ESTUDIO DE UN MÉTODO EFICAZ PARA LA DETECCIÓN DE ESCHERICHIA COLI EN AGUAS

0.

ÍNDICE

0. ÍNDICE.....................................................................................................................................1 1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................5 1.1 IMPORTANCIA DE LOS ORGANISMOS COLIFORMES ........................................5 1.2 ....................................................... IMPORTANCIA DE LA ESCHERICHIA COLI 7 1.2.1 ....... IMPORTANCIA DE LA ESCHERICHIA COLI EN SANIDAD MEDIOAMBIENTAL. 8 2. DETERMINACION DE COLIFORMES.................................................................................9 3. OBJETIVO DEL ESTUDIO ....................................................................................................9 4. MÉTODOS Y MATERIALES.................................................................................................9 5. DESARROLLO DEL ESTUDIO ...........................................................................................10 5.1 ESTUDIO DE LOS MEDIOS USANDO CULTIVOS PUROS..................................10 5.1.1 ..........................................................................ESTUDIO DE ESPECIFICIDAD 11

5.1.2ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD, EFICIENCIA, EXACTITUD Y PRECISION DE RECUENTO DE LOS M 5.2 ESTUDIO DE LOS MEDIOS USANDO MUESTRAS REALES ..............................17 5.3 ESTUDIOS ESTADÍSTICOS ......................................................................................18 6. IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS .....................................................................................21 7. CONCLUSIONES ..................................................................................................................21 8. OBJETIVOS ...........................................................................................................................23 8.1 OBJETIVO PRINCIPAL .............................................................................................23 8.2 OBJETIVOS INTERMEDIOS.....................................................................................23 9. MATERIAL Y MÉTODOS....................................................................................................24 9.1 MUESTRAS DE AGUA..............................................................................................24 9.1.1 ................................................................................ AGUAS SUPERFICIALES 24 9.1.2 ............................ AGUAS SOMETIDAS A DIFERENTES TIPOS DE TRATAMIENTO 24 9.1.3 ............................................................................... AGUAS SUBTERRÁNEAS 25

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9.2 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS MEDIANTE MÉTODOS CROMOGÉNICOS ......................................................................................................25 9.3 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS MEDIANTE MÉTODOS FLUOROGÉNICOS.....................................................................................................25 9.4 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS MEDIANTE LOS MÉTODOS DE REFERENCIA..............................................................................................................25 9.5 RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS ...................................................25 9.6 VERIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS ..........................................26 9.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS ............................................................26 10. RESULTADOS ......................................................................................................................26 10.1 .......................................................... 3.1. MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL 26

10.1.1ANÁLISIS DE LA CAPACIDAD DE LOS MÉTODOS ID, MP Y CT PARA DETECTAR E. COLI EN AG 10.1.2ANÁLISIS DE LA CAPACIDAD DEL MÉTODO ID PARA DETECTAR COLIFORMES TOTALES Y E. 10.2 .................... AGUAS SOMETIDAS A DIFERENTES TIPOS DE TRATAMIENTO 31

10.2.1MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL O EFLUENTES DE ALTA CALIDAD MEZCLADAS CON AGUA 10.2.2........................................ MUESTRAS DE AGUA MARGINALMENTE CLORADA 35 10.3 ........ MUESTRAS DE AGUA SOMETIDA A PROCESOS DE POTABILIZACIÓN 39 10.4 .............................................................MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA 40 10.5MUESTRAS DE AGUA CON ELEVADOS NIVELES DE BACTERIAS HETEROTROFAS 46 11. CONCLUSIONES ..................................................................................................................48 12. BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................49

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ESTUDIO DE UN MÉTODO EFICAZ PARA LA DETECCIÓN DE ESCHERICHIA COLI EN AGUAS

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PROYECTO REALIZADO POR EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DEL ISTITUTO DE INVESTIGACIONES Y ANÁLISIS ALIMENTARIOS DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Y EL LABORATORIO CENTRAL DE AQUAGEST GALICIA.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

PROFESOR DOCTOR MANUEL JOAQUÍN GARRIDO VÁZQUEZ PROFESOR DR. D. MANUEL ARAUJO PRADO PROFESORA DRA. DÑA. ROSA ANA SUEIRO BENAVIDES D. CARLOS SANTOS RODRÍGUEZ

LABORATORIO CENTRAL AQUAGEST GALICIA

D. MARIANO JULIO GÓMEZ LÓPEZ (INVESTIGADOR PRINCIPAL) DÑA. MARÍA JOSÉ VÁZQUEZ GARCÍA DÑA. MARÍA DEL PILAR PENA CAAMAÑO DÑA. MARÍA TERESA DÍAZ DÍA

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1.

INTRODUCCIÓN

La próxima entrada en vigor de la Directiva 98/83 [1], sobre la calidad de las aguas destinadas al consumo público, que obliga a la determinación individual de la Escherichia coli, además de las coliformes totales supone, para las empresas suministradoras de agua, la adopción de nuevas estrategias de medida de dichas bacterias. Esta nueva reglamentación modifica a las nacionales de diversos países de la CEE y USA [2-6], que hasta este momento exigían solo la determinación de coliformes fecales y coliformes totales y, se adapta a las nuevas recomendaciones que la OMS [2] dio para la calidad bacteriológica de aguas potables en 1993. Estas directrices se enmarcan dentro de nuevos criterios de contaminación, según los cuales los organismos coliformes se analizan solo como señalizadores de la eficacia del tratamiento y la integridad del sistema de distribución no como indicadores de la presencia de patógenos, mientras que los organismos coliformes termotolerantes, en este caso los se analizan como indicadores de polución fecal. Hasta este momento, en casi todos los laboratorios de estas empresas se determinan coliformes totales y coliformes fecales de acuerdo con la definición siguiente: todo bacilo gramnegativo, capaz de desarrollarse en presencia de sales biliares u otros agentes (tensioactivos) que tengan propiedades similares inhibitorias del crecimiento y que sean capaces de fermentar la lactosa a temperaturas de 35º ó 37ºC, con producción de ácido, gas y aldehido en un lapso de 24 a 48 horas; también son oxidasa negativas, no esporágenas y reducen el nitrato a nitrito. Este grupo comprende, según la clasificación de Clark y Pagel los géneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter pertenecientes a la familia de las enterobacterias. Sin embargo, hay autores que discrepan de esta clasificación como Lecrerc y Mossel [7] que incluyen Serratia y Buttiauxella. En 1904, Eijkman [8] propuso que la producción de gas a partir de glucosa a 46º C podría ser un buen método para la determinación de coliformes de origen fecal. Una modificación de este método sirve para definir las bacterias coliformes fecales termotolerantes, que son las que poseen las propiedades antes citadas a una temperatura de 44º ó 45ºC. Estas últimas, cuando fermentan tanto la lactosa como otros sustratos adecuados, como el manitol, a las mismas temperaturas con producción de ácido y gas y que también forman indol a partir del triptófano, se consideran como presuntivas. Se puede confirmar que se trata de mediante la demostración de un resultado positivo en la prueba del rojo de metilo, al no producir acetilmetilcarbinol y no utilizar citrato como única fuente de carbono. Estas no son definiciones taxonómicas sino prácticas de trabajo que se usan en el análisis del agua y, en ese sentido, están comprendidos miembros de diversos géneros. Así por ejemplo, algunos organismos que desde el punto de vista taxonómico se identificarían como coliformes no serán reconocidos como tales cuando se analizan en el agua, como también algunas cepas de que no son termotolerantes. En estos ejemplos se incluyen especies de bacterias coliformes que son anaerogénicas y algunas que no fermentan la lactosa. Dentro de los coliformes termotolerantes aparte de la E. coli, se pueden encontrar, entre otros menos frecuentes, Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae.

1.1

IMPORTANCIA DE LOS ORGANISMOS COLIFORMES

El uso de organismos intestinales normales como indicadores de contaminación fecal, en lugar de los patógenos mismos, es un principio de aceptación universal en la vigilancia y evaluación de la seguridad microbiana en los sistemas de abastecimiento de agua. Lo ideal sería que el hallazgo de dichas bacterias indicadoras denotara la presencia posible de todos los organismos patógenos pertinentes. Las exigencias a las que debe responder un organismo indicador las podemos agrupar en: ♦

Epidemiológicas: La relación entre un indicador, su naturaleza o concentración y la probabilidad de aparición de infecciones en la población debe establecerse a partir de estudios o encuestas epidemiológicas.

