Establecimiento in vitro de Caesalpinia spinosa (Mol.) O. Kuntz Jenny Núñez1*, Elisa Quiala2, Manuel de Feria2. 1 Escuela Superior Politécnica del Chimborazo. Facultad de Recursos Naturales. Laboratorio de Cultivo de Tejidos 2 Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara. Cuba. CP 54 830 *Autor para correspondencia:
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[email protected] Resumen Es un árbol originario de los Andes, en peligro de extinción en Ecuador, muy útil para los programas de forestación y reforestación y con gran importancia económica. A partir de sus vainas se obtienen taninos y productos muy demandados en la industria alimenticia. Estudios de campo han permitido la selección de ocho genotipos con rendimientos superiores a los 40 kg de vainas por árbol y elevada producción de taninos, a partir de los cuales se propone iniciar un programa de clonación empleando técnicas biotecnológicas. El objetivo principal de este trabajo fue lograr el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guarango (Caesalpinia spinosa), obtenidas de plantas donantes establecidas en casa de cultivo. Estas plantas donantes fueron revigorizadas de árboles adultos mediante injerto. Los tratamientos de desinfección estudiados combinaron el efecto de una solución de Hipoclorito de sodio al 3.0% con 1.0 ml de Tween-80 con diferentes tiempos de exposición de los explantes a esta solución (10, 20, 30 min.). Cada yema se colocó por separado en un tubo de ensayo que contenía 10 ml de medio de cultivo en estado semisólido, el medio de cultivo estuvo compuesto por el 50% de las sales MS complementado con 3.0% de sacarosa. Se estudió además, el efecto del 6-BAP en el establecimiento in vitro y la respuesta de las yemas en esta fase del proceso. El mejor tratamiento para la desinfección de los explantes se logró al combinar 3.0% de Hipoclorito de sodio y 10 minutos con un 90% de explantes libres de contaminantes microbianos. Mientras que, el mayor porcentaje de explantes brotados (96.66%) se logró en el medio de cultivo compuesto por el 50% de las sales MS complementado con 0.25 mg l-1 de 6-BAP. Palabras clave: biodiversidad, conservación, cultivo de tejidos, desinfección, especie leñosa, guarango.
Introducción La Caesalpinia spinosa (Mol.) O. Kuntz (Guarango) es un árbol originario de los Andes, produce frutos que cuando secos contiene por lo menos dos subproductos con demanda internacional, los taninos de las vainas molidas y las gomas de las semillas procesadas (Rojas, 2007).
La vaina separada de la semilla se muele y es un extraordinario producto de exportación como materia prima para la obtención de ácido tánico y gálico muy usado en las industrias peleteras, así como también en las industrias farmacéutica, química, pinturas, entre otras. De las semillas se obtiene mediante un proceso térmico-mecánico una goma de uso alimenticio. (Malaga Webb y Asociados, 2009).
Perú es el primer exportador mundial de harina de Guarango, pero solo cubre aproximadamente el 20% de la demanda mundial, por lo que existe una demanda insatisfecha del 80% (Power plugs demo effect, 2005).
En Ecuador el Guarango se encuentra especialmente en los valles bajos de la sierra ubicados en las provincias de: Imbabura, Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo, Cañar, Azuay y Loja. Por lo que se podría afirmar que Ecuador cuenta con un buen potencial productivo de Guarango.
El Consorcio Nacional de Productores de Guarango (CONAPROG) se ha fijado como meta plantar al menos cinco mil hectáreas de esta especie en diversos agrosistemas con el fin de agrupar a los productores y facilitar el acopio, procesamiento y exportación los subproductos. (Desde el Surco, 2008).
Los cultivadores de Guarango buscan poblaciones o individuos cuyos frutos tengan alta concentración en taninos, para cumplir con la demanda internacional en cuanto a porcentaje de taninos presentes en la vaina, el cual debe oscilar entre 45-62%. (Inforcomercial.com 2009; Pebani Inversiones S.A. 2008).
