Estudio comparativo de los venenos de serpiente cascabel (Crotalus durissus durissus) de ejemplares adultos y recien nacidos

0041-0101/83 S3 .00+ .00 0. 1983 Pergatnon Press Ltd .

Toxirort, Vol . 21, No. 3, pp . 379-384, 1983 . Printed in Great Britain .

ESTUDIO COMPARATIVO DE LOS VENENOS DE SERPIENTE CASCABEL (CROTALUS DURISSUS DURISSUS) DE EJEMPLARES ADULTOS Y RECIEN NACIDOS BRUNO LOMONTE, JOSÉ A. GENÉ, JOSÉ MARiA GUTIÉRREZ y LUIS CERDAS Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiologia, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica (Accepted for publication 4 November 1982)

B. LomoNTE, J . A. GENE, J . M. GUTIÉRREZ and L. CERDAS . Estudio comparativo de los venenos de serpiente Cascabel (Crotales durissus durimus) de ejemplares adultos y recién nacidos. Toxicon 21, 379- 384, 1983 . - Venoms from adult and newborn Central American rattlesnakes (Crotales durissus durissus) were compared for lethal, proteolytic, hemorrhagic, myonecrotic, edematigenous and in vitro hemolytic activities . Electrophoretic and immunoelectrophoretic patterns showed some differences between these venoms . Venom from newborn snakes was devoid of hemorrhagic and edematigenous activities, whereas the venom from adult specimens induced these effects . On the other hand, newborn snake venom showed higher lethality and indirect hemolytic activity, and lower proteolytic activity, than venom from adult specimens. Both types of venoms induced only slight myonecrosis in mice, as judged by histological observation . The ED,o of an antivenom, in terms of absolute weight neutralized per ml of serum, was lower for the newborn specimens venom than for adult's venom, however, for each venom the number of LD  neutralized was similar. INTRODUCCION

previos en los que se han comparado venenos de seipientes adultas con los de serpientes juveniles y recién nacidas de la misma especie, tanto bioquimicos como farmacolbgicos, han demostrado que existen diferencias significativas en algenas de sus propiedades tales como letalidad, actividades enzimâticas, patrones electroforéticos, efectos locales y otroS (JIMÉNEZ-PORRAS, 1964; MINTON, 1967, 1975; FIERO et al., 1972; BONILLA ESTUDIOS

et al., 1973; REID y THEAKSTON, 1978 ; GUTIÉRREZ et al., 1980; MEIER y FREIVOGEL, 1980) .

El estudio de las variaciones ontogenéticas en los venenos de seipiente posee importancia tanto desde un pento de vista de ciencia bâsica como en el campo clinico . Algunos investigadores han sugerido la utilizacibn de los venenos de seipientes juveniles para la purificacibn de algenos componentes que se encuentran en proporciones significativamente mayores que en el veneno de ejemplaies adultos (BONILLA et al., 1973) . En el presente trabajo se han comparado los venenos de ejemplaies recién nacidos y adultos de serpientes Cascabel (C. durimus) basàndose en las actividades letal, proteolitica, hemolitica, hemorrâgica, mionecrdtica y edematigena. Ademàs se han comparado los patrones inmunoelectroforéticos de estos venenos fiente a un suero antiofidico polivalente comercial, asi como la capacidad neutralizante de este antiveneno para la actividad letal. MATERIALES Y METODOS Venenos

El veneno de cascabeles adultas es una mezcla obtenida de mis de 50 ejemplares de C. d. durissws (lote N° C.D .7-80) procedentes de Guanat,aste, noroeste de Costa Rica . El veneno de cascabeles recién nacidas es una 379

380

BRUNO LOMONTE et al.

mezcla obtendda de nuis de 50 ejemplares nacidos en nuostro serpentario (de 3 camadas) y monores de un mes de edsd (lote N° C.D .R .N .-1-80). Todos los ejemplares grévidos procedfan de la misma zona geogréfica descrita . Los venenos fueron congelados, liofilizados y conservados a -70°C hssta su utilizacibn .

Antiveneno

El suoro antiofidico polivalente (lote N° 121-P) producido en el Instituto Clodomiro Picado (Costa Rica) fue utilizado en las pruebas de neutralizaciôn de letalidad e inmunoelectroforesis . La mezcla inmunogénica empleada en la producci6n de este suero incluye venenos de Bothrops asper, C. d. durissus y Lachesis muta.