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♦

Ecológicas: Un buen indicador debe ser específico de contaminación fecal; debe hallarse de forma constante en las heces de los animales de sangre caliente y estar asociado de forma exclusiva a las aguas residuales. Es decir, su presencia en ambientes no polucionados debe ser mínima o nula.

♦

Bacteriológicas: Los organismos indicadores deben ser más resistentes que los patógenos a los agentes desinfectantes y por otra parte, ser incapaces de reproducirse o crecer, en el ambiente acuático.

♦

Taxonómicas: Los organismos indicadores deben ser fácilmente reconocibles y clasificables en especies de acuerdo con los criterios bacteriológicos existentes. Es decir, cuando un organismo indicador corresponda a una población de determinados organismos, ésta debe estar perfectamente definida.

♦

Metodológicas: Un buen organismo indicador debe ser fácilmente aislable, identificable y enumerable en el menor tiempo posible y con el menor coste. Debe ser capaz de crecer en los medios de cultivo empleados, estar distribuido al azar en las muestras y ser resistente a la inhibición de su crecimiento por otras especies.

En la práctica, todos estos criterios no pueden darse en un solo organismo, aunque las bacterias coliformes cumplen muchos de ellos: están siempre presentes en aguas que contienen patógenos entéricos, su tiempo de supervivencia es muy superior al de microorganismos productores de enfermedades: Mc Feters y colaboradores [9] señalan que mientras un coliforme sobrevive una media de 17 horas, una Salmonella typhi tiene una vida media de 6 horas y un Vibrio cholerae tiene una vida media de 7,2 horas, razón por la cual puede suponerse que en la mayoría de los casos en los cuales el agua no contenga coliformes estará libre de bacterias productoras de enfermedades. Por otra parte, el mejor indicador conocido de contaminación fecal de origen humano o animal es la presencia de coliformes fecales, ya que las heces contienen dichos microorganismos, presentes en la flora intestinal, y, de ellos, entre un 90% y un 100% son mientras que en aguas residuales y muestras de agua contaminadas este porcentaje disminuye hasta un 59% [10]. De echo, un gramo de heces humanas contiene entre 5*109 y 5*1010 bacterias. Es decir, más del 40% del peso húmedo de las heces humanas está compuesto de células bacterianas. Si bien las bacterias coliformes pueden no tener relación directa con la presencia de virus en aguas potables, el uso de la prueba coliforme sigue siendo esencial para vigilar la calidad microbiana del agua en los sistemas de abastecimiento. Se sabe que los quistes de algunos parásitos son más resistentes a la desinfección que los organismos coliformes. La ausencia de estos últimos en agua de superficie que solamente ha sido desinfectada no significa necesariamente que también haya ausencia de quistes de Giardia, amebas u otros parásitos. Es preciso tener en cuenta que las bacterias coliformes no provienen solo de las heces de los animales de sangre caliente, sino también de la vegetación y el suelo [11-13]. Bajo ciertas condiciones, dichas bacterias pueden también persistir en nutrientes que provienen de materiales de construcción no metálicos. Por las razones expuestas, la presencia de algunos microorganismos coliformes (1-10 ufc/100ml), especialmente en aguas subterráneas que no hayan sido tratadas, puede tener poca importancia desde el punto de vista sanitario, siempre que haya ausencia de organismos coliformes fecales. También se han encontrado relaciones entre la y la fauna heterótrofa presente en el agua, de tal suerte que en experiencias de laboratorio se ha podido comprobar que en agua esterilizada en autoclave el número de presentes es inversamente proporcional al número de bacterias heterótrofas presentes [14]. Este resultado se refleja claramente en el gráfico 1:

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Período de Supervivencia de la E. coli en agua de mar esterilizada tras la adición de bacterias marinas 7

Colif. 1/L.

6

Agua de mar esterilizada en autoclave + 100.000 bacterias marinas por mL

5

Agua de mar esterilizada en autoclave + 1000 bacterias marinas por mL Agua de mar esterilizada en autoclave + 10 bacterias marinas por mL

4

Agua de mar esterilizada en autoclave

3

2 0

1

2

3

4

Días

5

6

7

8

Microbiologia de las aguas G. Rheinheimer

Existen otros organismos que satisfacen algunos de estos criterios, aunque sin alcanzar el grado de satisfacción de las bacterias coliformes, y que en determinadas circunstancias, pueden usarse también como indicadores suplementarios de contaminación fecal. El significado que puede adjudicarse a la presencia o ausencia de determinados indicadores fecales varía con cada organismo y especialmente con el grado de relación que dicho organismo guarda con las heces.

1.2

IMPORTANCIA DE LA ESCHERICHIA COLI

Además de las características ya citadas, de todos los organismos coliformes, solo los tienen un origen específicamente fecal, pues están siempre presentes en grandes cantidades en las heces de los seres vivos de sangre caliente y rara vez se encuentran en agua o suelo que no haya sufrido algún tipo de contaminación fecal. Por tanto, se considera que la detección de éstos como organismos fecales o la presunción de constituye una información suficiente como para estimar la naturaleza fecal de dicha contaminación. Es poco probable que en el sistema de explotación se desarrollen nuevamente organismos fecales [15], salvo que existan los suficientes nutrientes bacterianos ( DBO > 14 mg/L, T>13ºC y no haya cloro libre residual). Sin embargo, estudios recientes inyectando en sistemas de distribución, han demostrado que una vez contaminado éste, al cabo de unos diez días, se produce acumulación de bacterias en el biofilm de las tuberías. Pese a todo, la colonización de la red por dicho microorganismo es sólo parcial y transitoria [16] Flanagan [6] ha resumido la interpretación de la presencia de como sigue: "Cuando los están presentes en un gran número, la interpretación es que ha tenido lugar una polución fuerte y/o reciente por desechos animales o humanos. Si el número de es pequeño indica que la polución, del mismo tipo, es menos reciente o menos importante. Si se detectan coliformes pero no señala que la polución es reciente pero de origen no fecal o de origen fecal pero lejana, de modo que los coliformes intestinales no han sobrevivido". Otra característica importante de las , es que pueden ser vectores de algunas enfermedades. en este caso se trata de patógenos, de los cuales existen muchos serotipos diferentes capaces de causar gastroenteritis en humanos y animales, siendo éstas especialmente serias en recién nacidos y niños de edad inferior a 5 años. Pese a que se considera que los patógenos representan menos del 1% del total de coliformes presentes en el agua contaminada, basta con 100 organismos para causar una enfermedad.

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La importancia de este microorganismo queda patente en muchos casos a lo largo de la historia. Desde que Bray publicó en 1.945 el primer estudio epidemiológico sobre la presencia de cepas de en 42 de los 44 recién nacidos con diarrea que estaban ingresados en un hospital londinense, se han descrito muchos episodios de trastornos debidos a la contaminación producida por esta bacteria. [17-18]. Una extensa revisión de la importancia de este microorganismo y las características de sus serotipos puede encontrarse en la referencia [17]. Entre los diversos tipos de patógenos podemos diferenciar: ♦

Enteropatogénico (EPEC): Son aquellas cepas asociadas a diarreas infantiles, denominadas a menudo gastroenteritis infantiles (GEI), que se presentaron en forma epidémica en la década de los 40 en los países industrializados, decreciendo a partir de 1.970.

♦

Enterotoxigénico (ETEC): Son capaces de producir enterotoxinas LT (enterotoxina termolábil), bastante parecida a la toxina del cólera y ST (enterotoxina termoestable), que parece encubrir a un grupo de varias toxinas parecidas. En la actualidad los ETEC constituyen una de las principales causas de diarrea infantil en los países en vías de desarrollo. En los países industrializados estas epidemias son excepcionales. Son también los agentes más frecuentes de la llamada diarrea del viajero; enfermedad que se produce habitualmente a los 4-6 días de llegada a otro país, generalmente tropical.