A partir del 2009, se identificaron árboles plus seleccionados por sus buenas características morfo-agronómicas con rendimientos superiores a 40 kg de vainas por árbol y elevada producción de taninos. Sin embargo, al ser poblaciones silvestres, las cuales han sido el resultado tanto de procesos de autofecundación y fecundación cruzada no controlados por
el hombre, hace que se desconozca el origen de estos árboles y su estabilidad genética. Por lo que la multiplicación y reproducción de estos individuos por semilla sería un gran riesgo de cara a garantizar una elevada y estable producción en el futuro.
El desarrollo de una metodología de propagación clonal de C. spinosa mediante técnicas biotecnológicas, permitiría no solo disponer de mayores volúmenes de plantas que mantengan las características de alta productividad y elevada concentración en taninos, sino que al mismo tiempo reduciría el problema de suministro de semilla para el establecimiento de plantaciones comerciales.
El objetivo de este trabajo fue lograr el establecimiento in vitro de yemas axilares de C. spinosa, obtenidas de plantas donantes revigorizadas a partir de injertos realizados con estacas de árboles plus.
Materiales y Métodos
Fase de establecimiento in vitro Como material vegetal se emplearon yemas axilares obtenidas de plantas revigorizadas en casa de cultivo, las cuales fueron obtenidas mediante injertos a partir de estacas de árboles adultos previamente seleccionadas por sus características morfo-agronómicas y rendimiento.
En la casa de cultivo, las plantas donantes fueron manejadas en condiciones de umbráculo (baja intensidad luminosa) y de forma preventiva en busca de reducir pérdidas por contaminación microbiana en la fase de establecimiento in vitro, se aplicaron tratamientos fúngicos.
Efecto del NaClO en la desinfección de yemas axilares Las yemas axilares con un tamaño aproximado de 3.0 cm fueron lavadas durante 10 minutos con una solución de detergente líquido comercial preparada a una concentración de 5.0 ml l-1, transcurrido ese tiempo fueron enjuagadas dos veces con agua corriente y sumergidas en una solución de etanol al 70% durante 30 segundos. Seguidamente se retiró el etanol mediante un enjuague con agua desionizada estéril y se procedió a tratar las yemas con una solución de Hipoclorito de Sodio al 3.0% con 1.0 ml de Tween-80 durante tres tiempos (10, 20 y 30 min) de inmersión en dicha solución desinfectante para un total
de tres tratamientos. Durante la ejecución de este protocolo de desinfección se empleó ácido cítrico como agente antioxidante.
Cada yema se colocó por separado en un tubo de ensayo que contenía 10 ml de un medio de cultivo compuesto por el 50% de las sales MS (Murashige y Skoot, 1962), complementado con 0.25 mg l-1 de 6-BAP, 50 mg l-1 de cisteína, 3.0% de sacarosa, 7.0 g de agar como agente gelificante y pH ajustado a 5.7 antes de ser esterilizados en una autoclave a 121°C de temperatura durante 15 minutos. Se evaluó a los 15 y 30 días de cultivo, el número de explantes contaminados.
Efecto del 6-BAP en la respuesta in vitro de las yemas axilares Se estudió además, el efecto de tres concentraciones de 6-BAP (0.25, 0.5, 1.0 mg l-1) en la respuesta in vitro de las yemas axilares en esta fase del proceso, para lo cual se evaluó a los 30 días de cultivo el número de explantes brotados, el número de brotes por explante y la longitud (cm) de los brotes.
Procesamiento estadístico Se utilizó el paquete estadístico SPSS versión 22.0, a los datos se le aplicaron pruebas de normalidad y homogeneidad de varianzas y en los casos en que no se cumplieron los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza, los mismos fueron transformados de acuerdo con x´= (x+0,5)0,5 y analizados estadísticamente mediante un ANOVA de clasificación simple, para determinar el grado de significación entre las medias se empleó la prueba de Tukey.
Resultados y Discusión
Fase de establecimiento in vitro Efecto del NaClO en la desinfección de yemas axilares El empleo de NaClO al 3.0% fue efectivo para la desinfección de los explantes, pues independientemente del tiempo utilizado el porcentaje de explantes libres de contaminantes microbianos visibles superó en todos los tratamientos el 90.0%. Desde el punto de vista estadístico, no se observaron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos, razón por la cual, se decidió seleccionar para la desinfección de los explantes, el tratamiento compuestos por una solución de NaClO al 3.0% durante 10 min.
