Estampas del mundo microscópico Javier Gutiérrez-Jiménez Lorena Mercedes Luna-Cazáres
Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas 2009
El jaguar es uno de las especies más representativas de la fauna chiapaneca y el símbolo por antonomasia de la biodiversidad en nuestro estado. Bajo su nombre están contenidos todos los títulos pertenecientes al ámbito de las ciencias naturales producidos en la universidad.
Primera edición: 2009 D. R. ©2009. Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas 1ª Avenida Sur Poniente número 1460 C. P. 29000, Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, Mexíco. www.unicach.edu.mx
[email protected] ISBN 978-607-7510-27-7 Diseño de la colección: Manuel Cunjamá Diseño de Portada: Wendy Vázquez Gómez Impreso en México
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Agradecimientos
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xpresamos nuestro agradecimiento por el esfuerzo realizado a María Guadalupe del Carmen Torres Sánchez, Leamsi Paola Fajardo Martínez, Alejandro Vera Domínguez, Juan de Dios Flores Hernández y a Carlos Alberto Balcázar Reyes, todos ellos alumnos de la licenciatura en Biología de la UNICACH, así como a Hugo Arturo Moreno Rivero, egresado de la licenciatura en Biología de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, por la disponibilidad mostrada y participación entusiasta en el desarrollo del presente material didáctico. Asimismo, agradecemos a la empresa Alta Especialidad de Instrumentos, S.A. de C.V., por las facilidades brindadas para el empleo del microscopio de la marca Olympus y accesorios de microscopía como la videocámara “Infinity” y su software, así como la asesoría técnica del Ing. Bruno Roblero Galdámez, sin la cual no hubiese sido posible la calidad de las imágenes mostradas en el presente trabajo.
Índice Prefacio Organismos procarióticos Tinción de bacterias Estructuras bacterianas Cápsula Endoscopia
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Organismos eucarióticos Organismos de vida libre Candida spp. en preparación húmeda Candida albicans en agar harina de arroz-Tween 80 Metabolismo bacteriano Degradación de macromoléculas por Bacillus spp Hemólisis de eritrocitos por Streptococcus pyogenes Microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa Microorganismos fermentadores y oxidadores Referencias Semblanza
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Prefacio
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os microbios incluyen tanto a las células procariotas como a las bacterias y las arqueas, así como a eucariotas tales como protistas, hongos y protozoos; su estudio implica la observación de organismos que no pueden ser vistos la mayoría de las veces a simple vista, siendo el microscopio el instrumento que permitió el descubrimiento del mundo microbiano. En la Facultad de Ciencias Biológicas (otrora Escuela de Biología) se estudia a los microorganismos desde diversos aspectos, entre ellos su forma microscópica, el tipo de colonias que forman cuando crecen en los medios de cultivo, los nutrientes que utilizan y que se encuentran presentes en las formulaciones de tales medios de cultivo o por la afinidad que exhiben por ciertos colorantes. El presente trabajo fue desarrollado con la intención de aportar material didáctico de tipo visual para el aprendizaje de organismos microscópicos, ámbito de estudio que depende de la capacidad de observación. El formato se ha concebido mostrando imágenes de alta calidad, con una descripción breve que acompaña a dicho material. Los autores esperamos cumplir con nuestro objetivo, y que no sólo
constituya una herramienta valiosa para la asignatura de microbiología que cursan los estudiantes de la licenciatura en Biología, sino de otros estudiantes del área de las ciencias biológicas. Javier Gutiérrez-Jiménez Lorena Mercedes Luna-Cazáres
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Organismos procarióticos
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ste término se debe a E. Chatton y se empezó a usar a inicios de 1950; en la actualidad comprenden dos grupos separados pero muy amplios: las arqueas – arqueobacterias– y las bacterias –bacterias verdaderas o eubacterias–, todos son organismos unicelulares. Este último grupo incluye células pequeñas que miden de 1 a 10 µm con características distintivas tales como el que su material genético no está rodeado por una membrana, casi todas se encuentran protegidas por una pared celular rígida (excepto los incluidos en el género Micoplasmas), la gran mayoría se reproduce por división binaria y presentan diversas estructuras superficiales como la cápsula.
