol, aislando
células mononucleares de sangre periférica o preparados de
células de lavados peritoneales o broncoalveolares, esto seguido
por una selección positiva de monocitos/macrófagos de estas
preparaciones debido a su virtud de adherencia a superficies
plásticas o de vidrio. Asimismo otras células se adhieren pero
su adhesión no es lo suficientemente fuerte y pueden ser
removidas con lavados, como sea esta adherencia no es propiedad
única de los macrófagos, por lo que mediante este procedimiento
se puede confiar en obtener poblaciones celulares con alto
contenido de macrófagos y un pequeño número pero apreciable de
otros tipos celulares, particularmente cuando se aíslan
macrófagos de tejidos (fibroblastos, células endoteliales).


ii. Moléculas de adhesión de los macrófagos:
Los monocitos/macrófagos son células capaces de adherirse a
otras células, componentes del complemento, complejos inmunes y
matrices extracelulares, en forma muy específica a través de la
expresión de receptores de adhesión tipo leucocitario (LFA-1,
Mac-1 y p150, p95 de la familia de las β2 integrinas
relacionadas en las interacciones entre células y entre células
y complemento) así como una gran cantidad de miembros de los
receptores de "antígenos de activación tardía" (de la familia β-
1 integrina) los que juegan un rol en la interacción entre
célula-substratos. Las integrinas son capaces de unirse a
matrices moleculares como fibronectina, colágeno, y laminina
reconociendo en sus ligandos secuencias específicas de
aminoácidos. La más estudiada es la secuencia RGD (arginina,
glicina y acido aspártico), encontrada dentro de un número de
matrices proteicas incluidas fibronectina, fibrinógeno,
vitronectina, laminina y colágeno tipo 1. Muchas, muy bien
conocidas, moléculas de adhesión expresadas en monocitos y
macrófagos son también encontradas en otras células
hematopoyéticas como: Linfocitos (principalmente), fibroblastos
y células endoteliales y epiteliales.
A diferencia de otros tipos celulares, los macrófagos se
adhieren al plástico en ausencia de cationes divalentes. Esta
adhesión catión-independiente está mediada por el receptor
scavenger. Las interacciones arriba mencionadas, de los
receptores con componentes de matriz extracelular y/o ligandos
de las superficies celulares de células endoteliales y de tejido
conectivo, tienen una importante influencia en las señales de
transducción de procesos en monocitos/macrófagos.






5.4 Cándida albicans (26)


a. Características biológicas de la Cándida albicans
La C. albicans tiene características biológicas que la identifican
y la hacen especial dentro del grupo de Cándida y de otras
Levaduras.
El Género Cándida se cultiva en un medio de Agar Sabouraud (alto
contenido en glucosa) el cual es adicionado con un antibiótico,
generalmente cloranfenicol al 0,5 mg/ml, este medio de cultivo es
utilizado para la mayoría de las especies de hongos. La especie
albicans necesita o requiere de biotina para su desarrollo. Estos
cultivos de Cándidas crecen en rangos de temperatura entre 20 y
40ºC, y entre rangos de pH de 2 y 8. Los cultivos de Cándida no
necesitan de estufa Pasteur para su desarrollo, basta con la
temperatura del cuarto, entonces desarrollan colonias en el Agar
Sabouraud que tienen la peculiaridad de ser grandes, suaves, color
crema y con el característico olor a levadura. En algunos casos, la
C. albicans, produce una proporción de colonias de superficie
áspera, lo cual corresponde a una alta frecuencia de cambio en
morfología colonial, lo que puede ser gatillado por dosis bajas de
luz ultravioleta.
C. albicans exhibe diferente morfología bajo diferentes condiciones
ambientales. Esta morfología incluye:
a) Células ovoides germinativas (blastosporas, blastosconidias)
b) Pseudohifas (células elongadas que parecen células filamentosas
en cadenas).
c) Hifas verdaderas y Clamidosporas.
A temperaturas bajo 33ºC, se favorece el crecimiento de células de
levadura germinativas, las cuales son de forma ovoidea
aproximadamente de 3x5 μm, y la formación de una yema ocurre en la
región polar de la célula, dando origen a una célula hija. A
temperaturas elevadas alrededor de 37ºC, y a un pH alrededor de 7,
nos encontramos que una morfología micelial es la constante, y esta
morfología se genera a través de la formación de tubos germinales. 
En una primera etapa de la formación de los tubos germinales,
crecen cinco protuberancias que emergen de la célula madre desde
cualquier región de la superficie celular. A diferencia de una
célula en etapa de multiplicación, en las células que emiten tubos
germinales, no hay una estrangulación en la unión con la célula
madre. El suero sanguíneo ya sea humano o de conejo es un fuerte
inductor de la formación de tubos germinales, y esta particularidad
es usada para hacer un diagnóstico rápido de C. albicans, la cual
desarrolla tubos germinales dentro de las dos horas posteriores a
la siembra. Excepto algunas cepas de C. stellatoídea (variante de
C. albicans) y muy raras cepas de C. tropicalis que también lo
forman, las otras especies de Cándidas no lo hacen.
Los tubos germinales derivan en hifas verdaderas las cuales atraen
el citoplasma celular, dejando tras ellas extensas vacuolas.
Las pseudohifas se encuentran frecuentemente en el crecimiento "in
vitro" e "in vivo", y son largos filamentos de células elongadas
formadas por yemación polar y con una estrangulación en el sitio de
emergencia con el septum.


