Fijación Biológica de Nitrógeno

LFV, SEMESTRE B2016, INFORME #8, 14/1/2017

Fijación Biológica de Nitrógeno Andrés León C.I: 20.435.551 Laboratorio de Docencia de Fisiología Vegetal, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias; Núcleo la Hechicera, Universidad de los Andes Mérida Edo. Mérida Venezuela

Resumen La fotosíntesis en un proceso bio-energético necesario para el sustento de la vida de las plantas ya que brinda moléculas que sirven en la energética celular a partir de energía lumínica capturada en forma de moléculas con altos potenciales de reducción. En este proceso ocurre la transferencia de electrones desde los centros de reacción lumínica hasta moléculas de ferredoxina que difunden en el estroma para reducir NADP+ en NADPH. Este proceso es independiente de una fuente de carbono pero es dependiente estrechamente de la incidencia de la luz, lo que llevo a muchos científicos a encontrar cuales y cómo eran los pasos en el fotosíntesis. Un gran avance se logró cuando el fisiólogo R. Hill publicó un trabajo en el que demuestra que la producción de oxígeno es independiente de carbono y se generó la categoría de fase lumínica de la fotosíntesis. Para el estudio de la fase lumínica se utilizó DCPIP ya que esta molécula puede ser reducida por la ferredoxina producida y así inducir un cambio de color que puede ser registrado y cuantificado para determinar la tasa fotosintética. Se encontró que el calor, oscuridad y aplicación del herbicida afalon afectan negativamente los ritmos de fotosíntesis. A demás se determinó la tasa o velocidad de reducción de DCPIP por minuto por mililitro. Palabras Clave: Afalon, DCPIP, Fotosíntesis, Hill, Linuron, cadena trasportadora de electrones

Introducción El paso inicial en la fotosíntesis es la absorción de luz por las moléculas de clorofila, en particular la clorofila a es el pigmento capaz de absorber longitudes de onda de violeta –azul (380 -490 nm) y naranja –rojo (590 -750nm) y reflejar verde y amarillo (1, 2). Este pigmento es encontrado en todos los organismos oxigénicos desde algas verdes hasta eucariotas, y usualmente se encuentra organizado en complejos cosechadores de luz, asociados al fotosistema II, en donde ocurre la reacción de fotólisis del agua (2). Esta reacción consiste en una serie de pasos, comenzando en el complejo antena con la excitación por la luz de la clorofila

a y traspaso de electrones a través de reducción hasta el centro de reacción, en el cual se genera la separación foto-inducida de cargas y se forma un par de moléculas de clorofila reducidas llamada el par especial que forman el citocromo P680 creando un potencial de reducción alto en él para continuar el proceso de fijación de los electrones producidos por la separación fotoinducida(2). P680 es parte del complejo proteico del fotosistema II (PSII) que consiste de una gran cantidad de proteínas entre las cuales se encuentran dos plastoquinonas (PQa y b) estrechamente asociadas a P680 que pueden recibir los electrones (e-) entregados, y otras

que forman el dominio de oxidación de agua (DOA), que posee un grupo de4 átomos de Mg y uno de Ca coordinados de forma que pueden remover dos electrones de cada moléculas de agua y tras oxidar dos, formar O2 como producto. En primer lugar, cuando la luz incide sobre el PSII y se produce la separación de cargas, el P680* (reducida) interactúa con la plastoquinona para comenzar el transporte de electrones, PQa recibe un e- de P680, y lo transfiere a PQb, que está menos estrechamente asociada, PQa queda disponible para otra ronda de reducción y de nuevo transfiere el e- a PQb, en este momento PQb -2 se disocia del PSII, sin embargo, cada reducción con un e- a PQb es neutralizada con la asociación a un protón de la cara del estroma por lo tanto PQb asocia a dos protones antes de difundir como PQH2 por la bicapa lipídica hasta el citocromo bf, y en este proceso contribuye a crear el gradiente electro-químico de protones. Por otra parte, entonces el P680+ (oxidado) se convierte en un agente oxidante fuerte, y gracias a la cercanía al DOA toma un electrón de uno de los átomos de Mg y genera un intermedio Mg+, el cual terminará oxidando a una molécula de agua para obtener electrones, con cada dos rondas de reducción oxidación de P680 entonces se utiliza una molécula de agua y en cuatro rondas se oxidan dos de agua y producen un O2, y 4 protones, los cuales son liberados hacia el lado del lumen tilacoidal contribuyendo aún más a la generación del gradiente electro-químico (1, 2). Entonces, la PQH2 generada se mueve a través de la membrana del tilacoide y encuentra al citocromo bf, el cual cataliza la transferencia de electrones desde PQH2 a varios intermediarios con complejos Fe-S que pasaran un electrón a la vez desde PQ hasta plastocianina (PCi) la cual es soluble en el lumen del tilacoide y puede transferir estos electrones hasta el fotosistema I

