Estudio morfológico comparativo de microfilarias de Onchocerca volvulus de Liberia, Togo y Venezuela

CAICET, Pub/. Cient. N° 3, 1985, 125-138

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Estudio morfológico comparativo de microfilarias de Onchocerca volvulus de Liberia, Togo y Venezuela (Comunicación preliminar) CARLOS BOTT0 1, LIGIA SAMPSON2, MYRTHA ARANGd, PEDRO BELMONTE2, CARLOS AYESTA 3 Y LUIS YARZABAL 2 1

Sección de Endemias Rurales, Instituto de Medicina Tropical, Universidad Central de Venezuela, Apartado 2109, Caracas, Venezuela.

2 Centro Amazónico para Investigación y Control de Enfermedades Tropicales «Simón Bolívar» (CAICET), Apartado 59, Puerto Ayacucho 7101, Territorio Federal Amazonas, Venezuela.

3 Laboratorio

de Fotografía, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela

Resumen

Se estudiaron las características morfológicas de microfilarias de Onchocerca vo/vulus de la Sierra Parima (Alto Orinoco, Venezuela), Togo y Liberia, procesadas con una técnica estandarizada de fijación y coloración y se determinaron los recuentos nucleares de mfs de Togo y Parima, de acuerdo con la técnica de Tada et al. (1981), comparándose las diferentes poblaciones por análisis de varianza. Los resultados demostraron diferencias significativas en todas las variables examinadas entre Parima y Liberia y en 6 de 9 variables entre Parima y Togo, así como en los recuentos nucleares . En Liberia se comprobó la existencia de una variedad fácilmente distinguible de las mfs de Parima y Togo. Los hallazgos preliminares apoyan la existencia de razas geográficas de O. volvulus asociadas a diferentes especies de simúlidos vectores y sugieren que podrían ser diferenciables morfológicamente en la fase de microfilaria. Introducción

Onchocerca volvulus comprende un conjunto de razas geográficas, que se diferencian por su capacidad para infectar distintas especies de simúlidos vectores, por su patogenicidad para el hombre y animales de experimentación y por los patrones de actividad enzimática de las microfilarias (De León et al., 1966; Duke et al., 1966 y 1972; Duke, 1970 y 1981; Ornar, 1978 y 1982; Prost et al., 1980; Yarzábal et al., 1983c). El reconocimiento de que la adaptación a los ve.:tores locales parece ser un factor importante de selección natural (Sasa, 1979) ha llevado a distinguir a dichas razas geográficas con el nombre de complejos Onchocerca- Simulium. Évidencias preliminares sugieren que en el Alto Orinoco (Venezuela) y en el Territorio Roraima (Brasil) existe un peculiar complejo Onchocerca-Simulium, responsable de la severa endemia oncocercósica que sufre el grupo indígena yanomama. Este foco geo-

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C. Botto el al.

gráficamente aislado se caracteriza por presentar pacientes con altas cargas parasitarias en la piel y con microfilarias en la cámara anterior del ojo, en la sangre y en la orina de un elevado número de individuos (Rassi el al., 1978; Botto el al., 1982; Yarzábal el al., 1983a) En estos pacientes son frecuentes los nódulos cefálicos, las lesiones oculares y las lesiones severas de piel y sistema linfático (ingle colgante). Los transmisores principales en este foco son S. pinloi y S. cuasisanguineum (Ramírez-Pérez el al., 1982) . El objetivo de este trabajo es investigar si las características fisiológicas antes mencionadas (patrones de actividad enzimática, patogenicidad para el hombre, infectividad para el vector) se asocian con caracteres morfológicos de las microfilarias Tal tipo de estudio ha sido desalentado por la diversidad de técnicas y de resultados obtenidos , a pesar de la importancia taxonómica que en el nivel específico posee la anatomía de las microfilarias (Bain, 1975 y 1981). Sin embargo, Schiller et al. (1979), demostraron diferencias significativas entre microfilarias de Alto Volta y Guatemala empleando una técnica estandarizada de fijación, y estudios realizados en la Sierra Parima revelan que algunas de las técnicas para el estudio de microfilarias producen resultados fácilmente reproducibles (Botto el al., 1983). Por otra parte, la técnica de recuentos nucleares empleada para diferenciar poblaciones mendelianas de filarías también encuentra en este campo fértil aplicación (Schacher el al., 1969; Tada el al., 1981).