b. La pared celular y la estructura antigénica de la Candida
albicans
Shepherd, autor del capítulo sobre biología de las especies de
Cándida del libro de Samaranayake y Mac Farland, y basado en los
trabajos de numerosos investigadores sobre el tema, indica que C.
albicans tiene una pared celular bastante compleja compuesta por
beta-glucanos, y una pequeña cantidad de quitina. El mayor
componente son los carbohidratos, que conforman alrededor del 80-90
% del peso húmedo de la célula, un 2% de líquidos y un 3-6 % de
proteínas.
La pared celular de la C. albicans actualmente es una importante
área de estudio, debido a que la participación de la pared celular
de la C. albicans en la adherencia a los tejidos.
Su capacidad de colonización, sus componentes antigénicos y
productos secretados tales como la hidrolasa, ciertas "toxinas", y
la proteinasa que produce, también se consideran como importantes
factores de virulencia.
El conocimiento que tiene para nosotros la pared celular de la
Cándida se relaciona con el tratamiento de las Candidiasis, ya que
la pared ofrece blancos seguros para los agentes antigénicos,
puesto que los beta-glucanos y la quitina de la pared no estan
presentes en las células del hospedero, de esta manera, los nuevos
agentes antifúngicos que interfieran con la síntesis o degradación
de esta estructura del hongo, no harán daño ni serán tóxicos para
las células y tejidos del hospedero.
Las capas de los diferentes componentes químicos que conforman la
estructura de la pared han sido determinadas a través de estudios
con lectinas, tinciones citoquímicas y anticuerpos conjugados.
Por debajo de la pared celular del hongo se encuentra la membrana
celular cuya estructura física es muy similar a la de una célula
procariótica animal, sin embargo su diferencia estriba de que en
vez de colesterol, contiene ergosterol un esterol que la diferencia
y que permite una acción específica de quimioterápicos sobre el
hongo.
La C. albicans al igual que otras Cándida, metaboliza los
carbohidratos vía glicólisis, por la senda de la pentosa-fosfato y
el ciclo de los ácidos cítricos.
A consecuencia de su acción sobre los hidratos de carbono, C.
albicans libera una cantidad de productos finales del metabolismo,
los que vienen a ser metabolitos tóxicos, los cuales incluyen:
etanol, acetona y ácidos carboxílicos de cadena corta, tales como
acético, fórmico, láctico, propiónico, pirúvico y succínico.

6. Formulación del Problema
¿Tiene efecto tóxico el extracto acuoso de Erythrina falcata (pisonay)
sobre Polimorfonucleares (PMNs)?