(PSI) en dónde PCi sirve para reducir el complejo de par de moléculas de clorofila que conforman P700. PSI entonces también convierte energía lumínica en una separación de cargas y transfiere estos electrones generados a una clorofila especial Clorofila A0, luego una Quininona A1 y consecuentemente los electrones pasan a un agrupamiento de cuatro complejos Fe-S y estos reducen a una Ferredoxina (Fd) soluble la cual finalmente difundirá por el estroma hasta transferir sus electrones a una molécula de NADP+ para reducirla y formar NADPH+. Entones la consecuencia, de estos ciclos de fijación de la energía lumínica en potenciales de reducción por medio de procesos oxido-reducción permite generar no solo moléculas que almacenan dicha energía en poder reductor como el NADPH, sino acrecentar considerablemente el gradiente de protones entre el lumen del tilacoide y el estroma, lo que da la energía química-electromotriz necesaria para la síntesis de ATP por la ATP sintasa, de un modo análogo a la producción en mitocondrias (1, 2, 4). Dentro del estudio de la fotosíntesis, se llevaron a cabo experimentos para revelar el tipo de reacciones que se llevaban a cabo en los cloroplastos, y desde ya al menos 1920 se reconocía la capacidad de estas organelas de producir oxígeno al ser inducidos por luz, sin embargo existía controversia en la dependencia de CO2 para este proceso, ya que se pensaba que el oxígeno producido venía de la utilización de esa molécula. En 1939 Robert Hill demostró que la evolución de oxígeno en cloroplastos es un proceso que ocurre independiente a la presencia de CO2 pero es dependiente de la incidencia de luz y de la presencia de un aceptor fuerte de electrones (5). Esta evaluación del progreso de evolución de oxígeno independiente de CO2 permitió separar en dos fases la fotosíntesis, una plenamente

dependiente de luz y otra dependiente de la fijación de del CO2 ambiente. También la investigación de la fotosíntesis, el uso de herbicidas que interrumpen la cadena de transporte de electrones resulta muy provechoso para evaluar procesos determinados. El linuron es un herbicida de la familia de los fenilurideos e inhibe el transporte de electrones en el PSII al unirse irreversiblemente a la proteína transmembranal D1, en el sitio de unión de la PQb. En consecuencia la energía de excitación lumínica no puede ser transferida y rápidamente las moléculas de clorofila reaccionan entre sí para dar un triplete de clorofila, el cual puede reaccionar conO2 para dar oxígeno reactivo que induce la peroxidación de los lípidos de membrana y causar así la ruptura del plastidio y posiblemente la célula total (6). Para el presente trabajo se evaluó la fase dependiente de luz de la fotosíntesis en cloroplastos aislados y se observó indirectamente la producción de potencial de reducción en forma de Fd- con la presencia del aceptor de electrones artificial di-

clorofenol indolfenol (DCPIP), que oxida la Fdtomando dos electrones y cambiando de azul (oxidado) a incoloro (reducido). Se asume que esta molécula tiene un mayor potencial de reducción que NADP+, por lo cual si está en suficiente concentración, el ritmo de desaparición del color debe estar correlacionado al ritmo de producción de Fd- y así con el ritmo de fotosíntesis en general (7). Se evaluó mediante esta técnica el ritmo o tasa cualitativa de fotosíntesis en cloroplastos aislados en el tiempo, también se evaluó los efectos de la ausencia de incidencia de luz, desnaturalización por calor y efecto del Linuron sobre el ritmo de fotosíntesis. Se concluye que la técnica es eficiente que evidenciar los cambios en la tasa fotosintéticamente, que la fotosíntesis disminuyó significativamente bajo los tratamientos aplicados, y que ya que se trabajó con cloroplastos y fragmentos celulares de ese mismo tamaño se puede corroborar que el proceso de producción de poder reductor en forma de Fd- (fase dependiente de luz) es parcialmente independiente de la integridad celular.