Material y métodos Los ejemplares estudiados provenían de las siguientes localidades: 1) Parima B, región de sabana de altura de la Sierra de Parima, rodeada por áreas de bosque húmedo premontano (altitud 1.050 mts; precipitación anual de 1. 100 a 1.200 mm; latitud 2° 44' N; longitud 64° 05' Oeste), Venezuela, Sudamérica. 2) Región de selva húmeda de Libería, Africa . 3) Región de sabana de Togo, Africa. Los ejemplares de Liberia y Togo fueron obtenidos por gentileza del Dr. B. O . L. Duke (Unidad de Filariasis, OMS), del Dr. H. Schulz-Key (Bernhard-Nocht Institut, Hamburg) , y de la Universidad de Tubingen (Tropenmedizinisches Institut). Todas las microfilarias (mfs) estudiadas fueron obtenidas del útero de diferentes ejemplares hembra de O. volvulus, de cada localidad, secadas sobre una lámina, fijadas en metano! en el campo y coloreadas en los laboratorios del CAICET, Puerto Ayacucho (Venezuela) con Giemsa Merck en tampón fosfato de Sorensen de pH 7.2 (KH 2P0 4 2.0mM Na 2HP0 4 12Hp 4.7mM). Se estudiaron 100 mfs intrauterinas de Parima B (1 ejemplar hembra/2 láminas), 87 mfs intrauterinas de Liberia (2 ejemplares hembra 360-1 y 360-3/4 láminas) y 50 mfs intrauterinas de Togo (1 ejemplar hembra 55-8/2 láminas) . Las microfilarias de O. volvulus para recuentos nucleares fueron obtenidas de la misma fuente, fijadas en etanol absoluto: ácido acético en proporción 3:1, lavadas en etanol al 70o/o y trasladadas al laboratorio, donde se codificaron para ser estudiadas por dos observadores, sin conocimiento de la localidad de procedencia. Las microfilarias fueron coloreadas con orceína acética y sometidas a la técnica de «squash» (Tada el al., 1981). Aquéllas adecuadamente fijadas y coloreadas por esta técnica resultaron pertenecer a 3 ejemplares hembra de Togo (53-1, 55-8 y 64-1), con un total de 120 mfs y a 1 ejemplar hembra de Parima (115 mfs). Para cada población se determinó el tamaño de la muestra (N), la media aritmética (X), el desvío estándar (DE), y el coeficiente de variabilidad (CV = DE x 100/ X).

Comparación de microfilarias de Africa y Venezuela

127

Las diferencias entre distintas poblaciones se investigaron mediante los coeficientes de diferencia CD = [Xa- Xb 1 DEa + DEb], donde a y b son las poblaciones comparadas, y mediante análisis de varianza, con la ayuda de una computadora Apple II Plus, determinándose la probabilidad (P) de que las diferencias halladas sean debidas al azar. El valor CD = 1.28 indica que más del 900Jo de la población A difiere del 90% de la población B, si la distribución de ambas poblaciones es normal y si DEa ~ 1.5 DEb (Mayr et al., 1953; Schacher y Geddawi, 1969). -

