ENZYME MICROBIAL Producción de ácido succínico por la fermentación bacteriana

Available online at www.sciencedirect.com

ENZYME MICROBIAL ELSEVIER

Enzyme and Microbial Technology 39 (2006) 352-361 www.elseviencom/locate/emt

Review

Producción de ácido succínico por la fermentación bacteriana Hyohak Song a, Sang Yup Lee a'b'* a Metabolic and Biomolecular Engineering National Research Laboratory, Department of Chemical and Biomolecular Engineering and BioProcess Engineering Research Center; Republic of Korea b Department of BioSystems and Bioinformatics Research Center; Korea Advanced Institute of Science and Technology, 373-1 Guseong-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-701, Republic of Korea Received 13 October 2005; received in revised form 18 November 2005; accepted 23 November 2005

Abstracto El ácido succínico producido por diversos microorganismos se puede utilizar como un precursor de muchos productos químicos industrialmente importantes en las industrias alimentarias, químicas y farmacéuticas. La evaluación de costo de materia prima y la estimación del tamaño potencial de mercado indican claramente que el proceso de ácido succínico a base de petróleo actual se sustituye por el sistema de producción de ácido succínico fermentativo en el futuro previsible. Este artículo revisa los procesos para la producción de ácido succínico fermentativo, con especial énfasis en el uso de varios productores de ácido succínico prometedoras incluyendo succinogenes actinomycetemcomitans, succiniciproducens Anaerobiospirillum, succiniciproducens Mannheimia y Escherichia coli recombinante. Los procesos para la recuperación de ácido succínico de caldo de fermentación también se revisan brevemente. Por último, le sugerimos otras obras necesarias para mejorar el rendimiento cepa adecuada para la adecuada comercialización de la producción de ácido succínico fermentativo.

© 2006 Elsevier Inc. All rights reserved. Keywords: Succinic acid; Fermentation; Recovery; Genome; Metabolic engineering

Contents 1. 2. 3.

Int rod ucció n .. .. ... .. ... ... .. ... ... .. ... ... .. ... .. ... ... .. ... .. ... ... .. ... ... .. ... ... .. ... ... .. ... .. ... ... .. ... ... .. ... .. ... ... .. ... ... .. ... . Mercados ácido succínico y aplicaciones .......................................................................................................................... Productores de ácido succínico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.1. Actinobacillus succinogenes ................................................................................................................................................ 3.2. Mannheimia succiniciproducens........................................................................................................................................... 3.3. Anaerobiospirillum succiniciproducens ........................................................................................................................................ 3.4. E. coli Recombinante ........................................................................................................................................... 4 . Recuperación de ácido succínico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 . Conclusiones y perspectivas de futuro ........................................................................................................................ Agradecimientos ............................................................................................................................................................................... Referencias...........................................................................................................................................................................................................

Fig. 1. Various chemicals and products that can be synthesized from succinic acid.

1. Introduction El ácido succínico, también conocido como ácido ámbar o ácido butanodioico, es un ácido dicarboxílico que tiene la fórmula molecular de C4H604. Después de su primera

352 353 354 355 356 357 357 358 358 359 359

purificación del ácido succínico de ámbar por Georgius Agricola en 1546, se ha producido por microbios de fermentación para el uso en las industrias agrícola ticos, alimentos y pharmaceu [1]. En la actualidad, la mayor parte de ácido succínico disponible comercialmente se produce mediante un proceso químico, en el que el gas licuado de petróleo (GLP) o aceite de petróleo se utiliza como material de partida. El ácido succínico se puede utilizar como un precursor de muchos aliado industri productos químicos importantes,

incluyendo ácido adípico, 1,4-butanodiol, tetrahidrofurano, Nmetilpirrolidinona, 2-pirrolidinona, sales de succinato y gamma-butirolactona (Fig. 1). Además, se espera que el aumento de la demanda para el ácido succínico como su uso es extendido a la síntesis de polímeros biodegradables tales como succinato polibutirato (PBS) y poliamidas (nylon x, 4 ®) [2] y diversos disolventes verdes [3]. Sin embargo, el mercado mundial de ácido succínico (15.000 t en 1997, con un promedio anual tasa de crecimiento de 10.6% anual) es mucho menor en comparación con el de la química de la competencia, anhídrido maleico (213.000 t en 1997, con una tasa de crecimiento anual promedio de 3,6% por año) [2,3]. Esto se debe en parte para el alto costo de la conversión de anhídrido maleico a ácido succínico por el proceso químico, lo que limita el uso de ácido succínico para la amplia gama de aplicaciones. Por otro lado, el análisis reciente mostró que la producción fermentativa de ácido succínico a partir de recursos renovables puede ser más rentable que los procesos a base de petróleo [2]. También es notable que un gas de invernadero CO2 se fija en ácido succínico durante la fermentación , así provid ing una ventaja adicional de afrontamiento activo con el protocolo de Kioto. Muchos microorganismos diferentes han sido examinados y estudiados para la producción de ácido succínico de varias fuentes de carbono. Entre ellos, Anaerobiospirillum succiniciproducens [4-8] y succinogenes actinomycetemcomitans [9-12] han sido estudiados con mayor intensidad debido a su capacidad de producir una cantidad relativamente grande de ácido succínico. Más recientemente, un nuevo ácido succínico bacteria productora de Mannheimia succiniciproducens MBEL55E se aisló del rumen bovina [13]. Además, ha habido mucho esfuerzo en el desarrollo de cepas recombinantes de Escherichia coli que son capaces de la