♦

Enteroinvasivas (EIEC): Algunas cepas de pueden ser responsables de un cuadro clínico disentérico similar al de Shigella. La enfermedad se caracteriza por signos de toxemia con malestar, fiebre, intensos dolores intestinales y heces acuosas con sangre, mucus y pus. Estas cepas de pertenecen a un número limitado de serotipos y se parecen por sus características bioquímicas, antigénicas y por su comportamiento en modelos experimentales a las Shigellas aunque se diferencia de éstas por dar negativo el test de la lisina descarboxilasa. Se denominan enteroinvasivas ya que tras establecer contacto con el epitelio del intestino grueso, destruyen el borde ciliado y penetran en las células, dando lugar a ulceraciones e inflamación intestinal.

♦

E coli productora de verotoxina (VTEC): Es causa de diarrea, que tienen graves secuelas: colitis hemorrágica y posiblemente síndrome urémico hemolítico. Estas bacterias son, a diferencia de las anteriores clases, sorbitol y MUG (4-metilumbiliferil-β-D-glucorónido) negativos. Algunos autores incluyen a las bacterias de este grupo entre las ETEC, pero como clásicamente se ha considerado entre estas últimas a las bacterias capaces de producir LT y ST, se ha diferenciado entre ambas clases.

1.2.1

IMPORTANCIA DE LA ESCHERICHIA COLI EN SANIDAD MEDIOAMBIENTAL.

Por citar sólo algunos de los numerosos y más recientes casos en los que la es la responsable de muertes y gastroenteritis a lo largo y ancho del planeta se tienen los ejemplos significativos siguientes: el que se produjo en Japón en el año 1996 con más de 9.500 personas contaminadas y una decena de muertes en la ciudad de Sakai, de infección de varios cientos de personas, incluyendo cinco muertos, en Inglaterra debido a su presencia en carne de vacuno y de no menos de 55 muertos en Estados Unidos y Canadá, se puede citar que entre diciembree de 1989 y enero de 1990, la comunidad agrícola de Cabaol, Missouri, se vió afectada por un E. coli hemorrágico que originó 4 muertes, 32 hospitalizaciones y 243 casos de diarreas; siendo la hipótesis más sólida de contaminación la que achacó esta contaminación a los reemplazos de medidores y a las roturas de la red de distribución que se produjeron poco antes de que se manifestaran los primeros casos de la enfermedad [31]. Incluso, se puede destacar un caso más cercano, en la provincia de Lugo, donde según la Sociedad Gallega de Microbiología Clínica, ha afectado a no menos de ocho personas desde 1.992 y en 1.995 se detectó en un 2% de la carne que llegaba al matadero. Estos pocos ejemplos indican la importancia de controlar esta bacteria de una forma escrupulosa.

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2.

DETERMINACION DE COLIFORMES

Las bacterias coliformes, de acuerdo con la diversa y numerosa bibliografía existente [2,3,6,10,17,19-22], se pueden determinar, sin necesidad de grandes inversiones que incluyan la compra de aparatos sofisticados como PCR, medidores basados en el cambio de impedancia de un medio de cultivo, de diversas formas: métodos basados en el número más probable (NMP), de presencia-ausencia (P/A), basados en la filtración de membrana (MF) y métodos cromogénicos y/o fluorogénicos basados en reacciones específicas de estos microorganismos. Actualmente, los métodos NMP están en claro retroceso frente a las otras opciones. Entre los incluidos en la MF hay variaciones en el medio utilizado: puede ser Tergitol TTC, ENDO AGAR gelose, Agar de Chapman, Hektoen Agar, Levine EMB, Agar verde brillante-bilis, etc. e incluso en la forma de hacerlo: puede ser una filtración directa e incubación sobre una placa que contenga el medio o bien usar discos de cartón nutriente que se empapan con el medio. Los medios P/A tienen una desventaja inicial y que su nombre indica: no reflejan la "cantidad de contaminación" (número de colonias que se desarrollan) del agua analizada. En los medios cromogénicos y/o fluorogénicos, basados en reacciones con indicadores específicos (tecnología de sustrato definido), se produce un cambio de coloración o emisión de fluorescencia en caso de estar presentes organismos coliformes y respectivamente. Hay autores [17] que diferencian entre medio cromogénico y fluorogénico según el sustrato utilizado (unos provocan coloración y otros fluorescencia), pero en este trabajo se consideran indistintamente. El problema surge en el momento en que se quiere determinar específicamente el número de presentes ya que los medios cromogénicos más extendidos solo indican presencia o ausencia y los otros medios los usados tradicionalmente en MF y NMP- no son selectivos, solo son presuntivos. Por las razones expuestas, es por lo que se precisa un método de detección que sea a la vez selectivo y confirmativo. Hace poco tiempo se han puesto a disposición de los microbiólogos nuevos medios de incubación, cromogénicos, que intentan evaluar simultáneamente organismos coliformes y Escherichia coli. Se trata de medios que contienen sustratos cromogénicos enzimáticos.

3.

OBJETIVO DEL ESTUDIO

Es determinar la idoneidad de uno de los medios cromogénicos descritos en el capítulo anterior para analizar y diferenciar organismos coliformes, intentando establecer una comparación de resultados con métodos ya existentes para confirmar que se trata de un medio válido y utilizable.

4.

MÉTODOS Y MATERIALES

Como medio de referencia se ha escogido un medio de tripcasa de soja (TSA) de la casa Merck, medio general de crecimiento no selectivo. Como medios selectivos se han usado un medio ENDO AGARGelose, de la casa bioMérieux, acorde con la norma ISO 9038-1, que ya ha sido comparado con otros medios [17,23-24] y establecido su crecimiento como idóneo para análisis de agua. El medio sobre el que se va a realizar el estudio es uno denominado COLI ID, de la misma casa. Para identificar las colonias se utilizan galerías API 20E y RapID 20E de la misma casa. Estas galerías se basan en una serie de reacciones específicas que permiten establecer el tipo de organismo de que se trata con una fiabilidad muy elevada. Para testar cada medio se usan cepas de material de referencia suministradas por el BCR (Boureau Communitaire de Reference), la ATCC (American Type Culture Collection), la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo) y Microkit. En el estudio se consideran como organismos coliformes totales todas las colonias que crecen en medio ENDO AGAR tras incubación durante 24 horas a 37º y desarrollan coloración rojo oscuro, están nucleadas con color granate o presentan brillo metálico verde. Se consideran organismos coliformes fecales todas aquellas colonias de las mismas características que crecen en medio ENDO AGAR tras incubación durante 24 horas a 44ºC [10,17,19]. Las placas de medio COLI ID se incuban a 37ºC durante 24 horas, considerándose como las colonias de color morado o violáceo, como organismos coliformes totales las colonias de color azul además de las anteriores y como otro tipo de LABORATORIO-SANTIAGO  Copyright Grupo AGBAR 1997

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microorganismos las grisáceas y amarillas (éstas corresponden a pseudomonas según indicación del fabricante). Las placas de este medio contienen dos sustratos cromogénicos, uno que reacciona con la ??glucoronidasa, enzima que es producido por el 97% de las cepas de y que hidroliza el enlace oglucoronosil de los glucorónidos conjugados, coloreando las colonias de esta bacteria de morado o violeta y otro que reacciona con la???-galactosidasa, enzima específico producido por los organismos coliformes, coloreando las colonias de éstos de azul. La combinación de ambos sustratos optimiza la detección de E. coli y coliformes. Se han usado membranas filtrantes Millipore HAWG 047 de éster de celulosa.

5.

DESARROLLO DEL ESTUDIO

Dado que el medio COLI ID se presenta en frascos de 200 ml, siendo necesario licuarlo, extenderlo sobre placa y dejarlo solidificar cabrían dos posibilidades: proceder como en una filtración de membrana típica o bien añadir una cantidad fija de agua a la placa y echar el medio sobre ella. Para mayor seguridad del estudio han seguido los dos caminos. Las muestras de agua que se han analizado proceden de un río (Río Tambre), un efluente de EDAR (EDAR de Silvouta en Santiago de Compostela) y las preparadas con las cepas de referencia. De cada muestra se han realizado tres placas por el procedimiento de MF correspondiendo dos a medio ENDO AGAR, incubadas durante 24 horas a 37º y 44º respectivamente y otra al medio COLI ID incubada durante 24 horas a 37ºC.. Se ha separado el estudio en dos partes, la primera relativa a cultivos puros y la segunda relativa a muestras reales.