Inmunoelectroforesis

Las electroforesis e inmunoelectroforesis de los venenos fueron realizadas en geles de agarosa0,75% (Division of Marine Colloids Inc., Maine) on amortiguador de barbital pH 8,2, fuerza i6nica 0,l,en equipo electroforético Gelman (Ann Arbor, Michigan). Las tinciones se realizaron con colorante negro de almid6n (Allied Chemicals, New York). Las electroforesis fueron rastreadas y graficadas en un espectrofot6metro Varian-Techtron a 615 run de longitud de onda .

Letalidad y neutralizaci6n de la actividad Jetai

Grupos de dioz ratones blancos Webster de 16-18 g de peso, fueron inyectados por via i .p . con diferentes dosis de los venenos en un volumen total de 0,5 ml . Las muertes fueron registradas durante un periodo de 48 hr y los valores de DL. fueron obtenidos por el método de Speatman-Karber (W .H .O ., 1981). Los valores de DE,o para la neutralizacidn con antiveneno polivalente fueron obtenidos por el mismo método, inyectando grupos de dioz ratones de 16-18 g de peso con 5 DL . de los venenos por via i .p . en un volumen total de 0,5 ml, previamente incubados con cantidades variables del antiveneno .

Actividad proteoiftica

La actividad proteolitica fue determinada utilizando caseina como sustrato (FRIEDERICH y Tu, 1971). Se incubaron soluciones de los venenos con 2,0 ml de soluci6n de caseina al 1 % (BDH Chemicals, Poole) amortiguada a pH 7,0 con fosfatos 0,1 M. Después de 30 min a 37°, la reacciôn se detuvo anadiendo 4,0 ml de Lido tricloroacédco al 5% (Merck, Darmstadt) . Posterior a un reposo de 30 min a temperatura ambiente, la absorbancia de los sobrenadantes fue lefda a 280 nm en un espectrofotdmetro Varian-Techtron contra el blanco apropiado. La actividad proteolftica especffica exprosada en U/mg, se obtuvo dividiendo el cambio en absorbancia del sobrenadante en 30 min por los mg de veneno empleados.

Efecto edematigeno

Se utiliz6 et método de YAMAKAWA et al. (1976) ; grupos de sois ratones blancos Webster de 18-20 g de peso fueron inoculados en la almohadilla plantar dol miembro posterior izquierdo con dosis de 15, 30 y 60 leg de los venenos en un volumen de 30 pl . Se inyectaron 30 Nl de soluciôn salins amortiguada pH 7,2 en et miembro posterior derecho como control. A las 24 horas los animales fueron sacrificados y sus patas fueron cortadas a la altura de la articulaciôn tarsal, y pesadas en balanza analitica . El edema se expres6 como et porcentaje de sumento de peso de la pats envenenada en relaciôn al peso de la pats control, y la dosis odematfgena minima (DEM) se defmi6 como los gg de veneno que inducen un 30% de edema.

Ffecto hemorrdgico

Se emple6 el método de KONDO et al. (1960) con algunas modificaciones . Grupos de cuatro ratones blancos Webster de 18-20 g de peso fueron inyectados por via i .d . con dosis de 5, 10 y 20 mg de los venenos en un volumen de 0,1 ml . Alas 2 hr los animales fueron sacrificados por inhalaciôn de cloroformo, su piol flue removida y el drea de la mancha hemorrégica en esta fue medida. Se utilizsron ratones inyectados i.d . con 0,1 ml de soluci6n salina amortiguada pH 7,2 como control. La actividad hemorrâgica se expres6 como la DHM (dosis hemorrégica minima) que es la cantidad de voneno que induce un drea hemorrégica de 10 mm de diémetro .

Ffecto mionecr6tico

Grupos de cuatro ratones blancos Webster de 18-20 g de peso fueron inyectados i .m . en et muslo con dosis de 10, 25, 50 y 100 Ng de los venenos en un volumen de 0,1 ml . De rada grupo se sacrificaron dos ratones a las 5 y a las 24 horas. Se tourd uns muestra dol tejido muscular inoculado para la evaluaciôn histolégica de cortes tenidos con hematoxfina-" na. Como control se utiliraron ratones inyectados i.m . con 0,1 ml de soluci6n salins amortiguada pH 7,2.

Actividad hemolltica in vitro La actividad hemolitica in vitro sobre eritrocitos humanos fue determfnada segùn el método descrito por GômFz-LEIVA (1975) . La actividad hemolftica directa se midi6 agregando diferentes cantidades de los venenos a una suspensi6n de eritrocitos al 2,5% en soluciôn salina calcificada . Después de incuber 30 min a 37°, se ley6 la absorbancia de los sobrenadantes a 550 nm en un espectrofotdmetro Varian-Techtron. EI valor de 100% de hemôlisis se obtuvo agregando agua destilada a la suspensi6n estandarfzada de eritrocitos .