7. Hipótesis
El extracto acuoso de Erythrina falcata (pisonay) tiene efecto tóxico
sobre Polimorfonucleares (PMNs)






8. Variables

1. Dependiente: Toxicidad del extracto acuoso de Erythrina falcata
(pisonay) sobre PMNs.
i. Tipo: Mixta
ii. Escala: Nominal
iii. Indicadores: Viabilidad y funcionalidad celulares


2. Independiente: Concentración del extracto acuoso de Erythrina
falcata (pisonay)
i. Tipo: Cuantitativa
ii. Escala: De razón
iii. Indicadores: Concentración


9. Objetivo
Determinar la toxicidad de Erythrina falcata (pisonay) sobre PMNs.


10. Tipo de Investigación
Experimental, descriptivo.


11. Materiales y Métodos
a. Sujeto de Estudio
Para efectos de la realización de la presente investigación se
tomarán PMNs de una muestra de sangre venosa de un voluntario.


i. Criterios de inclusión
1. La muestra de sangre debe pertenecer a un voluntario que
tenga un hemograma dentro de límites normales.
2. El voluntario debe carecer de clínica patológica.

b. Procedimiento


i. Preparación del Extracto Acuoso
Se recolectaron muestras de corteza de Erythrina falcata
del Valle Sagrado de los Incas en Cusco, que se
estabilizaron en horno a 70ºC por media hora (2, 5) con el
fin de evitar que se produzca alteración en el material
recolectado, destruyendo los fermentos naturales del
vegetal, y así fijar su composición química.
Posteriormente se realizó el secado de dicha corteza al
ambiente bajo sombra por espacio de 5 días. Se procedió
seguidamente a la trituración mecánica en un molino de
granos y se procedió a almacenar a 4ºC hasta su posterior
utilización.
Para la elaboración del extracto acuoso al 100%
(peso/volumen) de la corteza molida de Erythrina falcata,
para ello, se tomarán 10 gramos de polvo de pisonay los
cuales se colocarán en una tela de gasa, donde serán
envueltos cuidadosamente, para evitar la pérdida de los
mismos, conformando un paquete pequeño.
El paquete en mención será sumergido en 100 ml de agua
destilada que se hará ebullir por un lapso de 5 minutos
realizándose la extracción del extracto acuoso por
agotamiento (2, 4, 5):
Luego de ebullir, se "exprimirá" el paquete,
eliminando el líquido que permanezca en el mismo;
seguidamente se le hará caer un chorro continuo de
agua destilada hirviendo, "exprimiéndose"
sucesivamente hasta obtener un líquido claro, lo cual
indicará el "agotamiento" del paquete.
Se nivelará la solución a 100 ml por evaporación del
volumen total en baño maría.
La solución obtenida se centrifugará a 2500 rpm por 5
minutos filtrándose después en papel de filtro de
filtración lenta, repitiéndose este procedimiento en tres
veces, hasta que se obtenga el extracto libre de
partículas, mientras que paralelamente se continúe
evaporando el líquido en baño maría.
Finalmente, obtenido el extracto, se procederá a su
esterilización en autoclave a 121ºC por 15 minutos y 20
lbs/pulg2 de presión. El volumen final se enrasará con agua
destilada estéril hasta obtener un volumen final de 10 ml.
Posteriormente se prepararán las diferentes concentraciones
(2%, 2.5% y 3%), según referencia del bioensayo con Artemia
salina realizado por Delgado (4).


ii. Preparación de cultivo de Cándida albicans
Se tomará una muestra de Cándida albicans de un cultivo del
laboratorio y se incubará a 37 ºC en Agar Sabouraud por 24
horas. Pasado este tiempo se tomará las suficientes
Unidades Formadoras de Colonias (UFC), a fin de obtener una
suspensión de 20000 cándidas/ml en una solución de PBS con
10% de suero autólogo.
Para determinar la cantidad de C. albicans por mililitro se
procede a su recuento en una cámara de Newbauer.


iii. Aislamiento de PMNs
Se aislará PMNs de una muestra de sangre venosa periférica
tomada de un donante sano. Para ello se colocarán dos gotas
separadas de sangre en un portaobjetos estándar limpio,
incubándose en cámara húmeda a 37ºC por 30 minutos.
Transcurrido dicho tiempo, se cubrirá las gotas de sangre
con PBS, y se despegará cuidadosamente los bordes de los
coágulos con una aguja, procediendo a remover el coágulo
mediante chorro continuo de PBS con pipeta Pasteur.