5.1

ESTUDIO DE LOS MEDIOS USANDO CULTIVOS PUROS

Los resultados fueron analizados mediante regresión lineal y análisis de varianza usando el paquete estadístico Statgrafics 5.0. Además, para la comparación de los diferentes métodos de detección de E. coli en aguas se siguieron los criterios propuestos por Levin y Cabelli y por El-Shaarawi y Pipes [ver referencia 21]. Estos parámetros se definen a continuación: 1.- Eficiencia de recuento: Capacidad del medio de cultivo bajo estudio para cuantificar un microorganismo especifico con relación a un medio de referencia. Se puede expresar como la relación entre el recuento en el medio problema y el máximo recuento alcanzado en cualquiera de los otros medios con los que se compara. •

Eficacia relativa del recuento: relación entre el recuento en el medio problema y el máximo recuento alcanzado en cualquiera de los otros medios con los que se compara.

2.- Exactitud: se puede definir como el grado de similitud entre una medida y el valor real. En el presente trabajo se calculó comparando los recuentos obtenidos en el medio problema con los conseguidos utilizando el medio de referencia (TSA) 3.- Precisión del recuento: mide la variabilidad asociada a los valores obtenidos mediante el uso de una determinada técnica y permite comprobar si la misma se debe a una distribución al azar o está influenciada por factores adicionales. 4.- Sensibilidad: Capacidad del medio de cultivo o método para detectar un microorganismo específico presente en un determinada muestra. También se puede expresar como la capacidad del medio de cultivo para diferenciar los verdaderos positivos. 5.- Especificidad: Capacidad del medio de cultivo para diferenciar el microorganismo o grupo de microorganismos problema de la flora acompañante. También se puede definir un medio como especí-

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fico, cuando más del 90% de los cultivos positivos en este medio son verdaderos positivos y cuando menos del 10% de los cultivos negativos son falsos negativos. 6.- Selectividad: Se define como la capacidad de un medio para inhibir o disminuir el crecimiento de la flora acompañante. Para que un medio se considere selectivo, debe de provocar una reducción de 3 órdenes de magnitud, respecto de la flora acompañante del grupo de microorganismos que se pretende determinar. 7.- Precisión: Mide el grado de variabilidad asociada a los valores obtenidos mediante una determinada técnica de detección de microorganismos. Permite comprobar si esta variabilidad se debe a una distribución al azar o está influenciada por otros factores adicionales. Para la evaluación de la precisión del recuento en los medios se ha calculado el índice de dispersión de Fisher D2, aplicando la fórmula de Eisenhart y Wilson [ver referencia 21]. Esta fórmula se expresa como:

[

]

D 2 = N ∑ xi2 − (∑ xi ) 2 / ∑ xi donde xi representa el recuento obtenido para cada placa de la misma muestra y N es el número de réplicas de cada placa (5 por muestra en este caso). 5.1.1

ESTUDIO DE ESPECIFICIDAD

TABLA 1. RESULTADOS DE LA SIEMBRA DIRECTA DE DIFERENTES CEPAS BACTERIANAS EN LOS DISTINTOS MEDIOS DE CULTIVO PARA LA DETECCIÓN DE E. COLI CEPA

COLI ID

ENDO AGAR

Aeromonas hydrophyla 1546

-

-

Citrobacter malonaticus 863

-

-

Citrobacter freundii 401

-

-

Enterobacter aerogenes 684

-

-

Enterobacter cloacae AQ 1

-

+

Enterobacter cloacae R2

-

-

Enterococcus faecalis 967

-

-

Enterococcus faecium 410

-

-

Escherichia coli 185

+

-

Escherichia coli 405

+

+

Escherichia coli 425

+

+

Escherichia coli 426

+

+

Escherichia coli 434

+

+

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CEPA

COLI ID

ENDO AGAR

Escherichia coli 515

+

+

Escherichia coli 533

+

+

Escherichia coli 543

+

+

Escherichia coli 682

+

+

Escherichia coli 683

+

+

Escherichia coli AQ2

+

+

Flavobacterium odoratum 998

-

-

Klebsiella oxytoca 860

-

-

Klebsiella pneumoniae AQ3

+

-

Klebsiella pneumoniae 142

-

-

Klebsiella pneumoniae AQ4

-

-

Kluyvera ascorbata 861

-

-

Kluyvera cryoscrescens 862

-

-

Pseudomonas putida 845

-

-

Salmonella choleraesuis 556

-

-

Salmonella choleraesuis 723

-

-

Salmonella choleraesuis 409

-

-

Serratia liquefaciens 483

-

-

Serratia marcescens 824

+

-

Shigella sonnei 452

+

-

Staphylococcus aureus 435

-

-

Staphylococcus epidermis 231

-

-

Yersinia enterocolitica 754

-

-

El signo + significa crecimiento de la cepa bacteriana testada con desarrollo de características típicas de E. coli en ese medio. El signo - significa tanto crecimiento de la cepa bacteriana testada sin desarrollo de características típicas de E. coli en ese medio como inhibición del crecimiento de la cepa en él.

A partir de los datos mostrados en la tabla anterior se han determinado los porcentajes de falsos positivos - cepas que crecen como colonias típicas en un determinado medio y no se corresponden con el microorganismo investigado - y los falsos negativos - cepas de microorganismos que debiendo crecer como colonias típicas en los medios indicados no lo hacen - recuperados en cada uno de los medios estudiados

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TABLA 2. PORCENTAJE DE FALSOS POSITIVOS (FP) Y FALSOS NEGATIVOS (FN) OBTENIDOS POR CADA UNA DE LAS TÉCNICAS EMPLEADAS PARA LA DETERMINACIÓN DE E. COLI. METODO

Nº1

FP(%)

Nº2

FN(%)

COLI ID

25

12

11

0

ENDO AGAR

25

4

11

18

1 2

Número de cepas testadas en los diferentes medios y que corresponden a verdaderos positivos Número de cepas testadas en los diferentes medios y que corresponden a falsos negativos.

Para interpretar la tabla anterior es necesario tener en cuenta que un medio o meto de detección debe ser específico para el microorganismo problema, de forma que más del 90% de los cultivos positivos en ese medio sean verdaderos positivos; es decir, menos de un 10% de falsos positivos y que menos de un 10% sean falsos negativos. 5.1.2

ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD, EFICIENCIA, EXACTITUD Y PRECISION DE RECUENTO DE LOS METODOS DE DETECCIÓN DE E. COLI EVALUADOS.

Para determinar las variables definidas en el apartado 5.1. se ha procedido a la preparación de muestras a partir de las suspensiones bacterianas de 20 a 80 células/100 ml de cada uno de los cultivos puros. Como ya se ha indicado, como método de control y referencia se ha usado el agar tripticasa de soja. Estos análisis se han efectuado según la metodología indicada. Los resultados que se presentan a continuación se corresponden con los obtenidos tras el análisis de las muestras preparadas a partir de cultivos puros de E. coli TABLA 3. RECUENTOS OBTENIDOS CON LOS MÉTODOS DE DETECCIÓN DE ANÁLISIS DE MUESTRAS PREPARADAS A PARTIR DE CULTIVOS PUROS.