producción de ácido succínico mejorada en condiciones aeróbicas y anaeróbicas [14- 20]. En este trabajo, se revisan las características metabólicas y el rendimiento de la fermentación de los productores de ácido succínico más prominentes. Formación de subproductos tales como acético, fórmico y láctico es un problema importante que tiene que ser resuelto, ya que reduce el rendimiento de ácido succínico y la productividad, mientras que aumenta la complejidad y el costo de la recuperación de ácido succínico. También se revisan Aplicaciones adoptadas para resolver este problema. Entonces, esta revisión concluye con las perspectivas futuras de la producción fermentativa de ácido succínico a partir de recursos renovables. 2. Los mercados ácido succínico y aplicaciones En la actualidad, el ácido succínico se produce principalmente por el proceso químico a partir de n-butano a través de anhídrido maleico. Se vende al precio de $ 5,9 a 9,0 kg -1 dependiendo de su pureza. Su coste de fabricación se ve afectado por varios factores, incluyendo la productividad de ácido succínico y el rendimiento, los costes de las materias primas, y el método de ery Recov. Particularmente, el coste de anhídrido maleico se ha sabido que contribuyen más significativamente al coste global de la producción de ácido succínico. En 2002, el anhídrido maleico a partir de n-butano se vendió a un precio promedio de venta de $ 0.977 kg -1. Teniendo en cuenta que el rendimiento global de la conversión de dride anhy maleico a ácido succínico es 95% (w / w), el mayor costo de materia prima en el proceso químico es $ 1.027 kg -1 ácido succínico. Por otra parte, más de 30 millones de toneladas de glucosa se produce anualmente en el mundo, y se vende a un precio de alrededor de $ 0,39 kg -1. Suponiendo que el rendimiento de ácido succínico de 91% (w / w) de la glucosa [21], el costo de materia prima en el bioproceso es entonces $ 0,428 kg-1.

ácido succínico. Por tanto, es claro que la producción fermentativa de ácido succínico a partir de recursos renovables puede competir con el proceso químico. Más importante aún, el carácter limitado de las reservas fósiles y cada vez más las preocupaciones ambientales se urg Us o para reemplazar los procesos químicos basados en el petróleo con los procesos de base biológica. Los recursos renovables son más de dante abun, se estima actualmente en 170 mil millones de toneladas por año, de los cuales se está utilizando sólo el 3,5%. El potencial de mercado para sí y sus derivados de ácido succínico se estima en más de 270.000 t año-1 en 2004 [2]. El potencial tamaño estimado de mercado de los polímeros polisuccinato ésteres y poliamidas que se pueden sintetizar a partir de ácido succínico es de hasta 27 millón de toneladas por año en 2001 [22]. A pesar de que la economía global todavía limita la producción de ácido succínico basado en compuestos biológicos, la evaluación de los costes de materias primas y la estimación del tamaño del mercado potencial sugieren claramente que el proceso de ácido succínico basado en petróleo actual será reemplazado por el sistema de producción de ácido succínico fermentativo en un futuro próximo. 3. Los productores de ácido succínico

Desde que Robert de Knock, el ganador del Premio Nobel, ha demostrado que el ácido succínico tiene una influencia positiva en el metabolismo humano y no hay riesgo de su acumulación en el cuerpo humano, se ha utilizado en las industrias de alimentos. El ácido succínico es un intermedio del ácido (TCA) ciclo tricarboxílico y uno de los productos finales de fermentación de metabolismo anaeróbico. Por lo tanto, se sintetiza en casi todas las células microbianas, vegetales y animales. Esos ismos de órganos adecuados para la producción eficiente de ácido succínico se pueden clasificar en hongos y bacterias. Muchos investigadores han hecho grandes esfuerzos para desarrollar un proceso biológico para la producción de ácido succínico mediante el empleo de hongos como el Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Byssochlamys nivea, Lentinus degener, Paecilomyces varioti, Penicillium viniferum y la levadura Saccharomyces cerevisiae. Estos organismos producen ácido succínico como un subproducto metabólico bajo condiciones aeróbicas y / o anaeróbicas [23,24]. S. cerevisiae ha sido mejor estudiado entre ellos para lograr una alta concentración de ácido succínico en la fabricación de vino [25,26]. Una serie de sus cepas mutantes fueron desarrollados por la inactivación de los genes no deseados, y algunos de ellos mostró los mayores niveles de succínico ácido en comparación con la cepa de tipo salvaje [27,28]. A. niger ha sido reconocido como un organismo muy importante para la producción de diversos ácidos orgánicos, especialmente ácido cítrico y ácido glucónico. Este organismo produce más de 78 g 1 -1 de ácido cítrico con el rendimiento de 65% (w / w) en sacarosa [29]. Thermore Fur, que muestra una capacidad para utilizar diferentes fuentes de carbono con un