iv. Exposición al pisonay
Se prepararán 16 portaobjetos, divididos en dos grupos de
8, los mismos que se subdividen en dos subgrupos con 4
láminas cada uno (8 muestras de PMNs). Se destinarán dos
subgrupos para formar las láminas "Control" y los dos
subgrupos restantes conformarán las "Muestras" propiamente
dichas. Así al final se tendrán 16 muestras de PMNs, 8 en
cada subgrupo, que se destinarán a los "Controles" y 16
muestras que formarán las "Muestras". Las muestras de PMNs
se cubrirán con 0.5 cc de PBS en el caso de los "controles"
y con 0.5 cc de pisonay a una de las concentraciones del
extracto acuoso mencionadas en el acápite primero. Tanto
dentro de los "controles" como en las "muestras", un
subgrupo de 4 láminas, 8 muestras de PMNs, se procesarán a
los 30 minutos de exposición y el otro a la hora de
exposición.


v. Prueba de viabilidad
Pasados los 30 minutos o la hora, según sea el caso, de
incubación en exposición al agente, se enjuagará con PBS y
se dejará secar al aire para luego cubrir el área donde se
encuentran los PMNs con una solución al 0.4% de azul de
tripan (peso/volumen en solución isotónica salina),
colocándose un cubreobjetos a fin de eliminar el exceso de
solución. Dentro de los 10 minutos siguientes se procederá
al conteo de los campos con microscopio óptico de luz a
40X, la razón de células viables al número total de células
contadas se registrará como el porcentaje de viabilidad de
cada muestra, luego se determinará la media del porcentaje
de viabilidad de éstas con cada concentración de pisonay.
La concentración problema que resulte con una media de
viabilidad del 85% o más, no será considerada
significativamente diferente de los controles expuestos al
PBS y de este modo, será considerada no tóxica.


vi. Prueba de funcionalidad
Pasados los 30 minutos o la hora, según sea el caso, de
incubación en exposición al agente, se enjuagará y secará
la lámina al aire para luego exponer las células a 0.5 cc
de solución de C. albicans preparada previamente. Se
incubará por 30 minutos a 37ºC en cámara húmeda antes de
enjuagar las láminas con PBS. Posteriormente se fijarán los
PMNs con metanol absoluto por 60 segundos, para luego
colorear las láminas con Azul de Metileno al 3% por 5
minutos. Luego de los cuales se enjuagará con agua
destilada y se dejará secar al ambiente. Se realizará el
examen de las láminas con microscopio óptico de luz con
objetivo 100X bajo aceite de inmersión. Se contabilizará el
número de levaduras "internalizadas" por 50 a 100 PMNs
discriminándose entre vivas y muertas, dependiendo de la
captación o no del colorante, calculándose así el índice
fagocítico y el porcentaje de muerte. Estos resultados se
compararán a los obtenidos con los controles con PBS,
determinándose la eficiencia de la fagocitosis, dada por el
porcentaje de muerte. Cuando la media de eficiencia
fagocitaria de la concentración en estudio sea del 85% o
más del control, entonces ésta se considerará no tóxica.
12.
13. Recursos
a. Recursos Humanos
i. Investigador
ii. Voluntario
b. Recursos Materiales
i. Equipos
1. Balanza analógica
2. Estufa
3. Horno
4. Microscopio óptico
5. Computadora
ii. Material Biológico y afines
1. Extracto acuoso de Erythrina falcata
2. Cultivo de Cándida albicans
3. Muestra de Sangre periférica
4. Búffer Fosfato Salino (PBS)
5. Agua Destilada
6. Metanol
7. Etanol
iii. Material de Vidrio y afines
1. Láminas portaobjetos
2. Láminas cubreobjetos
3. Cámara húmeda
4. Vasos Beaker
5. Frascos Estériles
6. Micropipetas multivolumen
7. Pipetas Pasteur
8. Tubos de Ensayo Estériles
9. Placas Petri
10. Goteros
11. Rejilla Portatubo
iv. Colorantes y afines
1. Azul de Tripán
2. Coloración de Giemsa
v. Otros
1. Papel Filtro
2. Rotulador
3. Jeringas 10 cc con aguja #21
4. Algodón
5. Gasa
6. Papel Toalla
7. Temporizador
8. Ligadura
9. Material de escritorio
10. Guantes Quirúrgicos

c. Recursos Financieros: propios






12. Cronograma


"TAREA "TIEMPO "
"Búsqueda Bibliográfica "8 meses "
"Ejecución del Proyecto "2.5 meses "
"Elaboración del Informe Final "0.5 mes "
"TOTAL "11 meses "