E. COLI A PARTIR DEL

MUESTRA

TSA

COLI ID

ENDO AGAR

Cepa 185

53.4

40

0

Cepa 405

56.8

52.4

53.4

Cepa 425

52.6

52.6

57.4

Cepa 426

46.7

30.6

35.0

Cepa 434

21.6

16.8

18.8

Cepa 515

72.8

58.4

73.4

Cepa 533

51.2

9.2

44.6

Cepa 543

80.4

61.0

79.8

Cepa 682

61.0

52.6

61.2

Cepa 683

62.2

51.6

59.4

Cepa AQ2

63.0

61.4

61.8

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PROYECTO COLI ID

A partir de los datos presentados en la tabla anterior se han calculado las diferentes variables evaluadas en el presente apartado 5.1.2.1 Determinación de la sensibilidad Los resultados presentados en la tabla anterior han permitido evaluar la sensibilidad de cada medio sobre la base del porcentaje de muestras en las que se detectó E. coli. De los medios estudiados, el COLI ID ha sido el más sensible ya que al igual que sucedió con el método de referencia (TSA) se ha detectado E. coli en las 11 muestras que se han analizado. El medio ENDO AGAR ha arrojado porcentajes algo inferiores ya que se han detectado E. coli en 10 de las 11 muestras analizadas (90,91%) 5.1.2.2 Eficacia relativa del recuento Los recuentos que se han obtenido han permitido, usando tests estadísticos, conocer tanto la eficacia relativa del recuento como la exactitud y la precisión del mismo. A continuación se exponen los resultados correspondientes al cálculo de la eficacia relativa de recuento de los diferentes medios de cultivo que se han evaluado. Estos resultados han sido calculados a partir de la tabla 3. TABLA 4. COMPARACIÓN DE LA EFICACIA RELATIVA DE RECUENTO DE LOS DIFERENTES MEDIOS PARA LA DETECCIÓN DE E. COLI UTILIZADOS. CÁLCULOS REALIZADOS A PARTIR DE LA TABLA 3. MUESTRA

COLI ID

ENDO-AGAR

Cepa 185

74,90

0,00

Cepa 405

95,25

94,01

Cepa 425

91,63

100,00

Cepa 426

65,52

74,90

Cepa 434

77,78

87,04

Cepa 515

79,56

100,00

Cepa 533

17,97

87,11

Cepa 543

72,97

95,45

Cepa 682

85,66

99,60

Cepa 683

82,99

95,50

Cepa AQ2

97,47

98,10

PROMEDIO

76,52

84,70

Los resultados obtenidos indican que el medio ENDO AGAR presenta una mayor eficacia que el medio COLI ID. Sin embargo, deben tenerse en cuenta los resultados individuales para cada una de las muestras, puesto que en algunos, como los correspondientes a las cepas 185 ó 533, se han obtenido eficacias relativas muy inferiores al medio que ha dado mayores recuentos. Para confirmar y completar los análisis de los resultados de los recuentos que se presentan el la tabla 3, se les ha aplicado un análisis estadístico basado en los test no paramétricos de Mann-Whytney y de Wilcoxon. En la tabla 5 se muestran los resultados obtenidos. LABORATORIO-SANTIAGO  Copyright Grupo AGBAR 1997

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TABLA 5. RESULTADOS DEL ANÁLISIS ESTADÍSTICO APLICADO A LOS RECUENTOS OBTENIDOS CON LOS DIFERENTES MEDIOS PARA LA DETECCIÓN DE E. COLI. EL CÁLCULO SE HA REALIZADO A PARTIR DE LOS DATOS QUE SE PRESENTAN EN LA TABLA 3. MEDIOS

TEST DE MANN-WHITNEY

TEST DE WILCOXON

Z

P

Z

P

TSA/COLI ID

-1,67683

0,093576

2,85402

4,32 * 10 -3

TSA/ ENDO AGAR

-0,49262

0,622273

1,95604

0,050460

COLI ID/ENDO AGAR

1,05094

0,293286

2,00049

0,045446

Los valores que se han obtenido en el test de Mann-Whitney indican que no existen diferencias significativas entre los recuentos que se han obtenido con los diferentes medios evaluados, ni entre ellos ni con respecto al medio de control (TSA) -para un nivel de significación de 0,05-. Sin embargo, el test de Wilcoxon indica la existencia de diferencias significativas entre los recuentos obtenidos por los diferentes medios con respecto al medio de control. Estas diferencias suponen una tendencia estadísticamente significativa a obtener recuentos inferiores con respecto al TSA. Esta tendencia se puede considerar lógica si se tiene en cuenta que el medio TSA es un medio no selectivo, mientras que tanto COLI ID como ENDO AGAR incorporan agentes selectivos en su composición, que inhiben el crecimiento de los no coliformes pero que, a su vez, afectan ligeramente a la capacidad del medio para recuperar E. coli. Por otra parte, si se utiliza el test de Wilcoxon para comparar los recuentos obtenidos entre los diferentes medios detección, se aprecian diferencias significativas entre el empleo de ENDO AGAR y el empleo de COLI ID, que indican menores recuentos de colonias en éste que en aquél. Otra forma de comparar los recuentos que se han obtenido con los diferentes medios es utilizar un análisis de regresión. Este análisis, aplicado a los resultados que se han obtenido utilizando los diferentes medios, ha arrojado los siguientes resultados TABLA 6. ANÁLISIS DE REGRESIÓN QUE SE HA OBTENIDO A PARTIR DE LOS RECUENTOS OBTENIDOS DEL ANÁLISIS DE MUESTRAS ELABORADAS A PARTIR DE CULTIVOS PUROS UTILIZANDO LOS DIFERENTES MEDIOS. MEDIOS

COEFICIENTE REGRESIÓN (R2)

TSA/COLI ID

0,5755

TSA/ ENDO AGAR

0,523

COLI ID/ENDO AGAR

0,42

De nuevo se vuelve a observar que la el coeficiente de regresión es inferior en la comparación COLI IDENDO AGAR, lo que confirma el análisis anterior de la determinación de eficacia relativa de que en el medio COLI ID se obtienen recuentos menores que en el ENDO AGAR 5.1.2.3 Determinación de la exactitud del recuento. Los resultados que se han presentado en el apartado anterior referentes a la similitud en la eficacia relativa del ENDO AGAR y el COLI ID se presentan de nuevo con el cálculo de la exactitud del recuento de los medios de cultivo para la detección de E. coli.

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TABLA 7. COMPARACIÓN DE LA EXACTITUD DE LOS DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO PARA RECUPERACIÓN DE E. COLI A PARTIR DE MUESTRAS PREPARADAS CON CULTIVOS PUROS Y USANDO TSA COMO MEDIO DE CONTROL. MEDIO

EXACTITUD (%)

COLI ID

77,37

ENDO AGAR

86,02

Como se puede observar, al igual que ha ocurrido en el apartado anterior, del cálculo de la exactitud resultan cifras similares a las obtenidas para la eficacia relativa del recuento, siendo el medio COLI ID el menos exacto. 5.1.2.4 Determinación de la precisión del recuento. Usando los datos que se muestran en la tabla 3, se ha calculado la precisión del recuento de los medios utilizados en el presente trabajo. Para la evaluación de la precisión del recuento en los medios se ha calculado, como ya se ha citado, el índice de dispersión de Fisher D2, aplicando la fórmula de Eisenhart y Wilson [30]. Esta fórmula se expresa como:

[

]

D 2 = N ∑ xi2 − (∑ xi ) 2 / ∑ xi donde xi representa el recuento obtenido para cada placa de la misma muestra y N es el número de réplicas de cada placa (5 por muestra en este caso). El resultado D2 para cada muestra y cada uno de los medios que se ha evaluado así como el promedio de los resultados individuales se muestra en la tabla 8. TABLA 8. COMPARACIÓN DE LA PRECISIÓN DE LOS DIFERENTES MEDIOS PARA LA RECUPERACIÓN DE E. COLI A PARTIR DE MUESTRAS PREPARADAS CON CULTIVOS PUROS. MUESTRA

TSA

COLI ID

ENDO AGAR

Cepa 185

5,60

22,85

ND

Cepa 405

3,85

6,10

2,31

Cepa 425

4,97

3,63

1,21

Cepa 426

2,27

3,76

0,46

Cepa 434

0,61

7,43

8,45

Cepa 515

0,86

0,16

0,83

Cepa 533

2,75

0,74

3,88

Cepa 543

1,31

1,11

2,22

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Cepa 682

9,97

3,98

4,75

Cepa 683

1,40

2,74

6,42

Cepa AQ2

1,69

1,69

5,94

PROMEDIO

3,21

4,93

3,65

Los datos dela tabla 8 permiten comparar la precisión del recuento de los medios que se han usado en este trabajo. Para hacerlo se han tomado el número de muestras con valores de D2 dentro de los límites de ρ= 0,5; 0,05; 0,025 y 0,005 [30] representados en la tabla 9 y en los valores de D2 que se presentan en la tabla 8. Según estos últimos, el medio ENDO AGAR es el que ha dado un menor índice de dispersión, mientras que el COLI ID ha presentado un valor mucho más elevado. TABLA 9. PORCENTAJE DE MUESTRAS CON VALORES DE D2 DENTRO DE LOS LÍMITES ρ= 0,5; 0,05; 0,025 Y 0,005 PARA LOS MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS. LIMITE