buen rendimiento (115%, w / w) en aceite de colza [30]. Recientemente, el metabolismo del carbono central de este organismo y su red metabólica fueron descifradas mediante la combinación de la información genómica, bioquímico y fisiológico. En base a ellos, se construyó un modelo ric stoichiomet compuesta de 284 metabolitos y 335 reacciones. Simulación de este modelo estequiométrico sugirió que este organismo puede producir ácido succínico 1,5 mol de 1 mol de glucosa bajo condiciones microaeróbica [31]. Sin embargo, el uso de hongos se ha limitado principalmente a la fabricación de alimentos y bebidas debido a las dificultades en la fermentación, separación y purificación, así como baja productividad. Sólo pocas bacterias Gram-positivas como Corynebacterium glutamicum y Enterococcus faecalis se han estudiado para la producción de ácido succínico. Varios ingeniería C. glutamicum cepas fueron creados por la interrupción y la sustitución de genes, y se desarrollaron sus condiciones óptimas de cultivo. Fue posible aumentar la tasa de producción de ácido succínico siete veces y la tasa de consumo de glucosa cinco veces bajo condiciones privado de oxígeno [32]. Se desarrolló un proceso de producción de ácido succínico en dos etapas, en el que el ácido fumárico obtiene de la fermentación de la glucosa y arroz salvado usando Rhizopus sp. posteriormente se convierte a ácido succínico por E. faecalis RKY1 [33]. El rendimiento de la conversión del ácido fumárico al ácido succínico era 95% (w / w) y la productividad fue 2,2 g1 -1 h -1. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el rendimiento de ácido fumárico en la glucosa y de la productividad de ácido fumárico en el primer paso eran bastante bajos en los niveles de 0,5 gg -1 y 0,21 g 1 -1 h -1, respectivamente, lo que limita su comercialización. Las vías metabólicas que conducen a la síntesis de ácido succínico son diversas. Algunas bacterias utilizan principalmente la enolpiruvato fosfo (PEP) reacción de carboxilación, mientras que otros utilizan múltiples vías para formar ácido succínico [34]. Muchos diferente ácido succínico producción de bacterias Gram-negativas se han aislado en diversos ambientes anaeróbicos tales como lodos doméstica, los residuos del ganado, arrozal, carcoma marinos, la boca del perro, rumen y gastro-intestinal. Hasta la fecha, las bacterias aisladas del rumen, incluyendo A. succinogenes y M. succiniciproducens, son los mejores candidatos para la producción de ácido succínico, ya que producen ácido succínico como un importante producto de fermentación. Esto es más probable debido a que el rumen es un órgano altamente eficiente provid ing un entorno para producir ácido succínico. El rumen es un ecosistema microbiano único encontrado en muchas especies de mamíferos herbívoros conocidos como los rumiantes. La función principal del rumen es para permitir la digestión pre-gástrica de varios materiales polisacáridos, que está mediada por una gran diversidad de microorganismos del rumen, que consta de 10 -10 10 9 bacteriana, 10 5 -10 6 protozoos y 10 3 -10 4 células fúngicas m1 -1 de fluido ruminal [35]. La producción de ácidos dicarboxílicos C4 en el rumen reduce la pérdida de energía asociada con la metanogénesis (30-40% en moles de CH4 está presente en el gas ruminal) mediante el aumento de la cantidad de energía olizable metab a