1

Resultados l. Estudios morfobiométricos

En las microfilarias adecuadamente fijadas se tiñeron intensamente los núcleos con el colorante de Giemsa, destacándose nítidamen te el espacio cefálico (EC), el anillo nervioso (AN), la célula R1 (R-1) y el último núcleo (UN) que delimita el espacio caudal. La célula excretora, las células R2 a R4 y la vesícula anal habitualmente tienen límites menos precisos con esta técnica. En todos los casos se determinó la distancia de cada una de las estructuras anatómicas al extremo cefálico, tanto en valor absoluto como en porcentaje de longitud total. Las microfilarias de Parima 8 miden con esta técnica, en promedio, 249.9 micras de longitud por 5.7 micras de diámetro mayor, y presentan un espacio cefálico muy corto, de 6.2 micras en promedio, que representa el 2.2% de la longitud corporal (Fig. 1-A). Las características biométricas comparativas se presentan en el Cuadro l . Las microfilarias de O. volvulus de Liberia son notables por presentar un cuerpo muy corto, un diámetro mayor que en las cepas de Togo y Parima, y un espacio cefálico llamativamente largo, de 10.0 micras en promedio, que representa el4.8% de la longitud corporal y que a veces alcanza hasta el 11.1 OJo de la longitud corporal. (Fig. 1-B). Las microfilarias de O. volvulus de Togo son en general más largas y finas y poseen un espacio cefálico de 7.6 micras en promedio, que representa el 2.8% de la longitud corporal, inás grande que en la cepa de Parima, pero mucho más pequeño que en la cepa de Liberia. Los histogramas de frecuencias mostraron en la mayor parte de las variables estudiadas una distribución normal o una clara tendencia hacia ese tipo de distribución. Los coeficientes de variabilidad fueron relativamente pequeños en Parima, mayores en Togo y muy grandes en Liberia. Las diferencias en la dispersión de los valores entre Parima y Liberia se aprecian bien en la Figura 2. Sin embargo, los valores expresados en porcentaje de longitud total mostraron una variabilidad mucho menor. Cuando se comparan los valores porcentuales obtenidos para cada una de las variables por análisis de varianza se obtienen los resultados presentados en la Figura 3. Dentro de cada población se compararon microfilarias procedentes de diferentes láminas y/,o de diferentes ejemplares hembra. Resuita claro que dentro de cada población se revelaron pocas diferencias significativas (A, B, C), pero entre Parima y Togo (D) se observaron diferencias significativas en 6 sobre 9 variables y entre Parima y Liberia en todas las variables analizadas (F); asimismo, los CD mostraron valores significativamente elevados entre Parima y Liberia . Las microfilarias de Parima se diferencian fácilmente de las de Liberia. En esta última localidad la mayor parte (84.2%) de los ejemplares corresponden a una variedad pequeña y gruesa, de espacio cefálico grande, en tanto que un 15 .8% corresponden a una variedad grande y fina, de espacio cefálico pequeño. Cuando se disponen en una

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C. Botto et al.

~-

A

FIGURA 1 Microfilarias intrauterinas de Onchocerca volvu/us s.l. fijadas en metano! y coloreadas en Giemsa (1000 X). A Sierra de Parima, Alto Orinoco, Venezuela. B Liberia, Africa. Las flechas indican el espacio cefálico y el anillo nervioso.

-

LIBERIA

200

D

250

Valores de longitud total expresados en micras

150

50

PARIMA

300

FIGURA 2 Longitud total en Microfilarias de Onchocerca volvulus de Liberia y Parima

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D = PARIMA vs TOGO

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A

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H

H

H

H

H

~

LT Longitud total; AM Ancho máximo ; EC Espacio cefálico; AN Anillo nervioso; CE Célula excretora; CR1 Célula R1; CR2 Célula R2; UN Ultimo núcleo; ECA = Espacio caudal. Medidas expresadas en porcentaje de longitud total , salvo LT expresada en micras. P = Valor de probabilidad por análisis de varianza.

=

-

,-,

A. = PARIMA vs PARIMA

LT

AM

EC

AN

CE

CR1

CR2

UN

ECA

p ( 0.01

F = LIBERIA -vs -PARIMA - -- -

C = LIBERIA vs LIBERIA

F

FIGURA 3 Diferencias biométricas entre poblaciones de O. volvulus de diferentes localidades 1

~

~

o

tl:l ~

0

1~

131

Comparación de microfilarias de Africa y Venezuela

gráfica x = Longitud total/Diámetro máximo y = EC OJo (espacio·cefálico expresado en porcentaje de longitud total) ambas poblaciones se separan claramente, observándose que algunos ejemplares de Liberia tienen valores semejantes a los de Parima (Fig. 4). Las mfs de Togo son morfológicamente similares a las de Parima y a la variedad grande de Liberia .

2. Recuentos nucleares Las microfilarias de O. vo/vu/us de Parima presentan valores de recuentos nucleares entre espacio cefálico y anillo (Fig. 5) claramente supe,riores a los de Togo {Cuadro 2). Tales diferencias son estadísticamente significativas (P 0.01). Las diferencias entre distintos ejemplares hembras en Togo no son en cambio significativas (P 0.01) .