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B Tinción de bacterias
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a tinción de Gram desarrollada por Hans Christian Gram en 1884, es una técnica de tinción universal usada en microbiología que constituye uno de los primeros pasos en la identificación bacteriana dado que separa a estos microorganismos en dos grandes grupos: Grampositivos que se tiñen de morado y a los Gramnegativos que se tiñen de rojo a rosa tenue. También se emplean otras técnicas de tinción como la de Ziehl-Neelsen o Kinyoun que aprovechan la afinidad de la pared celular de las micobacterias por la carbolfucsina (por su alto contenido lipídico) resistiendo así la decoloración con alcohol ácido; como colorante de contraste se emplean el azul de metileno (Ziehl-Neelsen) o el verde de malaquita (Kinyoun) para teñir los otros elementos celulares. 1- La imagen muestra un frotis de Staphylococcus aureus en el que se aprecian cocos Grampositivos dispuestos en grupos irregulares (en racimos de uva).
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2- Se muestra un frotis de Escherichia coli donde se observan los bacilos Gramnegativos. Esta bacteria se encuentra en el intestino de animales y seres humanos. 3-Neisseria gonorrhoeae. Es la bacteria que causa la gonorrea, infección de transmisión sexual que puede colonizar las superficies mucosas del cérvix, la conjuntiva, la faringe, el área anorectal, la uretra masculina pudiendo incluso transmitirse al recién nacido durante su paso por el canal vaginal infectado con esta bacteria. La imagen muestra un frotis de exudado purulento obtenido de la uretra masculina, teñido con el método de Gram; en ella, se aprecian los diplococos Gramnegativos típicos de N. gonorrhoeae dentro de leucocitos polimorfonucleares. 4- Mycobacterium tuberculosis es un bacilo recto a ligeramente curvo que causa la tuberculosis, un problema de salud pública mundial. La imagen muestra un conjunto de bacilos ácido alcohol resistentes (B.A.A.R.) de M. tuberculosis en una muestra de expectoración.
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B.A.A.R Diplococos Gramnegativos dentro de leucocitos
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Estructuras bacterianas Cápsula
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eneralmente es una cubierta de polisacáridos que se encuentra firmemente unida y además rodea a las bacterias que la sintetizan; tal estructura participa en la adhesión de los microorganismos a superficies animadas e inanimadas, le protege del ataque del sistema inmunitario así como de condiciones adversas como la desecación. 5-Preparación de Klebsiella pneumoniae, teñida con el método de Anthony que muestra a la cápsula como un halo blanco alrededor de la bacteria. 6-Preparación de Klebsiella pneumoniae, coloreada con el método de Hiss que muestra a la cápsula teñida en rosa tenue. Endosporas de Bacillus spp. Las especies del género Bacillus spp. son microorganismos en forma de bacilos que pueden disponerse en pares o cadenas y que tienen la capacidad para formar esporas; tales estruc19
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turas protegen a estas bacterias de las condiciones ambientales extremas. 7-La imagen muestra una preparación teñida con la técnica Schaeffer-Fulton, elaborada a partir de una colonia de Bacillus spp. en la que se observa a las esporas teñidas de color verde, en tanto que el resto de la célula bacteriana se aprecia en color rojo, teñido con safranina como colorante de contraste.
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Organismos eucarióticos
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stos seres constituyen una gran proporción de la masa total y diversidad entre los organismos microscópicos, siendo más grandes que muchos procariotes y que adoptan formas variadas de tamaño y forma. Pueden encontrarse en una gran variedad de nichos ecológicos tales como el agua, suelo, plantas, animales incluyendo al humano que se encuentre en condiciones saludables o enfermos. Tienen una estructura interna complicada cuyo material genético está limitado por una membrana -de allí se acuñó el término de núcleo verdadero-, así como varios organelos. Estos organismos abarcan desde los protozoos unicelulares hasta los animales y plantas multicelulares de todos tipos.
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Organismos de vida libre
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os protozoarios, habitantes del zooplancton de agua dulce, constituyen un amplio conjunto de organismos unicelulares dado que están constituidos por una sola unidad estructural que realiza todas las funciones esenciales para la vida.