Venenos de Serpientes Cascabel

38 1

La actividad hemolitica indirecta se midid agregando 250, 500, 750 y 1000 l+g de los venenos a una suspension de eritrocitos al 2,5% en solution salina calcificada, a la cual se agrego 0.1 ml de yems de huevo lavada como fuente de fosfatidileolina . Después de incubar 30 min a 37°, se leyd la absorbancia de los sobrenadantes a 550 nm . Todas las pruebas se realizaron por triplicado .

RESULTADOS

Para la mayoria de las caracteristicas estudiadas, los resultados mostraron diferencias significatives entre los venenos (Cuadro 1) . El veneno de las serpientes recién nacidos posee uns letalidad varias veces mayor que et de las adultas. La neutralizacibn de la letalidad de ambos venenos pur suero antiofidico polivalente fue similar en cuanto al niunero de DL . neutralizadas pur ml de antiveneno, aunque en términos absolutos las DE . mostraron diferencia en cuanto al peso de veneno seco neutralizado en rada calo. Los efectos hernorrâgico y edematigeno que induce et veneno de adultos no se presentaron al inoculer et veneno de recién nacidos; algunas de las dosis empleadas para evaluar estos efectos ton et veneno de adultos resultaron ser letales en et calo de venenos de recién nacidos : las de 60 Fàg para evaluar edema, y de 20 jug para hemorragia causaron la muerte del 100% de los ratones inoculados, sin que se observaran dichos efectos. CUADRO 1 . EFECTOS PROVOCADOS POR LOS VENENOS DE EJEMPLARFS ADULTOS Y RECIEN NACIDOS DE Crotalus duriuus durimus

Efecto

DL,o LP . t DE yo i .p .

Adultos 13,6 t 3,8 pg $ 2,62 t 0,32 mgV/mlS § 19 t1 U/mg 10,0 hg 2,2 gg leve

Recien nacidos" 1,9 t 0,2 pg 0,35 t 0,07 mgV/mlS 6 t 1 U/mg no detectable no detectable leve

Prote6lisis Edema (DEM) Hemorragia (DHM) Mionecrosis Hem6lisis directa Hem6lisis indirectal1 22 t2%a 100 t 5% *Este veneno muestra un aspecto casi incoloro, en contraste con el amarillo caracteristico del veneno de adeltos. 1' En raton blanco de 16- 18 g. *Segtln BoLAwos (1972) . §Mg de veneno/ml de suero antiofidico. 11 Valores obtenidos con 500 Ng de cada veneno.

Ninguno de estos venenos caus6 hemblisis directa; sin embargo el de recién nacidos posee una acci6n hemolitica indirecta mayor (Fig. 1). Histol6gicamente no se apreciaron diferencias cualitativas en la acci6n mionecr6tica de estos venenos, que en ambos casus provocaron una destrucci6n leve de fibres musculares . Los patrones electroforéticos mostraron algunas diferencias (Fig. 2). Llama la atenci6n que la banda de migraci6n an6dica râpida del veneno de adeltos es apenas perceptible en el de recién nacidos. Las inmunoelectroforesis mostraron un mayor nlumero de arcos de precipitaci6n con el veneno de adeltos, principalmente en la regi6n de migraci6n an6dica râpida . DISCUS16N

El veneno de las cascabeles (Crotales durimus durissus) recién nacidos, posee caracteristicas considerablemente diferentes a las del veneno de ejemplares adultos de la misma especie

BRUNO LOMONTE et al.

382

100 90 80 29

70 60 50 40 30 20 10 0

250

500

Veneno,

750

1000

Ag

FIG . 1 . ACTIVIDAD HEMOLITICA INDIRECrA DEL VENENO DE C. d. durlsw DE EJEMPLARES ADULTOS Y RECIEN NACIDOS.

0 ----

e

Recién nacidos;

e

e

adultos. Cada punto representa el promedio de tres determinaciones t 1 D .E .

FIG . 2 . PATRÔN ELECTROFORÉTICO DE LOS VENENOS DE C. d. dU/LMflS DE EJEMPLARES ADULTOS Y RECIEN NACIDOS .