disposición del animal en la forma de ácido onic propi. Aunque los compuestos dicarboxílicos C4, tales como oxalacética, málico, fumárico y succínico no se detectan en el fluido ruminal, grandes cantidades de estos ácidos son producidos por las reacciones de fijación de CO2, usando 6070% en moles de CO2 presente en el gas ruminal. Los principales compuestos C3 en la célula usada para la reacción de carboxilación son PEP y piruvato. En particular, el ácido succínico se convierte en ácido propiónico, que puede representar el 20% (w / w) de ácidos grasos volátiles totales (AGV) en el rumen, por la utilización de bacterias del ácido succínico como Veillonella parvula [36], Selenomonas ruminantium [ 37] y Succiniclasticum ruminis [38]. El ácido propiónico producido de esta manera se absorbe a través de la pared del rumen para la oxidación posterior para proporcionar energía y precursores biosintéticos para los animales. Por lo tanto, es razonable pensar que algunos microorganismos presentes en el rumen será un buen productor de ácido succínico. En este artículo examinamos las características metabólicas y actuaciones de fermentación de dos rumen bacterias A. succinogenes y M. succiniciproducens junto con otras dos bacterias buen candidato A. succiniciproducens y E. recombinante coli. Además, sus actuaciones son comparados en la Tabla 1. 3.1. Succinogenes Actinobacillus A. succinogenes se aisló originalmente de contenido ruminal de la especie bovina y pertenece a la familia Pasteurellaceae basado en su análisis de la secuencia 16S rRNA [9]. El análisis fenotípico demostró que este organismo es un anaerobio facultativo, no móvil, pleomórfico, y la vara Gram-negativas u ocasionalmente bacteria filamentosa. A. succinogenes muestra una capacidad distintiva para producir una cantidad relativamente grande de ácido succínico a partir de una amplia gama de fuentes de carbono tales como arabinosa, celobiosa, fructosa, galactosa, glucosa, lactosa, maltosa, manitol, manosa, sor Bitol, sacarosa, xy pierda o salicina en condiciones anaeróbicas [39]. A diferencia de E. coli o A. succiniciproducens, A. succinogenes es un osmophile moderada y tiene buena tolerancia a una alta concen tración de la glucosa, lo cual es beneficioso para la fermentación.

Amplia fisiológica y estudios genéticos relativos a la producción de ácido succínico en A. se han realizado succinogenes. Cinco enzimas claves responsables de la producción de ácido succínico se identificaron ser PEP carboxicinasa (PCK), malato dehydroge nase (MDH), enzima málica (SFC), fumarato (fum) y fumarato reductasa (FRD). Además, el análisis enzimático reveló la presencia de piruvato quinasa (Pyk), piruvato ferredoxina oxidorreductasa (PFO), quinasa de etilo (ack), alcohol deshidrogenasa (ADH) y lactato deshidrogenasa (LDH), que afectan el flujo de ácido succínico en las rutas metabólicas centrales. Carboxilación PEP, que es el paso comprometido importante para la producción de ácido succínico en las bacterias del rumen, está fuertemente regulada por los niveles de CO2. En teoría, se requiere 1 mol de CO2 para formar 1

mol de ácido succínico. El nivel de CO2 mayor resultó en un aumento de la producción de ácido succínico a expensas de etanol y ácido fórmico. Esto es más probable debido a la mayor boxylation coche de PEP a oxalacetato en lugar de la conversión de PEP a piruvato. Además, la adición de donadores de electrones adicionales incluyendo hidrógeno y eléctricamente reducida rojo neutro dio como resultado el aumento significativo de la producción de ácido succínico [10,34]. Estas observaciones son consistentes con que el uso de azúcares más reducidas tales como arabitol, manitol y sorbitol resultado aumentos significativos en la producción de ácido succínico y etanol en comparación con la glucosa [34]. A. succinogenes cepa 130Z y sus cepas variantes (FZ 6, 9, 21, 45 y 53) que son resistentes a 1-8 g de 1 -1 fluoroacetate se utilizaron para evaluar la posibilidad de la producción comercial de ácido succínico. Ellos fueron capaces de producir grandes cantidades de ácido succínico y eran más resistentes al ácido succínico que otros productores de ácido succínico se informó anteriormente [39,40]. Strain 130Z produjo 66,4 g1 -1 de ácido succínico por el consumo de 98,3 g1 -1 de glucosa después 84 h de fermentación. La fermentación discontinua se realizó en un fermentador de 11 con 15 g1 -1 de extracto de levadura y licor de maíz fermentado. MgCO3 (80 g) se añadió al fermentador antes de la esterilización en autoclave con el fin de moderar la caída de pH durante la fermentación. Las concentraciones de subproductos incluyendo acético, fórmico, propiónico y ácidos pirúvico se detectaron en los valores de 12,0, 8,7, 2,5 y 4,3 g 1 -1, respectivamente. Más recientemente, la fermentación continua biofilm y repetir-lote de A. succinogenes permitió un aumento significativo de la productividad de ácido succínico (8,8 g1 -1 -1 11), mientras que el rendimiento de ácido succínico era inferior al 50% (w / w), que es bastante bajo para la commercializa [12]. Aunque las cepas variantes produjeron menos etanol, los ácidos acético, fórmico y láctico, la formación de estos subproductos no podría evitarse por completo. Además, el la acumu de los ácidos propiónico y pirúvico, que no se detectan generalmente en el cultivo de otras bacterias productoras de ácido succínico, se observó.