13. Bibliografía

Textos
1. Abbas, Abul K. Inmunología Celular y Molecular. Cuarta Edición.
2003.
2. Arenas, David y Altuna, Cristian. "Determinación del efecto del
extracto acuoso de Erythrina falcata (pisonay) sobre la división
celular en cultivos de Escherichia coli". Tesis para optar por
el grado de Bachiller en Medicina. UNSA 2003.
3. Brack, A. 1999. Diccionario Enciclopédico de Plantas Útiles del
Perú. Editorial Centro de estudios Regionales Andinos. Bartolomé
de las Casas. Cuzco. Pág. 200.
4. Delgado, Gisele M. Efecto antiinflamatorio y antiulceroso de la
Triumpheta abutiloides (Rata – rata) sobre lesiones
experimentales inducidas en ratas albinas. Tesis para optar por
el título de Químico-Farmacéutica. Arequipa, 1999.
5. Delgado, Gisele M. "Efecto del extracto acuoso de Erythrina
falcata Bentham (pisonay) en el desarrollo embrionario de un
gasterópodo pulmonado (Planorbis sp.)". Tesis para optar por el
grado de Magíster, 2003
6. Djandetti, Meir y col. Phagocytosis – The mighty of the Silent
Warriors. Microscopy Research and Technique 57:421-431. 2002
7. G. K. Chatterjee. T. K. Gurman, A. K. Nag Chaudhury and S. P.
Pal. 1981. Preliminary pharmacological screening of Erythrina
variegata var. Orientalis (syn.e. Indica) seeds. Ind. J.
Pharmac., 11, (2) 153-158.
8. Gonzales, D. 1986. Cultura Guaraní, Diccionario Castellano-
Guaraní y Guaraní-castellano. Editorial CEPAG.As. Pág.614.
9. Hellewell, Timothy y col. A citotoxic evaluation of
antimicrobial and non-microbial wound cleansers. WOUNDS: A
Compendium of Clinical Research and Practice. Volume 9, Number
1, January / February 1997
10. Kobayashi, Scott y col. Regulation of the neutrophil-mediated
inflammatory response to infection. Microbes and Infection 5
(2003) 1337-1344.
11. Loirenzi, H. y Prata Neves, M. 1992 Arvores Brasileiras
.Editorial Plantarum LTDA
12. Nieto, E. 1985. Efectos del "pisonay" (Erythrina falcata
bentham) en la embriogénesis de Planorbis sp. en III Jornadas
Científicas Universidad Peruana Cayetano Heredia. Págs. 124-125.
13. Nieto E. y Col. 1986. Efecto bloqueador de las infusiones de
corteza de Erythrina falcata bentham en meristemos de Allium
cepa VIII Congreso Nacional de Biología, III Simposio de
Educación en Ciencias Biológicas. Arequipa. Págs. 208.
14. Nieto E. y J. Castillo. 1986. Acción in situ de la infusión de
la corteza de Erythrina falcata bentham en embriones pre-
implantacionales de ratón, VIII Congreso Nacional de Biología,
III Simposio de Educación en Ciencias Biológicas – Arequipa.
Págs. 260-261.
15. Miño, J y col. Actividad Antinociceptiva y Antiinflamatoria de
Erythrina crista-galli L. ("Ceibo"). Acta Farmacológica
Bonaerense 21 (2):93-8 (2002)
16. Paulnock, Donna M. Macrophages. Oxford University Press. 2000.
Págs 31-57
17. UNESCO. 2000 Manual de uso de hierbas medicinales del Paraguay.
páginas 17, 19, 44.

