ESTUDIO CINÉTICO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA

ESTUDIO CINÉTICO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA Javier E. Hernández, Luis F. Reyna, Eric Ortiz, M.C Salomón Rojas Treviño Tecnológico de Monterrey, Departamento de Química, Campus Monterrey

ABSTRACT: Las enzimas son macro-moléculas biológicas que actúan como catalizadores, es decir, que alteran la velocidad de una reacción favorablemente. Este texto surge tras la necesidad de estudiar los efectos de la concentración de la enzima catalasa en la descomposición de peróxido de hidrógeno y etanol como inhibidor. A través del apoyo de la interfaz Logger Pro ® se midió la variación de presión en un tubo de ensayo con soluciones preparadas y con dicha información se pudo obtener el comportamiento de la reacciones a temperatura constante. Se linealizaron los comportamiento y se obtuvieron parámetros importantes en el campo de cinética química como las velocidades inciales de reacción y el orden de la misma.

I INTRODUCCION Las enzimas son macro-moléculas biológicas que actúan como catalizadores impulsando la velocidad de una reacción hacia adelante. La mayoría de los catalizadores están formados por varias cadenas de aminoácidos llamadas proteínas que aceleran la velocidad de reacciones en los sistemas químicos [2]. La funcionalidad de los catalizadores depende de los pliegues de las proteínas y como es que estas interactúan. Hay diferentes factores como la temperatura, la concentración, la presencia de inhibidores y el pH que pueden alterar su funcionamiento óptimo. La mayoría de los procesos metabólicos dentro de la célula requieren enzimas en la medida de ocasionar tasas de reacción lo suficientemente altas para sostener la vida. La catalasa es una de las enzimas más abundantes en la naturaleza. Esta enzima sirve para proteger a la célula de efectos tóxicos de algunas sustancias como los

efectos del peróxido de hidrógeno a través de su descomposición en oxígeno molecular y agua sin producir radicales libres. Leonor Michaelis y Maud Leonora Menten propusieron un modelo conocido como Cinética Michaelis-Menten para describir la cinética enzimática. Este modelo sirve para explicar cómo una enzima puede aumentar la tasa de reacción describiendo la dependencia con la concentración de la enzima y el sustrato[5]. La reacción general de la enzimacatalizadora que en este caso se refiere a la catalasa es: (1) E representa a la enzima, S representa al sustrato, [ES] a la interacción de Encima-Sustrato y P al producto consecuente por dicha interacción [7].

(5)

Fig. 1 Representación gráfica de la interacción de Enzima y sustrato [2]

Para la reacción de catalasa tenemos:

Donde [H2O2] es la concentración del peróxido (moles/L) que por principio de Le Chatelier puede ser expresado en términos de presión (kPa), α es el orden de la reacción y k es la constante de velocidad que tendrá unidades dependiendo del orden de la reacción. Al analizar la ley de velocidad para el oxígeno se tiene que: (6)

La ley de velocidad de reacción se describe como las concentraciones de todas las especias presentes varían con el tiempo, cambiando así las propiedades del sistema. La velocidad de la reacción se calcula midiendo el valor de cualquier propiedad adecuada que pueda relacionarse con la composición del sistema como una función del tiempo [3] El objetivo de este texto es estudiar el comportamiento de la velocidad de reacción a diferentes concentraciones de enzima catalasa, de peróxido de hidrógeno (H2O2) y adición con un inhibidor. A causa de que es producido Oxígeno molecular a causa de la descomposición del Peróxido (H2O2) en la reacción la ley de velocidad para el reactivo es:

Y al aplicar logaritmo a ambos lados de la igualdad se tiene la siguiente expresión: (

(7)

La cual nos permite linealizar el comportamiento donde α es el orden de la reacción, y “lnk” corresponde a la ordenada al origen. II MATERIALES Para la realización de la práctica se utilizaron Fosfato de Potasio monobásico (𝐾𝐻2 𝑃𝑂4) y Fosfato de Potasio Dibásico (𝐾2 𝐻𝑃𝑂4 ), ambos reactivos son de la empresa “Analytyka”. Peróxido de Hidrógeno (𝐻2 𝑂2 ) fue obtenido de Quimicos Fermont a 3% de volumen. También se requirió Etanol (𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻) al 96% de volumen. Sensor de presión LabQuest® e interfaz computacional Logger Pro®.

1. Efecto den la concentración de catalasa.

Fig.2 Fosfato de Potasio Monobásico marca ANALYTYKA ®

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Se preparó una solución buffer de 100 ml de fosfato de potasio con 1.08 g de (𝐾𝐻2 𝑃𝑂4), 0.49 g de (𝐾2 𝐻𝑃𝑂4 ) y agua destilada. El PH de solución fue medida para verificar que fuera una solución neutra. Se preparó un baño de agua a aproximadamente 37 °C con el fin de simular la temperatura corporal y esta se mantuvo a lo largo de la experimentación. Se preparó también una solución de 1 mg de enzima catalasa en 50 ml de la solución buffer. Se utilizó un sensor de Presión Vernier, un sensor de temperatura y la interfaz de software Logger para el análisis de datos. La experimentación fue dividida en tres partes:

Un tubo de ensayo con 1mL de 𝐻2 𝑂2 (3% volumen) y dos pipetas de Beral, una con 1mL de la solución de catalasa y otra con 2 ml de solución buffer fueron puestas en el baño por aproximadamente 2 minutos. Posteriormente las soluciones fueron agregadas al tubo de ensayo con el peróxido (se agitó para homogenizar la mezcla), se conectó el tapón de goma hacia el sensor de presión y se procedió a tapar el tubo de ensayo. Con el tubo de ensayo sumergido en el baño se procedió a iniciar la lectura de datos durante 400 segundos. Finalmente la velocidad inicial de reacción fue determinada identificando la región lineal observando la gráfica seleccionando entre 60 y 100 segundos de la misma y con dicha información realizar una regresión lineal. Este mismo procedimiento se hizo tres veces para las diferentes medidas de catalasa que se muestra en la [Tabla 1]. Tabla 1. Experimentos con efecto en la concentración de la catalasa

H2O2 (ml) Sol. Catalasa (ml) Sol. Buffer(ml) 1 1 2 1 2 1 1 3 -

concentración del peróxido de hidrógeno como se muestra en la [Tabla 2]

Tabla 2. Efectos en la variación en la concentración del Peróxido de Hidrógeno

1 mL H2O2 (volumen) Sol. Catalasa (mL) 3% 1 1,5% 1 0,50% 1 Fig. 3 Baño de agua y sensor de temperatura

2. Efectos en la concentración de Peróxido de Hidrogeno Un tubo de ensayo con 1 mL de 𝐻2 𝑂2 (3% de volumen) y una pipeta con 1 mL de solución de catalasa fueron sumergidas en el baño de agua mostrado en la [Fig.3] durante 2 minutos. Posteriormente la solución de catalasa fue depositada en él tubo de ensayo y agitado para su homogenización. El tubo de ensayo fue cubierto por el tapón de goma el cual estaba conectado al sensor de presión. Se recolectaron los datos con el tubo de ensayo dentro del agua durante un intervalo de 400 segundos. De igual manera que en la parte anterior del experimento se analizó la región lineal de la gráfica para encontrar la velocidad inicial de la reacción y se procedió a hacer una regresión lineal tomando en consideración entre 60 y 100 datos. Se repitieron los pasos anteriormente mencionados haciendo variar la

3. Efectos de la inhibición de Etanol Un tubo de ensayo con 1 mL de 𝐻2 𝑂2 (3% de volumen), una pipeta beral con 1mL de solución de catalasa y una pipeta con 1mL de solución de etanol. Se sumergieron durante 2 minutos en el baño de agua precalentado, posteriormente se mezclaron las soluciones de las pipetas en el tubo de ensayo y se agitaron para homogenizarse. Se cubrió el tubo de ensayo con el tapón de goma conectado al sensor de presión. Se comenzó la recolección de datos en un intervalo de 400 segundos, se analizó la región lineal de la curva para obtener la velocidad inicial de reacción. Se procedió a hacer una regresión lineal tomando entre 60 y 100 datos. Estos pasos se realizaron tres veces para diferentes concentraciones de etanol las cuales se muestran en la [Tabla.3] Tabla 3. Efectos de inhibición por Etanol H2O2 (mL) Sol. Catalasa (mL) 1 mL EtOH (volume) 1 1 100% 1 1 50% 1 1 10%

III RESULTADOS

Reaccion de H2O2 con diferentes cantidades de Catalasa 107,00

y = 0,0597x + 97,393 R² = 0,9966

106,00

Presión (kPa)

105,00 104,00

y = 0,0309x + 97,282 R² = 0,9965

103,00 102,00 101,00 100,00

y = 0,0132x + 98,111 R² = 0,9648

99,00 98,00 40

60

80

100

120

140

Tiempo (s) Cat. 1 mL

Cat. 2 mL

Cat. 3 mL

Fig. 4 Gráfica del comportamiento de velocidad de reacción a diferentes concentraciones de catalasa

Las Figuras [4] [5] y [6] muestran el comportamiento del cambio de presión en función del tiempo de acuerdo a los procedimientos experimentales

anteriormente descritos. Las ecuaciones mostradas en dichos gráficos representan la regresión lineal de la información recopilada.

Reacciones a diferentes concentraciones de Peróxido 100,500

y = 0,0153x + 97,411 R² = 0,9953

Presión (kPa)

100,000 99,500

y = 0,0134x + 97,366 R² = 0,9987 Per. 3%

99,000

Per. 1.5%

y = 0,0038x + 98,507 R² = 0,9927

98,500 98,000

Per. 0.5 %

97,500 40

60

80

100

120

140

160

Tiempo (s)

Figura 5. Comportamiento de la Presión del Peróxido de Hidrógeno a diferentes concentraciones en función del tiempo

Figura 6. Comportamiento de la Presión del Peróxido de Hidrógeno a diferentes concentraciones en función del tiempo

Tabla 4. Velocidades iniciales vs concentración de Peróxido

Vel. Inicial (kPa/s) [H2O2] (mol/L) 0,0038 0,50% 0,0153 1,5% 0,0134 3% Se procedió a realizar un linealización de dicho comportamiento a través de la ecuación 7. Esto se hizo con la finalidad de obtener el orden de la reacción.

