EXTRACCION DE ADN

UNIVERSIDAD NACIONAL HERMILIO VALDIZAN
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE AGRONOMÍA






TEMA:
EXTRACCION DE ADN
CURSO : BIOTECNOLOGIA E HIDROPONIA
DOCENTE : TELLO VILLAVICENCIO, Milka
ALUMNOS : LÓPEZ PRESENTACIÓN, ORLANDO
ROSALES DURAN, WANYU


HUÁNUCO – PERÚ
2014
CONSEGUIR LA MUESTRAS

Se va al campo a buscar las muestras ellas pueden ser cultivado o silvestre y además debe estar libre de enfermedades y en buenas condiciones.

METODOLOGÍA

En bolsitas de papel rotulado y se coloca en hielo seco
En bolsas de plástico con granos de cilicagel (seca muestra sin degradar ADN) siempre lleva en forma regular

A) CALIDAD DE ADN
Para la prueba de calidad necesitamos preparar un gel de agarosa al 1%. Y con buffer de corrida NEB al 1x

B) Preparación:
Si vamos a correr un gel pequeño solo necesitamos 40 ml de gel.
Tomamos 4ml de buffer que está concentrado 10 veces y lo llevamos a 40ml con agua destilada, agregamos 0.4g de agarosa, lo llevamos al microondas por unos 40 segundos , o hasta que hierva; se deja enfriar hasta 65°C y se vierte en el molde previamente preparado y con los peines adecuados.
Se deja solidificar por unos 15 minutos y se coloca en as cámara electroforética, la cual debe contener el buffer de corrida NEB a la misma concentración con la que fue preparado el gel.



B) Preparación de muestra
Se toma 1.0ul de muestra de ADN, se mezcla con 5ul de blue juice y se procede a colocarlos en el gel junto con las muestras se corre un marcador de concentración conocida, con el cual vamos a poder cuantificar el ADN de la muestra, en este caso vamos a usar Lambda Hindlll.
Una vez colocadas todas las muestras se cubre la cámara se conectan los electrodos en sus respectivos lugares (positivo con positivo, negativo con negativo) y se aplica corriente; para el gel pequeño usamos aproximadamente entre 60 y 70 voltios por una 1hora.
Sacar el gel y colocarlo en una bandeja conteniendo Bromuro de Etidium, a una concentración final de 0.5ug/ml, dejar teñir por unos 15 minutos, enjuagar otros 10, minutos, colocarlo en el transluminador y capturar la imagen.
Lambda Hindlll en 4 ul:
160ng primera banda
65ng segunda banda
45ng tercera banda
30ng cuarta banda
C) PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ADN A PEQUEÑA ESCALA
Método CTAB (Bromuro de hexadecil treimetil amonio) a pequeña escala de Doyle & Doyle (1990), aplicado para la extracción de tejidos vegetales.
Pesar 100 mg de tejido foliar fresco, triturar en un mortero previamente enfriado con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino



Transferir el polvo a un tubo eppendorf de 1.5 ml: Añadir 700ul e buffer de extracción CTAB (CTAB 2% 1.4mM NaCl, 100mM Tris HCl pH 8.20 mM EDTA pH 8) y 2ul de B – mercaptoetanol, mezclar bien agitando suavemente cada 10 a 15 minutos. Dejar enfriar a temperatura ambiente por 2 a 5 minutos.


Agregar a cada tubo 700 ul cloroformo: Alcohol isoamílico. Mezclar suavemente por inversión para no dañar el ADN.










Centrifugar las muestras a 14000 rpm por 5 minutos a 4°C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Tener cuidado de no absorber la interface.












Agregar 50ul de tampón CTAB al 10% (en NaCl, 0.7M) agitar suavemente hasta obtener una mezcla uniforme , luego agregar 700ul de cloroformo : alcohol isoamilico y mezclar suavemente , Centrifugar a 14000 rpm por 5 minutos y transferir el sobrenada mente a un nuevo




Añadir igual volumen (400 – 500ul) de isopropanol frío (-20°C) y mezclar suavemente hasta visualizar el pellet o "medusa" de ADN. Incubar a 4°C por 30 minutos o 15 minutos a -20°C.










Centrifugar a 14000rpm por 15 a 20 minutos, eliminar el sobrenadante sin perder el precipitado. El ADN precipitado se deja secar invirtiendo los tubos abiertos por 2 minutos.













Lavar 2 veces el ADN precipitado en 1 ml de etanol al 70% por 3 minutos. Centrifugar las muestras a 14000 rpm por 15 a 30 minutos. Eliminar el etanol y agregar 1ml de etanol al 90% centrifugar las muestras a 14000 rpm durante 30 minutos y eliminar el etanol. Dejar que el precipitado seque a temperatura ambiente por 12 – 14 horas o en vacío por 15 minutos.









Diluir el ADN precipitado en 100ul de T E (10 mM Tris HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0, agregar 2 ul de RNAsa 10 mg/ml (libre de DNAsa) agitando suavemente y llevar a incubar las muestras a 37°C por 1 hora.










Almacenar las muestras a 4°C o -20°C