8- La imagen corresponde a un frotis hecho con una muestra de agua residual y que muestra a Notommata spp. (protozoario central), rotífero de cuerpo alargado que en uno de sus extremos tiene un órgano ciliado que emplea para la natación y alimentación y en el otro tiene una estructura que utiliza para fijarse. Bajo este protozoario, un Paramecium spp., ciliado que muestra sus vacuolas digestivas y que circulan por el citoplasma. Ascaris lumbricoides es un nemátodo alargado, cilindroide de extremos puntiformes que parasita el intestino delgado humano; entre los efectos que causa dicho parásito están las reacciones inmunitarias del huésped, el efecto mecánico de los gusanos adultos y los efectos de éstos en la alimentación del huésped. 25
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9- Huevos de A. lumbricoides en un frotis de materia fecal de una niña de 3 años. 10- Ejemplar adulto de -A. lumbricoides de más de 20 cm de longitud encontrado en la materia fecal de la muestra ya señalada.
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Candida spp. en preparación húmeda
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as especies de Candida pueden causar infecciones de las superficies mucosas como el del tracto genital femenino, de donde es frecuente recuperar dichos organismos. Algunas especies pueden formar una estructura especializada llamada pseudohifa, que se forma a partir de células en gemación o blastoconidias. 11- Muestra de un exudado vaginal que se mezcló con solución salina fisiológica en la que se aprecian las pseudohifas que se encuentran colonizando las células del epitelio vaginal. 12- La misma preparación utilizando microscopía de contraste de fases.
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Candida albicans en agar harina de arroz-Tween 80
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as especies de Candida pueden encontrarse en plantas y como parte de la flora normal del tracto digestivo de mamíferos y superficies mucosas en los humanos. El cultivo de levaduras sobre el agar harina de arroz-Tween 80 es un método para la identificación de Candida albicans y C. dubliniensis, el detergente Tween 80 favorece la formación de pseudohifas, blastoconidias y clamidoconidias durante la reproducción asexual de estos hongos. 13- Cepa de C. albicans aislada de un flujo vaginal y cultivada por cinco días en el medio de cultivo citado. Otras especies de Candida sembradas en dicho medio de cultivo pueden desarrollar blastoconidias y pseudohifas, pero no clamidoconidias.
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Bastoconidia
Pseudohifa
Pseudohifa
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Clamidoconidia
Blastoconidia
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Metabolismo bacteriano
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os microorganismos son capaces de respirar, moverse, responder a cambios en el ambiente, modificar lo que les rodea y reproducirse. Todos estos rasgos distintivos, son el resultado de un conjunto de reacciones químicas altamente organizadas que colectivamente se denominan metabolismo. Muchas especies bacterianas producen enzimas para utilizar sustratos ambientales como fuentes de energía, dichas enzimas que aunque no son tóxicas, pueden utilizarse para la identificación de la bacteria que las produce. Así, algunas especies producen exoenzimas como la amilasa, catalasa, gelatinasa y triptofanasa, entre otras. De manera similar y como resultado de la actividad metabólica bacteriana, se pueden generar ácidos productos de la fermentación de carbohidratos y que también son elementos útiles para la identificación bacteriana.
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Degradación de macromoléculas por Bacillus spp.
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as especies del género Bacillus secretan exoenzimas del tipo de las proteasas, nucleasas y amilasas para obtener fuentes de carbono a partir de macromoléculas tales como celulosa, quitina, almidón, proteínas y ácidos nucleicos. Estas enzimas han sido aprovechadas para fermentar cereales o leguminosas y obtener condimentos que se emplean en la cocina africana, o bien la inclusión de las amilasas en algunos detergentes. La composición de imágenes 14 y 15 muestra en la parte superior la degradación de caseína por Bacillus spp., proteína principal de la leche, la cual se puso de manifiesto luego de añadir HgCl2 al 12.5% que precipita igual a las proteínas en donde no se degradarón, formándose un halo transparente en la zona donde se degradó. Las imágenes centrales (16 y 17) muestran la degradación de gelatina por Bacillus spp., la cual se trató también con HgCl2 al 12.5%.
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En la parte inferior (18 y 19) se observa la degradación de almidón por Bacillus spp., luego de añadir yodo de Gram el cual reacciona con el almidón no degradado, se observa un halo transparente en la zona donde dicho azúcar se degradó. En los ensayos se usó como control negativo a E. coli (sembrada en las placas mostradas del lado derecho), bacilo que no degradó la caseína, gelatina o almidón.