Ln(V0) vs Ln([H2O2]) -3 -6,5

Ln(Vel. Inicial)

La pendiente de la Figura [5] se refiere a la velocidad inicial de descomposición de la reacción. La [Tabla 4] mostrada a continuación muestra las tasas iniciales de descomposición del Peróxido en a diferentes concentraciones.

-5,5

-4,5

y = 1,0424x + 0,5525 R² = 0,7867

-3,5

-3,5

-4

-4,5 -5

Ln([H2O2])

-5,5

Figura 7. Linealización logarítmica de la velocidad inicial vs la concentración de peróxido

El modelo de la ecuación y=mx + b donde la m representa la pendiente y en este caso es el orden de la reacción “α” y b es la ordenada al origen que es igual al 𝑙𝑛𝑘

𝛼 = 1.0424 𝑘 = 𝑒 −0.5525 = 0.5755 IV DISCUSION DE RESULTADOS Se puede observar en la [Figura 4] el efecto positivo de la concentración de catalasa en la descomposición del peróxido de hidrógeno, es realmente prominente el aumento de la pendiente (velocidad) de reacción de descomposición a medida que se aumenta la concentración de la enzima en la solución. De acuerdo a Su & Li [1] con un PH de aproximadamente 7, la tasa inicial de descomposición de Catalasa es de 0.147 kPa/s y en los resultados del experimento se obtuvo con 1mL de catalasa una tasa incial de 0.0132 kPa/s, sin embargo en el texto presentado de Su & Li la solución amortiguadora de buffer fue preparada en 18 ml de agua además de usar HCl y NaOH en lugar de Fosfato de Potasio monobásico y dibásico. En la [Figura 5] se deja la variable de la concentración de catalasa como una constante y lo variable es la concentración del peróxido de hidrógeno. Podemos observar una relación directamente proporcional en la concentración de peróxido y la variación de la presión. Sin embargo en el experimento con 0.5% de peróxido se puede apreciar que inicia con un offset de presión más alto que el de 3% y 1.5% , sin embargo la razón de cambio no es mayor, y como evidencia se observa una línea casi constante en cuanto a variación de la presión en función del tiempo.

En cuanto a la variación de la concentración de etanol se puede apreciar en la [Figura 6] que la concentración del mismo atenúa la velocidad de reacción. En el caso donde la solución era puramente etanol es claro que la pendiente de la variación de presión tiene valor negativo, limitando de manera abrupta la reacción.

V CONCLUSION Las enzimas son moléculas de origen biológico que acelerar el proceso de reacción y por ende se les atribuye el carácter de catalizador. Se pudo determinar el comportamiento de la descomposición del peróxido variando distintos parámetros como la concentración de la enzima catalasa, la concentración del mismo peróxido y el efecto inhibidor de un compuesto de grupo OH. En la literatura se ha encontrado como otro tipo sustancias como ácidos y bases a distintas concentraciones pueden resultar propicias demostrar distintos comportamientos de reacción. El tipo de propiedades que puede tener una sustancia como el que acelere una reacción o inhiba la reacción son de importancia en distintos campos de la ciencia como la bilogía, la química y la ciencia de los materiales.

Referencias [1]Su, C., & Li, M. (s.f.). Massachusetts Institute of Technology: Catalase Kinetics. Obtenido de

http://web.mit.edu/chrissu/Public/5 310lab3.pdf [2]Abdelnour, M., Quave, A., Ma, T., & Baghoyan, H. (s.f.). EnzymesChemwiki. Obtenido de http://chemwiki.ucdavis.edu/Biologi cal_Chemistry/Catalysts [3]Castellan, G. (1974). Fisicoquímica. Estado de México: Fondo Educativo Interamericano. [4]Kremer, M. L. (1975). Kinetics of Reduction of the Catalase-Hydrogen Peroxide Complex by Ethanol . The Journal of Physical Chemistry, 952955. [5]Le, H., Algaze, S., & Tan, E. (s.f.). MichaelisMenten Kinetics. Obtenido de http://chemwiki.ucdavis.edu/Biologi cal_Chemistry/Catalysts/Enzymatic_ Kinetics/Michaelis-Menten_Kinetics [6]Nita, M., Raducan, A., Puiu, M., D, O., & Bucharest, U. o. (2007). STABILIZATION OF CATALASE IN THE PRESENCE OF ADDITIVES. Obtenido de https://www.researchgate.net/profil e/Adina_Raducan/publication/26609 636_STABILIZATION_OF_CATALASE_I N_THE_PRESENCE_OF_ADDITIVES/li nks/0912f5075bdca58821000000.pd f [7]University of Washington. (s.f.). MichaelisMenten Kinetics and Briggs-Haldane Kinetics. Obtenido de http://depts.washington.edu/wmatk ins/kinetics/michaelis-menten.html

ANEXOS [4]

[1]

[2]

[5]