EI ânodo estâ en el lado derecho. Las places electroforéticas fueron tenidas con negro de almid6n y rastreadas adultos; 0 = origen . a 615 nm . - - - - Recién nacidos;

Venenos de Serpientes Cascabel

383

y zona geogr ifica . No oostante que la existencia de variaciones individuales intraespecificas ha sido claramente demostrada en los venenos de varias especies, el hecho de haber trabajado nosotros con mezclas de venenos provenientes de muchos ejemplares nos permite concluir que las variaciones observadas no estân determinadas por variaciones individuales, sino por diferencias de indole ontogenético . Es notable la alta letalidad del veneno de los recién nacidos (màs de siete veces mayor que el de adultos) . Reportes de distintos autores muestran que, en general, los individuos recién nacidos y j6venes de la familia Crotalidae, poseen venenos mâs letales que los adultos (MINTON, 1967 ; FIERO et al., 1972 ; REID y THEAKSTON, 1978 ; GuTIÉRREZ et al., 1980 ; MEIER y FREIVOGEL, 1980) . El anâlisis electroforético e inmunoelectroforético muestra que existen variaciones cualitativas y/o cuantitativas en la composicibn proteica de los venenos que dependen de la edad de los ejemplares ; estas variaciones pueden reflejarse en las diferencias obtenidas en las actividades y efectos evaluados . El pronunciado efecto hemorrâgico del veneno de ejemplares adultos no se detecta en el de ejemplares menores de 30 dias con el método y las dosis empleadas. MINTON (l967), tomando muestras de veneno de Crotalus horridus atricaudatus a diferentes edades, también encontrb que su actividad hemorrâgica aumenta con la edad, mientras que en caso de la especie Bothrops asper (GUTIÉRREZ et al., 1980) ocurre una situaci6n inversa, ya que el veneno de los recién nacidos es mâs hemorrâgico que el de los adultos. La ausencia de actividad hemorrâgica en el veneno de serpientes recién nacidas contrasta con los casos de muchos otros venenos de especies del género Crotalus, los cuales inducen un claro efecto hemorrâgico. De los venenos de Cascabel estudiados, solamente los de Crotalus scutulatus (OWNBY, 1982) y C. d. durissus recién nacidas no producen hemorragia . La actividad proteolitica sobre caseina en el veneno de adultos es mayor que en el de recién nacidos. El mismo fenbmeno ha sido descrito para la especie Crotalus horridus horridus (BONILLA et al., 1973) al comparar juveniles y adultos. Sin embargo, este fen6meno tampoco parece ser una regla general en la familia Crotalidae, pues de nuevo en la especie Bothrops asper ocurre lo inverso (GuTIÉRREZ et al., 1980). El efecto edematigeno es muy marcado en el veneno de adultos; no es detectable en grado significativo para el de recién nacidos. Esto contrasta con los hallazgos en la especie B. asper (GuTIÉRREZ et al., 1980) en que el veneno de recién nacidos es màs edematigeno. La mayor actividad hemolitica indirecta del veneno de recién nacidos sugiere que hay una mayor actividad de fosfolipasa A~ con respecto al veneno de adultos ; lo anterior puede deberse a diferencias en la concentracidn o en las propiedades catalrticas especificas de las fosfolipasas presentes. Resultados similares han sido comunicados para la especie Crotalus horridus atricaudatus (MINTON, 1967). Las variaciones de color entre los venenos estudiados correlacionan con observaciones previas de varios autores (JI1ÈNEZ-PORRAS, 1964 ; MINTON, 1967 ; FIERo et al., 1972 ; BONILLA et al., 1973) y sugieren que el veneno de ejemplares adultos posee mayor cantidad de L-aminoàcido oxidasa que el de recién nacidos. El suero antiofidico comercial neutraliza cantidades absolutas del veneno de recién nacidos significativamente menores respecto al de adultos, probablemente debido a la marcada diferencia en la letalidad entre estos. De los resultados de este estudio se deduce que, al menos en rat6n, las caracteristicas fisiopatolbgicas del envenenamiento por C. d. durissus recién nacidas difieren radicalmente de las inducidas por el veneno de ejemplares adultos de dicha especie. GUT>ÉRREZ y CHAvEs (1980) describieron los efectos locales (hemorragia, edema y mionecrosis) inducidos por el veneno de C. d. durissus (adultas) en raton blanco . Por otro lado, en una revisi6n de

38 4

BRUNO LOMONTE et al.