Teniendo en cuenta los costes de separación y purificación de ácido succínico a partir de caldo de fermentación que contiene ácidos mixtos, la formación de subproductos debe reducirse al mínimo, o si es posible, completamente eliminada por la ingeniería metabólica y la optimización del proceso de fermentación. Por desgracia, se llevaron a cabo sólo unos pocos estudios sobre la ingeniería metabólica de A. succinogenes debido a la información genética limitada y la falta de herramientas genéticas adecuadas [11]. Además mejora del rendimiento de A. succinogenes requerirá el análisis del genoma y su uso en la ingeniería metabólica en una escala global. 3.2. Succiniciproducens Mannheimia

Otra bacteria productora de ácido succínico prometedor, M. succiniciproducens MBEL55E, fue recientemente aislado del rumen bovino [13]. fenotípica y estudios filogenéticos sugieren que M. succiniciproducens es un facultativo, mesófila no móviles, y capnophilic bacteria, Gram-negativa. Se produce ácido succínico como producto principal, los ácidos acético y fórmico como los segundos principales de diversas fuentes de carbono bajo condiciones 100% de CO2 a pH de 6,0-7,5. La productividad de ácido succínico tan alto como 3,9 g1 -1 -1 11 se podría lograr, que es el valor más alto que se ha informado hasta ahora. Además, la producción eficiente y económica de ácido succínico era posible por la fermentación de M. succiniciproducens usando un medio a base de suero de leche que contiene licor de maíz en lugar de extracto de levadura [41]. M. succiniciproducens también utiliza eficientemente xilosa, lo que hace posible el uso de hidrolizado de madera no tratada para reducir el costo de materia prima [42]. Estas observaciones sugieren que M. succiniciproducens puede ser un buen candidato para la producción de ácido succínico rentable a partir de recursos renovables.

Como se mencionó anteriormente, es necesario desarrollar un Metabol cepa de ingeniería camente capaz de producir ácido succínico con alto rendimiento y la productividad sin formación de subproductos. A pesar de que la selección racional y manipulación de un puñado de genes pueden conducir al desarrollo de una cepa superior, será deseable disponer de una secuencia de genoma completo vano capaz para una mejor ingeniería metabólica basado en el análisis de todo el genoma. Recientemente, la secuencia completa del genoma de M. succiniciproducens ha sido determinada [43]. Tiene un único cromosoma circular de 2.314.078 de pares de bases sin plásmido. Basándose en los resultados de anotación, se construyó el silico red metabólica en compuesta de 373 reacciones y 352 metabolitos. El análisis de flujo metabólico genoma escala se llevó a cabo utilizando la red metabólica in silico para comprender las características metabólicas generales en diversas condiciones. Las principales vías metabólicas implicadas en la producción fermentativa de ácidos son se muestra en la Fig. 2. Curiosamente, el flujo glucolítico bajo condiciones de CO2 fue cuatro veces mayor que la obtenida bajo N2. El flujo de PEP carboxilación así como el flujo ciclo TCA reductora aumentado considerablemente en atmósfera de CO2, lo que confirma que M. succiniciproducens es una bacteria capnophilic. Cuando se proporcionó poder reductor externo en forma de H2, el rendimiento de ácido succínico en la glucosa podría incrementarse aún más [43]. Se predijo que M. succiniciproducens pueden producir hasta 1,71 y 1,86 mol de ácido succínico de 1 mol de glucosa en ambientes de CO2 y CO2-H2, respectivamente. Estos resultados sugieren que M. succiniciproducens es un buen candidato para la producción de ácido succínico con una alta productividad y alto rendimiento. Como se ha mencionado para otras bacterias anteriores, formación de ácidos mixtos es un problema a resolver. 3.3. Succiniciproducens Anaerobiospirillum A. succiniciproducens se aisló de la garganta y heces de perro beagle [44], y produce ácidos succínico y acético como principales productos de fermentación y etanol y ácido láctico como los menores bajo condiciones estrictamente anaeróbico [21,45]. Pertenece a la familia Succinivibrionaceae y es una bacteria anaerobia estricta, móviles, y Gram-negativas [46]. Al igual que A. succinogenes y M. succiniciproducens, también utiliza PEP vía carboxilación para formar ácido succínico.

Estudios anteriores demostraron que A. succiniciproducens pueden utilizar eficientemente la glucosa, glicerol, sacarosa, maltosa, lactosa y fructosa como fuentes de carbono. El uso de glicerol como fuente de carbono dio como resultado un aumento del rendimiento de ácido succínico (133%, mol / mol) y mucho más alta relación de ácido succínico a ácido acético (relación de Gram de 25.8: 1) que los obtenidos con la glucosa [47]. Además, una posibilidad de producción de ácido succínico rentable fue presentado usando suero de leche sin tratar, hidrolizado de madera y licor de maíz fermentado, que