TSA

COLI ID

ENDO AGAR

0,5

90,91

72,73

80

0,05

90,91

90,91

100

0,025

100

90,91

100

0,005

100

90,91

100

5.2

ESTUDIO DE LOS MEDIOS USANDO MUESTRAS REALES

Tras el estudio inicial trabajando con cultivos puros se ha procedido al estudio con muestras reales, tanto con aguas superficiales como con aguas tratadas. A estas muestras se les ha realizado un análisis parecido al que se ha realizado en el caso de los cultivos puros. Los resultados que se han obtenido son: TABLA 10. DISTINTOS PARÁMETROS EMPLEADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DETECCIÓN TY ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES QUE SE HAN OBTENIDO A PARTIR DEL ANÁLISIS DE AGUA SUPERFICIAL. (VALORES PROMEDIO DE 38 MUESTRAS ANALIZADAS)

PARÁMETRO

ENDO AGAR

COLI ID

Eficacia de recuperación relativa1 (%)

76,3

89.5

Factor de reducción de flora acompañante2

164

313

Reducción logarítmica de la flora acompañante

1.39

1,59

1 El porcentaje de recuperación relativa se ha calculado aplicando la ecuación: Porcentaje de recuperación relativa del medio a evaluar = Recuento en el medio a evaluar/Recuento máximo en cualquier medio)*100 2

Relación entre recuento de bacterias heterótrofas a 37ºC realizados sobre R2A agra y recuentos totales obtenidos en cada uno de los medios evaluados.

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TABLA 11. DISTINTOS PARÁMETROS EMPLEADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE E. COLI QUE SE HAN OBTENIDO A PARTIR DEL ANÁLISIS DE AGUA SUPERFICIAL. (VALORES PROMEDIO DE 62 MUESTRAS ANALIZADAS) PARÁMETRO

ENDO AGAR

COLI ID

Eficacia de recuperación relativa1 (%)

70,20

64,64

Factor de reducción de flora acompañante2

1363,08

397.21

Reducción logarítmica de la flora acompañante

2,42

1,60

Precisión3

3.13

3.42

1

El porcentaje de recuperación relativa se ha calculado aplicando la ecuación: Porcentaje de recuperación relativa del medio a evaluar = Recuento en el medio a evaluar/Recuento máximo en cualquier medio)*100 2 Relación entre recuento de bacterias heterótrofas a 37ºC realizados sobre R2A agra y recuentos totales obtenidos en cada uno de los medios evaluados. 3 La precisión se ha obtenido calculando el índice de dispersión de Fisher, D2.

5.3

ESTUDIOS ESTADÍSTICOS

A la hora de presentar los resultados se diferencia entre coliformes totales y E. coli, cuando lo estrictamente correcto sería diferenciar entre coliformes totales y coliformes fecales . Esto no se ha hecho debido a que, como ya se ha mencionado, más del 90% de los coliformes fecales y además, como se demostrará más adelante -concretamente al estudiar las identificaciones- alguna colonia típica no corresponde a E. coli . Al hacer esta aproximación se incrementa el error. Los resultados que se han encontrado, tras realizar análisis muestras de agua superficial durante el período comprendido entre Febrero y Septiembre de 1.999 y realizar un número representativo de experiencias, ofrecen los siguientes valores: TABLA 11. VALORES MÁXIMOS, MÍNIMOS Y MEDIOS DE COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES Y COLI OBTENIDOS AL ANALIZAR MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL PARÁMETRO

MEDIO

VALOR MÁXIMO

VALOR MINIMO

VALOR MEDIO

Coliformes Totales

ENDO AGAR

2670

340

970

E. coli

COLI ID

1100

70

431

Coliformes fecales

ENDO AGAR

920

150

389

E. coli

COLI ID

980

50

349

E.

En una aproximación estadística: dividiendo el número de coliformes totales obtenidas al incubar en medio ENDO AGAR entre el número de coliformes totales obtenidas al incubar en medio COLI ID y procediendo de igual forma para las E. coli y, calculando la desviación estándar, la correlación y el chi cuadrado para cada uno de los casos, se obtiene:

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TABLA 12. PARÁMETROS ESTADÍSTICOS QUE SE OBTIENEN AL COMPARAR LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LOS RECUENTOS DE LOS DIFERENTES MEDIOS AL DIFERENCIAR ENTRE COLIFORMES TOTALES Y E. COLI.

σn

MEDIA

CORRELACION χ2

Colifor. totales(ENDO AGAR)/Colifor. 0,77 totales (COLI ID)

2,31

0,94

5,2

E. coli (ENDO AGAR)/ E. coli (COLI 0,71 ID)

1,78

0,88

6,3

De la anterior tabla es fácil deducir que existe una cierta paridad entre los datos correspondientes a los organismos E. coli encontrados en cada caso, puesto que la media de los cocientes entre los números de colonias incubadas en ambos se aproxima a la unidad (que sería el caso ideal). En cambio, para los organismos coliformes totales la paridad es mala ya que el mismo cociente se separa bastante de la unidad. Sin embargo, la correlación individual de cada uno de los datos es mejor en el caso de los coliformes totales, como indica el coeficiente de correlación calculado en la gráfica resultante de representar los valores obtenidos en cada medio en cada uno de los casos. De la tabla del chi cuadrado se puede concluir que para P= 0.05 y 5 grados de libertad, (χ2 = 11,1) que no se puede rechazar la hipótesis de que los resultados sean independientes del medio utilizado. Si se representan las curvas de dispersión de los valores encontrados en las experiencias realizadas para ambos medios, se encuentra que los puntos guardan una relación bastante próxima a la linealidad –como era de esperar en función del valor de correlación de la anterior tabla-, volviéndose a encontrar una mejor relación en el caso de coliformes totales que en el de E. coli..

Correlación entre medios. Colif. totales

Medio Coli ID

1400 1200 1000 800 600 400 200 0

Serie1 Lineal (Serie1)

y = 0,4537x + 25,526 R 2 = 0,8793

0

1000 2000 Medio Endo-Gelose

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3000

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FIGURA 1: ANÁLISIS DE REGRESIÓN REALIZADO A PARTIR DE LOS RECUENTOS OBTENIDOS PARA COLIFORMES TOTALES EN EL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL EMPLEANDO LOS MEDIOS OBJETO DE ESTUDIO

Correlación entre medios. E. coli 1200 Medio Coli ID

1000 800

Serie1 Lineal (Serie1)

600 400 200

y = 0,7559x - 25,371 R2 = 0,7732

0 0

500

1000

1500

Medio Endo-Gelose

FIGURA 2: ANÁLISIS DE REGRESIÓN REALIZADO A PARTIR DE LOS RECUENTOS OBTENIDOS PARA E. COLI EN EL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL EMPLEANDO LOS MEDIOS OBJETO DE ESTUDIO

Finalmente, si se realiza un análisis de varianza para cada uno de los casos se tiene: ANOVA PARA COLIFORMES TOTALES Fuente de variación

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media

F

Regresión

2035041,667

1

2035041,667

10,373

Residuo

11379256,667

58

196194,080

Total

13414298,333

59

Fuente de variación

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media

F

Regresión

244737,067

1

244737,067

3,698

ANOVA PARA E. COLI

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Residuo

3839009,867

58

Total

4083746,933

59

66189,825

En este caso, se observa que F 80 UFC

0

7,1

0

35,7

En la Tabla 8 puede observarse que, en el medio MP, la media geométrica de colonias bacterianas desarrolladas no pertenecientes a E. coli fue de 30,4 y que el porcentaje de muestras que dieron valores de colonias en el medio MP superiores a 80 UFC fue de casi un 36 %. Todos estos valores fueron muy superiores a los obtenidos con los otros métodos de recuento de E. coli. Ello significa, que en una alta proporción de muestras (muestras con niveles de colonias en MP superior a 80) habría dificultades para distinguir colonias de E. coli en el medio MP, dada la gran cantidad de flora acompañante. Este resultado permite desaconsejar este medio de cultivo para emplearlo en la detección de E. coli en este tipo de aguas.