Metodología I.

Obtención de los cloroplastos. 1.

Se lavaron hojas de espinaca, se secaron y se eliminaron las nervaduras principales, luego se pesaron 50 g y se homogeneizaron en licuadora en frío en un volumen de 100 ml de NaCl 0.35M y 10 ml de buffer Tris 0.2M a pH 8.0

Se filtró el homogenato con un gasa embebida en el mismo buffer tris utilizado. 3. Se tomaron 30 ml. del homogenizado y se centrifugó en frío a 1700 rpm por un minuto. 4. Se extrajo el sobrenadante y centrifugó nuevamente en frío a 2500 II. Reacción de Hill. 2.

5.

6.

7.

8.

rpm por 10 minutos, y de esta manera sedimentar los cloroplastos. Se eliminó el sobrenadante y resuspendieron los cloroplastos en 3 ml de solución de NaCl 0.35M agitando muy suavemente Se diluyó la suspensión hasta 30 ml con NaCl 0.35M y se centrifugó en frio a 1000 rpm por 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y resuspendieron los cloroplastos en 10 ml de NaCl 0.35M. Esto se guardó en hielo hasta su uso.

1. Se diluyó la suspensión de tubo 2, 3 y 4 (1 ml de buffer fosfato cloroplastos en NaCl 1: 9 hasta que la 0.1 M a pH 6,5; 1 ml de suspensión lectura del blanco quedó incluida en celular diluida; 3 ml de agua la escala del espectrofotómetro destilada), y uno para el tubo 5 (1 ml evaluando en longitud de onda 660 de buffer fosfato 0.1 M, pH 6,5; 1 ml nm. de suspensión de cloroplastos diluida; 2. Se preparó un blanco para el tubo 1 (1 1 ml de Afalon; 2 ml de agua ml de buffer fosfato 0.1M a pH 6.5; 4 destilada). ml. de agua destilada), uno para el 3. Se prepararon los tubos de reacción según la tabla 1 Tabla 1. Preparación de los tubos de reacción Tubo Buffer Fosfato Agua DCPIP 0.2 M Suspensión Herbicida 0.1 M pH 6.5 destilada Celular (ml.) Afalon (ml.) (ml.) (ml.)

1 2 3 4 5

1 1 1 1 1

a)

3 2 2 2 1

1 1 1 1 1

0 1 1 1 1

0 0 0 0 1

El tubo N°3 fue cubierto completamente con papel de aluminio para que esté en completa oscuridad. El tubo N°4 debe contener los cloroplastos que previamente fueron calentados hasta ebullición, en baño de maría, por 20 minutos. El tubo N°5 contenía el herbicida Afalon a una concentración equivalente a la de su uso comercial, 0.2g/ml.

b) c)

4. La reacción se comenzó al agregar la suspensión de cloroplastos a cada tubo, momento en el cual se realizó la lectura inicial en el espectrofotómetro a 660 nm, excepto para el tratamiento en oscuridad, inmediatamente después, debe colocar todos los tubos frente a una fuente de luz,

anteponiendo un recipiente con agua, procurando que la irradiación fuese uniforme para todos los tubos de reacción. 5. Se dejó reaccionar, y al cabo de un tiempo descrito en resultados se procedió a efectuar la lectura de la absorbancia en el espectrofotómetro.

Resultados y Discusión Tabla 1: Cambios en la absorbancia medida en cada tratamiento empleado desde su tiempo inicial hasta el final para cloroplastos extraídos por filtración y después centrifugación diferencial en un medio de NaCl a 0.35M. Tratamientos Tiempo

Control

Tiempo

Oscuridad

Tiempo

Calor

Tiempo

Afalon

Tiempo

Cloroplastos

Absorbancia

0.26

0.00

0.30

0.00

0.21

0.00

0.21

0.00

0.25

Inicial Absorbancia Final Cambio de Absorbancia Fd(μmol/ml)

0.25

47.00

0.25

-0.01 0.0006

33.00

0.19

-0.05 0.0029

Control

Cloroplastos

35.00

0.26

-0.02 0.0012 Oscuridad

Calor

0.05 -0.0029

79.00

0.12 -0.13 0.0076

Afalon

0.020

DCPIP (μmol/ml)

0.018 0.016 0.014 0.012 0.010 0.008 0.006

0

5

10

15 26 Minutos

44

62

79

Gráfico 1: Cambio en la concentración de DCPIP para cada tratamiento, obtenido a partir del cambio de absorbancia medido en el sistema de cloroplastos aislados.