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Degradación de caseína
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No degradación de gelatina
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No degradación de gelatina
Degradación de gelatina
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No degradación de almidón
Degradación de almidón
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Hemólisis de eritrocitos por Streptococcus pyogenes
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lgunas especies de estreptococos secretan exotoxinas que rompen la membrana eritrocitaria por lo que son llamadas hemolisinas; estos microorganismos pueden identificarse mediante la observación de sus reacciones hemolíticas sobre agar sangre. J.H. Brown, en el Instituto Rockefeller, describió las diferentes reacciones hemolíticas que a la fecha se conocen: hemólisis alfa en la que hay degradación parcial de eritrocitos, hemólisis beta en la que hay degradación total de eritrocitos y la gamma, en la cual no hay degradación de eritrocitos. 20- Las imagen muestra una cepa de S. pyogenes sembrada sobre la superficie de un agar sangre de carnero cuya estría en forma de beta muestra un discreto halo transparente alrededor del crecimiento microbiano, las “comillas” (hechas puncionando el agar con el asa) permiten apreciar una mayor hemólisis de los eritrocitos dado que la hemolisina actúa mejor en baja tensión de oxígeno.
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21- Se puede observar la cepa de S. pyogenes sembrada con la técnica de vaciado en placa; en ésta los estreptococos crecen inmersos en el agar sangre lo que permite apreciar una mejor actividad de la hemolisina que se observa como el halo transparente alrededor de la colonia bacteriana por la baja tensión de oxígeno.
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Microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa
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a lactosa es un disacárido que algunas bacterias pueden fermentar para obtener energía. El agar de MacConkey (mostrado en la imagen 22) es un medio selectivo que contiene sales biliares y cristal violeta que inhibe bacterias Grampositivas, también es diferencial por contener lactosa, la que distingue entre bacterias Gramnegativas fermentadoras de lactosa de las que no lo hacen. Como resultado de la fermentación de la lactosa, se forman metabolitos ácidos que disminuyen el pH haciendo que el indicador rojo neutro (incluido en la formulación del medio) vire a rojo, por lo que las colonias adquieren una tonalidad rosa intenso a tenue indicando que son fermentadoras de lactosa o lactosa positivas (parte inferior de la placa de agar MacConkey); por el contrario, la bacteria es incapaz de fermentar dicho azúcar, las colonias crecen incoloras y translúcidas, por lo que se denominan lactosa negativas (parte superior de la placa de agar MacConkey).
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Microorganismos fermentadores y oxidadores
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os microorganismos sacarolíticos pueden degradar la glucosa por fermentación u oxidación. Los productos finales de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, en tanto que los que se forman en la oxidación son débiles. El medio de oxidación-fermentación (OF) detecta la producción de ácidos por la aparición de un color amarillo por el vire del indicador azul de bromotimol al bajar el pH. En la imagen mostrada (23), el par de tubos de la izquierda fueron sembrados con Escherichia coli, un microorganismo que produjo ácidos tanto en presencia de oxígeno (tubo abierto, sin aceite mineral) como en ausencia de oxígeno (tubo cerrado, con aceite mineral) por lo que su metabolismo es fermentativo. El par de tubos de la derecha fue sembrado con Pseudomonas aeruginosa, microorganismo que produjo ácidos sólo en presencia de oxígeno (tubo abierto) y no en ausencia de oxígeno (tubo cerrado) por lo que su metabolismo es oxidativo.
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Referencias SCHEMBRI MA, DALSGAARD D, KLEMM P (2004) Capsule shields the function of short bacterial adhesions. Journal of Bacteriology. 186: 1249-1257. ROBERTS IA (1996) The biochemestry and genetics of capsular polysaccharide production in bacteria. Annual Reviews of Microbiology. 50: 285-315. ANTHONY EEJR (1931) A note on capsule staining. Science (new series). 73: 319-320. SCHAEFFER AB, FULTON M (1933) A simplified method of staining endospores. Science. 77: 194. HUSSEY MA, ZAYAITZ A (2007) Endospore stain protocol. ASM Microbelibrary. http://www.microbelibrary.org (Consulta:25-02-2009). MURRAY PR (2003) Manual of clinical microbiology. Vol. 1. 8th ed. ASM Press. Washington DC, USA. FORBES BA, SAHM DF, WEISSFELD AS (2002) Bailey & Scoot´s Diagnostic Microbiology. Mosby. St. Louis, Missouri, USA. CORLIS JO (1979) The ciliated protozoa: characterization, classification, and guide to the literature. 2nd ed. Pergamon Press. New York, U.S.A.