son mucho menos costosos que los hidratos de carbono refinados y extracto de levadura, respectivamente [6,48]. Los niveles de CO2, la cultura pH, una fuente de electrones externo y los componentes del medio han sido conocidos por ser factores críticos que afectan tanto el crecimiento celular y la producción de ácido succínico. El aumento de la disponibilidad de CO2 ejerce una influencia positiva sobre el rendimiento de ácido succínico en A. succiniciproducens, mientras presionado el crecimiento celular que resulta en la productividad de ácido succínico disminuido. Por otro lado, la administración de suplementos de hidrógeno en las formas de H2 / mezcla de CO2 (5:95, v / v) como un donador externo de electrones mejorado significativamente tanto el crecimiento celular, rendimiento de ácido succínico (91%, mol / mol) y la productividad (1.8 g1 -1 11 -1) [21]. Además, la administración de suplementos de biotina mejora el consumo de glucosa, el crecimiento celular y las tasas de producción de ácido succínico [5]. Las principales enzimas involucradas en ácido succínico vías de producción, incluyendo carboxiquinasa PEP, oxaloacetato descarboxilasa y piruvato quinasa han sido estudiados en detalle [7,49-52]. Especialmente, el A. succiniciproducens pckA gen que codifica PEP carboxicinasa ha sido clonado, secuenciado y expresado en E. coli, lo que resultó en la producción mejorada de ácido succínico, así como la reducción de la formación de subproductos [53]. Se aislaron cepas variantes resistentes fluoroacetato de A. succinicipro ducens y se utilizan en el proceso integrado com planteado de la fermentación, la separación y purificación [40,54-56]. Superior concentraciones de ácido acético más bajos de ácido succínico y se podrían lograr con las cepas variantes en comparación con su cepa par ent. La producción de ácidos mixtos también es un problema que hay que resolver para evitar alto costo de purificación. De nuevo, la información genómica desconocido es una barrera para la ingeniería metabólica de A. succiniciproducens para mejorar la producción de ácido succínico y prevenir la formación de subproductos. 3.4. E. coli recombinante

Un tipo salvaje E. coli fermenta principalmente de glucosa a etanol, ácido fórmico, acético y láctico con sólo cantidades detectables de ácido succínico en condiciones anaeróbicas. El rendimiento de ácido succínico en la glucosa típicamente obtenible no es más que 0,2 mol Se ha sabido que E. coli utiliza seis vías para formar ácido succínico, y diferente de tres bacterias se mencionó anteriormente, el PEP carboxicinasa juega un papel menor [57]. Sin embargo, el análisis de flujo metabólico demostró que el rendimiento máximo alcanzable molar ácido succínico en E. coli es 1.647 [58]. A núm ero de estrategias de ingeniería metabólica se han desarrollado para mejorar la producción de ácido succínico por E. . coli Los enfoques pueden ser clasificadas como sigue: la inactivación de las

enzimas que participan en las reacciones, que compiten con las vías de ácido succínico, la amplificación de las enzimas implicadas en las vías de ácido succínico, y la introducción de enzimas heterólogas que catalizan reacciones hacia el aumento de la formación de ácido succínico . El primer enfoque de ingeniería metabólica tomada en E. coli para la producción de ácido succínico eficiente fue la sobreexpresión del carboxiquinasa PEP (PCK) y PEP carboxilasa (ppc) genes [14]. La sobreexpresión de la PEP carboxilasa se tradujo en un 3,5 veces aumento en la cantidad de ácido succínico, mientras que el PEP carboxiquinasa sobreexpresión no tuvo ningún efecto. El fenómeno lat ter era debido a que PEP carboxicinasa funciona como una enzima gluconogenic en E. . coli Con el objetivo de reducir la formación de subproductos, la cepa NZN111 fue desarrollado mediante la inactivación de la piruvato:. formiato liasa (PFL) y el drogenase Dehy lactato (LDH) genes [15,16] Se ha sido más ampliamente utilizado como una cepa de partida Para más ingeniería metabólica de E. coli para mejorar la producción de ácido succínico. La inactivación de los genes PFL y LDH se incrementa el rendimiento de ácido succínico a expensas de etanol y los ácidos acético, fórmico y láctico bajo Anaero condición BIC, pero excreta una cantidad significativa de ácido pirúvico. Además, el crecimiento celular se inhibió gravemente probablemente debido a la incapacidad para regenerar NAD suficientemente [15,59]. E. coli tiene una enzima málica que puede interconvertir piruvato y malato. Sin embargo, el valor m K de E. coli enzima málico es de 16 y 0,4 mM de piruvato y malato, respectivamente, lo que indica que la reacción procede para formar piruvato [45]. Después de observar la acumulación de piruvato en la cepa NZN111, se razonó que la amplificación de la enzima málico haría dado lugar a la conversión de piruvato a malato. De hecho, el ácido succínico pro ducción se podría mejorar mediante la sobreexpresión del gen que codifica la enzima málica en sfcA NZN111 [15,16]. Un derivado de NZN111 que mostró restauró el crecimiento celular fue seleccionado por mutación cromosómica espontánea. La cepa mutante llamado AFP 111 podría crecer en glucosa y tuvo mutación en el gen específico de glucosa fosfotransferasa (ptsG). La fermentación de esta tensión aumentó drásticamente el rendimiento de ácido succínico y productividad a 1,0 mol mol -1 y 0,87 g1 -1 h -1, respectivamente. La clonación de la piruvato carboxilasa (PYC) gen heterólogo de Rhizobium etli o C. glutamicum en el AFP111 para desviar el piruvato acumulada se llevó a cabo a ácido succínico. La fermentación de fase doble de una cepa AFP111 recombinante que contiene pTrc99A-pyc, compuesto por la fase de crecimiento aeróbico inicial seguida por anaeróbico fase de producción de ácido succínico, dio como resultado la concentración de ácido succínico y la productividad de 99,2 g1 -1 y 1,3 g 1 h -1 - 1, respectivamente [17]. Recientemente, se ha hecho un mayor esfuerzo para desarrollar E. recombinante coli cepas capaces de producir ácido succínico con alta eficiencia. Los genes pyc ppc Sorghum vulgare y Lactococcus lactis se introdujeron en el /