Los puntos han sido centrados en el mismo origen con respecto al tratamiento cloroplastos para resaltar las diferencias. Con la excepción del tratamiento Cloroplastos, todas las demás medidas fueron puntuales en los tiempos registrados, por lo que se trazaron líneas de tendencia para estimar mejor el comportamiento. El tratamiento control consistió en dos medidas independientes de todo el sistema pero sin cloroplastos, en distintos tiempos pero inmediatamente después de agregarles DCPIP para evidenciar que los cambios observados en la experiencia son debido a cada uno de los tratamientos en particular y no es un comportamiento predispuesto por el DCPIP.

De estos resultados se puede observar que el tratamiento con calor es el que tiene la pendiente más similar al control y más cercana a cero. Esto evidencia que este fue el tratamiento que tuvo la menor producción de Fd-, y esto muy probablemente se deba a una desnaturalización de las estructuras proteicas y de la membrana de los cloroplastos dejándolos incapaces de llevar a cabo el transporte de electrones entre fotosistemas. Es interesante considerar que en estas condiciones extremas de temperatura son inhibitorias para la fotosíntesis en plantas pero que existen otros organismos capaces de llevar a cabo los procesos mencionados en estas temperaturas, lo que indica que no es inviable llevar a cabo las

reacciones si las organelas y complejos proteicos se mantienen en su estructura y organización nativa (8). Otro de los tratamientos que mostró una tasa de fotosíntesis muy reducida fue el de oscuridad, ligeramente mayor al de calor. Este tratamiento tuvo como fin evaluar la dependencia de luz para la reducción del DCPIP, por la producción de Fd reducida. Se evidencia que hubo un cierto grado de reducción de Fd por lo que se sugiere que esto fue producto de la excitación de algunas moléculas de clorofila antes de guardar al sistema en oscuridad, lo que produjo un flujo de electrones que se habrían acumulado entre los intermediarios del proceso y que permitieron la reducción de algunas moléculas de Fd para así reducir algunas de DCPIP. Se puede sugerir entonces que la fotosíntesis pudo continuar para dar unos pocos productos más después de perder la fuente de excitación por luz. Al observar el tratamiento con Afalon se puede observar que es el único en el cual aumenta la concentración de DCPIP neutro, o no reducido (azul). Esto se puede explicar al considerar que el efecto del afalon sobre la fotosíntesis es inhibir competitivamente la reducción de PQb

por lo cual el PSII no puede descargar sus electrones y, dado que el sistema se mantuvo bajo la incidencia de luz, es posible que se haya inducido entonces la trimerización de las moléculas de clorofila y la consecuente producción de oxígenos reactivos, estos oxígenos reactivos muy probablemente interactuaron con el DCPIP para des-protonarlo y así oxidarlo. También debe mencionarse que el coeficiente de extinción molar del DCPIP es altamente dependiente de pH de la solución que la contenga (7) por lo cual si el oxígeno reactivo causó la lisis de las membranas del tilacoides se pudieron liberar una cantidad considerable de protones que acidificó la solución y disminuyó el coeficiente, aumentando así la absorbancia de las moléculas de DCPIP y dando valores más altos a los reales de concentración calculada. Ambas son posibilidades son mutuamente inclusivas y pueden explicar la razón por la cual se observa un aumento en la concentración, si el ambiente ácido abundante en protones por la lisis del tilacoide y los oxígenos altamente reactivos juntos promovieron la desprotonación y oxidación del DCPIP.

0.016

DCPIP

Fd-

0.014

y = -9.42e-5x + 0.014 R² = 0.997

μmol/ml

0.012

0.010 0.008 0.006 y = 9.42e-5 + 0.0002 R² = 0.9562

0.004 0.002 0.000 0

5

10

15

26

44

62

79

Minutos Data Source: Data 1 in Notebook2 Equation: Standard Curves, Linear Curve

f = y0+a*x R Rsqr Adj Rsqr 0.9972 0.9955 0.9936

Standard Error of Estimate 0.0002

Coefficient Std. Error

t

P

y0 0.0144 0.0001 124.3942