Páginas Web
18. Cabieses, Fernando. Medicina tradicional expertos destacan su
valor psicoterapéutico, 1999, Editora Nacional S.A.
http://www.eleste.com/comun/foros
19. EMBRAPA. Agrobiología.
http://www.cnpab.embrapa.br/servicos/leguminosas/eritrina.html
20. FACED. UFBA. Directório Acadêmico de Ciências Naturais – DACN.
CNPJ: 04.027.378/0001-30. Botánica. Plantas medicinais.
http://www.faced.ufba.br/~dacn/planta.htm
21. Herbodietética Pringles. Plantas Medicinales.
http://www.escape.com.ar/usr/dietprin/ceibo.htm
22. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. Laboratorio de
Farmacología Molecular II.
http://www.biof.ufrj.br/labs/cfarm.html
23. Jardín Botánico. "Dr. Miguel J. Culaciati". Fundación Botánica
Conservacionista Argentina. Colección.
http://www.botanico.org.ar/coleccion.htm
24. List of Test Protocols for Basal Cytotoxicity. European Center
for the Validation of Alternative Methods (ECVAM). Scientific
Information System (SIS).
http://www.ivtip.org/protocols.html#basalcyto
25. Max Heinig Neto. Acadêmico do Curso de Farmácia e Bioquímica da
Furb
http://www.maracujanosia.hpg.ig.com.br/ciencia_e_educacao/8/index
_pri_1.html
26. Microbiología
http://odontologia.uchile.cl/revistaFO/v14n2/candida/pag01.html
27. Plantas Ornamentais Toxicas.
http://www.plantastoxicas.hpg.ig.com.br/toxicas/erycri.htm
28. Overview of Probes for Cell Viability, Cell Proliferation and
Life-Cell Function.
http://www.probes.com/handbook/print/1501.html
29. Pro Diversitas. Vademecum Herbolario.
http://www.prodiversitas.bioetica.org/vademecum.htm
30. The Global Compendium of Weeds. Erythrina crista-galli L.
http://www.hear.org/gcw/html/autogend/species/7735.HTM
31. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Agroindustrias.
Hipertextos del área de la Biología.
http://www.efn.uncor.edu/dep/biologia/intrbiol/adntema3.htm#Table
%20of%20Contents
32. XV Congreso Mexicano de Botánica. Análisis de los alcaloides en
las flores de Erythrina coralloides A.DC.
Sánchez Herrera, Susana; Soto Hernández, Marcos; García Mateos,
María del Rosario
http://www.socbot.org.mx/disco/resume/re889.htm
33. Webster´s Online Dictionary
http://www.websters-online-dictionary.org/definition/english/Cy/
Cytotoxic.html
14. Anexos
a.
b.

-----------------------
Erisopina

Erisotrina

Eritralina

Erisovina

Erisodina

Subgrupo Erisopina

$9:;WXZ]"¥¦­ÆÈç " $ % & 6 ?
íÛͺ« ºÍƒoƒ`ƒÍSÍSÍE7Eh2I—hÌ4±5?OJ[?]QJ[?]^J[?]h2I—h¦Wå5?OJ[?]QJ[?]^J[?]h2I—h
2I—OJ[?]QJ[?]^J[?]h¯ü5?CJOJ[?]QJ[?]^J[?]aJ&h2I—h2I—5?6?CJOJ[?]QJ[?]^J[?]aJ#h
2I—h2I—5?CJα- eritroidina

Subgrupo Eritroidina

β- eritroidina

DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD DEL EXTRACTO ACUOSO DE Erythrina falcata
(PISONAY) EN POLIMORFONUCLEARES

Preparación del Extracto Acuoso

Aislamiento de PMNs

Controles x 8 láminas (16 muestras)

Muestras x 8 láminas (16 muestras)

Incubación con PBS

Incubación con pisonay

1 hora
(4 láminas)

Determinación de Funcionalidad

Determinación de Viabilidad

30 minutos
(4 láminas)

Muestras x 8 láminas (16 muestras)

1 hora
(4 láminas)

30 minutos
(4 láminas)

Coloración con Azul de Tripan 0.4% y lectura al Microscopio Óptico

Incubación con PBS-Suero autólogo 10% + cándida (20000/ml)
por 30 minutos

Lavado de láminas

Controles x 8 láminas (16 muestras)

30 minutos
(4 láminas)

1 hora
(4 láminas)

30 minutos
(4 láminas)

1 hora
(4 láminas)

Incubación con PBS

Incubación con pisonay

Coloración con Azul de Metileno 3% y lectura al Microscopio Óptico

Porcentaje de Viabilidad= Nº de células viables x 100
Nº total de células contadas


Índice Fagocítico = Nº total de levaduras ingeridas
Nº de células contadas


Porcentaje de Muerte = Nº de levaduras muertas x 100
Nº total de levaduras ingeridas