dh-pf / -inactivated y / inactivado-dh-pta-ack E. cepas mutantes de E. coli, respectivamente, con el fin de redirigir la piruvato acumulada a oxalacética ácido [18]. En otro enfoque, una cepa recombinante fue creado mediante la activación de la vía de glioxilato porque requiere menos NADH en E. coli [60]. Más recientemente, diseñado metabólicamente E. coli cepa capaz de producir ácido succínico aeróbicamente a través de la vía de glioxilato y la rama oxidativa del ciclo TCA fue desarrollado mediante la inactivación de la succinato dehydroge nase (SDH), piruvato oxidasa (poxB), pta-ack, aceBAK represor del operón (ic1R) y ptsG genes. La fermentación aeróbica fed-batch de esta cepa resultó en la producción de 58.3 g de ácido 1 -1 succínico en 59 h con el rendimiento de ácido succínico de 0,85 mol mol -1 glucosa [19,20]. Sin embargo, la producción de pirúvico (6,1 g1 -1) y acético (3,0 g 1 -1) ácidos no podían ser evitadas. Aunque las cepas de ingeniería metabólicamente de E. coli fueron notables en su rendimiento en comparación con la cepa de tipo salvaje, todavía necesitan mejorar. En particular, las productividades de ácido succínico específicos y volumétricas son mucho más bajos que los obtenidos con A. succiniciproducens y bacterias del rumen (Tabla 1). La productividad de ácido succínico específica baja requiere una mayor densidad celular para la producción de ácido succínico eficiente, lo que reduce el rendimiento de ácido succínico debido a la conversión de fuentes de carbono tanto a la biomasa. Co-producción de otros ácidos es el mismo problema que se observa en otras bacterias, que debe ser resuelto para la purificación eficaz de ácido succínico. 4. Recuperación de ácido succínico

Un proceso típico para la producción de un bioproducto como el ácido succínico por fermentación microbiana consiste en el cultivo de semillas, la fermentación, la recuperación del producto, la concentración y la purificación. Teniendo en cuenta que el coste de purificación de aguas abajo en el proceso basado en la fermentación normalmente representa más de 60% del coste total de producción [61], que es crucial para desarrollar un proceso de purificación económica de ácido succínico a partir de caldo de fermentación. En el caso de la purificación del ácido succínico, la separación de subproductos incluyendo acético, fórmico, láctico y ácidos pirúvico es la más crucial. Varios métodos para la purificación de ácido succínico, incluyendo electrodiálisis, la acidificación y la extracción han sido devel desarrollados. La electrodiálisis es un proceso de separación ampliamente utilizado, en el que los compuestos ionizados se separan de com no ionizados libras por membrana de intercambio iónico, en el tratamiento de aguas residuales, industria farmacéutica y de procesamiento de alimentos [62,63]. El ácido succínico existe normalmente en forma de ionized- succinato de sal en un caldo de fermentación, mientras que otros hidratos de carbono incluyendo, pro proteínas y aminoácidos son en su mayoría no ionizada. La mayoría de las especialidades aplicaciones y de las materias primas de ácido succínico requieren la forma de