10.4

MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA

El estudio con las muestras de agua subterráneas consistió en evaluar la capacidad de los dos métodos cromogénicos (ID y MP) para detectar coliformes totales y E. coli en comparación con los métodos de referencia para determinar coliformes totales (ISO-CT) y E. coli (ISO-EC y m-TEC). De todas las muestras analizadas (38 para coliformes totales y 62 para E. coli), el 100% y 50% de las muestras fueron respectivamente positivas para coliformes totales y 62 para E. coli, por alguno de los métodos empleados en el trabajo. Los recuentos en estas muestras oscilaron entre 1 a 200 coliformes totales y entre 0 y 200 E. coli por 100 ml de muestra. El análisis de regresión de los recuentos de coliformes totales obtenidos con los dos métodos cromogénicos (ID y MP) en comparación con el método ISO (ISO-CT) se muestra en la Figura 9. Este análisis dio como resultado valores de coeficiente de correlación de 0,74 para ID y 0,76 para MP. Estos relativamente bajos coeficientes de correlación se deben a que los mayores recuentos de coliformes totales con respecto al método ISO-CT se obtuvieron con los dos métodos cromogénicos (ID y MP), principalmente en las muestras con bajos niveles de coliformes (Figura 10). El análisis de varianza de los datos obtenidos demostró la ausencia de diferencias significativas entre los recuentos de coliformes obtenidos con los métodos ID y MP y el método empleado como referencia. Sin embargo, la evaluación de la sensibilidad y eficacia de recuperación relativa de ambos medios de cultivo cromogénicos dio como resultado que estos dos medios de cultivo son más sensibles y significativamente más eficientes (p < 0,05) que el método ISO-CT para detectar coliformes en aguas subterráneas (Tabla 9).

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FIGURA 10. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE COLIFORMES TOTALES OBTENIDOS CON LOS MÉTODOS ID Y MP Y EL MÉTODO DE REFERENCIA ISO-CT EN MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA. 2.5

Log UFC/100 ml (ID y MP)

ID (R2 = 0,74) MP (R2 = 0,76)

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Log UFC/100 ml (ISO-CT)

TABLA 9. DISTINTOS PARÁMETROS EMPLEADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES OBTENIDOS A PARTIR DEL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA (VALORES PROMEDIO).

PARÁMETRO

MÉTODO ISO-CT

m-TEC

ID

Sensibilidad (%)

100

100

97,3

Eficacia de recuperación relativa(1)

72,20

72,20

64,65

Factor de reducción de flora acompañante(2)

1363,08

1056,00

174,16

Reducción logarítmica de la flora acompañante

2,42

2,52

1,60

(1)

El porcentaje de recuperación relativa se calculó aplicando la ecuación: Porcentaje de recuperación relativa medio a evaluar = (Recuento en el medio a evaluar/Recuento máximo en cualquier medio) x 100. (2) Selectividad: Relación entre recuentos de bacterias heterotrofas a 35 ºC realizados sobre R2A y recuentos totales obtenidos en cada uno de los métodos evaluados.

Por otra parte, el análisis de regresión entre los recuentos de coliformes obtenidos con los dos métodos cromogénicos permite comprobar que ambos medios de cultivo se comportan de forma similar a la hora de detectar coliformes en aguas subterráneas, como lo demuestra el alto coeficiente de correlación (Figura 11) y la ausencia de diferencias significativos entre los mismos en lo que a eficiencia de recuento y sensibilidad se refiere (Tabla 9). LABORATORIO-SANTIAGO  Copyright Grupo AGBAR 1997

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FIGURA 11. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE COLIFORMES TOTALES OBTENIDOS CON LOS DOS MÉTODOS CROMOGÉNICOS, ID Y MP, EN MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA.

2.5

Método MP (Log UFC/100 ml)

R2 = 0.89

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Método ID (Log UFC/100 ml)

Por lo que respecta a la evaluación de los dos métodos cromogénicos para detectar E. coli en aguas subterráneas, el análisis de regresión llevado a cabo ha demostrado una buena correlación entre estos dos métodos y las técnicas de referencia. Como puede constatarse en las figuras 12 y 13, el valor de los coeficientes de correlación obtenidos fueron altamente positivos, con el más alto coeficiente de correlación entre ID y m-TEC (R2 = 0.92) y el más bajo entre MP y m-TEC (R2 = 0.87). El análisis de varianza de los datos demostró la ausencia de diferencias significativas entre los recuentos de E. coli con los métodos ID y MP y con los métodos de referencia empleados.

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FIGURA 12. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS DOS MÉTODOS ID Y MP Y EL MÉTODO DE REFERENCIA ISO-EC EN MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA.

2.5

Log UFC/100 ml (ID y MUG)

ID (R2 = 0,90) MUG (R2 = 0,88)

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Log UFC/100 ml (ISO-EC)

FIGURA 13. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS DOS MÉTODOS ID Y MP Y EL MÉTODO DE REFERENCIA M-TEC EN MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA.

2.5 ID (R2 = 0,92)

Log UFC/100 ml (ID y MP)

MP (R2 = 0,87)

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Log UFC/100 ml (m-TEC)

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TABLA 10. DISTINTOS PARÁMETROS EMPLEADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE E. COLI OBTENIDOS A PARTIR DEL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA (VALORES PROMEDIO).

PARÁMETRO

MÉTODO ISO-EC

m-TEC

ID

MP

Sensibilidad (%)

35,5

33,9

33,4

40,3

Eficacia de recuperación relativa(1)

55,0

45,8

44,8

67,7

Factor de reducción de flora acompañante(2)

2838

2047

261

99,5

Reducción logarítmica de la flora acompañante

2,87

2,78

1,62

1,34

(1)

El porcentaje de recuperación relativa se calculó aplicando la ecuación: Porcentaje de recuperación relativa medio a evaluar = (Recuento en el medio a evaluar/Recuento máximo en cualquier medio) x 100. (2) Selectividad: Relación entre recuentos de bacterias heterotrofas a 35 ºC realizados sobre R2A y recuentos totales obtenidos en cada uno de los métodos evaluados.

Los valores de sensibilidad, eficiencia relativa de recuento de E. coli y selectividad de los diferentes medios de cultivo analizados se muestra en la Tabla 10. En esta tabla puede observarse que el medio MP fue el medio más sensible para la detección de E. coli y significativamente más eficiente (p < 0,05) que los métodos m-TEC e ID. Por el contrario, el medio MP resultó ser el menos selectivo para detectar E. coli de los cuatro métodos empleados en este trabajo. En todo caso, la comparación de los recuentos obtenidos con los dos métodos cromogénicos, permite deducir un alto grado de correlación entre ellos, como lo demuestra el análisis de regresión mostrado en la Figura 14, en la que puede verse un elevado coeficiente de correlación.

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FIGURA 14. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS DOS MÉTODOS CROMOGÉNICOS, ID Y MP, EN MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA.

2.5

Método MP (Log UFC/100 ml)

R2 = 0.93

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Método ID (Log UFC/100 ml)

Los datos obtenidos han demostrado que la capacidad de los dos métodos cromogénicos ensayados para enumerar coliformes y E. coli en aguas subterráneas es comparable o superior a los métodos estándar o de referencia. En este sentido, los dos medios de cultivo cromogénicos evaluados son similares a otros métodos enzimáticos desarrollados para la detección simultánea de coliformes totales y E. coli en agua [22-25]. Finalmente, la identificación de 400 colonias típicas y atípicas a partir de los medios ID y MP, ha demostrado una alta especificidad del agar ID para coliformes totales y E. coli (Tabla 11). En otras palabras, se detectó un alto porcentaje de falsos positivos para ambos grupos de indicadores con el método MP. Una alta tasa de falsos positivos para coliformes es coincidente con la tasa de confirmación hallada en otros estudios para los medios cromogénicos y fluorogénicos [23]. Sin embargo, el porcentaje de falsos positivos para E. coli obtenido con el medio MP es mayor que el valor normal para este tipo de medios de cultivo [25]. Este resultado puede deberse a la baja selectividad del agar MP (Tablas 9 y 10) que permite el crecimiento de una gran cantidad de flora acompañante. Muchas de las cepas falso positivas en este medio fueron gram-negativas, oxidasa positivas, incapaces de crecer a 44°C, de la misma forma, por ejemplo, que las flavobacterias productoras de β-glucuronidasa [25]. TABLA 11. ESPECIFICIDAD DE LOS MEDIOS CROMOGÉNICOS ID Y MP PARA EL RECUENTO DE E. COLI Y COLIFORMES TOTALES EN AGUAS SUBTERRÁNEAS. Método

10.4.1.1.1.1 Especificidad para coliformes totales

10.4.1.2 ESPECIFICIDAD E. COLI

PARA

FP1 (%)

FN2 (%)

FP (%)

FN (%)

ID

4/121 (3.3)

5/41 (12.2)

0/40 (0.0)

6/97 (6.2)

MP

17/138 (12.3)

3/66 (4.6)

7/48 (14.6)

3/129 (2.3)

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1

Falsos positivos (número de colonias que no se han confirmado como coliformes totales o E. coli/número total de colonias típicas examinadas). 2 Falsos negativos (número de colonias no típicas confirmadas como coliformes totales o E. coli/número total de colonias no típicas examinadas).