En esta fase del proceso también se logró reducir la presencia de explantes con una fuerte oxidación fenólica, afectación que había sido una constante desde los primeros intentos por lograr el establecimiento in vitro de esta especie. En este sentido, los resultados obtenidos indican que los manejos realizados tanto a las plantas del banco de donante como a los explantes antes y durante el proceso de establecimiento in vitro fueron efectivos y redujeron significativamente la ocurrencia de este fenómeno. Como se conoce, tanto la contaminación microbiana, como la fenolización han sido dificultades que han limitado la propagación in vitro de especies forestales (Rivero, 2001; Teixeira, 2001).
Los resultados obtenidos con el empleo de NaClO al 3.0% durante 10, 20 y 30 min para la desinfección de las yemas axilares de Guarango fueron superiores a los descritos por otros autores para esta misma especie, por ejemplo, Lozano (2011) refiere un 67% de explantes libres de contaminantes microbianos con un tratamiento de NaClO al 1.5% durante 15 minutos, mientras que, Sánchez (2006) obtuvo un 63% de explantes establecidos in vitro y libres de contaminantes microbianos al desinfectar con una solución de 1.0 ml l-1 de formol al 37% durante 40 minutos. Ambos autores mencionaron la ocurrencia de una fuerte oxidación fenólica durante el desarrollo de esta fase del proceso.
Efecto del 6-BAP en la respuesta in vitro de las yemas axilares La concentración de 6-BAP no influyó significativamente en el número de explantes brotados con respecto al tratamiento control. Sin embargo, con respecto al número de brotes por explante los mejores resultados se alcanzaron en los tratamientos con 0.25 y 0.5 mg l-1 de 6-BAP (Tabla 1).
Tabla 1. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP en la respuesta in vitro de yemas axilares de C. spinosa después de 30 días de cultivo. [6-BAP] (mg l-1) 0.0 0.25 0.50 1.0
Brotación (%) No. de brotes/exp 96.66 a 1.40 bc 96.66 a 2.07 a 93.33 a 1.63 ab 86.66 a
1.03 c
Longitud (cm) 7.73 a 6.71 ab 5.06 b 6.88 ab
*Media con letras distintas en una misma columna difieren significativamente (ANOVA simple, Tukey p≤0.05). Para el tratamiento estadístico los datos expresados en porciento fueron transformados de acuerdo con x´= (x+0,5)0,5. Los datos que se presentan en la tabla son no transformados, (n=30)
A pesar de que entre estos dos tratamientos no se observaron diferencias significativas, se seleccionó como mejor concentración de 6-BAP para esta fase del proceso la más baja (0.25 mg l-1), con la cual se logró un 96.66% de brotación. Estos resultados fueron
superiores a los descritos para esta misma especie por Sánchez (2006) y Lozano (2011), los cuales obtuvieron un 63 y 67% de explantes brotados. Uno de los factores que quizás influyó en este resultado, pudo estar relacionado con la escasa oxidación fenólica que se obtuvo en el presente estudio como respuesta a la aplicación de diferentes manejos y productos antioxidantes antes y durante el desarrollo de la fase de establecimiento in vitro.
Los resultados obtenidos permitieron diseñar un esquema para el establecimiento in vitro de C. spinosa a partir de yemas axilares de plantas donantes revigorizadas obtenidas a partir de injertos de estacas tomadas de árboles adultos (Fig. 1).
Figura 1. Secuencia de pasos para el establecimiento in vitro de C. spinosa.
Conclusiones Se determinó que el mejor tratamiento para la desinfección de las yemas axilares consistió en una solución de Hipoclorito de sodio al 3.0% y 10 minutos de inmersión de los explantes en la misma, con lo cual se logró un 90% de explantes libres de contaminantes microbianos visibles. Mientras que, la mejor respuesta in vitro de las yemas axilares en la fase de establecimiento se logró con una concentración de 0.25 mg l-1 de 6-BAP al brotar el 96.66% de las mismas, con una longitud de 6.71 cm y un promedio de dos nuevos brotes por explante.
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