ácido libre en lugar de la forma de sal. Por lo tanto, el proceso de purificación del ácido succínico compuesto de electrodiálisis convencional seguido de pilas de membrana de electrodiálisis-división de agua, que elimina la mayor parte del catión de la sal y produce corriente de ácido altamente puro, fue desarrollado. Con el fin de eliminar las resinas catiónicas, aniónicas y amino ácidos, intercambio catiónico y aniónico residuales se integraron en el proceso anterior como la etapa de purificación final [55]. Aunque este proceso aumenta la concentración de ácido succínico a partir de 51,5% a 79,6% (w / w) y completamente proteínas y sales eliminadas, la concentración de ácido acético aumentaron de 13,2% a 19,9%. Otro proceso de purificación que emplea la precipitación de sales de succinato fue desarrollado [56]. Succinato en el caldo de fermentación se precipita como succinato de calcio mediante la adición de dihidróxido de calcio, que puede neutralizar el caldo de fermentación al mismo tiempo. Succinato de calcio se recupera por filtración, y se convierte a ácido succínico mediante la adición de ácido sulfúrico. El ácido succínico se recupera por filtración, y se purificó adicionalmente por ácidos y básicos intercambiadores de iones. Este proceso mejoró dramáticamente la pureza del ácido succínico a partir de 44,5% en el caldo de fermentación a 94,2% (w / w) después de la purificación. A diferencia de la recuperación de ácido succínico proceso basado en la electrodiálisis, no puede completamente eliminar las proteínas principalmente debido a la saturación de los sitios de intercambio iónico con el anión de succinato. Los dos procesos anteriores son bastante complejas, lo que resulta en costos relativamente altos de purificación. La extracción reactiva de ácido succínico con extractante basado en amina, el empleo de aminas terciarias hidrófobos, ha sido considerada como un método de purificación eficaz y económica en los últimos años porque el proceso se hace funcionar a temperatura y presión normales [64,65]. Este proceso se basa en la reacción reversible entre el extractante y la carboxílico extraído ácido. La separación selectiva de ácido específico de Fermenta caldo ción que contiene ácidos mixtos se puede lograr basa en el pK a valores del pH ácidos y operativo [61,66-69]. El uso de tri-n-octilamina como agente de extracción como resultado la la recuperación del ácido succínico de la mezcla binaria de ácido succínico y ácido acético con alta selectividad y alta eficiencia de extracción [70]. Más recientemente, se ha desarrollado el proceso de recuperación de ácido succínico integrada compuesta de la extracción reactiva, destilación al vacío y la cristalización. Esto permitió la purificación de ácido succínico con la pureza de 99,76% (w / w) y el rendimiento de 73,09% (w / w) del caldo de fermentación real de M. succiniciproducens. Además, no ácido acético se detectó después de la destilación de vacío. Este proceso es mucho más simple y más rentable de los mencionados anteriormente. 5. Conclusiones y perspectivas de futuro

En este artículo, revisamos los procesos para la producción de ácido succínico a partir de recursos renovables por la

fermentación bacteriana. Los mejores candidatos para la producción de ácido succínico, incluyendo A. succinogenes, M. succiniciproducens y A. succiniciproducens uso Vía carboxilación PEP para formar ácido succínico. Las enzimas que catalizan las reacciones que compiten con el camino de ácido succínico manera, tales como la piruvato quinasa, phosphotransacetylase / acetato quinasa, lactato deshidrogenasa, piruvato: formiato liasa y la alcohol deshidrogenasa, son responsables de la formación de byprod pro-, que aumentan el coste de la purificación y disminuir el rendimiento de ácido succínico. Aunque unas pocas cepas variantes capaces de producir menos subproductos se obtuvieron por mutagénesis, la formación de subproductos persistía. Este problema puede ser resuelto por ingeniería metabólica racional basada en la sistemática de análisis de todo el genoma. Gracias a la disponibilidad de la com secuencia del genoma completa de M. succiniciproducens, es posible llevar a cabo el análisis del genoma escala metabólica flujo, y transcriptoma genómica y análisis del proteoma. Esto nos permitirá desarrollar estrategias de ingeniería metabólica para el aumento de la producción de ácido succínico, considerando lo siguiente. En silico análisis de flujo metabólico nos permitirá determinar la distribución de flujo intracelular bajo diversas perturbaciones genéticas y ambientales. Las condiciones ambientales y genéticos que conducen a un mayor flujo hacia el ácido succínico con reducidos flujos de subproductos serán seleccionadas y verificadas experimentalmente. Durante este proceso, los resultados de los análisis del transcriptoma y proteoma se pueden incorporar para afinar las restricciones. Objetivos de ingeniería se pueden seleccionar directamente desde transcriptoma y proteoma análisis también. Esos genes y proteínas que se encuentran para ser interesante desde el análisis del transcriptoma y proteoma pueden ser manipulados para mejorar el rendimiento metabólico. En última instancia, la ingeniería metabólica de un productor de ácido succínico debe permitir la producción de ácido succínico a una concentración alta con una alta productividad y alto rendimiento sin formación de subproductos. Por supuesto, este proceso de desarrollo de la cepa debe ser integrado con el desarrollo del proceso de fermentación que también considera la mejor fuente de carbono disponible, la masa celular óptimo, y otras condiciones de cultivo. Además, con los avances en el desarrollo de un proceso aguas abajo eficiente, tales como la extracción reactiva basado en amina para la purificación de ácido succínico, el costo de purificación se puede reducir considerablemente. En conjunto, el futuro de la producción fermentativa de ácido succínico es brillante considerando el costo de materia prima cada vez más aceptable, gran tamaño del mercado potencial, la ventaja adicional de la fijación del dióxido de carbono, y los avances en el desarrollo de estrategias para la mejora de cepas, la fermentación y purificación.