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>

Discusión Diversos autores están de acuerdo en la importancia de la anatomía y de los recuentos nucleares de las microfilarias para su identificación a nivel específico y poblacional (Schacher y Gedawi, 1969; Bain 1975 y 1981; Yarzábal et al., 1983b). En este sentido, son yaliosas las coincidencias registradas en el estudio del complejo _Onch_oqerca- Simulium de Centroamérica por Gibson (1952}, Martínez Palomo et al. (1977) y Schiller et al. (1979), en períodos muy alejados en el tiempo. El presente trabajo constituye una comunicación preliminar, basada en el estudio de un número pequeño de microfilarias y de ejemplares hembra de cada localidad, lo cual impide extraer conclusiones definitivas. Sin embargo, puede señalarse que la posición relativa de las diferentes estructuras anatómicas de la microfilaria es muy constante dentro de cada localidad, hecho reconocido por varios autores (Fülleborn, 1913; Gratama, 1970; Botto et al., 1983). La ausencia de diferencias significativas dentro de cada localidad y la presencia de tales diferencias entre localidades alejadas sugiere la existencia de razas geográficas morfológicamente diferenciables . La existencia de una variedad dominante en Liberia, con espacio cefálico grande, fácilmente distinguible de las mfs de Parima o de Togo , constituye el hallazgo más sorprendente. El valor promedio de longitud del espacio cefálico, de 4.8% en Liberia se aproxima al hallado por Gratama (1970) y casi duplica los valores observados en Parima (2.5%) y Togo (2.8%). No obstante, debe notarse que la variabilidad intrapoblacional no ha sido adecuadamente investigada. La mayor variabilidad observada en Liberia podría depender del mayor número de ejemplares hembra incluidos en el estudio en esta localidad, aunque la coexistencia en Africa de una variedad pequeña y una variedad grande de microfilarias de O. vo/vu/us ha sido mencionada reiteradamente por diversos autores ~iacklock, 1926; Gratama, 1970; Sasa, 1979). Según Gratama (1970), M. Wanson sugiere que podrían representar formas incipientes de diferenciación sexual aunque tal interpretación no está de acuerdo con las frecuencias de cada una de las variedades observadas en este trabajo. Gratama (1970) sostiene que tales variedades pueden expresar un diferente grado de retracción de las microfilarias en frotis de espesor desigual. Aunque un proceso de secado lento en atmósfera húmeda puede producir una marcada retracción de las microfilarias en frotis gruesos (Fülleborn, 1913; Gratama, 1970; Botto et al., 1984), tal efecto no se observa con la misma intensidad con la técnica de fijación en metano!. Por otra parte, este efecto no explica las llamativas diferencias en la longitud del espacio cefálico entre las microfilarias de Liberia y las de Parima y Togo . Las observaciones realizadas sugieren que tales diferencias no traducen una diferenciación sexual ni constituyen un artefacto de técnica, sino que _expresan más bien la existencia

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C. Botto et al.

FIGURA 4 Longitud del espacio cefálico y relación longitud/ancho máximo en microfilarias de Liberia y Parima EC% o

o o

10-

o o o

o

o

o

*** ~o LT/AM

20

30 o

LIBERIA

40 'f

50

PARIMA

EC% = Longitud de espacio cefálico expresado en porcentaje de longitud total. LTIA M = Longitud total/Ancho máximo expresado en micras.

Comparación de microfilarias de Africa y Venezuela

B FIGURA 5 Microfilarias de Onchocerca volvulus s.l. de la Sierra de Parima, Venezuela. Tin ción con orcefna para recuentos nucleares. La flecha indica el anillo nervioso. A 400 X. B. 2000 X.

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Parima

(2.8 ± 0.5)

(4.8 ± 2.0) 51.2 ± 7.6

59.0 ± 1.9

++

87

100

~a muestr~a

Tamañ~

de

214

7.0 1.0) 112

239.2 (95.7 -

1.5)

+ 30.0 199.1 -+ (95.1 - 1.0)

+ 17 .8 138.5 -+ (68.9 - 3.6)

4.8

++

175.1 (70.1 -

(24.3 -+ 2.0)

(23.5 ± 0.8)

N° Ejemplares hembra/ N° Láminas

Ultimo núcleo

Célula R 1

Anillo nervioso

7.6 ± 1.5

10.0 ± 3.4

(2 .5 ± 0.3)

+

112 50

255.3 -+ 18.4 (96.0 - 0.9)

+ 14.0 179.2 -+ (67 .8 - 4.6)

62.0 ± 4.7 (23.3 -+ 2.1)

(2.0 ± 0.4)

(3.4 ± 0.7)

6.2 ± 0.7

± 0.9

Espacio cefálico

6.9

± 19 . ~ 5.2 ± 0.8 266 .0

± 6.6 ± 0.2 (2.2 ± 0.2)

S. damnosum s.s.

5.7

249 .9

Togo

Sabana

Diámetro máximo

S. sanctipau/i S. yahense 208.6 ± 30.5

Selva húmeda

Liberia

AFRICA

Longitud del cuerpo

S. pintoi

Sabana de altura

Vectores Principales

Ecosistema

Sudamérica

CUADRO 1 Dimensiones en micras de microfilarias de O. volvulus de Parima, Liberia y Togo XZ: 1 desvío estándar. Entre paréntesis: porcentaje de longitud total.