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BEAVER PC, JUNG RC, CUPP EW (1990) Parasitología Clínica. 2da. ed. Salvat. Barcelona, España. GUTIÉRREZ-JIMÉNEZ J, FLORES-HERNÁNDEZ JD, BALCÁZAR REYES CA (2009). Degradation of biological macromolecules by Bacillus spp. ASM Microbelibrary. http://www.microbelibrary.org (Consulta: 25-02-09). GUTIÉRREZ-JIMÉNEZ J, RESENDIZ-SÁNCHEZ J (2008). Candida albicans on rice meal agar-Tween 80. ASM Microbelibrary. http:// www.microbelibrary.org (Consulta: 25-02-09). KONEMAN EW, ALLEN SD, DOWELL VR, SOMMERS HM (1979) Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. J.B. Lippincott Company. U.S.A.
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Semblanza Javier Gutiérrez-Jiménez. Químico Clinico; maestro en ciencias Químico-Biológicas, IPN; Doctor en Ciencias Con especialidad en Biología Celular, CINVESTAV-IPN. Catedrático de tiempo completo (UNICACH). Se interesa en el estudio de microorganismos que producen enfermedades gastrointestinales en comunidades de alta marginación, así como en el desarrollo de herramientas para la docencia en microbiología. Lorena Mercedes Luna-Cazarés. Química Farmacéutica Bióloga, Maestría en Docencia en Ciencias de la Salud, UNACH. Candidata a Doctora en Ciencias Biológicas, UNAM. Catedrática de Tiempo Completo (UNICACH). Integrante del Sistema Estatal de Investigadores. Se interesa en el estudio de microorganismos en estudios etnobotánicos de comunidades étnicas y cmapesinas.
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Rectoría Ing. Roberto Domínguez Castellanos Rector Mtro. José Francisco Nigenda Pérez Secretario General C.P. Miriam Matilde Solis Domínguez Auditora General Lic. Adrián Velázquez Megchún Abogado General Mtro. Pascual Ramos García Director de Planeación Dr. Amín Andrés Miceli Ruiz Director Académico Mtro. Jaime Antonio Guillén Albores Director de Extensión Universitaria CMF. Juan José Ortega Alejandre Director de Investigación y Posgrado C.P. Julio César Vázquez Pérez Director de Administración L.R.P. Aurora Evangelina Serrano Roblero Directora de Servicios Escolares Ing. Luis Antonio Aceituno Gen Director de Tecnologías de Información Lic. Noé Fernando Gutiérrez González Director de Servicios de Información y Documentación
Dependencias de Educación Superior C.D. Jaime Raúl Zebadúa Picone Director de la Des de Odontología Mtra. Érika Judith López Zúñiga Directora de la Des de Nutrición Mtro. Martín de Jesús Ovalle Sosa Director de la Des de Psicología Dra. Sandra Urania Moreno Andrade Directora de la Des de Biología Ing. Francisco Félix Domínguez Salazar Director de la Des de Ingenierías Mtro. Carlos Gutiérrez Alfonzo Director de la Des del CESMECA Ing. Javier Balboa Garcíaprieto Director de la Des de Oferta Regionalizada Antrop. Julio Alberto Pimentel Tort Director de la Des de Artes Lic. Diego Martín Gámez Espinosa Coordinador del Centro de Lenguas
Estampas del mundo microscópico
Se terminó de imprimir en el mes septiembre de 2009, con un tiraje de 500 jemplares, en los Talleres de Ediciones de la noche, Guadalajara, Jal. El diseño tipográfico estuvo a cargo de Wendy Vázquez Gómez, la corrección de Karén Limón y el cuidado de la edición de la Oficina Editorial de la unicach, durante el rectorado del Ing. Roberto Domínguez Castellanos.