En resumen, los dos métodos evaluados basados en la tecnología de los sustratos definidos, son una alternativa viable a los procedimientos de referencia para la detección y recuento de coliformes en aguas subterráneas. Además, tienen la ventaja de que los resultados pueden obtenerse de una forma más sencilla y rápida. La comparación de los resultados obtenidos con estos dos medios cromogénicos indicaron que el agar MP fue más sensible y eficiente que el agar ID, mientras este último fue más específico y selectivo que el primero.

10.5

MUESTRAS DE AGUA CON ELEVADOS NIVELES DE BACTERIAS HETEROTROFAS

Otro de los aspectos importantes a la hora de evaluar la capacidad de un determinado método para detectar la presencia de un determinado indicador de contaminación es investigar la interferencia, que la flora acompañante, puede tener sobre el desarrollo de los microorganismos específicos en ese medio de cultivo. Con el objeto de evaluar la influencia de la flora acompañante sobre la capacidad de detección de E. coli por los medios de cultivo cromogénicos y fluorogénicos con respecto a los de refencia, se han analizado muestras con un alto contenido de bacterias heterotrofas, entre 103 y 106 bacterias/100 ml. El análisis de regresión entre los recuentos obtenidos con los métodos basados en la tecnología de sustratos y los métodos de referencia se muestra en las Figuras 15 y 16. Los resultados de este análisis demuestran una alta correlación entre los resultados obtenidos con los métodos ensayados y los de referencia. De acuerdo con estos datos, podemos indicar que la capacidad de los métodos basados en la tecnología de sustratos para detectar E. coli es equivalente a la de los métodos de referencia empleados en presencia de altos niveles de bacterias heterotrofas.

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Log UFC/100 ml (ID y MP); Log NMP/100 ml (CT)

FIGURA 15. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS MÉTODOS ID, MP Y CT Y EL MÉTODO DE REFERENCIA ISO-EC EN MUESTRAS CON ALTOS NIVELES DE BACTERIAS HETERÓTROFAS.

3.5 2

ID (R = 0.98) 2 MUG (R = 0.97)

3.0

2

MP (R = 0.91)

2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

Log UFC/100 ml (ISO-EC)

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Log UFC/100 ml (ID y MP); Log NMP/100 ml (CT)

FIGURA 16. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS MÉTODOS ID, MP Y CT Y EL MÉTODO DE REFERENCIA M-TEC EN MUESTRAS CON ALTOS NIVELES DE BACTERIAS HETERÓTROFAS.

3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

2

ID (R = 0.84) 2

MUG (R = 0.86)

0.5

2

MP (R = 0.65)

0.0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

Log UFC/100 ml (m-TEC)

11.

CONCLUSIONES

1.- El análisis de regresión obtenido entre los recuentos de E. coli observados con los medios cromogénicos y fluorogénicos con respecto a los métodos de referencia permite concluir que se dio una excelente correlación entre los recuentos obtenidos en los dos medios cromogénicos (ID y MP) y los dos métodos de referencia empleados en este trabajo. Esta correlación fue inferior cuando se comparan los resultados obtenidos con el medio fluorogénico. 2.- El medio MP es el que ha permitido una mayor eficacia de recuperación relativa de E. coli en aguas superficiales. No obstante, cuando se tienen en cuenta los demás parámetros (sensibilidad, selectividad y especificidad) las diferencias con respecto al ID apenas existen. 3.- El método ID, en términos de eficacia y selectividad, es más adecuado que el método de referencia ISO-CT para el recuento de coliformes totales en aguas superficiales. 4.- El análisis de varianza de los datos obtenidos con las muestras de agua preparadas en el laboratorio a partir de mezclas de agua superficial y tratada demostró la ausencia de diferencias significativas entre los recuentos de E. coli sobre ID, CT y MP y los obtenidos con los métodos de referencia empleados (ISO-EC y m-TEC). 5.- La mayor eficacia de recuperación relativa de E. coli en las muestras de agua preparadas a partir de mezclas de agua superficial y tratada se obtuvo con el medio MP. El análisis de varianza demostró que la eficacia de recuperación relativa de E. coli con este medio fue significativamente superior a la obtenida con los dos métodos de referencia y con el medio fluorogénico CT. Por su parte, entre LABORATORIO-SANTIAGO  Copyright Grupo AGBAR 1997

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los dos métodos fluorogénicos no se encontraron diferencias significativas en lo que a eficacia de recuperación relativa de E. coli se refiere. 6.- El análisis de varianza de los datos obtenidos con las muestras de agua marginalmente clorada también demostró la ausencia de diferencias significativas entre los recuentos de E. coli sobre ID, CT y MP y los obtenidos con los métodos de referencia empleados (ISO-EC y m-TEC). Sin embargo, cuando se analiza la sensibilidad y eficiencia de recuperación relativa E. coli de los diferentes métodos, se puede comprobar que los valores obtenidos con el método MP son inferiores a los hallados con las técnicas ISO-EC e ID. Estos valores fueron significativamente inferiores (p < 0.05), cuando se comparan con el método de referencia (ISO-EC). 7.- Al igual que sucede con las aguas preparadas en el laboratorio a partir de mezclas de agua superficial y tratada, en las muestras de agua marginalmente clorada también se observó una baja sensibilidad y eficiencia del método fluorogénico (CT) para detectar E. coli. Los valores obtenidos con este método fueron siempre significativamente inferiores (p < 0.05) a los observados con los otros métodos. 8.- De los tres métodos basados en la tecnología de sustratos definidos, el método cromogénico ID es el que permite un mayor nivel de detección de E. coli en muestras de agua marginalmente clorada. Las diferencias entre estos tres métodos se da en la sensibilidad y eficiencia de recuento, pues la especificidad para detectar E. coli por los tres métodos basados en la tecnología de sustratos definidos es, además de alta, muy similar entre ellos. 9.- Del análisis de las muestras de agua tratada, se puede deducir que los métodos basados en la tecnología de sustratos definidos dieron resultados equivalentes a los obtenidos con los métodos de referencia. No obstante, el recuento de la población total de bacterias que creció en los diferentes medios de cultivo, permite confirmar lo obtenido con otras muestras, en el sentido de que el medio MP es muy poco selectivo, al contrario de lo que sucede con los otros medios de cultivo. 10.- Los dos métodos evaluados, basados en la tecnología de los sustratos definidos, constituyen una alternativa viable a los procedimientos de referencia para la detección y recuento de coliformes totales y E. coli en aguas subterráneas. Además, tienen la ventaja de que los resultados pueden obtenerse de una forma más sencilla y rápida. 11.- La comparación de los resultados obtenidos en las muestras de agua subterránea con estos dos medios cromogénicos indicaron que el agar MP fue más sensible y eficiente que el agar ID, mientras este último fue más específico y selectivo que el primero. 12.- Los resultados del análisis de muestras de agua con elevados niveles de bacterias heterotrofas demostraron una alta correlación entre los resultados obtenidos con los métodos ensayados y los de referencia. De acuerdo con estos datos, podemos indicar que la capacidad de los métodos basados en la tecnología de sustratos para detectar E. coli es equivalente a la de los métodos de referencia empleados en presencia de altos niveles de bacterias heterotrofas.

12.

BIBLIOGRAFIA

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