1

1

......

1[

~

1~

""

......

87.73

80.10

69.36

Amenca Central (Guatemala) *

Sudamérica (Venezuela)

Africa Occidental (Togo)

(*)De acuerdo conTada et al., 198 1

Media

Localidad

7.96

4. 19

6.87

Desvío estándar

0.67

0.39

0.69

.E rror estándar

11.48

5.23

7.83

Coeficiente variabilidad

141

115

100

Tamaño de la muestra

Recuentos nucleares en Microfilarias de O. volvulus de Sudamérica, Centroamérica y Africa

CUADRO 2

º

.....

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136

C. Botto et al.

de diferentes razas geográficas, asociadas con distintas especies de simúlidos: S. pintoi - S. cuasisanguineum en la sabana de Parima, S. damnosum s.s. en la sabana de Togo y S. yahense- S. sanctipauli en la selva húmeda de Liberia (Duke, 1981; Ramírez Pérez et al., 1982). Las mfs de Parima difieren de las mfs de Liberia no solamente en la morfología y biometría, sino también en los patrones de fosfatasa áCida y en la prevalencia en el humor acuoso y en la sangre. Sin embargo, esta última diferencia puede depender también de la carga parasitaria, que es mayor en Parima, (Prost et al., 1980; Yarzábal et al., 1983b) o bien de una menor destrucción de mfs por mecanismos inmunes . En relación. con ésto debe señalarse que en Parima se han evidenciado antígenos circulantes, que son capaces de inhibir in vitro la proliferación de linfocitos por activación de células supresoras (Arango et al., 1983; Des Moutis et al., 1983; Ouaissi el al., 1983). La separación entre las mfs de sabana de Togo y de selva húmeda de Liberia es igualmente nítida, como lo son las diferencias en la patogenicidad, infectividad para el vector y patrones de fosfatasa ácida entre las cepas de selva y de sabana de O. volvulus en Africa Occidental (Duke et al., 1966; Duke & Anderson, 1972; Ornar, 1978; Prost, 1980; Prost et al., 1980; Duke, 1981). Las diferencias morfológicas y biométricas entre las microfilarias de Parima y Togo no son tan claras. Aunque difieren significativamente por análisis de varianza, existe clara sobreposición de los valores, que muestran mayor dispersión en Togo. La escasa variabilidad observada en Parima podría ser un atributo de una pequeña población aislada, pero también puede expresar el pequeño número de láminas examinadas, similar por otra parte al de Togo. Los recuentos nucleares mostraron diferencias significativas entre microfilarias de Parima y Togo, así como entre Parima y Guatemala (Tada et al., 1981; Yarzábal et al., 1983b). Aunque la variabilidad intrapoblacional no ha sido bien estudiada en estas localidades, en Togo no se detectaron diferencias intrapoblacionales significativas. Los hallazgos morfológicos y en los recuentos nucleares confirman que los complejos

Onchocerca-Simulium de Centroamérica y Sudamérica se separan nítidamente de los complejos africanos, como lo sugieren las experiencias de infección cruzada de Simúlidos (Duke, 1970) y los patrones de actividad enzimática de las microfilarias (Ornar, 1978 y 1982; Yarzábal et al., 1983c). Son necesarias aún nueva,¡; investigaciones, asociando estudios morfológicos de mfs fijadas en formaldehido cori estudios enzimáticos y de infección cruzada de simúlidos, para esclarecer las relaciones del complejo Onchocerca-Simulium del Alto Orinoco con otros complejos de Centroamérica y Africa. Summary

Morphological characteristics of Onchocerca volvulus microfilariae from Parima (Upper Orinoco Basin), Togo and Liberia were studied, using the same fixing and staining techniques. Significant differences in severa! biometric variables and in nuclear counts were found among these demes . This preliminary evidence suggests the existence of morphologically distinct geographical strains of O. volvulus. Agradecimientos

Se agradece especialmente al Dr. B.O.L. Duke (Unidad de Filariasis, OMS) y al

Dr. H. Schulz-Key (Bernhard-Nocht Institut. Hamburg), el envío de microfilarias de

Comparación de microjilarias de Africa y Venezuela

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Togo y Liberia . Este trabajo fue financiado en parte mediante subvenciones del CONICIT (Proyecto Sl -1128), del PROICET-Amazonas y del Ministerio de la Investigación .y la Industria de Francia (Proyecto 81-L-0013).

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