21 expedientes clinicos de envenenarniento por esta misma especie, se encontraron efectos locales semejantes a los descritos en rat6n (Bolan"os et ai., 1981). Esto sugiere que la ausencia de efecto hemorràgico y edematigeno del veneno de ejezaplares recién nacidos en rat6n, podria darse también en el humano .

Agradecimientos - Agradecemos a los compaâeros ALVARo FLoREs, GUILLERMO FLORES, GERARDO SERRANO,

pot ALFREDO VARGAS, AUL ROBLES y OSCAR RAMEREZ, su valiosa ayuda aportada a este estudio; a la Dra . ELsA PORTILLA por la preparacibn de los cortes histoldgieos y a las Sras . MARIETTA COLLADO r HILDA HERRERA por et trabajo mecanogrdrico. Esta investigacibn fue financiada por la Vicerrectorfa de Investigacibn de la Universidad de Costa Rica, Proyecto No 02-07 10-67.

REFERENCIAS BoLANos, R. (1972) Toxicity of Costa Rican snake venoms for the white mouse. Am. J. trop. Med. Hyg. 21, 360. BoLARos, R., MARIN, O., MORA, E. y ALFARo, E. (1981) El accidente ofidico por cascabela (Crotahrs durissus durissus) en Costa Rica . Acta mod. costarric. 24, 211 . BONILLA, C. A., FAITH, M. R. y MINTON, S. A., JR . (1973) . L-Aminoacid oxidase, phosphodiesterase, total protein and other properties of juvenile timber rattlesnake (C. h . horridus) venom at different stages of growth . Taxiton 11, 301. FIERo, M. K., SEwERT, M. W., WEAvER, T. J. y BONILLA, C. A. (1972) Comparative study of juvenile and adult prairie rattlesnake (Crotalus viddis viridis) venoms. Toxicon 10, 81 . FRIEDRICH, C. y Tu, A. T. (1972) Role of metals in snake venoms for hemorrhagic, esterase, and proteolytic activities . Biochem. Pharmac. 20, 1549. GUTIÉRREz, J. M., CHAvEs, F. y BoLAivos, R. (1980) Estudio comparativo de venenos de ejemplares recién nacidos y adultos de Bothrops riper. Revta Biol. trop. 28, 341 . GUTIERREZ, J. M. y CHAvEs, F. (1980) Efectos proteolftico, hemorrégico y mionecr6tico de los venenos de serpientes costarricenses de los g6neros Bothrops, Crotalus y Lachesis. Taxiton Is, 315. JIMÉNEz-PoRRAs, J. M. (1964) Intraspecific variations in composition of venom of the jumping viper, Bothrops nummilera. Toxfeon 2, 187. KoNDo, H., KoNDo, S., IREZAWA, I., MURATA, R. y OHSAKA, A. (1960) Studies of the quantitative method for the determination of hemorrhagic activity of Habu snake venom . Jap. J. med. Sci. Biol. 13, 43 . MEIER, J. y FREYvoGEL, T. A. (1980) Comparative studies on the venoms of the fer-de-lance (Bothrops atrox), carpet viper (Bchis carinatus) and spitting cobra (Ngia nigricollis) snakes at different ages. Toxicon 18, 661 . MINTON, S. A., JR . (1967) Observations of toxicity and antigenic make up of venoms from juvenile snakes . En: Animal Toxins, p . 211 (RUSSELL, F. E. y SAUNDERS, P., Eds.) . Oxford : Pergamon Press . MINTON, S. A. (1975) A note on the venom of an aged rattlesnake. Toxicon 13, 73 . OWNBY, C. L. (1982) Pathology of rattlesnakes envenomation . En : Rattlesnake Venoms, Their Actions and Treatment, p . 163 (Tu, A. T., Ed .) . New York : Marcel Dekker, Inc. REID, H. A. y THEAKSTON, R. D. G. (1978) Changes in coagulation effects by venoms of Crotalus atrox as snakes age. Am . J. trap. Med. Hyg. 27, 1053 . WORLD HEALTH ORGANIZATION (1981) Progress in the Characterization of Venoms and Standardization of Antivenoms, W. H. O. Offset Publication No . 58 . Geneva : W.H.O. YAMAKAWA, M., NozAKI, M. y HOKAMA, Z. (1976) Fractionation of Sakishima-habu (Trimeresurus elegans) venom and lethal, hemorrhagic, and edema forming activities of the fractions . En : Animal, Plant and Microbial Toxins, Vol . 1, p. 97 (OHSAKA, A., HAYASHI, K. y SAWAI, Y., Eds.) . New York : Plenum Press .